JPH0246200B2

JPH0246200B2 - Toriguriseridokenshutsuyososeibutsu

Info

Publication number: JPH0246200B2
Application number: JP1227086A
Authority: JP
Inventors: Uorutaa Esudaasu Seodoa; Toomasu Gutsudohyuu Chaaruzu
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1976-08-19
Filing date: 1986-01-24
Publication date: 1990-10-15
Anticipated expiration: 2006-01-24
Also published as: FR2362395B1; JPS5726600A; JPS5324892A; JPS61293397A; GB1590736A; FR2362395A1; JPH0131880B2; DE2737288A1; CA1100023A; JPS6012040B2; DE2737288C2

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はトリグリセリド含有水性液体、特に血
清トリグリセリドの分析に用いるのに適したトリ
グリセリド検出用組成物に関する。血清トリグリセリドの濃度測定は数種のタイプ
の過脂肪血症及びアテローム性動脈硬化性心臓疾
病の診断において重要性が増して来た（参照：
Kahlke，W.「Med.Wscht」第91巻26頁（1966
年）、Kuo，P.T.及びBasset，D.R.「Amer.
Intern.Med.」第59巻、465頁（1963年））。慣用的
な血清トリグリセリド測定法はトリグリセリドを
加水分解してグリセリンを遊離し、そしてこのグ
リセリンを種々の試薬で処理して分光分析法で定
量できる化合物を生成することからなる。塩基を
用いて加水分解を行うことが一般的であるが、ビ
ユーコロ（Bucolo）らへの米国特許第3703591号
及びストーク（Stork）らへの米国特許第
3759793号では、それぞれリパーゼを単独で（前
記同第3759793号）もしくはプロテアーゼとの併
用して（前記同第3703591号）加水分解を行う酵
素方法を述べている。他の酵素によらない加水分
解法はドイツ国特許第2229849号及び同第2323609
号に記載されている。現在任意の出所のグリセリンを測定するのに三
つの酵素方法が慣用的に用いられる。これらは下記の通りである。 (a) ガーランド及びランドル法（Method of
Garland and Randle）（Garland，P.B.及びRandle，R.J.著
「Nature」、第196巻、987−988頁（1962年））グリセリン＋ATPグリセリンキナーゼ ―――――――――→ Ｌ−α−グリセロホスフエート＋ADP ADP＋ホスホノエノールピルベートピルベートキナ
ーゼ ――――――――――→ ピルビン酸塩＋ATP ピルビン酸塩＋NaDHラクテートデヒドロゲナーゼ ―――――――――――――――→ 乳酸塩＋NAD＋ (b) ワイランド法（Weilands Method）（Weiland，O.「Biochem Ｚ」329号、313頁
（1957年））グリセリン＋ATPグリセリンキナーゼ ――――――――――→ Ｌ−α−グリセロホスフエート＋ADP Ｌ−α−グリセロホスフエート＋NAD＋α−グリセ
リン酸デヒドロゲナーゼ ―――――――――――――――――――→ NADH＋ジヒドロキシアセトンホスフエート＋H⁺ (c) グリセリンデヒドロナーゼ法（Hagen，J.H
及びHagen，P.B.「Can J.Biochem and
Physiology」第40巻、1129頁（1962年））グリセリン＋NAD＋グリセリンヒドロゲナーゼ ―――――――――――――――→ ジヒドロキシアセトン＋NADH＋H⁺ 方法(a)の変更態様はドイツ特許第2665556号、
英国特許第1322462号及び米国特許第3759793号に
も記載されている。全ての場合、NADH生成も
しくは消失はUV.分光分析法の340nmにおいて測
定される。方法(a)は多くの商業上の“道具
（kits）”に利用される。三酵素工程であり、そし
てNADHの消失を測定する。方法(b)は二酵素工
程からなりNADHの生成は酵素グリセリンデヒ
ドロゲナーゼ単一反応（方法(c)）の場合の様に測
定される。後者の二操作は極めてPHに鋭敏であ
り、かつ、厳密なPH管理を保たなければ誤つた値
を生む。又、三方法全てにおいて、（特に方法(a)）
では、診断用酵素だけでなく、補因子（コフアク
ター）、即ち、NADHの安定性が主要に関係して
くる。現在の酵素法における誤差については
Chen，H.P.及びEl−Mequid，S.S.が
「Biochemical Medicine」第７巻、460頁（1973
年）で詳しく検討している。別のトリグリセリド分析法はドイツ特許第
2139163号に記載されている。この特許の方法は、
トリグリセリドを加水分解し、生成したグリセリ
ンを酸化してホルムアルデヒドにし、そしてこの
ホルムアルデヒドをアンモニア及び水−アルコー
ル−溶解性の安定で無色のアセチルアセトン金属
錯体と反応させて有色化合物を生成することから
なる。本発明の目的はトリグリセリド、特に血清トリ
グリセリドを定量測定するための組成物であつ
て、厳密でかつ狭いPH管理の必要性がなく、使用
する試薬の安定性にすぐれたトリグリセリド検出
