JPH0248862B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0248862B2 JPH0248862B2 JP57071832A JP7183282A JPH0248862B2 JP H0248862 B2 JPH0248862 B2 JP H0248862B2 JP 57071832 A JP57071832 A JP 57071832A JP 7183282 A JP7183282 A JP 7183282A JP H0248862 B2 JPH0248862 B2 JP H0248862B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- opa
- solution
- peptides
- fluorescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
この発明はＯ―フタルアルデヒド溶液を使用す
るペプチドの分析方法に関する。 Ｏ―フタルアルデヒド（以下OPAと略する）
は一級アミノ基に対する極めて優れたポストラベ
ル用螢光試薬であるが、アミノ酸の連鎖すなわち
ペプチド鎖の増大に伴い螢光強度は減少する欠点
を有する。たとえばトリペプチドやテトラペプチ
ドの長さになると従来法では螢光感度の低下やと
きに全くみられなくなる場合もある。 この点を鑑み、この発明はOPAによる検出感
度の向上を計るために、種々のペプチドを分離後
ペプチド鎖の切断、OPAによる発螢光反応を組
み合せた方法を提供するものである。すなわちペ
プチド含有試料を高速液体クロマトグラフイに付
し、得られるペプチド含有溶離液にアルカリ溶液
を混合して加熱加水分解し、次いで冷却後得られ
反応液をＯ―フタルアルデヒド溶液で発螢光さ
せ、この螢光を検出することを特徴とするペプチ
ドの検出方法を提供する。この発明において逆相
クロマトグラフイ用カラムとはシリカゲル粒子に
オクタデシル基を化学結合させたもの（ODS充
填剤）等をクロマトグラフ管に充填したカラムを
いう。この逆相用カラムを使用してペプチドを分
離するにはメタノール、アセトニトリル等の有機
溶媒と、少量の酸、アルカリ、あるいは塩類を含
みPHを調整された水溶液との混合溶液が移動相と
して使用されるが、とりわけ有機溶媒としてプロ
パノール、PHを調整した水溶液としてりん酸塩溶
液との混合液を移動相として使用することが望ま
しい。 この発明に使用されるアルカリ溶液とは一般的
にペプチド結合を開裂しうるアルカリ水溶液であ
り、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
等の水溶液が挙げられる。この水溶液中のアルカ
リの濃度は普通１〜２規定でよく、ペプチド含有
溶離液との反応時間は６〜８分、加熱温度は140
〜160℃が適当である。適当な設定温度の恒温槽
中においたチユーブを通す方法が便利である。 この発明で使用するOPA溶液とはAnal
Biochem93，423（′79）に記載の方法で調製した
ものでよく、その組成は１にホウ酸50ｇを加
え、50％水酸化ナトリウム溶液を加えてPH８とし
（約40ml）、脱気後メルカプトエタノール２mlと
OPA50mg（10mlのメタノール溶液）を加える。
従つてOPA濃度は約0.05％である。 この発明の別な態様としてペプチド分析装置を
提供し、その一実施例を第１図に示す。このペプ
チド分析装置１は、ペプチド含有試料のペプチド
成分を分離してその溶離液を流出する高速液体ク
ロマトグラフ部２、アルカリ溶液をポンプで混入
するアルカリ混入部７、アルカリ加水分解反応を
加熱下に行う反応部１０、冷却チユーブ１３、冷
却した反応液にOPAを加えて発光させる試液混
合部１４及び螢光検出器１７をこの順に連設して
なるもので、この操作は通常のポストラベル法と
大差なく簡便である利点をも有する。 高速液体クロマトグラフ部２は移動相槽３、移
動相送液ポンプ４、試料導入装置５及び分離カラ
ム６から構成されており、溶離液を流出する。ア
ルカリ混合部で、アルカリ溶液槽８からポンプ９
によつてアルカリを約0.6ml／分の流量で、前記
溶離液に混入する。反応部１０はステンレスチユ
ーブ恒温槽からなり、ステンレスチユーブを約
140〜160℃に恒温された槽内に設置し、このチユ
ーブを通過する間に、溶離液中のペプチドは加水
分解される。加熱された反応液を冷却チユーブ１
３を通して室温まで冷却する。OPA試液混入部
１４はアルカリ混入部と同様の構成であり、
OPA溶液槽１５とポンプ１６からなり、冷却さ
れた反応液に約１ml／分の流速で混合し、発螢光
させる。この螢光強度を検出器１７で検出する。 この発明によつて本来OPAで検出されないザ
ルコシルペプチドやプロリルペプチド等も高感度
に検出されるばかりかUVや螢光等で検出できる
基をもたないペプチドやアミドに広く利用できる
ものと期待される。従つて生化学上重要な標的で
あるペプチド含有試料、たとえばヒト血漿、尿、
組織又は天然物からの抽出試料の高感度な検出方
法を提供しうる。 次に実施例にてこの発明をさらに詳しく説明す
る。 実施例 ゾルバツクスODS（15cm×4.6mmi.d.）のカラム
を用い、移動相として種々の容量比のプロパノー
ルを含む0.02モルリン酸二水素カリウム（PH2.5）
（０：10〜３：７）の1.0ml／分の流速でペプチド
含有試料を分離させた。この溶出液を160℃の恒
温槽中に置いたステンレスチユーブ（20ｍ×0.8
mmｉ・ｄ・）に1.2モル水酸化ナトリウム溶液を
流速0.6ml／分で送液しながら通じ、さらにテフ
