JPH02500331A - リンパ球増幅の検出 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 リンパ球増幅の検出 発明の背景 本発明は一般的には免疫系の細胞に関し、さらに特定すればリンパ球のクローン 増幅に関する。

高等動物は、生体に侵入する外来性物質、または抗原を認識し、それに対して応 答する役割を有する免疫系の存在によって特徴づけられる。これらの機能は、２ 種類の型、Ｂリンパ球またはＢ−細胞およびＴリンパ球またはＴ−細胞として存 在するリンパ球と呼ばれる細胞によって行われる。抗原によって活性化された場 合、Ｂ−細胞は分化し、外来性物質を認識しそれに結合する抗体、または免疫グ ロブリンを分泌する。活性化された「−細胞は、特定のＢ−細胞の援助および抗 原を除去する反応の開始を含めた様々な機能を実行する。

Ｂ−細胞およびＴ−細胞はいずれも、それぞれに特定の抗原に対し高度な特異性 を示す。各日−細胞は、そのペプチド鎖のアミノ酸配列によって識別され、きわ めて限られた一連の抗原にしか結合できない単−同種抗体種を産生する。Ｔ−１ １１胞は、その表面に位置し、■細胞レセプターまたはＴＣＰと呼ばれ、同じく 限られた一連の抗原を認識しそれに結合する抗体様分子構造から、その特異性が 誘導される。

哺乳類動物は通常、特異性の異なる１００．０００および１００，０００．００ ０のリンパ球を有し、全体としてきわめて広範囲の抗原に対して応答できる。ヒ ト末梢面のリンパ球は大部分、非分裂性である。しかしながら、成熟、抗原−反 応性Ｔ−細胞およびＢ−細胞は周期的にクローン増幅を受けるので、一部は分裂 性であり、その結果、特定の抗原に対する特異性を有する細胞が反復分裂し、多 数の同一細胞またはクローンを与える。リンパ球のクローン増幅は、特定の抗原 または他の刺激に応答して起こることがある。抗原性刺激は、外因性刺激たとえ ば感染剤もしくは臓器移植から、また内因性刺激たとえば自己免疫疾患における 組織抗原もしくは癌における新生抗原から誘導される。免疫学的に反応性の細胞 を多数発生することにより、このクローン増幅は、感染に対する抵抗もしくは腫 瘍の拒絶を促進して宿主に有利である場合もあれば、また、自己免疫疾患や臓器 移植の拒絶を生じて宿主に事実上有害な場合もある。リンパ腫たとえば白血病で もクローン増幅が起こり、悪性リンパ球が分裂をくり返す。

リンパ球はその独特の抗原特異性を、それぞれの１涯の早い時期に、胸腺での分 化に際して取得する。抗体およびＴＣＰは多数のペプチド鎖、すなわち抗体では 重鎮および軽鎖、ＴＣＰではアルファ、ベータ、ガンマまたはミュー鎖から構成 され、これらはすべて相当する遺伝子によってコードされる。これらの各遺伝子 内には、すンパ球のいわゆる可変部（Ｖ）、不変１　（Ｃ）　、多様部をコード する関連ヌクレオチド配列が多重に存在し、これらのＤＮＡ領域は各細胞内で別 個に再配列されてＣおよびＶ、ＤおよびＪ領域の特定の組合せを与え、成熟、反 応性Ｔ−およびＢ−細胞に認められる抗原特異的レセプターの独自性が付与され る。各遺伝子は細胞内で独立に再配列され、特異的抗原反応性細胞の著しい多様 性が可能になる。これは、Ｔ　ＣＰ遺伝子ＤＮＡ制限フラグメントのパターン° における同様の多様性によって明らかである。■領域のコピーが２５〜５０個あ り、他の領域それぞれのコピーが数個ずつあれば、数百万に及び独自の再配列が 可能になる。したがって、同じ特異性を有する２個の細胞は、多分、単一の共通 の母細胞から誘導されたと考えてよい。いったん再配列されると、その遺伝子パ ターンはその成熟リンパ球の生涯を通じて、またそのクローン子孫のすべてに残 存する。これらの細胞は多年にわたって生存すると考えられるので、このパター ンは個体の生涯を通じて持続する。

リンパ球のｉｎ　ｖｉｖｏにおけるクローン増幅が確認できれば、診断および治 療に著しい利益をもたらすことが考えられる。たとえば、前癌状態の早期診断は 、有効な治療の実行に決定的である場合が多い。クローン増幅の同定は、著しく 多数のクローン細胞を生じていても、独特な抗原感受性細胞がもつ可能性のある 著しい多様性のためにとくに困難である。厖大なりローン増幅も抗原感受性細胞 の巨大な能力範囲の中にあっては、干し草の山の中の１本の針にすぎない。能動 的に分裂しているかまたは最近ｉｎ　ｖｉｖｏで分裂して成熟Ｔ−細胞が減少し ているリンパ球に選択的に注意を向ける方法があれば、このような同定はきわめ て用意になるはずである。本発明はこの要求を満足し、それに関連した利益を提 供するものである。

１虱立１１ 本発明は、哺乳類動物におけるリンパ球のクローン増幅現象の存在を検知するた めの、独特かつ鋭敏な方法を提供するものである。体細胞突然変異を示すリンパ 球に焦点をあてることにより、本発明の方法は、ＴＣＰの類似性でＷ１識される クローン増幅を受けたリンパ球細胞集団の検出を促進する。

本発明の方法によれば、リンパ球のサンプルをクローン化し、リンパ球における 以前の突然変異現象の指示剤に応答したクローン化細胞集団を提供する。以前の 突然変異現象が指示されたこれらのクローン化細胞集団をついで別個に生育させ 、突然変異クローン化細！ａ集団を単離する。特異的抗原レセプターをコードす る核酸領域の再配列を決定し、比較する。この再配列の類似性は、共通の母細胞 に由来するリンパ球のクローン増幅を指示するものである。クローン増幅の決定 はある種の疾患の診断に有用である。

以上から、本発明がリンパ球のクローン増幅を検出するための新規な方法を提供 するものであることは明らかであろう。本発明の他の特徴および利点は、本発明 の原理を例によって説明するさらに詳細な説明から明らかになろう。

発明の詳細な説明 本発明はリンパ球のクローン増幅を検出する方法を提供する。単一のリンパ球母 細胞に由来する細胞の反復分裂により多数の同一細胞またはクローンを生じる。

