JPH0246300A - コリンエステラーゼ活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 血清中のコリンエステラーゼ活性の減少は、肝硬変症、
慢性肝炎、肝腫瘍、悪性閉塞性黄痘、胃癌２敗血症、子
宮筋腫、肝癌、有機燐製剤中毒などに認められる。−船
釣には、肝機能の低下を端的に表していると言われる。

また、活性上昇はネフローゼ症候群において認められる
。このように各疾患、特に肝疾患などと血清中のコリン
エステラーゼ活性値との関係は非常に密接であり、臨床
検査として重要な項目の一つである。

〔従来技術〕

従来、コリンエステラーゼ活性はｐＨメーター法〔高橋
、柴田、医学と生物学、２０巻、９６ページ、（１９５
１））　、チオコリン誘導体を基質として生成されるチ
オコリンのＳＨ基を定量する方法〔クリニカル・ケミス
トリー（Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｅｍ、）、１１巻、９１ページ
、（１９６５）　）等が用いられていた。近年、酵素を
用いるコリンエステラーゼ活性測定法の開発が積極的に
行われ、コリンオキシダーゼを用いる方法（特開昭５４
−１３６８９５号）、　ｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化
酵素を用いる方法〔ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リー（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、９４巻、１１ページ、
（１９８３））　、コリンキナーゼを用いる方法（特開
昭５２−９９８８８号）等も利用されるようになった。

しかし、ｐＨメーター法は操作が繁雑で正確性にも問題
があり、チオコリン誘導体のＳＨ基を測定する方法は基
質が不安定で操作も繁雑である欠点を有し、測定精度に
問題がある。

また、酵素を用いる方法に用いられる酵素はいずれも基
質特異性が厳密でなく、測定精度を低下させる原因とな
っている。それに加え、コリンオキシダーゼを用いる方
法は血清中に共存するリン脂質の分解などで生じるコリ
ンの干渉を受けやすい。また、ｐ−ヒドロキシ安息香酸
水酸化酵素やコリンキナーゼを用いる方法は血清中の干
渉物質の影響は受けにくいが、紫外部吸光度の減少量を
測定するために正確性、精密性に問題がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は現在までに報告されているコリンエステラーゼ
活性測定法が有している多数の問題点を解決するもので
ある。さらには、酵素を用いる方法における以下のよう
な問題点を解決するものである。つまり使用する酵素の
基質特異性が厳密でない（すなわち使用する酵素によっ
て生成される反応生成物にも該酵素が作用する。）点で
あり、さらには紫外部の吸光度を測定する方法の場合、
その吸光度の減少量を測定する（正確性、精密性に問題
がある。）点である。

本発明は使用する酵素の基質特異性が厳密であり（すな
わち酵素反応によって生成される反応生成物には全く作
用しない。）、シかも紫外部吸収測定においては吸光度
の増大量を測定可能ならしめることにより測定精度を向
上させ、さらに色素系への適用も可能とするものである
。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明によれば基質であるコリン誘導体とコリンエステ
ラーゼ作用により生成する分解物のうちコリンでない他
の一方の化合物を酸化する酵素を必須の成分として含む
試薬組成物を用いることにより吸光度の増大を測定する
コリンエステラーゼ活性測定法が提供される。さらに詳
細に例示すると以下のような方法が挙げられる。

（１）基質と乳酸オキシダーゼ及び色原体、ペルオキシ
ダーゼから成る発色試薬を添加混合し、定時間加温後血
清を添加し吸光度の増加を測定する方法。

（２）基質と乳酸脱水素酵素、　ＮＡＤ（Ｐ）”を添加
混合し、一定時間加温し次いで血清を添加し吸光度の増
加を測定する方法。

（３）基質と乳酸脱水素酵素、　ＮＡＤ（Ｐ）”　、ジ
アホラーゼ、テトラゾリウム化合物を添加混合し、定時
間加温後、次いで血清を添加して吸光度の増加を測定す
る方法。

これらの方法において、反応時間は１〜２０分、好まし
くは３〜１０分間、反応温度は２０〜４０″Ｃ１好まし
くは２５〜３７°Ｃである。また緩衝液は反応を阻害し
ないもので存ればいずれでも使用できる。例えばリン酸
緩衝液やトリス・塩酸緩衝液等である。

反応のｐＨは使用される酵素によって変化できるが好ま
しくは７．５〜８．５で行われる。

以上のごとく本発明法の特徴は、基質のコリンエステラ
ーゼによる分解生成物のうちコリンでない物質に作用す
る酵素を用いる事により、従来の様な基質が不安定であ
るための欠点、吸光度の減少で測定する事による欠点、
使用する酵素の特異性が厳密でない事による欠点及びコ
リンによる干渉を克服したものであり、正確性、精密性
、迅速性に優れた、自動分析装置にも適した新規な方法
である。

