JPH0246285A

JPH0246285A - 植物由来２−オキソアルデヒドレダクターゼ

Info

Publication number: JPH0246285A
Application number: JP19614888A
Authority: JP
Inventors: Hiromichi Kato; 加藤　博通; Fumitaka Hayase; 文孝早瀬; Toshihide Nishimura; 敏英西村; Chigun Yana; 梁　智群
Original assignee: RIYOUSHIYOKU KENKYUKAI
Current assignee: RIYOUSHIYOKU KENKYUKAI
Priority date: 1988-08-08
Filing date: 1988-08-08
Publication date: 1990-02-15
Anticipated expiration: 2012-11-26
Also published as: JP2683048B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、蛋白質と糖によるメイラード反応、所謂褐変
反応の中間生成物である３−デオキシグルコソンを代謝
し、さらには細胞代謝物でありながら強い細胞毒性を示
すとされているメチルグリオキサールを不活性化する植
物由来の２−オキソアルデヒドレダクターゼに関するも
のである。

褐変化蛋白質は、プロテアーゼ作用を受けにくく、消化
吸収率が低下しており栄養価が劣る。また、生体内のヘ
モグロビン、クリスタリン、コラーゲンなどの蛋白質も
メイラード反応により重合、不溶化、螢光発生、着色す
るところから、老化、成人病発症との関連が推論されて
いる。

一方、メチルグリオキサールは、蛋白質、ＲＮＡ、ＤＮ
Ａの合成阻害及びＤＮＡの修飾も行なう他、変異原性の
あることも知られており、細胞増殖にとってこのメチル
グリオキサールの存在は極めて不利である。

本発明の植物由来２−オキソアルデヒドレダクターゼは
、反応性に富むこれらの２−オキソアルデヒドを不活性
化し、食品及び生体内褐変反応進行の抑制、細胞毒性作
用の排除に役立つ新規な酵素である。

〔従来の技術〕

蛋白質と糖によるメイラード反応、所謂褐変反応は、蛋
白質のＮ−末端アミノ基およびリジン残基のε−アミノ
基が、シッフ塩基を経てアマトリ転位を起こした型に修
飾された後、これが分解して２−オキソアルデヒド、特
に３−デオキシグルコソンを生成し、これが二次的にリ
ジン、アルギニン、トリプトファン残基と反応して架橋
を形成し、重合、螢光発生、褐変を引き起こす一連の反
応である。

食品においては、メイラード反応により、必須アミノ酸
であるリジン、トリプトファンが損失するだけでなく、
重合することによりプロテアーゼ作用を受けにくくなり
消化吸収率が低下する。

一方、生体内においても、このメイラード反応は進行し
、コラーゲンのような代謝回転の遅い蛋白質がメイラー
ド反応により褐変、重合したときに伴う硬化、代謝遅延
と老化や成人病との関連、或いは代謝回転することのな
い特殊蛋白質である眼球レンズのクリスタリンの不透明
化と糖尿病による白内障との関連などが議論されている
。また、生体内で修飾、重合した蛋白質は、代謝を受け
にくくなり、血管壁に沈着すると動脈硬化の原因となる
可能性もある。このように生体内で生じたメイラード反
応生成物は、老化や成人病の発症と関連があると考えら
れるところから、生体にとっては都合の悪い物で、これ
を排除する必要がある。

このメイラード反応の重要な中間体である３−デオキシ
グルコソンを代謝する酵素として、３−デオキシグルコ
ソンと同じく分子内にカルボニル基とアルデヒド基を有
し、反応性に富む細胞増殖阻害物質であるメチルグリオ
キサールを代謝する２−オキソアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼとメチルグリオキサールレダクターゼが既に知られ
ている。

メチルグリオキサールの分解に関与している酵素系は数
種あり〔蛋白質核酸酵素３１　（１１）　１０１０〜１
０２１）　、補酵素グルタチオンからなるグリオキサラ
ーゼにより乳酸に転換する経路、メチルグリオキサール
還元酵素により、ラクトアルデヒドを経て乳酸に転換す
る経路、メチルグリオキサール脱水素酵素により、直接
ピルビン酸に転換する経路が明らかにされている。これ
らの酵素は、多くの微生物及び動物の脳、心臓、肝臓、
肺臓、腎臓などに見出されている。また、グリオキサラ
ーゼ系については植物にも見出されている。しかし、メ
チルグリオキサールに反応して、アセトールに転換する
酵素はまだ報告されていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

