JPH02500326A - ヒトｂ親リンパ性ウイルス（ｈｂｌｖ）の分子クローニング及びクローン類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＢ親すンパ性ウィルス（ＨＢ　Ｌ　Ｖ）の分子クローニング及びクローン類 ヒトＢ親すンパ性ウィルス（Ｈｕｍａｎ　Ｂ　Ｌｙａ＋ｐｈｏｔｒｏｐｉｃＶ１ ｒｕｓ　）　（ＨＢ　Ｌ　Ｖ）と称される新しいＤＮＡウィルスが、リンパ増殖 性障害を有する患者の血液白血球から単離されている。このウィルスは形態学的 には、下記に示すようにウィルス類のヘルペス族、ＨＢＬＶに属するものである が、このウィルスは従来特性化されていない。

ＨＢＬＶ！ｔＡＩＤｓおよび非−ＡＩＤＳ患者ニオケル、ある悪性に伴うもので あるがしかしＡＩＤＳの病原体であるヒトＴ−細胞親リンパ性ウィルスタイプＩ ｆｆ（ＨＢＬｖ−ｍ）とは明確に異なるものである。ＨＢＬＶは大きい二本鎖Ｄ ＮＡゲノムを含み、Ｂ細胞を選択的に感染するのに対し、ＨＢＬＶ−Ｉｌｌは一 本鎖ＲＮＡゲノムを含み、Ｔ細胞に対して選択的に感染し、および細胞溶解性で ある。

ＨＢＬＶウィルスのヌクレオキャプシドは１６２個のキーヤブソメアと２０面体 対称であり、−脂質膜内にエンベロープされている。ウィルスエンベロープの外 表面は短いスパイクで覆われている。エンベロープされたピリオンの直径は約１ ８０ｎｉであり、ヌクレオキャプシドは直径が約１００ｎｏである。キャプシド とエンベロープの間の空間３０〜４０ｎｍは非晶質物質で満たされている。ヌク レオタンパク質芯即ちヌクレオイドは直径が約６５ｎαであり、随時、桿状或い は非対称となる。

−次細胞或いは帯血液細胞の感染は、感染後４〜１０日後に特徴的大細胞を生成 する。これらの細胞は小さい白血球の直径の２〜４倍であり、培養液中約１週間 後に細胞病原性および細胞溶解性変化を示す。これらの細胞の核はしばしば高度 に回旋状であり、顕著な特徴なしに主として真正染色質クロマチンおよび核小体 を含有する。

殆んどの感染細胞により、多数のピリオンが放出される。

発明の詳細な説明 本発明はヒトＢ親すンパ性ウィルス（ＨＢＬＶ）の分子クローンの製造、及び診 断及び治療操作におけるそのクローンの使用である。

新しいヒトＢ親すンパ性ウィルス（ＨＢ　Ｌ　Ｖ）は次の六人の個人の末梢血液 白血球から単離した；即ち、三人の後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連リン パ腫瘍を有するヒトＴ−細胞白血病ウィルス（ＨＢＬＶ−ｍ）血清陽性患者、二 人のアンギオー免疫芽球リンパ節疾患を有するＨＢＬＶ−ＩＩＩ血清陽性患者及 び−人の急性リンパ芽球白血病を有する患者。全ての六つの単離体は抗原及び分 子分析により密接に関連し、又全での六人のウィルス−陽性患者からの血清は各 ウィルス単離体と免疫的に反応する。これに対して、２００名を超えるランダム に選択された健常供与者からの僅かに四つの血清のみが、血清陽性であった。Ｈ ＢＬＶは大きな二本鎖ＤＮＡゲノムを含み、ヘルペスウィルス群のあるものと形 態学的に類似している。ＨＢＬＶは新たに単離されたヒトＢ細胞を感染し、それ はそこで核及び細胞質封入体を含有する特徴的な大きな屈折性の単核或いは三核 細胞の出現を誘発する。しかしながら、ＨＢＬＶは宿主範囲、感染細胞に及ぼす 生物学的影響及び抗原或いはゲノム関連性の欠乏により、あらゆる公知のヒト及 び亜ヒト霊長類ヘルペスウィルス類から区別され得る。