以下、実験例、実施例をもって本発明をさらに詳しく説
明する。

ｆｆｉエ　ＤＬ及びＬ−フェニルラクチルコリンのヨウ
素塩の合成 メタノール５０ｍ１に水酸化カリウム０．３４ｇを溶解
し、ついでＯＬ及びＬ−フェニル乳酸の各々１ｇを溶解
した。５分間室温で撹拌したのち、減圧乾固し、残留物
にイソプロピルアルコール５０ｄ、β−ジメチルアミノ
エチルクロライドを０．７２ｇ加え、２．５時間還流し
た。不溶物をろ過して除き、ろ液を減圧上濃縮し、残留
油状物質をシリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒と
してクロロホルム：メタノール＝２００　：　１）にて
精製し、ＤＬ及びＬ−フェニル乳酸β−ジメチルアミノ
エチルエステルを油状物質として０．７ｇ得た。この物
質の元素分析の結果は以下に示す通りであった。

元素分析値＝自Ｊ＋ＪＯ＋ ＣＨＮ 計算値　６５．８０％　８．０７％　　５．９０　　％
測定値　６５．７２％　８．１７％　　５．６８　　％
次いで上記で得られたＯＬ及びＬ−フェニル乳酸β−ジ
メチルアミノエチルエステル０．６５ｇをアセトン１０
１ｄに溶解し、ついでヨウ化メチル０．３５ｄを加え、
室温で１時間撹拌した。析出晶をろ取し、アセトン２０
ｄで洗浄し、ＯＬ及びＬ−３−フェニル乳酸コリンのヨ
ウ素塩を０．６７ｇ得た。この物質の元素分析の結果は
以下に示す通りであった。

元素分析値＝Ｃ＋Ｊｚ□ＩＮＯ。

ＣＨＮ 計算値　４４．３４％　５．８５％　　３．６９　　％
測定値　４４．２０％　５．６４％　　３．８５　　％
以上で得られたＤＬ及びＬ−３−フェニル乳酸コリンの
ヨウ素塩はこのまま基質として使用することも可能であ
る。

実験例２　コリンエステラーゼに対する基質の検討 ５ｍＭのし一フェニルラクチルコリンと１．０単位のコ
リンオキシダーゼ（東洋醸造製）を０．１ｍｇの４−ア
ミノアンチピリン、２μｌのフェノール及び１０単位の
ペルオキシダーゼ（天野製薬製）を含有する０、１Ｍ　
　）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）の０．９　ｄに添
加後、ブチルコリンエステラーゼ（ウマ血清由来、シグ
マ社製）を各々０．０５単位、０．１５単位、０．２５
単位、０．４０単位及び０．５０単位添加して３７°Ｃ
で３分間反応させ波長５０５ｎｍの吸光度変化量を測定
し、その結果を第１図に示す。

第１図から判るように、コリンエステラーゼ活性と吸光
度変化量の間には良好な直線関係が得られ、フェニルラ
クチルコリンがコリンエステラーゼの基質となることが
確認された。

夫隈五ｌ　乳酸脱水素酵素の種類の差によるフェニル乳
酸に対す６反応性 ■　コリンエステラーゼ活性測定の基質としてＬ−フェ
ニルラクチルコリンを用いた場合にコリンエステラーゼ
で分解されて生成される反応生成物であるＬ−フェニル
乳酸を５ｍＭと２１１ＩＭのＮＡＤ＋を含む０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８，０）　１．ＯｍＲにブタ心臓由来
乳酸脱水素酵素（東洋紡績型）を３００単位添加し、３
７°Ｃ，５分間反応させた。その結果、波長３４０ｎｍ
の吸光度値は０．２１と増大し、Ｌ−フェニル乳酸がブ
タ心臓由来の乳酸脱水素酵素の良好な基質となることが
確認された。

■　ブタ心臓由来の乳酸脱水素酵素のかわりに細菌由来
の乳酸脱水素酵素（天野製薬製）を５００単位添加した
場合、波長３４０ｎｍの吸光度の増大は全く認められず
、Ｌ−フェニル乳酸が細菌由来の乳酸脱水素酵素の基質
とならないことが確認された。