用組成物を提供することにある。本発明に従えば、(a)リパーゼ、(b)グリセリンキ
ナーゼ、(c)アデノシントリホスフエート、(d)α−
グリセロホスフエート・オキシダーゼ、及び(e)過
酸化活性を示す物質を含む水性液体中のトリグリ
セリド検出用組成物が提供される。本発明において、トリグリセリドは下記の一連
の反応（第Ｉ表）によつて好適に定量測定され
る。第Ｉ表１トリグリセリド＋HOHノパーゼ ――――→ グリセリン＋脂肪酸２グリセリン＋ATPグリセリンキナーゼ ――――――――――→ Ｌ−α−グリセロホスフエート＋ADP ３Ｌ−α−グリセロホスフエート＋電子受容体α−グ
リセロホスフエート・オキシダーゼ ――――――――――――――――――――――→ ジヒドロキシアセトンホスフエート＋分析測定用の物
質酸素が前記電子受容体であるとき、H₂O₂は上
記(3)における分析測定用の物質として生成され、
そして、H₂O₂の測定は以下の反応によつて好適
に実施される。４ H₂O₂＋H₂A（還元型）パーオキシダーゼ ―――――――――→ Ａ（酸化型、検出可能物質）＋H₂O ただしH₂A（還元型）は染料の還元形態であ
る染料前駆体である。Ａ（酸化型）はH₂Aの酸化によつて生成され
る染料である。好ましい組成物の組合わせ反応において、グリ
セリン及び／もしくはトリグリセリドの濃度に比
例して検出可能物質を生成される。この方法は、
沢山の臨床適用、詳しく言えば、血清トリグリセ
リドの定量に用いることができる。本発明の操作は慣用方法に優る独自の利益を多
く有する。第一にパーオキシダーゼが電子供与体
として利用するロイコ染料はいずれも指示薬組成
物に有効に用いることができる。従つて前記反応
を、染料の選択に依存して、スペクトルの可視区
域における数種の波長のうちの１種で測定でき
る。第二に、可視区域で行なつた測定は340nmで
行つた測定より妨害されにくい。第三に、染料の
他、過酸化水素を検出する任意な手段を用いるこ
とができる。第四にO₂がα−グリセロホスフエ
ート・オキシダーゼ反応の補因子であるので、
NAD⁺もしくはNADHの安定性は重要ではない。
第五に従来技術の反応工程を妨害する、NAD⁺も
しくはNADHを利用する血清成分（例えば、乳
酸塩とラクテートデヒドロゲナーゼのたしたも
の）は、本処理を妨害しない。第六にO₂を電子
受容体として用いるときにO₂消費量を測るいか
なる手段も検出手段として利用できる。最後に、
本目的の工程に用いられる酵素は比較的広いPH範
囲に亘つて活性でありこの為に厳密なPH管理が必
要ではない。以下、トリグリセリドを定量する為の溶液及び
溶液法に主な中心をおいて討議するが、全ての試
薬を乾燥もしくは凍結乾燥形態で提供し、そして
使用直前に水で再組成できることが当業者にとつ
て容易にわかるはずである。この種の組成物がこ
こにおいて明らかに期待できる。加水分解本発明の方法は最も複雑な態様において、トリ
グリセリド含量に関する水性液体、例えば血清を
分析するのに利用される。この態様によれば、ト
リグリセリドを当業界で述べられているよく知ら
れた任意の技法によつて遊離グリセリンに加水分
解する。酵素による技法が好ましい。これらは通
常、前記血清試料の処理を前記トリグリセリドの
性質に依存してプロテアーゼもしくは界面活性剤
のようなイフエクターと組合せた、もしくは単独
のリパーゼで行うことからなる。このような技術
及びこれらの実施に有用な組成物についての詳し
い検討は1972年11月21日にビユーコロらへ発行さ
れた米国特許第3703591号及び1973年９月18日に
ストークらへ発行された米国特許第3759793号に
掲載されている。ビユーコロらはプロテアーゼと
組合せてリパーゼ、好ましくはリゾプスアリズス
（Rhizopus arrhizus）（ヴアル・デレマール
（var.delemar））のリパーゼ及び類似物質を用い
て血清トリグリセリドを加水分解するが、ストー
クらはリゾプスアリズスのリパーゼだけを用いて
加水分解を行うことを開示している。別法は、そ
れ自体では、通常血清中に見られるような蛋白質
と複合したトリグリセリドを加水分解できないリ
パーゼと、イフエクターとしての相溶性を有する
界面活性剤との相溶性混合物を用いる血清トリグ
リセリドの加水分解からなる。相溶性界面活性剤
は下記の試験で述べるようにリパーゼによるトリ
グリセリドの加水分解を促進するものである。従
つて、前記界面活性剤はリパーゼの活性を阻害せ
ずに実質的に高める。前記リパーゼはカンジダシ
リンドラセア（Candidacylindracea）（カンジダ
ルーゴサ（Candidarugosa））のものが好ましい。任意の前記技法に従うトリグリセリド加水分解
に有用なリパーゼは植物もしくは動物からとつた
ものでもよいが、下記のように界面活性剤とリパ
ーゼを併用するとき、微生物（microbiol）リパ
ーゼ例えば、カンジダシリンドラセアのものが最
良である。例えば、フクモト（Fukumoto）らが
「J.Gen.Appli.Microbiol.」第10巻、257〜265頁
（1964年）に記載のように、クロモバクテリウム
ヴイスコサム（Chromobacterium viscosum）
のリパーゼ、種々のパラリポリテイクム
（Paralipolyticum）の粗製もしくは精製リパー
ゼ、リゾプスアリズス（種々のリゾプスデルマー
ル）の精製リパーゼ及び類似の活性を有するリパ
ーゼ精剤も有用である。他の有用なリパーゼ及びそれらの調製方法は下
記の米国特許に記載されている。 1959年５月26日グランデル（Grandel）に発行