これらのリンパ球クローンが共通のは細胞に由来することは、それらの特異的抗 原レセプター、Ｂ−細胞中の抗体およびＴ−細胞中のＴＣＰの共通性によって実 証される。

ＴＣＲペプチドのアミノ酸配列は、たとえば、特定の限られた一連の抗原に特異 的になる。各個体には、１０６から１０７ともいわれるきわめて多様なＴＣＲタ イプがある。ＴＣＲ特異性の多様性は、ＴＣＲペプチドをコードする核酸の領域 の再配列によって生じる。ＴＣＲペプチドをコードする遺伝子は、Ｖ、Ｃ，Ｏお よびＪと呼ばれる領域を含むいくつかの異なる領域からなる。胸腺での突然変異 の間に、各Ｔ−リンパ球は単一のＴＣＲ分子種のみを合成するように分化される 。この説明によって限定されるものではないが、Ｖ、Ｃ，ＤＩ５よびＪ領域のＤ ＮＡの転座または再配列が、■−リンパ球を単一のＴＣＰの発現にかかわらせる 機構であると考えられる。

同様に、各Ｂ−細胞は、単一の同種抗体種または免疫グロブリン分子をもっばら 産生ずる。この特異性は、突然変異の間に、免疫グロブリンペプチドをコードす るＤＮＡの様々の領域の再配列によって生じるものと考えられる。本発明の目的 においては、■−細胞およびＢ−細胞におけるこのような再配置現象は、本明細 で用いられる意味での「突然変異」とは考えない。

体細胞遺伝子の突然変異は、ペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列の 変化である場合に起こる。このような変化には、１つのヌクレオチドの他のヌク レオチドによるＨ換、１個もしくは２個以上のヌクレオチドの挿入もしくは欠失 が包含され、その結果、コードされたペプチドの相当するアミノ酸配列に変化を 生じる。体ｍ胞遺伝子の突然変異は、一部の例外を除き、ゲノムの遺伝子内にラ ンダムに分布するので、全く確率論的に分布する。しかしながら、突然変異は、 不正確なりＮＡ複製によって生じることが多いので、有糸分裂またはｌＩｍ分裂 中の細胞に最も起こりやすい。したがって、り０−ン増幅の場合のようば反復分 裂を続けている細胞種族では体細胞遺伝子突然変異の蓄積の確率が高い。

ある種の体細胞遺伝子の突然変異はリンパ球で起こり、検出できる。たとえば、 ６−チオグアニン抵抗性（ＴＧ’　）Ｔ−リンパ球は、ヒボキサンチン−グアニ ンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）の遺伝変異は２つの方法の一 方、短期オートラジオグラフィー検定およびもつと正確なりローン検定によって 検出できる。両者とも現在、ヒトでの変異原性の試験に用いられている方法であ る。クローン検定は、ｉｎ　ｖｉｖｏ誘導１且ニュ突然変異細胞の単離、および 大集団へのｉｎ　ＶｉｔｒＯ増殖ついで完全な特性づけを行う。このようなヒト 体細胞突然変異細胞は、選択がないためＴＧ’表現型を維持し、ＨＰＰＴ活性を 欠くことが明らかにされている。さらにｉｎ　ｖｉｖｏ誘導突然変異体は、ＣＤ ＮＡ１且Ｌニブローブを用いたサザンプロットで明らかにされるｈｐｒｔ構造道 伝子の変化を示す。いずれの検定も、ｈｐｒｔ−で示される突然変異を示す細胞 は６−チオグアニンの存在下にも生存可能であるが、ｈＤｒｔ”表現型を有する 野生型細胞は死滅するという事実に基づいている。

ＴＣＲ遺伝子の再配列パターンも、野生型とクローン検定で単離された１且Ｌユ 突然変異Ｔ−細胞クローンについて明らかにすることができる。可能なＴＣＲパ ターンの厖大な範囲に基づいて期待されるように、独立に単゛離された野生型ク ローンの大部分は、α、βまたはγＴＣＲ遺伝子プローブによってサザンプロッ トを行った場合、独特のＴＣＲ遺伝子再配列パターンを示す。しかしながら、自 然発生ｈｐｒｔ−突然変異コロニー中のＴＣＲ遺伝子再配列パターンを研究する と、様々な程度のクローン増幅がｉｎ　ｖｉｖｏで、突然変異体を生じるクロー ンについて頻繁に起こることを示している。同一のＴＣＰ遺伝子再配列パターン を示すクローンの複製体単随によって明らかにされるこのクローン増幅現象は、 ｈＤｒｔ−の個体では容易に２１Ｅされる。、「正常」自然突然変異の度数値は 約５Ｘ１０−６であるのに対し、Ｔ−細胞突然変異の度数は５０Ｘ１０−６以上 である。ヒトＴ−リンパ球におけるｉｎ　ｖｉｖｏ自然体細胞突然変寅は、ｉｎ 　ｖｉｖｏで能動的に分裂しているＴ−リンパ球または最近ｉｎ　ｖｉｖｏで分 裂を受けたＴ−リンパ球で好んで起こるようである。いずれの場合も、突然変異 は、クローン増幅を受けているクローンに由来する細胞を選び出すようにみえる 。全ｉｎ　ｖｉｖｏ　Ｔ−リンパ球集団の代表であるべきサンプルから得られた リンパ球の突然変異分画のみに注意を向けることによって、本発明の方法は、ｉ ｎ　ｖｉｖ。

でクローン増幅を受けている細胞の小さな少数集団区分のより有効な同定を可能 にするものである。サンプリングされたリンパ球の、体細胞突然変異を示す分画 をまず単離することにより、クローン増幅を示す分画区分がより容易に検出でき る。臨床的あるいは他の情報と国連づければ、宿主に対しある種の生物学的また は病理学的重要性を有する抗原刺激に応答してＩｌｌ胞増幅を行っている細胞の 同定に、この方法は有効である。

リンパ球におけるｈｐｒｔ−遺伝子突然変異を明らかにするクローン検定は、し たがって、ｉｎ　ｖｉｖｏクローン増幅を受けたクローンの典型である細胞の同 定、研究および製造方法を提供する。クローン検定で細胞を単離し、大集団に増 殖させ、特性を調べる。特性の検討には、適当なＴ−細胞レセプター遺伝子ブ０ −ブを用いたサザンプロットによるＤＮＡの研究が包含させる。本発明は、この ような、哺乳類動物におけるリンパ球クローン増幅を決定するための方法を提供 する。