本発明の一つの好ましい実施態様においては、分子クローンｐＺＶＨ１４が培養 液中におけるｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンにより調帯血液リンパ球及 び膵臓細胞の早期ウィルス感染の検出に用いられる。

本発明はウィルスの目標細胞中に遺伝子を組換えＤＮＡウィルスベクター系とし て導入することができるものと思われる。

ＨＢＬＶウィルスの超構造的特徴並びにその形態形成は、このウィルスをヘルペ スウィルス族に置くが・・・この族の如何なる公知のものとも類似性及び相違点 を有する。

免疫電子顕微鏡研究は、ウィルスを単離した患者はこのウィルスのウィルスエン ベロープ及び内部成分の両者に対し゛て極めて特異的な抗体を作ることを示して いる。免疫学的、分子的、生物学的、及び宿主範囲研究は、ＨＢＬＶウィルスが 従来説明されていないことを示す。

感染血液試料からの単核細胞の培養液は一次細胞或いは帯波細胞での培養後４〜 １０日で相当数の特徴的な大細胞を発達する。電子顕微鏡分析はＨＢＬＶウィル ス粒子は大細胞中に存在するが、小リンパ球中には不存在であることを示す。感 染細胞は小リンパ球の直径の２〜４倍であり、如何なる初期の細胞変性変化を示 さない。しかしながら、培養１週間後に、細胞変性及び細胞溶解性変化が容易に 観察される。特に、感染細胞の核はしばしば高度に回旋されており、クロマチン は主として真正染色質であり、顕著な特徴なしに核小体を含んだ。細胞質は、か なり大きいゴルジ（Ｇｏｌｇｉ　）装置、異なった大きさの小胞、粗い細胞質内 細胞の突起した配列及び豊富なミドフンドリアを示した。これらの細胞の一般的 外観はリンパ起源の高度に多形の増殖芽球のそれである。

外部細胞ウィルスの特異的免疫標識化は予備吸収された患者の血清及びヤギ中で 産出されたヒトガンマグロブリンに対する抗血清を用いて超構造的レベルで生じ 、フェルチン或いはベルオーキシダーゼを用いて標識化される。

殆んどの感染細胞により多数のピリオンが放出され、細胞の表面に緊密なプラス ターとして出現する。実質的に全てのとりオンは、それらの周辺において標識化 されている。ある場合には、標識はピリオン中に侵入し、ピリオンのあるものの エンベロープが無傷ではなく、又、患者の血清のあるものはウィルスの内部成分 並びにウィルスエンベロープに対する抗体を含むことを示している。

本発明のＨＢＬＶウィルスは、具体的な開示においてより詳細に説明されるよう に、ヒト血液帯細胞をＨＢＬＶで感染させることにより、増殖される。

寄託の陳述 本発明の主題物、分子クローンｐＺＶＨ１４はメリーランド州、ロックビルのア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣＮｏ、４０２４７とし て寄託され、本出願の許可後、３０年間或いはその様な寄託に対する最終の要請 後５年間、或いは特許の有効期間の内最長の期間維持される。寄託物は、寄託期 間内に培養物が突然具するか或いは成育不能となった場合には、取換えられる。

図面の説明 図面は、ヒトＢ親すンパ性ウィルスゲノムＤＮＡのサザーンプロット分析である 。

有用性の陳述 本発明の分子クローンはＨＢＬＶで感染された宿主細胞とのｉｎ　５ｉｔｕハイ ブリダイゼーシヨンを行なうことかできる。従って、このクローンはＨＢＬＶ− 感染細胞の゛ための診断プローブとして、並びに血液試料中のウィルス抗原或い は抗体の検出のために（ウィルス核酸を用いる免疫蛍光アッセイ或いは他の如何 なる抗原或いは抗体のアッセイを用いて）有用である。分子クローンｐＺＶＨ１ ４は又培養におけるｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンにより成帯血液リン パ球及び膵臓細胞の早期ウィルス感染の検出においても用いられる。