した米国特許第2888385号 1965年２月２日メルセル（Melcer）らに発行
した米国特許第3168448号 1969年６月15日ヤマダ（Yamada）らに発行し
た米国特許第3189529号 1966年７月26日フクモト（Fukumoto）らに発
行した米国特許第3262863号 1970年５月19日モベネー（Mauvernay）らに
発行した米国特許第3513073号前記リパーゼは凍結乾燥した形態で容易に入手
できるので、分析試料を接触用の反応混合物を生
成する為に、水による再組成用乾燥混合物に容易
に組み入れるか、もしくは他のこのような溶液と
合併できる安定な試薬溶液として提供するかのい
ずれかである。特に好ましい市販のリパーゼにはインジアナ州
のエルクハールトにあるマイルス研究所が供給す
る小麦胚種リパーゼ、ウイルソン研究所が供給す
るリパーゼ3000、シグマケミカル社が供給するス
テアプシン（最後の２つの酵素は両方とも膵臓酵
素である）及びエンザイムデイベロツプメントカ
ンパニーが供給する（カソジダルーゴサからの）
リパーゼＭが含まれる。非イオン性及びアニオン性界面活性剤はそれ自
身では血清トリグリセリドを加水分解できない、
リパーゼ製剤と併用して有用であることが分つ
た。このような物質の中でもロームアンドハース
社が商標トリトン（Triton）で市販している、
オクチル及びノニル・フエノキシ・ポリエトキ
シ・エタノールが最も好ましい。 HLB（hydrophile lupophile balance）値が約
15未満でかつポリオキシエチレン鎖のポリオキシ
エチレン単位数が約20未満である界面活性剤を用
いるとき、最良の結果が得られる。リパーゼ及び界面活性剤の相溶性組成物は、下
記の試験によつて容易に定義される。評価すべき組成物の界面活性剤を、緩衝してい
ない再組成した血清（詳しく言えば、ニユージヤ
ージイー州、モリスプレイズ、ワーナーランバー
トカンパニー（Warner Lambert Company）の
ザネラルダイアグノステイクスデイヴイジヨンか
ら入手できる血清標準バリデイト（Validate）
に、約０及び10重量％の間の様々な濃度で添加
し、そしてこの溶液を37℃で約５分間インキユベ
ートする。この時点で、目的のリパーゼ製剤の試
料を加えて約20分の間インキユベートを続ける。
この溶液の一部（〜0.2ml）を（沈殿生成を促す
ために1.3mMのCaCl₂を含む）水で1.6mlに希釈
し、沸騰している水浴上に10分間置き、そして遠
心分離して（４℃、37000×ｇ、10分間）澄明に
する。澄明な上澄液0.4mlのグリセリンを、ガー
ランド、ピー。ビー（Garland，P.B）及びラン
ドール、ピー・ジエイ（Randle，P.J.）が
「Nature」第196巻987−988頁（1962年）に記載
する方法によつて、1.2mlの総容量中で定量的に
測定する。有効グリセリンの理論濃度の少くとも
約50％を遊離する組成物はいずれも有用と見なさ
れ、かつ本発明の範囲内にある。前記試験を実施
するとき、リパーゼ以外の混合物の成分全てを含
む空試験を行うことが非常に望ましく、その結果
遊離グリセリンもしくは他の血清成分に帰因する
任意の反応を差し引くことができる。好ましい組
成物は10分未満で有効トリグリセリドのグリセリ
ンへの加水分解を75％遂げるもので、更に好まし
いものは約10分未満で実質的に完全に、即ち、約
90％以上有効トリグリセリドをグリセリンに加水
分解するものである。このように好ましい組成物
の例は下記第表に示す。何らかの理由で、従来技術のプニテアーゼーリ
パーゼの組合せを加水分解に用いるとき、大低の
プロテアーゼを用いることができる。これらは、
例えば、キモトリプシン、ストレプトミセスグリ
セリウス（Streptmyces griseus）プロテアーゼ
（プロナーゼという登録商標名で市販されてい
る）、アスペルギルスオリザエ（Aspergillus
oryzae）及びバチルスサブチリス（Bacillus
subtilis）のプロテアーゼ、エラスターゼ
（elastase）、パパイン及びブロメライン
（bromelain）を含む。もちろん、このような酵
素の混合物も用いる事ができる。リパーゼ及び界面活性剤、プロテアーゼ等の他
のイフエクターの有効濃度は前記分析に課せられ
た時間制約等に依存して広く変化するが、これら
は当業者によつて容易に測定される。有効濃度の
典型的な非制限例は後の例に記載する。分析する前に遊離グリセリンを取得するため
に、強塩基で処理することを含む公知の従来技法
“非酵素的”方法のいずれによつてもトリグリセ
リドを加水分解することができる。しかしながら、グリセリン分析系の酵素を阻害
するか、さもなければ、正確なグリセリン測定を
行うのに必要な反応を妨害する物質を含まない媒
体中において、前記グリセリンを、酵素によるグ
リセリン分析組成物に配ることを保証する注意を
払わなければならない。グリセリン分析トリグリセリド加水分解を達成したとき、本発
明の新規な酵素によるグリセリン分析を行うこと
ができる。上記の反応で明らかなように、グリセリン分析
に用いる最初の酵素はグリセリンキナーゼであ
り、これはアデノジン三リン酸（ATP）の存在
下でグリセリンのＬ−α−グリセロホスフエート
への転化に触媒作用を示す。一般的に、任意のグ
リセリンキナーゼを用いて本発明を成功裡に実施
できるが、大腸菌及びカンジダミコデルマ
（Candidamycoderma）から得たものが好まし
い。他のグリセリンキナーゼ酵素は当業界におい
てよく知られている。このような物質を完全に討
議し、かつ更にそれらの調整及び反応性に関する
文献はテイー・イー・バールマン（T.E.