本発明の方法は、たとえば体液サンプルから得られる、個体からの成熟リンパ球 サンプルを必要とする。この体液としては、静脈穿刺によって得られる全白が好 ましい。

抗凝固剤たとえばヘパリンを血液サンプルと合して凝血を防止する。別法として 、成熟リンパ球を含有する他の適当な体液、たとえば関節滑液、真水もしくは腹 水、を髄液または他の体液も使用できる。リンパ球は体液から、好ましくはＦｉ ｃｏｌ　Ｉ−Ｈｙｐａ（ｌｕｅ密度勾配遠心法によって分離されるが、他の適当 な方法も使用できる。このようにして得られたリンパ球を、好ましくは等偏食塩 水で洗浄し、組織培養メジウムたとえばＲＰＭＩ−１６４０または他の適当なメ ジウムに移す。メジウムには栄ｒｃｍたとえば血清を含有させるのが好ましい。

さらに、細胞の活性化または始動のために、マイトジェンのような剤を添加して もよい。フイトフエマグルチニン（ＰＨＡ）はプライミング剤として好ましい。

他の適当なプライミング剤にはレクチンたとえばコンカナバリン−Ａ（Ｃｏｎ− Ａ）またはブタ草マイトジェン（ＰＷＭ）がある。これらのプライミング剤はそ れぞれ、リンパ球の別の集団区分を活性化する。抗−Ｔ３抗体を用いてＴ−リン パ球を始動または活性化することもできる。リンパ球は２４〜４８時間、プライ ミングまたは活性化するのが好ましい。この間隔は細胞分裂がｉｎ　ＶｉｔｒＯ で起こらないように選択される。この段階での細胞分裂は、新しい突然変異現象 が起こるのに好都合な機会を与えるので望ましくない。

リンパ球を培養メジウムから取り出し、洗浄し、適当なメジウム中に適当な濃度 で置換する。プライミングされた細胞を次に、マイクロタイタープレートのウェ ルに制限希釈での微小容硲を播種する。各ウェルの全播種は、適当なメジウム、 栄側り成長因子たとえば「−細胞にはＴ−細胞成長因子（ＴＣＧＦ）または８− 細胞にはＢ−細胞成長因子（ＢＣＧＦ）を包含する。これらの制限希釈播種では 、各ウェルあたり０．５．１または２個の細胞が含有されるように選択し、プレ ート中のこれらのウェルは、クローン化効率の一定に用いられる。

遺伝子座における突然変異゛の存在を決定するために用いられる他のプレートの ウェルは、上述の播種メジウム中にさらに指示剤を加え、ウェルあたり細胞が１ 〜２×１０４個になるように播種する。たとえば、細胞が野生型ｈＤｒｔ＋対立 遺伝子または突然変異ｈｐｒｔ一対立遺伝子のいずれをもつかを決定するために は、６−チオグアニンを使用できる。野生型対立遺伝子をもつ細胞は６−チオグ アニンの存在下には生存できないが、突然変異遺伝子型を有する細胞は生存でき る。ｈｐｒｔ一対立遺伝子は天然の細胞集団ではきわめて稀である。したがって この指示剤の存在下における細胞コロニーの成長は、細胞系内に以前、突然変異 現象が起こっていることを示す。しかしながら、ｈｐｒｔ遺伝子座における突然 変異を検出できる８−アゾグアニン、およびｈｐｒｔ遺伝子座における突然変異 を同じく検出できる６−メルカプトプリンを含めて、他の指示剤を使用すること もできる。

８−アザグアニンは６−チオグアニンに比べて緊縮選択が低いので、得られる突 然変異細胞の頻度および特徴は変わってくる。そのほか使用できる指示剤として は、それぞれジフテリア抵抗性、ウアバイン抵抗性およびＨＬ　Ａ遺伝子におけ る突然変異を検出するシフリア毒素、ウアバイン、抗−ＨＬＡ抗体および補体を 挙げることがを与えればよく、必ずしも特定の遺伝子型の細胞を死滅させる必要 はない。たとえば、指示剤は、ある種の遺伝子型の［ＩＷｌに強力に結合し、細 胞ンーターによる分離を可能にしてもよい。遺伝子型の他の識別機構は本技術分 野の熟練者には明らかであろう。すなわち、２セツトのプレートを準備する。き わめて少数の細胞を含有し指示剤を含まないプレートと、指示剤の存在下に多数 の細胞を含むプレートである。後者のプレートが突然変異分画の決定に用いられ る。この制限希釈播種の技術的細部は様々に変えることができる。たとえば、丸 底マイクロタイターウェルが好んで用いられるが、平底ウェルの方が良好な自然 の成長を示す場合がある。様々な支持細胞を使用できるが、Ｘ線照射Ｂ−リンパ 芽球細胞が好ましい。

突然変異分画を決定するために指示例を含ｈ゛するウェルに播種する細胞の数は 予想される突然変異頻度によって変化する。たとえば、高いあるいは上昇した突 然変異頻度が期待されるならば、ウェルあたり１０４個未満、たとえば１０３個 が播種される。各９６個のウェルを為する重複プレート、たとえば３個もしくは それ以上のプレートに、クローニング効率を測定するため、細胞を低密度で播種 する。実用的な範囲でできる限り多数のプレートに指示剤の存在下、細胞を高い 密度で播種する。

プレートを標準条件下にインキュベーター中に置き、ウェルのクローンの成長を 観察する。通常、ウェルの検査は７．１０６よび１４日目に行う。生育する細胞 を含む各プレート中のウェル数を数え、プレートあたりの陽性ウェルの割合をめ る。この割合は単純に、ウェルの総数に対する生育クローンを含む陽性ウェルの 数である。

クローニング効率は、ｐｏ−ｅ（ｘはウェル中に最初に置かれ生育可能であった 細胞の平均数である）と定義されるポアソン分布のＰｏ１ｌによって決定される 。

基本的には、各実験について２つのクローニング効率が計算される。クローニン グ効率は、指示剤なしで生育する細胞と、指示剤の存在下に播種され生育する細 胞の両者について決定することができる。前者はり０−ニング効率（ＧＥ）と呼 ばれ、後者は突然変異分画（ＭＦ）と呼ばれる。突然変異個体の割合はついで、 ＭＦ／ＧＥとして計算される。