■　Ｌ−フェニル乳酸のかわりにり、Ｌ−フェニル乳酸
を用いて上記の■及び■と同一条件で反応を行った結果
、ブタ心臓由来及び細菌由来の乳酸脱水素酵素のいずれ
を添加しても波長３４０ｎｍの吸光度は増大した。この
ことより細菌由来の乳酸脱水素酵素はＤ−フェニル乳酸
を基質とすることができると推定された。

実験例４　乳酸脱水素酵素のフェニルラクチルコリンに
対する反応性 ■　５ｍＭのし一フェニルラクチルコリンと２ｍＭのＮ
ＡＤ”を含む０．９５　ｄの０．１Ｍのトリス・塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）に５０μ２のブタ心臓由来の乳酸脱
水素酵素（東紡績製）　５００単位を添加して３０°Ｃ
，５分間反応させた結果、波長３４０ｎｍの吸光度はほ
とんど増大せず、Ｌ−フェニルラクチルコリンにブタ心
臓由来乳酸脱水素酵素は作用しないことが確認された。

■　５ｍＭの口、Ｌ−フェニルラクチルコリンと２１１
ＩＭのＮＡＤ”を含む０．９５ｍｊ！の０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ８，０）に５０μｌの細菌由来の乳酸脱水
素酵素（天野製薬製＞　５００単位を添加して３０″Ｃ
，５分間反応させた結果、波長３４０ｎｍの吸光度はほ
とんど増大せず、ロ、Ｌ−フェニルラクチルコリンに細
菌由来の乳酸脱水素酵素は作用しないことが確認された
。

尖狭斑主、尖慧炎↓よりフェニルラクチルコリンを基質
として用いた場合コリンエステラーゼが作用し、フェニ
ル乳酸が生成された場合のみ吸光度が増大すると推定さ
れた。

失履倣上 ５ｍＭのし一フェニルラクチルコリン、２ｍＭのＮＡＤ
　”及び２５０単位のブタ心臓由来の乳酸脱水素酵素（
東洋紡績型）を含む０．９５７の０．１Ｍ）リス・塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０）を３０°Ｃ，３分間加温後、５０
μｌのブチルコリンエステラーゼ（ウマ血清由来、シグ
マ社製）を各々０．０５単位、０．１３単位、０．２５
単位、０．４０単位及び０．５０単位添加し、３０’Ｃ
。

３分間反応させ波長３４０ｎｍの吸光度の増大量を測定
した。その結果を第２図に示す。第２図から判るように
、添加したコリンエステラーゼの活性量と吸光度の最大
増加速度との間には良好な直線関係が得られた。

実施例２ ５ｍＭのＤルーフェニルラクチルコリン、２ＩＩＩＭの
ＮＡＤ”及び５００単位の細菌由来の乳酸脱水素酵素（
天野製薬製）を含む０．９５　ｄの０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ８，０）を３０’Ｃ，３分間加温後、５０μｌ
のブチルコリンエステラーゼ（ウマ血清由来、シグマ社
製）を各々０．０５単位、０．１３単位、０．２５単位
、０．４０単位及び０．５０単位添加し、３０°Ｃ，５
分間反応させ波長３４０ｎｍの吸光度の増大量を測定し
た。その結果を第３図に示す。第３図より判るように、
コリンエステラーゼ活性量と吸光度の最大増加速度との
間には良好な直線関係が得られた。

実施例３ ０．１１μｌｇの４−アミノアンチピリン、２μｌのフ
ェノール及び１０単位のペルオキシダーゼ（天野製薬製
）を１艷の０．１Ｍのトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
）に溶解して作成した発色液の０．９０ｄに５ｍＭのフ
ェニルラクチルコリンと０．５単位の乳酸オキシダーゼ
（東洋醸造型）を含有する液０．０５ｄを添加して３０
″Ｃ，３分間加温後、５０μｌのブチルコリンエステラ
ーゼ（ウマ血清由来、シグマ社製）を各々０．０２単位
、　０．０５単位、０．１０単位、　０．１５単位。

０．２０単位及び０．２５単位添加し、３０°Ｃ，５分
間反応させ波長５０５ｎｍの吸光度の増大量を測定した
。その結果を第４図に示す。第４図から判るようにコリ
ンエステラーゼ活性量と吸光度の最大増加速度との間に
は良好な直線関係が得られた。

実施例４ ５ｍＭのし一フェニルラクチルコリン、２ｍＭのＮＡＤ
”及び２５０単位のブタ心臓由来の乳酸脱水素酵素（東
洋紡績型）を０．３単位のジアホラーゼ（天野製薬製）
及び０．１５■のニトロブルーテトラゾリウムを含む０
．９５ｄの０．１Ｍ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
に添加し、３０″Ｃ，３分間加温した。この液にブチル
コリンエステラーゼ（ウマ血清由来。