上述したように、３−デオキシグルコソンは、メイラー
ド反応における主要な中間体であり、またメチルグリオ
キサールは、細胞増殖阻害物質として知られている。

本発明は、これら２−オキソアルデヒドに作用して、ア
ルデヒド基を還元し、これら２−オキソアルデヒドを不
活性化するこれまで全く報告されていない新規な酵素で
ある植物由来２−オキソアルデヒドレダクターゼを提供
するという課題を解決したものである。

（課題を解決するための手段〕本発明者らは、これまでに検索されたことのない２−オ
キソアルデヒドを不活性化する植物由来の２−オキソア
ルデヒドレダクターゼを求めて鋭意研究を進めた結果、
新鮮な食用植物に緩衝液を加え磨砕して得た粗抽出物中
に目的する２−オキソアルデヒドレダクターゼが存在す
ることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明
は３−デオキシグルコソンを不活性化し、さらにメチル
グリオキサールを不活性化する植物由来２−オキソアル
デヒドレダクターゼである。

上記３−デオキシグルコソンは蛋白質−糖基メイラード
反応に於ける主要な中間体であり、またメチルグリオキ
サールは細胞の代謝及び増殖に関与する化合物である。

以下本発明について詳細に説明する。

本発明の２−オキソアルデヒドレダクターゼ（以下、本
発明酵素という）は、例えばカフ、セリ、レタス、ミツ
バ、チンゲンサイ、ネギ、ホウレンソウ、シュンギク、
ニラ、パセリ、フロラコリー、食用菊などの植物の根、
茎、葉または花などから、例えば次のようにして得るこ
とができる。

上記植物の根、茎、葉、または花などに、適量（２倍量
）の緩衝液、例えばβ−メルカプトエタノールを含む燐
酸緩衝液を加え、磨砕もしくはホモゲナイズし、適当な
手段で例えば濾過、遠心分離などで液分を分離するか、
あるいはさらにこの液分を同じ緩衝液で透析して粗抽出
物を得る。

この粗抽出物を、硫安飽和、透析、カラム処理、例えば
ＤＥＡＥ−セルロース、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ）　Ｇ　−１００、ヒドロキシルアパタイト（Ｈｙ
ｄ−ｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ）などのカラム処理など
を適当に組合わせて処理することにより、５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で単一なバン
ドを示す精製酵素を得ることができる。

本発明酵素の理化学的性質を示すと次のとおりである。

■作用３−デオキシグルコソン、メチルグリオキサールなどの
２−オキソアルデヒドに作用してアルデヒド基を還元す
る。

■　基質特異性３−デオキシグルコソン、メチルグリオキサール、フェ
ニルグリオキサールなどの２−オキソアルデヒドの他、
グリセルアルデヒドなどのアルデヒドにも活性を示すが
、ジアセチル、ジヒドロキシアセトンなどのケトンには
活性を示さない。

■　至適ｐＨ及び安定ｐＨ至適ｐ８　７〜７．５安定ｐＨ６〜８ ■　阻害、活性化及び安定化０．１ｍＭのＰＣＭＢ　　（ｐ−クロロマーキュリー−
ベンゾイックアシド）で完全に阻害される。

ＳＨ還元剤により安定化される。

補酵素としてＮＡＤＰＨのみを要求する。

■　分子量ゲル濾過法で６７に、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動で３５に０ ■　精製方法硫安飽和、透析、カラム処理、例えばＤＥＡＥ−セルロ
ース、セファデックスｃ−ｔｏｏ、ヒドロキシルアパタ
イトなどのカラム処理を適当に組合わせて精製する。精
製の具体例は後記実施例２に記載のとおりである。