生育細胞を順次大きな培養容器に移してクローン化細胞の大集団を発生させる。

クローン化大集団が発生したならば、所望に従いその特性を調べることができる 。たとえば、ｍ胞は、標準的なよく知られた方法により、細胞表面マーカーたと えばＴ　、Ｔ　、Ｔ　および１３等で表現型を分類できる。野生型および突然変 異クローンで１４　Ｐ　ＲＴの酵素活性を調べ、突然変異体に期待される酵素活 性の実際の喪失を明らかにすることができる。これらのクローンについて染色体 解析を実施できる。クローンからのＤＮＡを本技術分野の熟練者にはよく知られ ているサザンプロット法で解析する。要約すれば、クローンからのＤＮＡを制限 酵素で消化し、フラグメントをたとえば電気泳動で分離する。ついでフラグメン トのパターンを決定するために、分離されたフラグメントを適当な遺伝子プロー ブと接触させる。この目的では、多くの制限酵素および様々なプローブを使用で きる。たとえば、ｃＤＮＡ　ｈｏｒｔ３ｍ伝子プローブを用いてサザンプロット を精査し、小ｈｐｒｔ遺伝子内に生じた構造変化を明らかにすることができる。

突然変異を検出し、その性質を明らかにするためには、核酸配列決定またはＲＮ 　Ａ　ａｓｅ切断のような他の方法も利用できる。これらの方法はすべて、遺伝 子突然変異で起こった変化および変化のスペクトルを明らかにすることが可能で ある。

野生型および突然変異クローンからのサザンプロット上におけるＤＮＡ＠限フラ グメントのパターンも、Ｔ−細胞レセプターをコードする核酸の領域の再配置を 決定するために解析される。α、βまたはγＴＣｒ（遺伝子のいずれかのプロー ブを使用できる。ＴＣＲ道伝了再配列パターンのサザンプロット解析が、野生型 またはｈｐｒｔ突然変異クローンの独立のクローン性の決定に使用される。好ま しくはβ遺伝子プローブが、またγ遺伝子プローブが用いられる。Ｔ−細胞レセ プター遺伝子再配列の完全な研究には、クローン化細胞ＤＮＡを２種またはそれ 以上の制限酵素で制限されるか、または２個またはそれ以上のＴＣＲ遺伝子で解 析されなければならない。２種、３種またはそれ以上のクローンが特定のＴＣＰ 遺伝子再配列パターンを共有しているかどうかを決定するためにとくに重要であ る。特定のクローンがｉｎ　ｖｉｖｏでクローン増幅を受けた細胞に由来するか どうかを決定するのは、数個の突然変異クローン集団内での類似パターンの共有 だからである。与えられた個体から同一のＴＣＲ遺伝子再配列パターンを共有す る多くの突然変異クローンを同定することは、その個体内で増幅を受けたＴ−細 胞クローンを指示するのに役立つ。

本発明の方法はＢ−細胞に使用するために修飾できる。

この場合も、リンパ球サンプルを上述のようにして採取し、分離する。しかしな がら、この場合は、クローニング前に細胞を活性化または刺激するためのプライ ミングまたは活性化に抗−ＩＱＭまたは抗−〇’３Ｂ−レセプターが必要である 。クローニングはＢ−ａ胞成長因子の存在下に行うのが好ましい。Ｂ−１８１１ １についてのｈｐｒｔ−遺伝子突然変異の検定は、■−細胞について本明細書に 記述したのと同様にして実施される。解析される最配列パターンは免疫グロブリ ンペプチドをコードする核ＳａＷの再配列である。クローン増幅は上述したと類 似の方法で確認される。

本発明の他の特徴および利点は、本発明の原理を実例によって例示した以下のざ らに詳細な例から明らかにする。

例工 ■−リンパ球のクローニング Ｔ−細胞リンパ球は、０″Ｎｅ１ｌｌらの方法（Ｈｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、２　 ：　８７．１９８７）に従ってクローン化した。この文献は参考として本明細書 に導入する。

ヒト末梢自サンプルを静脈穿刺によって採取し、全血１ｄあたり１０単位のウシ 肺ヘパリン（υｐｊｏｈｎ、　Ｗａｓｈｉｎｏ−ｔｏｎ　、　Ｄ、Ｃ，）でヘパ リン化した。このサンプルをＦｉｃｏｌｌ（鋤１．４００．０００＞　−ＨＶｐ ａＱｕｅ　Ｈ、９０％（比重−１、０７７）　［ＦｉｃｏｌｌはＳｉｇｍａ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、Ｎｏ　；　Ｈｙｐａｑｕｅは５ｔｅｒｌｉｎｅ　Ｄｒｕｇ　（Ｗｉ ｎｔｈｒｏｐ）、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹから入手］含有、滅菌５０Ｍ！遠心 管（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｃｏ、、　Ｃｏｒｎｉｎｇ、　ＮＹ）中に全 面対Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　２　：　１の割合で加えた。サンプル含有 遠心管を２０℃において３０分間、６００ｘＧで遠心分離した。

血漿−Ｆｉｃｏｌｌ−）１ｙｐａ４ｕｅ界面に白色のバンドを形成する単核細胞 分画を新たなチューブに移し、リンＭＷ１ｍ食塩溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄した 。使用した「基礎メジウム」は、２５８８　Ｈｅｐｅｓｌｌ衝液、２１ＨＬ−グ ルタミン、１゜Ｏ単位／〆ペニシリンおよび１００ｍμｇ／Ｉ１１ストレプトマ イシン含有ＲＰＭ１１８００ｒ、２ａｌｔ炭ｍ水素ナトリウム添加前にｐＨを７ ．２に調整した。すべてのリンパ球培養は２０％栄養メジウムＨＬ　−１（Ｖｅ ｎｔｒｅｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｐｏｒｔｌａｎｄ、　ＨＥ）含有基礎 メジウム中で行った。凍結保存に際しては、細胞を２０％ウシ胎仔血清（Ｆ　Ｂ 　Ｓ　：　Ｈｙｃｌｏｎｅ、　５ａｌｔ　Ｌａｋｅ　Ｃ１ｔｙ、　ＬＩＴ　）お よび７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭｓｏ：ＶｗＲ３ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、 　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　ＮＹ　）を添加した基礎メジウム中、−１℃／分で凍 結し、液体窒素下に保存した。