Barman）の「エンザイムハンドブツク
（Enzyme Hand book）Ｉ」（Springer−
Verlag，N.Y.（1969年）、401−402頁）に見られ
る。ワーシントンバイオケミカルカンパニー
（Worthington Biochemical Company）のグリ
セリンキナーゼは満足できる市販品の酵素を供給
する。次の反応工程では、Ｌ−α−グリセロホスフエ
ート・オキシダーゼ及び検出できる反応を生成す
るための電子受容体の存在下でＬ−α−グリセロ
ホスフエートの酸化を行う。この検出できる変化
は好ましくは色の変化もしくは色の生成であり、
好適な場合においては液体試料に含まれるグリセ
リンに定量的に関係する。酸素消費量のような検
知できる他の変化を監視しても分析結果を認める
ことができる。オキシダーゼ酵素の存在下、検知
できる変化を伴つてα−グリセロホスフエートを
酸化する、任意の電子受容体はこの反応において
好適に使用される候補物質である。直接もしくは
間接的に、放射線測定法で検知できる、好適には
有色生成物を与える物質が、電子受容体として特
に好ましい。有用性のありそうな電子受容体を用
いて実験することによつて、いかなる個々の電子
受容体の利用性も決定できる。非常に好ましい電子受容体は酸素であり、これ
はオキシダーゼの存在下でＬ−グリセロホスフエ
ートを酸化してジヒドロキシアセトンホスフエー
ト及び過酸化水素にする。この種の反応において
過酸化水素を測定し、かつ酸素の消費量を調べる
方法は公知であることは言うまでもない。別の好
ましい態様において、酵素及び基質の存在下で還
元されて直ちに変色もしくは呈色をこうむる有色
もしくは無色の物質を電子受容体として用いる。
前述のように、このような物質は特殊な使用状況
下で試験して選ぶことができる。このような状況
は下記例５に記載する。この方法を用いると、或
る種のインドフエノール、フエリシアン化カリウ
ム、及び或る種のテトラゾリウム塩が有用な電子
受容体であることが分つた。詳しく言えば、この
反応における電子受容体として２，６−ジクロロ
フエノールインドフエノールを単独、もしくはメ
ト硫酸フエナジンと併用して、及び２−（ｐ−ヨ
ウドフエニル）−３−（ニトロフエニル）−５−フ
エニル−2H−テトラゾリウムクロリドを単独も
しくはメト硫酸フエナジンと併用するかのいずれ
か一方が有用であることがわかつた。検出できる変化は電位差測定技術を用いて、た
とえば、酸素電極を用いて酸素消費量を測定する
ことによつて測定することもできる。Ｌ−α−グリセロホスフエート・オキシダーゼ
は様々の出所源から取得できる微生物酵素であ
る。下記に詳しく示すように或る種の出所源の酵
素の特性は他からのものの特性より好ましい。一
般的に、前記酵素は連鎖球菌族、乳酸桿菌族及び
ペジオコツカス（Pediococcus）から取得でき
る。アメリカンタイプカルチヤーコレクシヨン
（American Type Culture Collection）から入
手可能なストレプトコツカスフアエカリス
（Streptococcus faecalis）培養物からの酵素が
特に好ましい。特に有用で、かつ好ましい酵素
は、前記コレクシヨンの保管品に基づいて同定さ
れる菌株ATCC11700、ATCC19634及び
ATCC12755から得られる。下記の例で記載及び
例証されるように、ATCC12755の酵素は他の２
菌株から得た酵素より若干広いPH範囲で活性を有
し、かつこのために最も好ましいといえる。下記の二つの文献は酵素並びに酵素の調製及び
抽出に関する有用な技法を記載するものである。文献：コデイチエツク、エル．ケー．（Kodits
−chek，L.K.）及びアンブライト、ダヴリユー．
ダヴリユー．（Umbreit，W.W.）、「ジヤーナル
オブバクテリオロジー（Journal of
Bacteriology）」第98巻３号、1063−1068頁
（1969年）に記載の「ストレプトコツカスフアエ
シウム（Streptoccocus faecium）のα−グリセ
ロホスフエート・オキシダーゼ」ジエイコブ、エヌ．ジエイ．（Jacob，N.J.）
及びヴアンデマーク、ピー．ジエイ．（Van
DemarkP.J）の「ストレプトコツカスフアエカ
リスのα−グリセロホスフエート酸化酵素の精製
及び性質」上記の刊行物のいずれかに記載の方法に従つて
調製された酵素は本発明を成功裡に実施する上で
有用である。わかつていない全組成の酵素製剤の
任意のものを用いるとき、分析結果を妨害するい
かなる汚染物をも抜取ることに注意を払わなけれ
ばならない。例えば、下記のように誘導されるＬ
−α−グリセロホスフエート・オキシダーゼ製剤
が非常に高濃度の不純物を含む為に、不所望な妨
害物質を含まない血清トリグリセリドの分析を達
成する前に、慣用の分別法及びカラム分離法を用
いて、前記粗製の製剤を精製しなければならなか
つた。グリセリン及び／もしくはトリグリセリドを含
む水溶液、例えば血清中のグリセリンの検出は酸
素の存在下でＬ−α−グリセロホスフエートの酸
化で生成された過酸化水素の濃度を検知する指示
薬組成物を用いて好適に実施される。酵素によつ
て生成された過酸化水素を検知する為の指示薬組
成物は、特にグルコース及び尿酸の酵素には検知
の指示薬組成物として当業界によく知られてい
る。他の多くの中でも、米国特許第3092465号及
び同第2981606号では、このような有用な指示薬
組成物について記載している。前記過酸化水素指示薬組成物は過酸化活性と有
する物質、好ましくはパーオキシダーゼと、過酸
化水素及び過酸化活性を有する物質の存在下で呈
色もしくは変色をこうむる染料前駆体とから成
る。別法として、前記染料前駆体はH₂O₂及び過
酸化活性を有する物質の存在下で酸化されて実質
的な変色をこうむらないが、その酸化形態におい
て、色を生成もしくぁ変色する物質（例えば、発
色剤）と反応して化学反応を可視的に証明する、
一種もしくはそれ以上の物質であることができ
る。特に米国特許第2981606号には、このような
指示薬組成物の詳しい記載がある。後者の染料前
駆体は、即ち、カツプリング反応によつて呈色す
るもので、本発明を実施するに好ましい。パーオキシダーゼは過酸化水素もしくは他の過
酸化物が別の物質を酸化する反応に触媒作用を示
す酵素である。前記パーオキシダーゼは一般的
に、ポルフイリン鉄を含有する複合蛋白質であ