本発明は又、ウィルスの目標細胞中に遺伝子を組換えＤＮＡウィルスベクター系 として導入することもできる。

発明の詳細な説明 一般的に、ヒトＢ親すンパ性ウィルス（ＨＢ　Ｌ　Ｖ）ゲノムの一つのクローニ ング方法は、−次細胞或いは帯血液細胞をＨＢＬＶウィルスで感染後に、未一体 化ウィルスＤＮＡを単離することを含むものである。この未一体化ウィルスＤＮ Ａを次いでラムダファージライブラリー中でクローン化し、ウィルスｃＤＮＡを 用いてスクリーニングする。

゛−感染−次細胞及び培養末梢帯血液細胞は、ＨＢＬＶウィルスを産出し、ヒト 血清におけるウィルス特異的抗原及び抗体を検出するために用いられる。免疫学 的アッセイのための主たる産出体として役立つ。感染細胞の培養物を増殖及び取 得後、新たに感染された細胞から低分子量ＤＮＡを抽出する。これにより未一体 化ウィルスＤＮＡが生成される。ｃＤＮＡライブラリーをＨＢＬＶｃＤＮＡを用 いて形成する。このｃＤＮＡを次いで未一体化ウィルスＤＮＡを測定するための プローブとして用いる。次いで、本発明のＨＢＬＶゲノムを含有する未一体化線 状ＤＮＡ　（プロウィルスＤＮＡ）が得られる。このＤＮＡを次いで適当なプラ スミド中で消化して、クローンｐＺＶＨ１４を形成する。

上記方法の二つの要素は良く知られた組換えＤＮＡ操作、即ちＤＮＡライブラリ ー及びｃＤＮＡプローブである。このライブラリーは、感染された一次或いは末 梢血液細胞から全ＤＮＡを取出し、ＤＮＡを適当な制限酵素で断片に切断し、こ れらの断片を放射標識化ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズさせ、これらの断片 をプラスミドベクターに連結し、及び次いで組換えＤＮＡを適当な宿主中に導入 することにより形成される。

このｃＤＮＡプローブは二重帯ＨＢＬＶ　ｍＲＮＡから作られるＨＢＬＶ　ｃＤ ＮＡプローブである。。短オリゴーｄＴ鎖をｍＲＮＡ鎖のポリーＡ尾部にノ＼イ ブリダーイズさせる。このオリゴ−ｄＴ上セグメント、ｍＲＮＡを相補的ＤＮＡ 鎖の合成のための鋳型として用いる逆転写酵素の作用のためのプライマーとして の役割を果す。

得られたｃＤＮＡは末端がヘアピンループとなる。一度ｍＲＮＡ鎖がＮａＯＨて の処理により分解されると、ヘアピンループは対形成されたＤＮＡ鎖を完結する ＤＮＡポリメラーゼｌのためのプライマーとなる。このループを次いでＳ１ヌク レアーゼにより切断して二本鎖ｃＤＮＡ分子を生成する。次いで、この二本鎖ｃ ＤＮＡにＤＮＡリガーゼを用いてリンカ−を添加する。リンカ−を制限酵素で切 断開放し、このｃＤＮＡを同一酵素により切断された適当なプラスミド中に挿入 する。その結果、ｃＤＮＡ−含有組換えプラスミドが得られる。

例５に示す如く、ＨＢＬＶゲノムの分子クローンｐＺＶＨ１４はＴ７　ＲＮＡポ リメラーゼを用いる放射標識化ＲＮＡ、Ｓ−標識化ｄＧＴＰ、及び未標識化リボ トリホスフェートのための鋳型として有用である。