Ｔ−リンパ球は次のようにしてクローン化した。新鮮な、１人の受給者からの甲 核細胞を最初、１５％ＦＢＳおよび１ｍμｇ／ＩｔＩ！フィトヘマグルチニン− Ｍ　（ＰＨＡ−Ｍ　：　Ｗｅｌｌｃｏｇ＋ｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｇｒ ｅｅｎｓｖｉｌｌｅ、　ＳＣ）を含有する生育メジウム１Ｍ！あたり１Ｘ１０６ １１核細胞の割合で培養して、プライミングした。ついで細胞懸濁液を１０分間 ５００ｘｇで遠心分離した。

細胞をマイクロタイタープレートに２セット播種した。

クローニング効率の測定には、１〜２細胞／ウエルに相当する細胞懸濁液のサン プル容量を、９６−ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに置いた。１セ ツトのウェルには、１５％ＦＢＳおよび後述のようにして決定した至適違のＴＣ ＧＦを含む生育メジウム、ならびに５×１０３個の支持細胞を、最終容１０．２ ｄ／ウェルになるように加えた。使用した支持細胞は、ＴＫ６と呼ばれ、１０％ ウマｔｈ清を含有し抗生物質を含まないメジウムＲＰＭ１１６４０中で生育させ たＷｌ−Ｌ２リンパ芽球ａＩ！！！の、マイコプラズマを含まないｈｐｒ　を− 誘導体とした。丁に６細胞は予め、ドライアイス上、コバルト６０照射源により １５０ｒａｄ／分、総照Ｍ　ｍ　１０　ｋｒａｄｔ’照射した。平行セットプレ ートは、１０ｍμＭ６−チオグアニン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｎｏ）および５×１０３支持細胞を加えた生育メジウ ム０．２ｄ中、細胞約１０４個／ウェルをｍ種した。６−チオグアニン存在下に おける生存。すなわち、選択メジウム中で生存する細胞はｈｐｒｔ遺伝子座に突 然変異現像があったもので、ＴＧ　突然変買体と命名される。

ついでプレートを、メジウムを変えないで１４日間インキユベートシ、コロニー を生育させた。ウェルは、倒立位相差顕ａｍでコロニーの生育をモニタリングし た。

各プレートの細胞生育は、７．１０および１４日目に、２人の試験者が評価した 。

使用したＴＣＧＦは、はぼＩｎ０ｔ＋ｙｅらの記載（ＳＣａｎｄ、Ｊ。

１■ｕｎｏｌ、１２　：　１４９．１９８０）に従って調製したＰＨＡ刺激ヒト 末梢血リンパ球からの条件メジウムとした。略述すれば、数人の個体からの照射 （１０００ｒａｃｌ）ヒト単核細胞を、１％ＦＢＳ、１ｍμｇ／Ｉ１１フィトヘ マグルチニン（ＰＩ−ＩＡ　；　ＨＡ　−１７、ＷｅｌｌＣＯｌｌｅＤｉａｇｎ ｏｓｔｉｃｓ、Ｇｒｅｅｎｖｉｌｌｅ、　ＳＣ）　オ、Ｊ：　Ｕ　２　Ｘ　１０ ５照射（４０００ｒａｄ　）ＴＫ６細胞／ｄを含有するメジウムＲＰＭ１１６４ ０中、密度１〜２×１０　細胞／１ｌＩｌ！テ播種した。４２時間インキュベー ションしたのち、上澄液を捕集し、合し、濾過し、−３０℃で凍結した。■−細 胞の生育のための至適団を明らかにするためのＴＣＧＦ活性の試験には３種の異 なる検定を採用した。採用した第１の検定は、成長因子依存性Ｔ−リンパ“球に よるトリチウム化チミジノ（Ｈ−ｄＴ）の取り込みを測定する短期培養であった 。この検定に用いたＴ−リンパ球はｉｎ　ＶｉｔｒＯで少なくとも１４日間生育 させて、も早ＰＨＡに応答しなかった。ｍ胞は、指定量のＴＣＧＦを含むメジウ ム２００ｍμｌ中核マイクロタイターウェル（９６−ウェル、平底）あたり２× １０　個を播種し、２４時間インキュベーションし、ｍμＣ＋　Ｉ−１−ｄ　Ｔ を加え（比活性−６Ｃｉ／ｇａｏｌ）、さらに２４時間インキコベと液体シンチ レーションスペクトロメーターを用いて測定した。第２の検定は以下に記載する ように、１ｍμ９／ｄのＰＨＡと４０１１８１ｉ１インキユベーシヨンし、つい で種々の爵のＴＣＧＦ中１〜２個の細胞を丸底ウェルに置いて実施した。第３の 検定はクローニング検定に際して播種したと同一の細胞での大酒培養生育であっ た。細胞は、２ｘ１０５照射ＴＫ６細胞および種々の量のＴＣＧＦを含有するメ ジウム２Ｉｄ中、１Ｘ１０４細胞／ウエルの割合で２−０２ウエルに播種した。

ｍ飽数はコールタ−カウンターを用いて測定した。ＴＣＧＦ活性の指標としては 最大細胞数（通常７〜９日間のインキュベーションで得られる）を使用した。Ｔ ＣＧＦは、試験によって測定される最大細胞生育とクローニングを生じるように 、通常２０％ＴＣＧＦを用いた。また、市販のＴＣＧＦ　（ヒトＴ−細胞ポリク ローン、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、、Ｃａｍｂｒ ｉｄｇｅ、ＨＡ）を５または１０％ＴＣＧＦで使用することもできる。

非選択メジウム中でのクローニング効率（ＣＥ）および選択メジウム中での突然 変異分画（ＭＦまたＴＧ’　）はポアソン式、ｐｏ＝ｅ　（ｘはウェルあたりの クローン化可能細胞の平均数）によって計算される。各ウェルに添加されたＩＩ 胞数でＸを割った値がそれぞれ、クローニング効率（ＣＥ）および突然変異分画 （ＭＦ）と定義される。突然変異分画をクローニング効率（ＣＥ）で割ると得ら れる。