ロンチユーブ（４ｍ×0.25mmｉ・ｄ・）に通して
室温まで冷却した。これにOPA試薬（Anal・
Biochem.93423（′79）に記載の方法に従つて調製
した。ただしPHは8.0、Brijは使用しなかつた）
を1.1ml／分の流速で送液し、螢光検出器FLD―
１（島津製作所製）で定量した。対照として加水
分解チユーブを通さないペプチド含有試料の螢光
検出を行い比較した。 第１図は加水分解後螢光させた場合のペプチド
のクロマトグラムＡと加水分解せずに発螢光させ
た場合のペプチドのクロマトグラムＢを示したも
のである。クロマトグラムから、加水分解させる
ことによつて分離されたペプチドの螢光感度が非
常に高くなつている。 表１は各種ペプチドの発螢光率を示したもので
加水分解を行つた場合と行なわなかつた場合との
比を計算したものである。この発明によるOPA
感度はジペプチド（及びトリペプチド）では数倍
から数十倍増大したことが理解される。 【表】
るペプチドの分析方法に関する。 Ｏ―フタルアルデヒド（以下OPAと略する）
は一級アミノ基に対する極めて優れたポストラベ
ル用螢光試薬であるが、アミノ酸の連鎖すなわち
ペプチド鎖の増大に伴い螢光強度は減少する欠点
を有する。たとえばトリペプチドやテトラペプチ
ドの長さになると従来法では螢光感度の低下やと
きに全くみられなくなる場合もある。 この点を鑑み、この発明はOPAによる検出感
度の向上を計るために、種々のペプチドを分離後
ペプチド鎖の切断、OPAによる発螢光反応を組
み合せた方法を提供するものである。すなわちペ
プチド含有試料を高速液体クロマトグラフイに付
し、得られるペプチド含有溶離液にアルカリ溶液
を混合して加熱加水分解し、次いで冷却後得られ
反応液をＯ―フタルアルデヒド溶液で発螢光さ
せ、この螢光を検出することを特徴とするペプチ
ドの検出方法を提供する。この発明において逆相
クロマトグラフイ用カラムとはシリカゲル粒子に
オクタデシル基を化学結合させたもの（ODS充
填剤）等をクロマトグラフ管に充填したカラムを
いう。この逆相用カラムを使用してペプチドを分
離するにはメタノール、アセトニトリル等の有機
溶媒と、少量の酸、アルカリ、あるいは塩類を含
みPHを調整された水溶液との混合溶液が移動相と
して使用されるが、とりわけ有機溶媒としてプロ
パノール、PHを調整した水溶液としてりん酸塩溶
液との混合液を移動相として使用することが望ま
しい。 この発明に使用されるアルカリ溶液とは一般的
にペプチド結合を開裂しうるアルカリ水溶液であ
り、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
等の水溶液が挙げられる。この水溶液中のアルカ
リの濃度は普通１〜２規定でよく、ペプチド含有
溶離液との反応時間は６〜８分、加熱温度は140
〜160℃が適当である。適当な設定温度の恒温槽
中においたチユーブを通す方法が便利である。 この発明で使用するOPA溶液とはAnal
Biochem93，423（′79）に記載の方法で調製した
ものでよく、その組成は１にホウ酸50ｇを加
え、50％水酸化ナトリウム溶液を加えてPH８とし
（約40ml）、脱気後メルカプトエタノール２mlと
OPA50mg（10mlのメタノール溶液）を加える。
従つてOPA濃度は約0.05％である。 この発明の別な態様としてペプチド分析装置を
提供し、その一実施例を第１図に示す。このペプ
チド分析装置１は、ペプチド含有試料のペプチド
成分を分離してその溶離液を流出する高速液体ク
ロマトグラフ部２、アルカリ溶液をポンプで混入
するアルカリ混入部７、アルカリ加水分解反応を
加熱下に行う反応部１０、冷却チユーブ１３、冷
却した反応液にOPAを加えて発光させる試液混
合部１４及び螢光検出器１７をこの順に連設して
なるもので、この操作は通常のポストラベル法と
大差なく簡便である利点をも有する。 高速液体クロマトグラフ部２は移動相槽３、移
動相送液ポンプ４、試料導入装置５及び分離カラ
ム６から構成されており、溶離液を流出する。ア
ルカリ混合部で、アルカリ溶液槽８からポンプ９
によつてアルカリを約0.6ml／分の流量で、前記
溶離液に混入する。反応部１０はステンレスチユ
ーブ恒温槽からなり、ステンレスチユーブを約
140〜160℃に恒温された槽内に設置し、このチユ
ーブを通過する間に、溶離液中のペプチドは加水
分解される。加熱された反応液を冷却チユーブ１
３を通して室温まで冷却する。OPA試液混入部
１４はアルカリ混入部と同様の構成であり、
OPA溶液槽１５とポンプ１６からなり、冷却さ
れた反応液に約１ml／分の流速で混合し、発螢光
させる。この螢光強度を検出器１７で検出する。 この発明によつて本来OPAで検出されないザ
ルコシルペプチドやプロリルペプチド等も高感度
に検出されるばかりかUVや螢光等で検出できる
基をもたないペプチドやアミドに広く利用できる
ものと期待される。従つて生化学上重要な標的で
あるペプチド含有試料、たとえばヒト血漿、尿、
組織又は天然物からの抽出試料の高感度な検出方
法を提供しうる。 次に実施例にてこの発明をさらに詳しく説明す
る。 実施例 ゾルバツクスODS（15cm×4.6mmi.d.）のカラム
を用い、移動相として種々の容量比のプロパノー
ルを含む0.02モルリン酸二水素カリウム（PH2.5）
（０：10〜３：７）の1.0ml／分の流速でペプチド
含有試料を分離させた。この溶出液を160℃の恒
温槽中に置いたステンレスチユーブ（20ｍ×0.8
mmｉ・ｄ・）に1.2モル水酸化ナトリウム溶液を
流速0.6ml／分で送液しながら通じ、さらにテフ
