JPH02500361A - 解熱及び抗炎症性ペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 解熱及び抗炎症性ペプチド類 本発明は発熱及び炎症の治療に有用な新規医薬組成物に関する。更に詳しくは、 本発明は解熱及び抗炎症剤として確認されたＡＣＴＨ及びα−メラニン細胞刺激 ホルモン中に含まれるトリペプチド配列に関する。

解熱剤として現在常用されている薬剤としては、サリチレート類及びｐ−アミノ フェノール誘導体の２クラスがある。アセチルサリチル酸（即ち、アスピリン） で特徴付けられるサリチレート類は、最も繁用されている解熱剤である。アスピ リンはサリチレート類及び類似作用をもつ他の薬剤双方の原型であって、これら 薬剤の比較及び評価のための参照標準である。アスピリンの解熱作用は、発熱患 者において通常速効的かつ効果的である。

サリチレート類は、“サーモスタット２を正常温度にリセットするように作用す る。

アスピリンは大半の個人において通常十分に耐えられるものであるけれども、い くつかの毒性副作用がその使用に付随している。サリチレート起因性胃潰瘍形成 及び時には出血が具体的な懸念事である。消化性潰瘍症状（胸やけ、消化不良） の悪化、胃腸出血及びびらん性胃炎はすべてアスピリン服用患者において報告さ れている。

他の一般的副作用としては、耳鳴り及び聴覚低下、酸−塩基バランス及び電解質 パターンの変化、並びに呼吸アルカローシスがある。一般的にこのような副作用 は特に危険というわけではないが、それらは患者の応諾を困難にする傾向がある 。通常解熱及び／又は抗炎症活性のために用いられる他のサリチレート誘導体は 、アスピリンと比べて高い毒性を有することが判明している。

ｐ−アミノフェノール誘導体、アセトアミノフェン及びツェナセチンは、その解 熱及び抗炎症用としてアスピリンの代替物である。アセトアミノフェンは全体的 毒性がやや低く、ツェナセチンよりも通常好ましい。アセトアミノフェンは十分 に耐えられしかもアスピリンの望ましくない作用の多くを欠いているため、それ は“常備家庭解熱剤”として好評を得ていた。しかしながら、この目的における その適合性には疑問がある。即ち、急性的過剰投与時にアセトアミノジエンは致 死的な肝ネクローシスを引き起こしうるからである。しかも、ツェナセチンは急 性毒性として、但し更に一般的には長期過剰投与の結果としてメトヘモグロビン 血症及び溶血性貧血を引き起こす。これらの薬剤は、発熱の治療に関してアスピ リンとほぼ同等の効力を有する。

α−メラニン細胞刺激ホルモン（以下、“ＭＳＨ”と称する）の研究に関する最 近の進展で、このタンパク質が発熱の治療に有効であることを立証した。α−Ｍ ＳＨは、副腎皮質ホルモン（“ＡＣＴＨ”　）由来の１３アミノ酸ペプチドであ る。ＭＳＨ及びＡＣＴＨはいずれも体温を調節するうえで有効な１３アミノ酸配 列を共有している。これらのニューロペプチドは体温の中枢コントロールを含め た中枢媒介プロセスに影響を与えている、という証拠がある。双方のペプチド共 、十分な投与量で末梢又は中枢から投与された場合に、無熱ウサギのコア温度を 低下させる。更に著しく少量の投与量では、正常な温度を変えることなく熱を低 下させる。

α−ＭＳＨは、温度調節を支配する前視床下部及び中隔を含めた脳領域に存在し ている。中隔におけるα−ＭＳＨの濃度は発熱時に上昇し、弓状核中の濃度は同 時に低下する傾向がある。中枢投与α−ＭＳＨ対繁用解熱剤アセトアミノフェン の解熱活性比較研究では、α−ＭＳＨが熱低下に関してアセトアミノフェンより も著しく有効であ、ってしかも熱低下に関してアセトアミノフェンよりも２５０ ０倍以上有効であることを示している。

ＡＣＴＨ以外の内因性物質で熱低下に関しこのような効力を有しているものは知 られていない。

α−ＭＳＨの解熱効力及びこのペプチドが末梢投与された場合であっても熱を低 下させうるという事実は、臨床上重要であろう。ＡＣＴＨはそれが最初に掲載さ れた後直ちに臨床的及び実験的発熱を低下させるために用いられたが、但しこの ペプチドは副腎皮質ステロイド放出も促進し、かつ繰返し投与時にクッシング症 候群を引き起こすことがある。他方、ＡＣＴＨから得られる更に短いα−ＭＳＨ 分子はステロイド放出を促進せず、ウサギ又はヒトに投与された場合に不可逆的 な有害作用は存在しないようである。