クローンからの細胞をｉｎ　ＶｉｔｒＯで生育させ、増大させてＴ−リンパ球コ ロニーの特性を調べた。至適恒の７ＣＧＦと２．５Ｘ１０　照射′［Ｋ６細胞を １ｃｍ２または表面積あたり含有する改良ＲＰＭ１１６４０メジウムを用いた。

マイクロタイター皿の陽性ウェル中のコロニーは１０〜１４日間のインキュベー ション後、１Ｘ１０〜２×１０５の細胞を含有した。これらのｍ胞をメジウム２ ａ！（選択コロニーについてはさらに１０ｓＨＭ６−チオグアニン）を含む２３ クールに移し、ウェルの表面が７０〜８０％集密になるまで、通常は３〜６日、 インキュベーションした。ついでＩＢ胞を取り、５００ｘＧで１０分間遠心分離 してａ胞を含まないメジウムを除去し、４ａｅのメジウム中、１ｄあたり約１× １０５個の細胞濃度で３個の４１２クールに移した。を記条件下で、集団の倍化 時間は１８〜２２時間であった。細胞は、細胞密度１〜１．５Ｘ１０６細胞／Ｉ ｄに達したとき、１×１０３細胞／ｄにおいて４日間隔で継代培養した。使用し たＴＣＲβプローブは１）ＢＲ３２２のＰｓｔ１部位にクローニングされたヌク レオチド１ｏｏ〜８７０を含有するＪｕｒｋａｔ　２　（Ｙａｎａｇｉら：Ｎａ ｔｕｒｅ、　３０８　：　１４５．１９８４）からの挿入体である。使用したＴ γプローブは、Ｊγ１を含有するゲノムクローンである、１）８６０の７００ｐ ｂ　Ｈｉ　ｎＤＩ［１−ＥｃｏＲｉ挿入体テアル（Ｌｅｆｒａｎｃら：Ｎａｔｕ ｒｅ、３１９：４２０，１９８６）。

且Ｉ Ｔ−細胞突然変異体の特性 Ｔ−細胞がクローン化され、ＴＧ　細胞が突然変異体であることを明らかにする ため、一部の生育クローンについて、Ｔ−１８胞表面マーカーとＨＰＲ丁活性を 調べた。

ｈｐｒｔ遺伝子変化の性質を突然変異体で、サザンブロット解析により決定した 。

各クローンの細胞上の表面抗原を、Ｔ　ＳＴ、１、Ｔ４およびＴｇ　（Ｏｒｔｈ ｏ　Ｄｉａ＋ＪｎＯ３ｔｉＣ３，Ｒａｒｉｔａｎ、　ＮＪ）に対するマウスモノ クローナル抗体を用い、ついでヤギ抗−マウスフルオレセインーイソチオシアネ ート標識抗体（Ｈｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、Ｍ ｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　ＣＡ　）によって検出し、特性を調べた。細胞は 蛍光顕微鏡により、表面マーカーＴ　、Ｔ　、Ｔ　およびＴ８について評価した 。

ＨＰＰＴ酵素活性はＤｅｂａｒｓ　＆　Ｈｅ１ｄの方法（Ｈｕｍａｎｇｅｎｅｔ ｉｋ、　９６　：　８７．１９７２）を次のように改良して検定した。Ｔ−リン パ球（約２Ｘ１０６）は０．１５８　ＫＣＪで２回洗浄し、１００ｍμｉ〜２０ ０ｍμｌの冷０．０１８　Ｔｒ　ｉ　ｓｏ衝液、Ｅ）Ｈ７，４中に懸濁し、超音 波で破壊した。マイクロフユージ中で３０秒間遠心分離したのち、希釈上澄液を 、０．１Ｈ丁ｒｉｓ！１ｉｉｌｌｉｐＨ８，４，５Ｘ１０　ＨＭＱＳＯ４，１， ９Ｘ１０−３Ｈヒポキサンチン、１０−４８　”Ｃ−ヒボキサンチン５ｍｕＣ１ ／ｄ、１０−２８５−ホスホリボシル１−ビロリン酸塩および蒸留水含有反応混 合物に添加した。３７℃の水浴中で２時間インキュベーションしたのち４Ｈギ酸 で反応を停止した。ヒポキサンチン（Ｈ）のイノシン（Ｉ）およびイノシン酸（ ＩＭＦ）への酵素的変換は、反応混合物の５％Ｎａ２ＨＰＯ４中上昇クロマトグ ラフイー後１ａｔｉａｎ　３Ｍ濾紙スポットの液体シンチレーションカウンティ ングにより測定した。変換は次式により計算した。

細胞抽出液のタンパク質含量はＬＯＷｒｙ　ＦＪ！の改良法によって測定した。

例工の方法によって誘導されたクローン化リンパ球集団突然変異体について、ｈ Ｄｒｔ遺伝子Ｔ−細胞レセプターの構造の変化を決定するために、ｈＤｒｔをコ ードするＤＮＡを単離し、特性を調べた。サザンプロット解析をＡｌｂｅｒｔｉ ｎｉｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　３１６　：　３６９．１９８５）に従って実 施した。この文献は参考として、本明細書に導入する。ゲノムＤＮＡは、選択さ れた野生型およびＴＧ　突然変異体コロニーから単離された。

ＤＮＡの単離には、各コロニーからの１５〜２０Ｘ１０　個の凍結細胞を洗浄し 、１Ｍ！！のＴｌｏＥｌ　（１０１ＨＴｒｉｓ、１＋ＨＥＤＴＡ　ｐＨ８，Ｏ） に再懸濁した。

４ｄ１７）ＴＥＮＳ（２５ｓＨＴｒｉｓ−ＨＣｊ　ｐＨ８，１００ｓＨＮａＣＪ 、１０ｇ＋ＨＥＤＴＡ　、　０．６％５ＤＳ）を加え、この溶液を６５℃に１５ 分間加熱した。プロテナーゼＫ　（０，５ｑ）を加え、ｕ合物を一夜、３７℃で インキュベーションした。さらに０．１４ηのプロテナ−ゼＫを加え、消化を３ Ｒ問続けた。得られた溶液を２回フェノール抽出し、ついで３回クロロホルム／ イソアミルアルコール（２４：１）抽出し、エタノール中に沈殿させ、Ｔ１゜Ｅ 、に再懸濁した。サザンプロットには、レーンあたり約７．５ｍＬｔｇのゲノム ＤＮＡを制限酵素（Ｈｉ　ｎＤＩＩ［または別法としてＢａｍＨＩ）で消化し、 ＴＡＥ１！ｉ液（４０ｓＨＴｒｉＳ−酢Ｗ１塩、２ｍＭＥＤＴＡ）中０．７％ア ガロースゲル上で分画し、ニトロセルロース濾紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　 ５ｃｈｕｅｌｌ）に移し、４０ｄ！の５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ，５Ｘデ ンハルト溶液、５０ｓＨＴｒｉＳ　ｐＨ７，５中、２５０ｍμグ／ｌの剪断、変 性サケ精子Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｇ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、。

Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｎｏ）とともに、４７℃でインキュベーションした。この 材料を、２０Ｍ１の５０％ホルムアミド、５×ｓｓｃ、ｉｘデンハルト溶液、２ ０１ＨＴｒｉｓ　ｐＨ７，５，１０％デキストラン硫酸中、２５０η／ｄ剪断、 変性サケ精子ＤＮＡおよび１．０〜１．５ｘ１０６ｃｐｍ／−のｇ識オリゴヌク レオチドプローブで、４２℃において一夜ハイプリダイゼーションした。

２５８．９５９３．１９８３）、完全なｈｐｒｔ：＋−ド配列を含む９４７ｂｐ 　ｃＤＮＡプローブである。一部のプロットでは、全プローブのＭ　ｓ　ｐ　Ｉ 〜ｐｓｔエサブフラグメントをバックグランドを減少させるために使用した（Ｍ ｓＰＩは大部分のエキソン１を含むプローブの５′末端を除去する）。

ハイブリダイゼーション後、ｈＤｒｔプロットを２×ＳＳＣ，０，５％ＳＤＳ中 、室温で１５分間、ついで２ＸＳＳＣ，０，１９％ＳＤＳ中５７℃で３０分間、 最後にＯ，ｌＸ５ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中５７℃で３０分間２回、洗浄した。

ＴＣＲベータおよびガンマプロットの洗浄は、２ＸＳＳＣ，０，２％ＳＤＳ中５ 分間３回、２ＸＳＳＣ，０，２％中６５℃で３０分間４回とした。

オートラジオグラフィーは一８０℃で、にｏｄａｋＸＡＲ−５フイルム（にｏｄ ａｋ、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　ＮＹ）およびＤｕｐｏｎｔ　ライティング・プ ラス・スクリーン（Ｅ、　１．　Ｄｕｐｏｎｔ　ｄｅＮｅｇ＋ｏｕｒｓ、　Ｗｉ ｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥ　）を用いて３〜５日間実施した。１且エユ遺伝子の 変化の解釈は、Ｐａｔｅｌら（Ｓｏｎ。

Ｃｅ１１．Ｈｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、、　１０　：　４８３．１９８４）およびｙｏ ｕｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ、　３１０　：　４１２．１９８４）によるエキソンか ら制限フラグメントのアサインメントに基づいて行った。両文献を参考として本 明細書に導入する。

■ Ｔ−１８胞レセプター遺伝子再配Ｊの決定ＴＣＰをコードするＤＮＡ領域の再配 列は、１且工ユ突然変異体細胞の集団について決定した。例■に用いた遺伝子濾 紙をこの目的に再使用した。濾紙の再生には、蒸留水中６５℃で１５分間、２回 洗浄してニトロセルロースからプローブを除去した。ついで１１１Ｍをハイブリ ダイゼーション前の溶液４０ｄに入れ、ざらにハイブリダイゼーションを行うま で冷蔵庫に保存した。

すなわち、濾紙上のＤＮＡは例■に記載したようにして調製したものであった。

■−細胞レセプターをコードするＤＮＡはこのＤＮＡ中に含まれ、アルファ、ベ ータおよびガンマＴＣＲプローブを用い、これらのプローブを代わりに用いるほ かは例■に記載した方法によって解析した。用いたＴＣＲプローブは、ＰｕＯ２ のＥＣｏＲＩ部位にクローン化したＣＤＮＡプローブ、ｐＹ　１　、　４　（Ｙ ａｎａｇｉら：ＰＮＡＳ１８２：３４３０．１９８４）であったが、他のＴＣＲ プローブも同様に使用できる。用いたＴＣＰベータプローブはｐＢＲ３２２のＰ ｓｔＩ部位にクローン化されたヌクレオチド１００〜８７０を含有するＪｕｒｋ ａｔ　２からの挿入体である（　Ｖａｎａｇｉら：Ｎａｔｕｒｅ、　３０８　： 　１４５．１９８４）、用いたＴガンマプローブは、Ｊガンマ１を含むゲノムク ローン、７ｏｏｂｐ　ｌ−１ｉ　ｎＤＩ［ｌ　〜ＥｃｏＲｉ挿入体ｐＨ６０であ る（　Ｌｅｆｒａｎｃら：Ｎａｔｕｒｅ、　３１９　：　４２０．１９８６）。

検討した各種クローンが独立の突然変異現象に由来するかまたは共通の母細胞に おける単一の突然変異現象に由来するかを決定するためには、■−細胞レセプタ ーの遺伝子構造のパターンを比較した。（１）２種の別個の制限酵素による切断 、または（２）別個のプローブとのハイブリダイゼーションから類似のサザンブ ロットが認められた場合は、Ｔ−細胞レセプターは類似し、共通の母細胞におけ る単一の以前の再配列と考えられる。このような類似性はりＯ−ン増幅現象が起 こって子離されたような突然変異体が生じたことを示している。

たとえば、成人女性からの血液サンプルを用いて、上記例工〜■に記載した方法 により、゛ｒ−リンパ球をクローン化し、その特性を調べるのに使用した。得ら れた突然変異度数値は５００ｘ１０６と高かった。これらのサンプルから得られ たＨ　ｉ　ｎＤＩＩＩ消化ＤＮＡよりサザンプロットパターンを得、計５１のＴ Ｇ　突然変異体コロニーについて検討した。しかしながら、これらの５１のＴＧ ’突然変異体コロニー中、４７のコロニーは類似のＴ−細胞レセプターベータ遺 伝子再配列パターンを示し、したがってこの個体でのクローン増幅が明らかにさ れた。