る。パーオキシダーゼは、西洋わさび、じやがい
も、いちじく樹液およびかぶら（以上植物性パー
オキシダーゼ）、乳汁（ラクトパーオキシダーゼ）
および白血球（ベルドパーオキシダーゼ）中に生
ずる。それはまた微生物中においても生ずる。テ
オレル（Theorell）およびマーリー（Maehly）
が「Actachem.Scand.」４巻422−434頁（1950
年）に発表したような合成パーオキシダーゼもま
た満足できる。ヘミン、メトヘモグロビン、オキ
シヘモグロビン、ヘモグロビン、ヘモグロモビ
ン、アルカリ性ヘマチン、ヘミン誘導体のような
物質および過酸化活性を有する他の化合物はそれ
よりやや劣る。酵素でないが過酸化活性を有する他の物質は次
の通りである。チオシアン酸鉄、タンニン酸鉄、
フエロシアン化第一鉄、シリカゲルに吸収されて
いる第２クロム酸塩（クロム硫酸カリウム）等
で、これらの物質はパーオキシダーゼそのもの程
十分ではないが同じ様に用いられる。過酸化水素及び過酸化活性を有する物質の存在
下で呈色を示す染料前駆体には下記の物質が挙げ
られる。必要な場合、発色剤も含む。 (1) アニリンおよびその誘導体、オルト−トルイ
ンジパラ−トルイジン等のモノアミン類 (2) オルト−フエニレンジアミン、Ｎ，N′−ジ
メチル−パラ−フエニレンジアミン、Ｎ，
N′−ジエチルフエニレンジアミン、ベンジジ
ン、ジアニシジン等のジアミン類 (3) フエノールそれ自体、チモール、オルト−、
メタ−およびパラ−クレゾール、α−ナフトー
ル、β−ナフトール等のフエノール類 (4) カテコール、グアヤコール、オーシノール、
ピロガロール、ｐ，ｐ−ジヒドロキシジフエニ
ルおよびフロログルシノールのようなポリフエ
ノール類 (5) サルチル酸、ピロカテキン酸、没食子酸のよ
うな芳香族の酸 (6) ロイコマラカイトグリーン及びロイコフエノ
ールフタレインのようなロイコ染料 (7) ２，６−ジクロロフエノールインドフエノー
ルのような着色染料 (8) エピネフリン、フラボン類、チロシン、ジヒ
ドロキシフエニルアラニンおよびトリプトフア
ンの様な種々の生物学的物質 (9) その他、グアヤゴム、グアヤコン酸、ヨウ化
カリウム、ヨウ化ナトリウムおよび他の水溶性
ヨウ化物、ならびにビリルビンのような物質並びに (10) ２，2′−アジン−ジ（３−エチルベンゾチア
ゾリン−(6)−スルホン酸）および３，3′−ジア
ミノベンジジンのような特殊染料パーオキシダーゼの存在下でパーオキシダーゼ
により酸化されることができ、かつ放射線測定技
法によつて検知できる物質を提供できる、他の指
示薬組成物には、或る種の塗料供与組成物が挙げ
られる。この態様において、前記指示薬組成物
は、パーオキシダーゼの存在下で酸化されると
き、そのままでもしくはその還元型とで自家カツ
プリングして塗料を提供する化合物を含むことが
できる。このような自家カツプリング化合物に
は、オルトアミノフエノール、４−アルコキシナ
フトール、４−アミノ−５−ピラゾロン、クレゾ
ール、ピロガロール、グアヤコール、オーシノー
ル、カテコール、フロログルシノール、ｐ，ｐ−
ジヒドロキシジフエニル、没食子酸、ピロカテキ
ン酸、サリチル酸等のような、様々な加水分解さ
れた化合物を挙げることができる。この種の化合
物はよく知られており、メース及びジエイムス版
（Mees and James Ed.）の「写真処理の理論
（The Theory of Photographic Process）」の、
特に第17章に等の文献に記載がある。別の態様で
は、パーオキシダーゼの存在下でロイコ染料を酸
化して対応する染料型を提供することにより検知
可能な変化が得られる。代表的なロイコ染料には
ロイコマラカイトグリーン及びロイコフエノール
フタレインのような化合物が挙げられる。オキシ
クロミツク（oxichromic）化合物と呼ばれる。
他のロイコ染料は米国特許第3880658号に記載が
あり、更に、このような化合物は適当なその置換
基で普及し得ると述べている。米国特許第380658
号に記載のある非安定化オキシクロミツク化合物
は本発明の実施に好ましいと考えられる。別の態
様において、パーオキシダーゼの存在下で酸化さ
れ得、かつフエノール基もしくは活性化メチレン
基を有するような発色剤とで酸化縮合され得る化
合物を含む指示薬組成物によつて前記検出可能な
変化が提供され得る。このような酸化型化合物の
代表例としてベンジジン及びその類似物質、ｐ−
フエニレンジアミン、ｐ−アミノフエノール、４
−アミノアンチピリン等のような化合物を挙げる
ことができる。沢山の自家カツプリング化合物を
含む広範囲の前記発色剤が、上記メース及びジエ
イムズの文献並びにコサール（Kosar）の
「Light Sensitive System）215−249頁（1965
年）に記載されている。本発明の指示薬組成物はその酸化状態で自家カ
ツプリングする４−メトキシ−１−ナフトールも
しくは１−７−ジヒドロキシナフタレン及び４−
アミノアンチピリン（HCl）の併用剤を含む。後
者の組成物では、酸化されたピリン化合物がジヒ
ドロキシナフタレンとカツプリングする。本明細
書に記載の要素に有用な種々の指示薬組成物の成
分濃度は試料中のグリセリン濃度、検出装置の精
度、生成された染料等に大きく依存するもので、
当業者によつて容易に測定できる。後記の例にお
いて代表的な値を示す。過酸化水素を検出する他の手段も本発明を成功
裡に実施する上で用いることもできる。例えば本
明細書中に記載されている酵素及び他の試薬はロ
ールズ（Rawls）、レベツカ、エル．（Rebecca，
L.）が「Electrode Hold Promie in
Biomedical Uses」（Chemical and
Engineering News、1976年１月５日、19頁）に
記載するように酸素を鋭敏なポーラログラフイー
電極の膜に組み入れることができる。別の方法として、生成された過酸化水素を測定
する代わりに酸素に敏感な電極を用いて酸素消費
量を測定し、こうして前記第Ｉ表の反応(1)で生成
されたグリセリンの量を決定することができる
が、これは第Ｉ表反応(3)における、前記量の酸素
を消費するものである。本明細書に記載されている新規な分析組成物の
その他の成分の濃度は被分析溶液（即ち、希釈も
しくは未希釈の血清又はグリセリン及び／もしく
はトリグリセリドの他の複合水溶液）に依存して