本発明の好ましい実施態様において、ＨＢＬＶ感染済感染成帯血液細胞上澄液を ２０％グリセロールクッション上に重層し、ベックマン５Ｗ４１０−ター中にお いて４℃で２５．０００ｒｐ１１において３時間遠心分離することによりベレッ ト化される。このベレットをＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭ、　Ｔｒｉｓ−ＣＩ、ｐＨ ９，１００ｍＭＮａＣｌ　：　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に懸濁させ、ＰＣｌ３（フ ェノール：クロロポルム：イソアミルアルコール；５０ｍＭ、、Ｔｒｉｓ−ＣＩ 、ｐＨ９：　：１００：１００：１：１０：　：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ）で抽出後、ク ロロホルム：イソアミルアルコール（２４：ｌ：：ｖ：ｖ）で抽出する。

豊化ウィルスＤＮＡを２容の９５％エタノールを添加することにより沈澱させる 。ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ブルースフリブベクター（ベクター・クロ ーニング・システムズ・カリフォルニア州から市販）中にクローン化する。標識 化豊化ＤＮＡでスクリーニング後に得られる幾つかのクローンについて、感染ヒ ト調帯血液細胞ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションの特異性を、感染細胞に 対する１ｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンにより検査した。ＨＢＬＶクロー ンＺＶＨ１４のペレット化ウィルスからのＤＮＡの特異的ハイブリダイゼーショ ンをＨｉｎｄｕ（第１図、パネルＡ）及びＥｃｏＲＩ（第１図、パネルＢ）で消 化した。細胞外ウィルスをレーン１に示し、ウィルス感染ヒト調帯血液細胞をレ ーン２に示し、及びＡＩＤＳ患者の皮膚から単離した陰性対照ＤＮＡをレーン３ に示した。これらのアッセイにおいて陽性であったクローンＺＶＨ１４は未感染 対照体にはハイブリダイズしかなかった。レーン２に示された感染細胞ＤＮＡは ヒト調帯血液細胞における数ラウンドの細胞なしのウィルス伝播後に単離された 。

例 皿上　上記の如く得られた精製ウィルスから抽出された核酸から得られた幾つか のＤＮＡクローンの特異性を調べ、その他のＤＮＡウィルスと比較した。これら の研究のだめに９．　０ＫｂＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有するｐＺＶＨ１４と称さ れる一つのＨＢＬＶクローンを用いた。サザーンプロット分析は精製ウィルス及 びＨＢＬＶ−感染ヒト帯血液細胞の両者からのＤＮＡのＨｉｎｄＩ［［及びＥｃ ｏ　ＲＩ消化物中にウィルス特異性ＤＮＡの存在を示した。同一プローブを用い てのｉｎ　５ｉｔｕハイブリダ、イゼーション実験も、又、これらの配列が感染 細胞に限定されていることを確認した。

皿ｌ　ヒトＢ親すンパ性ウィルスクローンｐＺＨＶ１４は下記の如く制限酵素マ ツピングされた：びウィルスＤＮＡ調剤中においてＥｃｏ　ＲＩを用いてｐＺＶ Ｈ１４インサートにより検出されるウィルス断片を示す）。

％Ｊ　３　ＨＳ　Ｖ−１、ＣＭＶ、及びＥＢｖ（それぞれヘルペス・シンプレッ クス・ウィルス・タイプ１、サイトメガロウィルス、及びエプスタインバーウィ ルス）に特異的な分子プローブを用いてＨＢＬＶと比較した。各ウィルスプロー ブがその相同核酸に特異的にハイブリダイズしたのに対し、ＨＢＬＶはこれらの 形質転換ヒトＤＮＡウィルスとは明らかに区別された。更に、ＨＢＬＶゲノムの 大きさは蔗糖勾配精製ウィルスＤＮＡの分析によりめられた１１０Ｋｂ一対の最 小の複雑さを含むことが示された。このゲノムの大きさ並びにその他の特徴も又 、アデノウィルス、ポリオマウィルス、パポバウィルス、及びパビロマウィルス 群のＤＮＡウィルスからＨＢＬＶを区別するものである。