これらの突然変異体コロニーの大サブセットについて、ＴＣＰガンマ遺伝子パタ ーンを検討し、これらのパターンも突然変異体内で類似であった。

検討した突然変異体Ｔ−細胞クローンを有する成人男性からクローン化するリン パ球は、ベータまたはガンマＴＣＲ遺伝子プローブを用いて調べた場合、類似の ＴＣＲ″Ｊ！ｉ伝子再配列バクーンを有していた。３つの突然変異体クローンの 第２の小群はベータおよびガンマ遺伝子プＯ−プを用いて調べた場合、異なるが 関連あるＴＣＲパターンを示し、この個体では少なくとも２つのクローンが増幅 されていたことが示された。

鼠ｙ Ｂ−リンパ球のクローニン ８−リンパ球突然変異体クローンは、例■の方法に従い、これを次のように改変 して得られる。すなわち、細胞は、抗−ＩＱＭ抗体または抗−ｃ’　３Ｂレセプ ター抗体でプライミングする。細胞は、Ｂ−細胞成長因子を加えた生育メジウム 中で生育させる。■ｇＧをコードする核酸の特性を、例■の方法に従い、遺伝子 再配列パターンを同定するため、Ｃ，Ｖ、ＤまたはＪドメインに特異的なプロー ブを用いて調べる。

以上、本発明を、現時点において好ましい態様を参照しながら説明したが、本技 術分野の熟練者によれば、本発明から逸脱することなく様々な改変が可能なこと を理解すべきである。すなわち、本発明は、以下の請求の範囲によってのみ限定 される。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳類動物におけるクローンリンパ球増幅を検出するにあたり、（ａ）上記 哺乳類動物からリンパ球のサンプルを得、（ｂ）そのリンパ球を、リンパ球の遺 伝子座における以前の突然変異現象を指示できる剤の存在下にクローニングして クローン化細胞集団を生成させ、（ｃ）以前に突然変異現象があつたことが指示 されるクローン化細胞集団を選択し、（ｄ）選択されたクローン化細胞集団を別 個に生育させて単離された突然変異クローン化細胞集団を得、（ｅ）この単離さ れた突然変異クローン化細胞集団について、特異的抗原レセプターをコードする 核酸の領域の再配列を決定し、ついで（ｆ）単離された突然変異クローン化細胞 集団中の特異的抗原レセプターをコードする核酸の領域の再配列を比較する各工 程からなり、別個に単離された突然変異体細胞クローンにおける特異的抗原レセ プターをコードする核酸の領域の類似構造の存在を上記哺乳類動物におけるクロ ーンリンパ球増幅を示すものとする方法 ２．哺乳類動物はヒトである請求の範囲第１項の方法 ３．以前の突然変異現象を指示できる剤は、６−チオグアニン、８−アザグアニ ン、６−メルカプトプリン、ジフテリア毒素、ウアパインおよび抗−ＨＬＡ抗体 と補体からなる群より選ばれる請求の範囲第１項の方法。 ４．遺伝子座はｈｐｒｔ、ジフテリア毒性抵抗性、ウアバイン抵抗性およびＨＬ Ａからなる群より選ばれる請求の範囲第１項の方法 ５．ある遺伝子座における以前の突然変異現象を指示できる剤は、その遺伝子座 に突然変異を有する細胞の増殖は許すが、その遺伝子座に野生型対立遺伝子を有 する細胞の増殖は阻止する請求の範囲第１項の方法６．特異的抗原レセプターは Ｔ−細胞レセプターである請求の範囲第１項の方法 ７．特異的抗原レセプターは免疫グロブリンである請求の範囲第２１項の方法 ８．クローニング工程はさらに成長因子を与えることからなる請求の範囲第１項 の方法 ９．決定工程はさらに、特異的抗原レセプターをコードする核酸の領域の再配列 をその核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションに より検出することからなる請求の範囲第１項の方法１０．決定工程はさらに、そ の核酸を制限酵素で消化して制限フラグメントを生成させることからなる請求の 範囲第１項の方法 １１．クローニング工程はさらに、上記リンパ球をプライミング剤とともに与え ることからなる請求の範囲第１項の方法 １２．クローニング工程はさらに、上記リンパ球を支持細胞の存在下にクローニ ングすることからなる請求の範囲第１項の方法 １３．病的異常の存在が疑われる哺乳類動物におけるその病的状態をクローンリ ンパ球増幅によつて診断するにあたり、（ａ）上記哺乳類動物からリンパ球のサ ンプルを得、（ｂ）そのリンパ球を、リンパ球の遺伝子座における以前の突然変 異現象を指示できる剤の存在下にクローニングしてクローン化細胞集団を生成さ せ、（ｃ）以前に突然変異現象があつたことが指示されるクローン化細胞集団を 選択し、（ｄ）選択されたクローン化細胞集団を別個に生育させて単離された突 然変異クローン化細胞集団を得、（ｅ）この単離された突然変異クローン化細胞 集団について、特異的抗原レセプターをコードする核酸の領域の再配列を決定し 、ついで（ｆ）単離された突然変異クローン化細胞集団中の特異的抗原レセプタ ーをコードする核酸の領域の再配列を比較する各工程からなり、別個に単離され た突然変異体細胞クローンにおける特異的抗原レセプターをコードする核酸の領 域の類似構造の存在を上記哺乳動物における病的状態を指示するクローンリンパ 球増幅を示すものとする方法 １４．哺乳頬動物におけるクローンＴ−リンパ球増幅を検出するにあたり、（ａ ）上記哺乳類動物からＴ−リンパ球のサンプルを得、（ｂ）そのＴ−リンパ球を 、リンパ球の遺伝子座にむける以前の突然変異現象を指示できる剤の存在下にク ローニングしてクローン化細胞集団を生成させ、（ｃ）以前に突然変異現象があ つたことが指示されるクローン化細胞集団を選択し、（ｄ）選択されたクローン 化細胞集団を別個に生育させて単離された突然変異クローン化細胞集団を得、（ ｅ）この単離された突然変異クローン化細胞集団について、特異的抗原レセプタ ーをコードする核酸の領域の再配列を決定し、ついで（ｆ）単離された突然変異 クローン化細胞集団中の特異列抗原レセプターをコードする核酸の領域の再配列 を比較する各工程からなり、別個に単離された突然変異体細胞クローンにおける 特異的抗原レセプターをコードする核酸の領域の類似構造の存在を上記哺乳類動 物におけるクローンリンパ球増幅を示すものとする方法発明の詳細な説明