シグマ社製）を各々０．０２単位、　０．０５単位、　
０．１０単位、　０．１５単位、　０．２０単位及び０
．２５単位添加し、３０°Ｃ，３分間反応させ波長５７
０ｎｎ＋の吸光度の増大量を測定した。その結果を第５
図に示す。第５図から判るように、コリンエステラーゼ
活性量と吸光度の最大増加速度との間には良好な直線関
係が得られた。

実施例５ ５ｍＭのし一フェニルラクチルコリン、２ｍＭのＮＡＤ
”及び６００単位のブタ心臓由来乳酸脱水素酵素（東洋
紡績型）を含む２４．５ｄの０．Ｅ）リス・塩酸緩衝液
（ｐＨ８，０）を３７°Ｃ，３分間加温後、ヒト血清を
５０μ２添加し、３７°Ｃ，３分間反応させ波長３４０
ｎｍの吸光度の増加量を測定した。ブランクとしては血
清を蒸留水でおきかえ、同様の操作を行った。血清中の
コリンエステラーゼ活性による一分間当りの吸光度増加
量は血清を用いて測定した一分間当りの吸光度増加量か
らブランクの一分間当りの吸光度増加量を差し引いて算
出した。

同時に、現在行われているコリンエステラーゼ測定法と
の比較のために、ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリンを基
質としているコリンエステラーゼ測定用市販キット（Ｃ
ｈ−εネオＵＶ″ジノテスト”ジノテスト社製）を用い
て同・−血清のコリンエステラーゼ値を求めた。その結
果を第６図に示す。

第６図から判るように、両側定値間には良好な相関関係
が得られた。

実施例６ 実施例３と同様に調製した２、４５ｄの発色液に５ｍＭ
のフェニルラクチルコリンと１．５単位の乳酸オキシダ
ーゼを添加した。この液を３７°Ｃ，３分間加温後、ヒ
ト血清を５０μ！添加し、３７°Ｃ，３分間反応させ波
長５０５ｎｍの吸光度の増大量を測定した。

ブランクとしては血清を蒸留水でおきかえ、同様の操作
を行った。血清中のコリンエステラーゼ活性による一分
間当りの吸光度増加量は血清を用いて測定した一分間当
りの吸光度増加量からブランクの一分間当りの吸光度増
加量を差し引いて算出した。

同時に、現在行われているコリンエステラーゼ測定法と
の比較のために、ｐ−ヒドロキシベンソイルコリンを基
質としているコリンエステラーゼ測定用市販キット（Ｃ
ｈ−ＥネオＵＶ”シノテスビシノテスト社製）を用いて
同一血清のコリンエステラーゼ値を求めた。その結果を
第７図に示す。

第７図から判るように、両側定値間には良好な相関関係
が得られた。

〔発明の効果〕

本発明により従来の酵素を用いる方法におけるコリンエ
ステラーゼ活性測定法が有している多数の問題点を解決
し、正確性、精密性の高い測定法を提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実験例２におけるコリンエステラーゼ活性と吸
光度の関係を示すものであり、第２図は実施例１におけ
るコリンエステラーゼ活性と吸光度の関係を示すもので
あり、第３図は実施例２におけるコリンエステラーゼ活
性と吸光度の関係を示すものであり、第４図は実施例３
におけるコリンエステラーゼ活性と吸光度の関係を示す
ものであり、第５図は実施例４におけるコリンエステラ
ーゼ活性と吸光度の関係を示すものであり、第６図は実
施例５における本発明の方法とコリンエステラーゼ測定
用市販キット（Ｃｈ−ＥネオＵＶ”ジノテスト”　・ジ
ノテスト社製）を用いた時との両測定法の相関関係を示
すものであり、第７図は実施例６における本発明の方法
とコリンエステラーゼ測定用市販キット（Ｃｈ−Ｅネオ
ＵＶ”ジノテスト”　・ジノテスト社製）を用いた時と
の両測定法の相関関係を示すものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 〔▲数式、化学式、表等があります▼〕 （式中、Ｘはハロゲン原子、ＯＨまたはＯＳＯ＿３Ｒを
   示し、ＲはＨまたはＣＨ＿３である。） で示される化合物を基質としてコリンエステラーゼを作
   用させ、生成したフェニル乳酸に作用する酵素を作用せ
   しめ吸光度の上昇を測定することを特徴とするコリンエ
   ステラーゼの活性測定法。