■　作用適温　　　　　３０°Ｃ ■　ｐＨ１温度などによる失活の条件ｐＨ５〜９で１０分間安定。

ｐＨ３では５分、ｐｉ−１１０では１０分間で失活する
。

（比較的不安定である） ■　力価の測定方法１００ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）中で４ｍＭの３−
デオキシグルコソン及び０．３ｍＭ　　ＮＡＤＰＨと共
に３０°Ｃでインキュベートし、３４０ｎｍにおける０
６Ｄ、を測定する。

本発明酵素による還元生成物について分析した結果、メ
チル、グリオキサールからア七トール（Ａｃｅ−ｔｏｌ
）が、３−デオキシグルコソンからは３−デオキシフラ
クトース（３−ｄｅｏｘｙｆｒｕｃｔｏｓｅ）が生成し
た。２−オキソアルデヒドに作用して、アルデヒド基を
還元する酵素はこれまで報告されていないので、本発明
酵素は新規な酵素と認められる。

［発明の効果］本発明の酵素は、蛋白質と糖によるメイラード反応、所
謂褐変反応の中間生成物である３−デオキシグルコソン
、細胞増殖阻害物質として知られているメチルグリオキ
サールなどの２−オキソアルデヒドに作用してこれら２
−オキソアルデヒドを不活性化し、食品及び生体内褐変
反応進行の抑制、細胞毒性作用の排除に役立つので、非
常に有用な酵素である。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１下記第１表に記載の植物の葉（７種）および花（２種）
のそれぞれ７５ｇに２倍量の１０ｍＭβ−メルカプトエ
タノール（ＭＣＥ）を含む２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７
，２）を加え、３分位ホモゲナイズした後、１２．００
０　Ｇで遠心分離して上滑液を得、これを上記と同じ緩
衝液で透析して（透析内液又は外液）粗酵素抽出物（Ｃ
Ｅ）を得た。

このＣＢの３−デオキシグルコソン（３−ＧＤ）とメチ
ルグリオキサール（ＭＧ）に対する代謝活性を、補酵素
ＮＡＤＰＨ，ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰ、ＮＡＤ存在下、１０
０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）中で、ＣＥを各基質に
３０°Ｃで作用させた時の補酵素の変化量を５〜１０分
間３４０ｎｍにおける吸光度の変化で測定した結果を第
１表に示す。なお表中の数値は植物組織１ｇ当りに存在
する酵素の活性量を示す。

（本頁以下余白）ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ第１ｓｓｕｅ表第１表から全てのＣＥにおいて、３−ＣＤ、ＭＧに対す
るＮＡＤＰ）！又はＮＡＤＨ依存性のレダクターゼ活性
が認められる。

しかしいずれの植物のＣＥも、３−ＧＤ、ＭＧに対して
、ＮＡＤＰ、又はＮＡＤ依存性の、これまで肝臓で報告
されている２−オキソアルデヒド脱水素酵素活性は全く
認められなかった。

実施例２実施例１に記載のようにしてパセリの葉から得たパセリ
のＣＥ１６７ｍｌ！を４５〜７０％硫安飽和して沈澱し
た画分３０ｍ１を、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール
含有の２０ｍＭ燐酸緩衝液に透析した後、透析内液を上
記緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラムにか
けた。非吸着蛋白質を溶出した後、食塩濃度傾斜法にて
酵素を溶出した。得られた活性画分を限外口過膜を用い
て濃縮した後、セファデックスＧ−１００のカラムにか
けた。つぎにこのカラムから溶出した活性画分を上記緩
衝液に透析した後、さらにこの透析内液を濃縮した。こ
の濃縮物をヒドロキシアパタイトのカラムにかけ、リン
酸カリウムの濃度傾斜法により酵素を溶出した。このよ
うにして５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ
ＡＧＥ）で単一なバンドを示す精製された本発明酵素０
．５■を得た。

この酵素を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，４）中で１
５ｍＭの下記第２表に記載の基質及び０．３ｍＭＮＡＤ
　Ｐ　Ｈと共に３０℃でインキュベートしたとき、３−
デオキシグルコソンの活性値を１００％とした場合の各
基質の相対的活性値を示すと、第２表のとおりである。

第２（本頁以下余白）表

Claims

【特許請求の範囲】

３−デオキシグルコソンを不活性化し、さらにメチルグ
リオキサールを不活性化する植物由来２−オキソアルデ
ヒドレダクターゼ。