ヘルペスウィルス類のあるものと同様な形態学的及びその他の性質にも拘らず、 ＨＢＬＶは新しいヒトＤＮＡウィルスであるように思われる。それはその他のウ ィルスから生物学的性質及び免疫学的及びゲノム的相同性の欠乏により区別され 得る。ＨＢＬＶはＣＭＶ、ＨＳＶ。

ＨＶＳ、及びＨＶＡと同様にｉｎ　ｖｉｔｒｏで高度に細胞溶解性であるが、し かしこれらのウィルス類或いはＥＢＶよりもより狭い宿主範囲を有し、Ｂ−細胞 のサブセットに限定される。

ｆ！ＩＪ４Ｍｔ帯血液リンパ球をＡＩＤＳ患者の血清（細胞）と共に共培養した 。調帯血液培養物中には特徴的な大きい屈折性細胞が出現した。培養液中で６日 後、細胞をペレット化し、上澄液を２０％グリセロール上に重層し、遠心分離器 （ベックマン５Ｗ４１或いは５Ｗ２８）中で２５．０００〜Ｂ０，０００ｒｐａ ＋で３時間回転させた。

ペレットは細胞残骸及びウィルス粒子を含有した。ペレットのフェノール抽出は 多量のウィルス核酸を生成した。

この核酸調剤から得られた二本鎖ＤＮＡクローンＺＶＨ１４をサザーンプロット 実験及びｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシツン実験におけるウィルスの特異的 ハイブリダイゼーション検出のために用いた。

剋５　ＨＢ　Ｌ　Ｖ−感染ヒト帯血液細胞のｉｎ　５ｔｔｕハイブリダイゼーシ ヨン。具体的な開示において説明した。

３５ｓ−標識化ＲＮＡプローブを用いて実験を行なったＨＢＬＶ’ｒ’／ム（７ ）り０−ンｐＺＶＨ１４をＴ７　ＲＮＡを用いる放射標識ＲＮＡ、３５ｓ−標識 化ｄＧＴＰ、及び未標識リボトリホスフェートのための鋳型として用いた。

細胞当り１個未満の粒子が未感染陰性対照培養液中に見られた。感染培養液の特 徴的な大きい屈折性細胞は標識化の程度が大きく、豊富なウィルスメツセージの 発現を示した。

国際調査報告

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受理Ｎｏ．４０２４７に対 応するヒトＢ親リンパ性ウィルスクローンｐＺＶＨ１４。
2. ２．ウィルスＤＮＡがクローニングベクター中にクローン化されるウィルスのゲ ノム配列のクローニング方法において、ヒトＢ親リンパ性ウィルスからのウィル スＤＮＡ配列をクローニングすることを特徴とする改良方法。
3. ３．該ウィルスＤＮＡが９．０Ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片である請求項２ に記載の方法。
4. ４．サザーンブロット分析により検査することを特徴とする９．ＯＸｂＨｉｎｄ ＩＩＩ断片を含有するヒトＢ親リンパ性ウィルスのＤＮＡクローンの試験方法。
5. ５．下記制限酵素地図を有するヒトＢ親リンパ性ウィルスクローン： ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここに、Ｂ＝ＢａｍＨｌ；Ｅ＝ＥｃｏＲ１；Ｘｈ＝Ｘｈｏｌ；Ｈ＝ＨｉｎｄＩ ＩＩ；Ｐ＝Ｐｓｔｌ、及び■は感染細胞及びウィルスＤＮＡ調剤中においてＥｃ ｏ　ＲＩを用いてｐＺＶＨ１４インサートにより検出されるウィルス断片を示す ）。