ＡＣＴＨ（プロオピオコルチンのアミノ酸１−３９）に関して、その副腎皮質ス テロイド刺激作用のせいでこのタンパク質が炎症の治療に有効であることは以前 から知られていた。しかしながら、副腎皮質刺激活性を示さないα−ＭＳＨ（Ａ ＣＴＨのアミノ酸１−１３）のような更に短いＡＣＴＨ関連ペプチドが抗炎症作 用を有することは示されておらず、ＡＣＴＨのアミノ末端部分に相当する副腎皮 質刺激活性を示さないペプチドのかかる役割について示唆するような根拠は以前 に存在していなかった。

本発明は発熱及び炎症の治療に有用な医薬組成物を提供する。この医薬組成物の 活性成分は、α−ＭＳＨのアミノ酸１１−１３、即ちリシン−プロリン−バリン （“Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ”）に相当するアミノ酸配列を含んだペプチドであ る。その最も一般的な範囲において、本発明はアミノ酸３−１３のペプチドに関 するが、そのペプチドはα−ＭＳＨの場合に相当する配列を有しかつ少なくとも そｇＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖ’ａｌ配列を含んでいる。更に具体的な態様において、 本発明はトリペプチド自体に関する。

好ましくは、トリペプチド自体が好ましくは生物学的に“保護された”形で本発 明に従い最大の効果を発揮するように投与される。トリペプチドがアミノ末端の アシル化及び／又はカルボキシル末端のアミド化により“保護°されている場合 には、得られるトリペプチドは薬理活性を増加させている。同様に、トリペプチ ドが“保護。

又は“非保護°にかかわらず銅イオンと共に同時投与された場合には、更に解熱 活性の増加が観察される。

本発明は治療を要する個体における発熱及び／又は炎症の治療方法を提供するが 、この方法ではトリペプチド配列を含んだペプチドの有効量が発熱個体に投与さ れる。

更に、このようなペプチドは全身性又は局所性双方の炎症の治療に用いられるこ とから、ステロイド及びサリチレート抗炎症剤の有用な代替物である。抗炎症活 性は、解熱作用を証明するための場合とほぼ同等の又はそれ以上の用量で動物に トリペプチドを投与し、治療すべき及びコントロールの動物の炎症侵襲に対する 反応性を試験することにより観察される。したがって、本発明のペプチドは、必 要な患者に選択的な用量で投与された場合に、解熱及び抗炎症剤の双方として使 用される。

本発明の具体的態様において、例えば炎症性膨張及び／又は毛細血管透過性の減 少のような抗炎症活性の発現のために有効なトリペプチド用量は、抗炎症活性用 として受入れられた標準たるヒドロコルチゾンの場合と重量ベースでおおよそ同 じであることが示されている。感受性“皮膚発青°アッセイが、ヒスタミンのよ うな起炎剤の毛細血管透過作用を阻害しうるトリペプチドの能力を調べるために 用いられた。このアッセイにおいて、保護されたＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　）ジ ペプチドは抗ヒスタミン作用を示し、特に保護トリペプチド１．２５μｇ／ｋｇ 体重はどの低い静注投与量で毛細血管透過性に関するヒスタミン媒介増加の抑制 を示した。しかも、伝統的カラゲテン／ラット足浮腫試験において、腹腔内投与 されたトリペプチドは、ヒドロコルチゾンの場合と同等の重量ベースでラット足 のカラゲチン起因性膨張を阻害しつる能力を示した。したがって、このような観 察から、トリペプチドＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌは１〜１０μｇ／ｋｇ体重はどの 低い投与範囲から好ましくは約０．２〜３＋ｇ／ｋｇ／日程度の範囲までで患者 に投与された場合には有効な抗炎症剤である、と結論付けることができる。

第１図：α−ＭＳＨのアミノ酸配列 第２図：ラットにおけるＡｃ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−Ｎｌ２（１００ｍｇ／ ｋｇ）及びヒドロコルチゾン（１００ｖｎｇ／　ｋｇ）により生じる足膨張の阻 害比較。各評点は、対照コントロール足容量の変化と比較した場合の定容量の平 均変化率％である。