広く変化することもできる。下記第表では本明
細書に記載されている新規な分析組成物の様々な
成分の一般的に有用でかつ好ましい濃度範囲につ
いての手近な参考試料となるであろう。

【表】これらの範囲以外でも有用な結果を得られるこ
とは言うまでもない。前記第表において、酵素の１国際単位は37
℃、PH７で１分間1μmolの基質の転化を来たす酵
素の量として定義する。当業界で良く認識されているように、各々の酵
素はPH活性の性質を有する。即ち、酵素の活性は
PHによつて変化する。これらのデータは下記の例
においてα−グリセロホスフエート・オキシダー
ゼに関して詳しく記載されている。そのデータで
示すように、Ｌ−α−グリセロホスフエート・オ
キシダーゼのPH活性の性質は約PH５及び8.5の間
でピークになる。前記新規反応工程において各々
の酵素が最も活性になるPHの範囲は第表に示さ
れる。第表 PH値リパーゼ５−９グリセリンキナーゼ７−９Ｌ−α−グリセロホスフエート・オキシダーゼ
6.3−8.0 パーオキシダーゼ６−８前記表から、本明細書に記載されている分析組
成物を約6.0及び約8.0の間、非常に好ましくは約
7.0及び約8.0の間のPHに緩衝させることが最も望
ましいことは容易に分るであろう。この種の緩衝
作用を得る方法は当業界で公知であり、かつ試薬
組成物に適当な濃度の緩衝剤物質を溶解し、分散
し、さもなければ分布させるか、又は別法とし
て、再組成可能な混合物を与えるときには乾燥形
態で提供することからなる。前記PH値に緩衝させ
るのに適当な緩衝剤は「生化学
（Biochemistry）」第５巻、467頁（1966年）にお
いて、グツド（Good）が詳しく記載している。
特に好ましい緩衝剤はリン酸カルシウムのような
リン酸塩である。生じた検知可能な物質の濃度は、任意の公知方
法例えば、標準色図と比較する方法、分光分析法
等を用いて検知できることはいうまでもない。後に記載する例において、次の酵素調製法及び
標準化した操作及び組成物を用いた。標準溶液グリセリン標準溶液の正確な濃度はガーランド
及びランドルの方法（「nature」第196巻987−988
頁（1962年））によつて測定した。過酸化水素溶
液はA₂₄₀（240nmにおける吸光度）を測定し、
ε₂₄₀＝43.6（ε：240nｍにおける分子吸光係数）を
用いて適切に計算することによつて標準（スタン
ダード）とした。血清試料をケスラー（Kessler）
及びレダラー（Lederer）の半−自動化螢光測定
法（「Fiuorometric Measurement of
Triglycerides，Automation in Analytical
Chemistry」、Technican Symposia，L.T.
Sheggs，Jr.，Ed.Medical Inc.，N.Y.，N.Y.341
頁（1966年））により、トリグリセリドの濃度に
関して分析した。 α−グリセロホスフエート・オキシターゼ法に
よるグリセリン及びトリグリセリドの定量総容量1.0mlに含まれるグリセリンを検出する
為にインキユベートする混合物リン酸カリウム緩衝剤（PH８） 200μmol 西洋わさびのパーオキシダーゼ4.2プルプロガ
リン（purpurogallin）単位 MgSO₄ 2.5μmol ATP 2.4μmol トリトンＸ−100 10mg ４−アミノアンチピレン塩酸塩 96μg １，７−ジヒドロキシナフタレン（エタノール
中の0.8％溶液として添加） 32μg 及び α−グリセロホスフエート・オキシダーゼ
（過剰のグリセリンキナーゼはα−グリセロホ
スフエート・オキシダーゼ製剤中に存在してい
た。）４単位トリグリセリド定量用の、インキユベート混合
物には上記成分の他にカンジダル−ゴザのリパー
ゼが10mg（８単位／mg）含まれていた。全成分を
５分間の間平衡状態に保ち、そして（初期）A₄₉₀
を測定した。グリセリンスタンダード（５−
100nmol）もしくは血清（20μのいずれか一方
を添加することによつて反応を開始し、そして20
ないし30分間続けた。次いで（最終）A₄₉₀を測つ
た。このスタンダードの系の変動を必要な場合に
示す。トリグリセリドの濃度の計算未知の検体のトリグリセリドグリセリン濃度は
次のように測定した。標準グリセリン検出系の存
在下でインキユベートした検体の△A₄₉₀（A₄₉₀（最
終値）−A₄₉₀（初期値））を、リパーゼＭと前記標
準グリセリン検出系の存在下でインキユベートし
た同検体の△A₄₉₀から差引いた。グリセリンもし
くは予じめ分析した血清検体のいずれか一方をス
タンダードとして用いた検量線の使用によつてこ
のリパーゼＭの吸光度における依存変化からトリ
グリセリド濃度を決定した。ストレプトコツカスフアエカリスの培養ストレプトコツカスフアエカリス（下記第表
に示した種類）は、0.1％グルコース、１％トリ
プトン、１％酵母エキス、0.65％K₂HPO₄及び1.5
％寒天を含有する斜面（Slant）上に保つた。前
記斜面コロニーの懸濁水（フラスコ１個につき
1.0ml懸濁水うちの0.2ml）を各培地25mlで充填し
たフラスコに接種する為に用いた。これらはニユ
ーブランズウイツクサイクロサームインキユベー
ターシエイカー（New Brunswick
Psycrotherm Incubator Shaker）中、30℃で22
時間の間、120rpm（２インチスロー）の振盪を行
つた。細胞を含まない抽出物の調製 100mlの培地からのセル（細胞）を遠心分離
（４℃、10000xg、10分間）によつて取得し、冷
0.05Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）40mlで洗
浄し、再び遠心分離し、そして緩衝液10mlに懸垂
させた。次いで細胞を、ロセツト冷却槽
（Rosett cooling cell）中、７分間（ブランソン
（Branson）Ｊ−17Aソニフアイア（Sonifier）を
40のセツトで運転して）ソニケーシヨン
（Sonication）破壊した。温度は８℃未満に保つ
た。10000xgで10分間遠心分離して得た上澄液を
酵素源として用いた。可溶性蛋白質の量は全例に
おいてソニケーシヨンの指示期間に最高に達し
た。牛血清アルブミンをスタンダードとして用い
て、蛋白質濃度はロウリイ（Lowry）外の方法
（Lowry，D.H.，Roseborovgh，N.S.，Farr，A.