ロンチユーブ（４ｍ×0.25mmｉ・ｄ・）に通して
室温まで冷却した。これにOPA試薬（Anal・
Biochem.93423（′79）に記載の方法に従つて調製
した。ただしPHは8.0、Brijは使用しなかつた）
を1.1ml／分の流速で送液し、螢光検出器FLD―
１（島津製作所製）で定量した。対照として加水
分解チユーブを通さないペプチド含有試料の螢光
検出を行い比較した。 第１図は加水分解後螢光させた場合のペプチド
のクロマトグラムＡと加水分解せずに発螢光させ
た場合のペプチドのクロマトグラムＢを示したも
のである。クロマトグラムから、加水分解させる
ことによつて分離されたペプチドの螢光感度が非
常に高くなつている。 表１は各種ペプチドの発螢光率を示したもので
加水分解を行つた場合と行なわなかつた場合との
比を計算したものである。この発明によるOPA
感度はジペプチド（及びトリペプチド）では数倍
から数十倍増大したことが理解される。 【表】
第１図はペプチド分析装置の構成説明図、第２
図はOPAによるペプチドの螢光クロマトグラム
で、Ａはペプチドを予め加水分解して発螢光させ
た場合、Ｂは加水分解せずに発螢光させた場合の
クロマトグラムである。 ２…高速液体クロマトグラフ部、７…アルカリ
混入部、１０…反応部、１４…OPA混入部、１
７…螢光検出器。
図はOPAによるペプチドの螢光クロマトグラム
で、Ａはペプチドを予め加水分解して発螢光させ
た場合、Ｂは加水分解せずに発螢光させた場合の
クロマトグラムである。 ２…高速液体クロマトグラフ部、７…アルカリ
混入部、１０…反応部、１４…OPA混入部、１
７…螢光検出器。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ペプチド含有試料を逆相クロマトグラフイ用
カラムを備えた高速液体クロマトグラフに付し、
得られるペプチド含有溶離液に約１〜２規定のア
ルカリ溶液を混合し約140〜160℃で約６〜８分間
加水分解し、得られる反応液をＯ―フタルアルデ
ヒド試薬で発蛍光させ、この蛍光を検出すること
を特徴とするペプチドの分析方法。 ２ 加水分解反応が恒温槽中においたチユーブ中
で行われることを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7183282A JPS58189555A (ja) | 1982-04-28 | 1982-04-28 | ペプチドの分析方法と装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7183282A JPS58189555A (ja) | 1982-04-28 | 1982-04-28 | ペプチドの分析方法と装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58189555A JPS58189555A (ja) | 1983-11-05 |
| JPH0248862B2 true JPH0248862B2 (ja) | 1990-10-26 |
Family
ID=13471908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7183282A Granted JPS58189555A (ja) | 1982-04-28 | 1982-04-28 | ペプチドの分析方法と装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58189555A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996030756A1 (fr) * | 1995-03-29 | 1996-10-03 | Sapporo Breweries Limited | PROCEDE DE DETERMINATION DU β-GLUCANE |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6082967A (ja) * | 1983-10-14 | 1985-05-11 | Shimadzu Corp | アミノ酸分析方法及び装置 |
| JPH03140863A (ja) * | 1989-10-26 | 1991-06-14 | Kao Corp | スフィンゴ脂質又はアミド結合を有する化合物の検出方法及び装置 |
| JPH0737971B2 (ja) * | 1989-12-27 | 1995-04-26 | 株式会社島津製作所 | アミノ化合物の分析方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5721115B2 (ja) * | 1974-10-21 | 1982-05-04 |
-
1982
- 1982-04-28 JP JP7183282A patent/JPS58189555A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996030756A1 (fr) * | 1995-03-29 | 1996-10-03 | Sapporo Breweries Limited | PROCEDE DE DETERMINATION DU β-GLUCANE |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58189555A (ja) | 1983-11-05 |
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