L.及びRandall，R.J.，「J.Boil.Chan」第193号
265頁（1951年））によつて測定した。 α−グリセロホスフエート・オキシダーゼのスト
レプトコツカスフアエカリスからの単離第表の結果はストレプトコツカスフアエカリ
ス三菌種から単離したα−グリセロホスフエー
ト・オキシダーゼを比較するものである。各例と
もこの菌をブドウ糖培地において30℃で22時間好
気的に培養した。遠心分離で細胞を集め、そして
次にソニケーシヨン破壊した。通常、10000xgで
遠心分離して得た上澄液を酵素源（粗抽出物）と
して用いた。しかし、前記オキシダーゼは
100000xgで１時間遠心分離した後にさえも溶液
中に残存していた。全例において溶存酵素の減少
割合は粗製の抽出物の量に比例し、そしてＤ，Ｌ
−α−グリセロホスフエート及び前記抽出物の両
者に完全に依存するものであつた。明らかに、三
菌種は全て酸素−連鎖型（oxygen−linked）活
性を呈した。ATCC11700菌株からの酵素の最適
PHは5.8であり、そそしてATCC19634菌株のオキ
シダーゼはPH7.0で最高値を示すことが報告され
ている。この傾向は第表でも見られる。12755
菌株の活性は類推してATCC19634の菌株のもの
と似ていた。

【表】 α−グリセロホスフエート・オキシダーゼの酸素
電極分析ニユーブランズウイツクデイー・オー・アナラ
イザー（New Brunswick D.O.Analyzer）で溶
存酸素の減少を測定することによつて、Ｌ−α−
グリセロホスフエート・オキシダーゼを分析し
た。電極撹拌機で絶えず撹拌しながら、N₂及び空
気の両者を飽和させた水に対して、この酸素電極
の目盛を測定した。全量7.5mlに緩衝液及びＤ，Ｌ−α−グリセロ
ホスフエートを含むインキユベート混合物を21℃
において平衡状態にしておいた。次いで、酵素の
添加によつて反応を開始し、そして溶存酸素の減
少割合を前記曲線の直線部分から算出した。各実
験について正確な状態及び濃度はしかるべきとこ
ろに定めた。 α−グリセロホスフエート・オキシダーゼの分光
分析 100μmlのリン酸カリウム緩衝剤（PH7.0）、66μg
のＯ−ジアニシジン、25μgの西洋わさびのパー
オキシダーゼ（4.6プルプロガリン単位）及び
200μmolのＤ，Ｌ−α−グリセロホスフエート
（PH7.0）を全量1.0mlに含む試薬を用いてα−グ
リセロホスフエート・オキシダーゼを分析した。
この試薬は37℃で平衡状態にし、そして酵素の一
部を添加することによつて反応を開始した。反応
をトレースする分光光度曲線の初期の直線状の傾
きから430nmの波長においてε＝1.08×10⁴（ε：
前記反応において生成した染料の430nmの波長で
の分子吸光係数）を用いて活性を求めた。粗製の抽出物中のα−グリセロホスフエート・オ
キシダーゼの性質 12755菌株のα−グリセロホスフエート・オキ
シダーゼの詳細なPH活性を第１図に示す。最適な
活性は6.3ないし7.5の広いPH範囲で観察され、PH
6.0未満及びPH8.0より上では活性は急激に低下し
た。又第１図にはtris−HCl（△−△）もしくはグ
リシン−KOH（Ｘ）緩衝剤のいずれか一方による
酵素の外見上の阻害も示す。PH7.7において0.1M
リン酸カリウム緩衝液中の活性は0.1Mグリシン
−KOH中で観察される活性の４倍であつた。し
かしながら、0.1Mグリシン−KOH及び0.07Mリ
ン酸カリウム緩衝液（PH7.7）の両方の存在下に
おいてインキユベートするとき（0.1Mリン酸カ
リウム緩衝液の存在下の）最初の活性の82％がも
とにもどつた。このことはtris−HCl及びグリシ
ン−KOHが阻害物質ではなくて、むしろリン酸
カリウム緩衝剤が酵素を活性化することを示唆す
るものである。酢酸ナトリウム緩衝液におけるPH
6.5での活性がリン酸カリウム緩衝液で観察され
た活性の少くとも90％であるので、酢酸ナトリウ
ム緩衝液もまたこの酵素（第１図）を賦活化する
と思われる。Ｌ−α−グリセロホスフエート・オキシダーゼ精
製 α−グリセロホスフエート・オキシダーゼ−グ
リセリン検出系の予備検査では、粗製のα−グリ
セロホスフエート（α−GP）オキシダーゼ製剤
が不純物を含有することを示していた。これらの
不純物のいくつかは血清試験において粗製のオキ
シダーゼ酵素の使用を明らかに妨害した。これは
前記オキシダーゼ酵素用基質が正常のトリグリセ
リド濃度に比較できる濃度で血清中に存在するこ
とが明らかなためである。これらの不純物の或る
種のものは血清中に存在する基質上に作用して過
酸化水素を生成したが、もちろんこれは好ましい
検知技術を妨害するものであつた。蛋白質分別技法を用いた精製結果を第Ｖ表に示
す。

【表】 α−グリセロホスフエート・オキシダーゼの安定
性前記酵素溶液は−20℃で冷凍貯蔵するとき、少
くとも４ケ月間完全に安定であつた。くりかえし
冷凍及び解凍を行つても酵素を変性させなかつ
た。又、この酵素はトリドンＸ−100が２％の濃
度であつても阻害されなかつた。下記の例は本発明の詳しい態様を説明するのに
役立つであろう。例１グリセリン及び過酸化水素に関する検量線グリセリン反応曲線を第２図に示す。α−グリ
セロホスフエート・オキシダーゼ法によるグリセ
リン及びトリグリセリドの定量において、上記の
ように混合物を調製した。基質の添加によつて反
応を開始しそして37℃15分間実質的に完了した。
第２図は、前記の一連の反応２，３及び４（第Ｉ
表参照）に対して、グリセリン濃度（基質濃度）
と染料生成濃度（△A₄₉₀／15分としてプロツト）
との間に直線関係が成り立つことを示している。例２トリグリセリド基質の定量測定氷浴中でオリーブ油（3.6μmol／ml）を0.4％ト
リトンＸ−100（ロームアンドハース社から入手で
きるオクチルフエノキシポリエトキシエタノー
ル）にソニケイテイングすることによつてトリグ
リセリド乳液を調製した。前記の一連の反応１，２，３及び４（第Ｉ表参
照）によるトリグリセリド基質の定量測定はガー
ランド及びランドルの方法による定量測定法と比
べた。カンジダル−ゴザからのリパーゼを十分量
添加して触媒としすばやく（１分以下で）かつ完
全にトリグリセリドを加水分解した。30分間イン
キユベートした後の△A₄₃₀を第２図に類似のグリ
セリン濃度反応曲線に対照することによつてトリ
グリセリドグリセリンを測定した。第表に表す
これらの結果は、二つの方法間で良好な一致を示
す。α−グリセロホスフエート・オキシダーゼ法
で測定したトリグリセリドの値は全例ともやや高
いが、その差は試料２においてだけ10％より大き
かつたにすぎない。

【表】例３ α−グリセロホスフエート・オキシダーゼ法に
よる血清トリグリセリドの定量測定 PH8.0の0.2Mリン酸カリウム緩衝液の好ましい
緩衝系によつて、濃度が0.50ないし6.50mMに亘
るトリグリセリドグリセリンに関して、10の血清
検体を分析した。対照混液はグリセリン検知用の標準成分しか含
んでいなかつた。試料混液はカンジダル−ゴザの
リパーゼと他にグリセリン検知用の標準成分とを
含有していた。全混液は37℃で５分間平衡状態に
し、そして初期のA₄₉₀を測定した各血清検体20μ
を添加することによつて反応を開始し、そして
20分間インキユベートした後、最終A₄₉₀を測定し
た。対照の△A₄₉₀を検体の△A₄₉₀から引いた後、
トリグリセリドグリセリン濃度を第２図のような
水性グリセリン検量線から決定した。ケスラー及
びレデラーの参照方法に対照した結果を第表に
示す。これら二方法の間に好ましい一致が認めら
れた。

【表】例４本明細書に記載の方法は、二つの別々にプール
した血清検体をくりかえして分析することによつ
て正確に試験した。一方は正常なトリグリセリド
濃度をしておりそして一方は高いトリグリセリド
の濃度をしていた。この結果は第表に示す。正
常及び異常な血清各々について5.1％及び2.6％の
変動係数（cov）を算出した。

【表】例５代りの電子受容体酸素以外の電子受容体を例証する為に、以下の
成分を含有する反応混合物を調製した。 0.1Mリン酸カリウム緩衝液（PH７にする） 0.2MD，Ｌ−α−グリセロホスフエート第表に明記する電子受容体とその濃度各例において、この混合物を37℃で平衡状態に
保ち、そして酵素の添加によつて反応を開始し
た。この酵素の活性はε₆₀₀＝16×10³（300nmにお
ける染料２，６−ジクロロフエノールインドフエ
ノールの分子吸光係数）、ε₄₀₀＝１×10³（400nmに
おける染料K₃Fe（CN）₆の分子吸光係数）及びε₅₀₅
＝18.5×10³（505nmにおける染料２−（ｐ−ヨー
ドフエニル）−３−（ｐ−ニトロフエニル）−５−
フエニル−2M−テトラゾリウムクロリド
（INT）の分子吸光係数を用いて、分光度曲線の
初期の直線状の傾きからベール（Beer）の法則
に従つて求めた。これらの結果を第表に示す。

【表】ラゾリウムクロリド
本明細書に記載の方法はもちろん全体試薬系に
用いた様々の試薬及び酵素のいずれを定量するの
にも用いることができる。例えば、ATPは分析
用試料によつて導入されるATPを除く全試薬か
らなる組成物を用いて測定することができる。同
様にして、グリセリンキナーゼ、リパーゼ及びα
−グリセロホスフエートは被分析物以外の他の所
要物質の全てを含む組成物を用いて測定できる。グリセリンもしくはトリグリセリドの定性もし
くは半定量分析に適した試験組成物を得る為に、
含浸もしくは他の方法によつて当業界で公知の種
類の吸収物質のマトリツクスに本明細書に記載の
分析組成物を入れてもよい。グリセリンもしくは
トリグリセリドの分析用に適合できる、典型的な
生成物質及び要素は例えば、次の米国特許第
3092465号、同第3418099号、同第3418083号、同
第2893843号、同第2893844号、同第2912309号、
同第30018879号、同第3802842号、同第3798064
号、同第3298739号、同第3915647号、同第
3917453号、同第3933594号、同第3936357号等に
記載されている。本発明はその好ましい態様に関し、特に詳しく
説明したが、本発明の精神及び範囲内で種々の変
更や改変がなしうることが了解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１図はストレプトコツカスフアエカリス
ATCC12755菌種からのα−グリセロリン酸オキ
シダーゼについて、そのPH活性を示すものであ
る。図中、印（〇）はリン酸緩衝液によるもの
で、（□）、（△−△）、（×）はそれぞれ酢酸ナト
リウム、tris−HCl、グリシン−KOH緩衝液によ
るものである。第２図は本発明に係る分析におけ
るグリセリン濃度（基質濃度）と染料生成濃度と
の関係を示すグラフ図である。

Claims

【特許請求の範囲】１ (a) リパーゼ (b) グリセリンキナーゼ (c) アデノシントリホスフエート (d) α−グリセロホスフエート・オキシダーゼ (e) 過酸化活性を示す物質からなることを特徴とする水性液体中のトリグリ
セリド検出用組成物。