本発明の実施に際して用いられたペプチドとしては、リシン−プロリン−バリン 配列がある。このトリペプチド配列は下記特徴を有する。

その天然形において、トリペプチド配列（リシンーブ′ロリンーバリン）はα− メラニン細胞刺激ホルモン（以下“ＭＳＨ“）及びＡＣＴＨのアミノ酸番号１１ −１３である。この発見はＡＣＴＨ（プロオピオコルチンのアミノ酸番号１−２ ４）及びＭＳＨ（ＡＣＴＨ及びプロオビオコルチンのアミノ酸番号１−１３；第 １図参照）のアミノ末端部分の解熱活性を説明しているが、その双方共それらの 構造中に本トリペプチド配列を示している。

したがって、ＭＳＨ及びＡＣＴＨの双方とも解熱性トリペプチドがそこから得ら れる有効な天然源であるが、α−ＭＳＨの場合にはさほど好ましい態様で４いと しても直接使用することができる。

ＡＣＴＨはクッシング症候群を引き起こしつるほど高い副腎皮質刺激作用を有し ていることから、本発明はペプチドが少なくともＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ配列を 含んでいる限り通常α−Ｍ　Ｓ　Ｈ及びそのペプチドに関する。これは、α−Ｍ ＳＨ（ＡＣＴＨのアミノ酸１−１３）がＡＣＴＨの副腎皮質刺激作用を示さずに 、代わって副腎皮質ステロイド中間体を介さないで直接それらの抗炎症作用を発 揮しているらしいという発見に基づいている。

好ましい態様の場合、トリペプチドはＭＳＨから単離することができる。これは 最初にタンパク質分解酵素キモトリプシンによる全体的消化を介してＭＳＨタン パク質を４つの更に小さなペプチドに断片化することにより行われる。消化産物 のペーパー電気泳動では４種の主産物を生じるが、そのうち１つは直接使用可能 なテトラベブチド：グリシン−リシン−プロリン−バリンである。

しかしながら、グリシン残基はトリペプチドを得るために部分的酸加水分解によ って除去してもよい。

本発明のペプチド類は化学的合成によって得ることもできる。これは、適切なア ミノ酸間のペプチド結合形成によって行われる。アミノ酸は酸性（−ＣＯＯＨ） 部分及び弱塩基性（−Ｎｌ２）部分の双方を有する両性分子である。したがって 、ペプチド結合形成（−ＣＯＮＨ−）はカルボキシル官能基に対するアミノ基の 核的攻撃によって行われる。

２つの仮定的アミノ酸Ｘ及び７間でペプチド結合を形成させる場合には、４種の 可能なジペプチドＸ−Ｙ％Ｙ−Ｘ、Ｙ−Ｙ及びＸ−Ｘが得られる。したがって、 このような相互作用から形成される可能性のある構造数を減らすためには、適切 なアミノ酸のアミノ又はカルボキシ末端は“保護された°部分を含む反応を防止 しうるように最初に“保護”されていなければならない。例えば、“Ｃ”が保護 カルボキシ末端を表しかつ“ｎｏが保護アミノ末端を表す場合には、ｃＸ及びＹ ｎの相互作用で１つの構造ｃＸ−Ｙｎのみを生じる。

しかしながら、合成目的の場合に化学的に有用であるためには、保護基は除去可 能でなければならない。一般に、カルボキシ基は−ＣＯＯＨから−ＣｏＯアルキ ル又は−ＣＯＮＨ２へのエステル化又はアミド化によって保護されうる。カルボ キシ末端用に好ましいアルキル基としてはメチル及びベンジル残基があるが、し かしながらエチル、プロピル、ブチル、ｐ−ニトロベンジル又はｐ−メトキシベ ンジル基のような他のアルキル基も利用可能である。

同様に、アミノ末端はアシル化によりアセチル基、ｔ・−ブトキシカルボニル基 、ｔ−アミルオキシカルボニル基、０−ニトロフェニルスルフェニル基、ベンジ ルオキシカルボニル基、ｐ−ニド６ペンジルオキシカルボニル基、トシル又はホ ルミル基のようなカルボキシル基を導入して保護される。

保護基は性質上官能基としても機能しうる。ペプチドのアミノ末端に結合された アセチル基及びカルボキシ末酵素攻撃及び分解に対する“保護２ペプチドの感受 性を低下させる役割があると推測された。したがって、“保護°　トリペプチド はこれらの保護基を有するように合成された。この保護トリペプチドは非保護ト リペプチドよりも高い薬理学的活性を有している。

トリペプチドの様々な異なる薬理作用、即ち抗炎症及び解熱は、許容される薬理 学的アッセイの利用により本発明で立証されている。例えば、解熱作用はインビ ボウサギ発熱アッセイで立証されるが、このアッセイでは保護トリペプチド（ア セチル−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＯ３）が次第に増量されながら発熱物質導 入ウサギに投与された。このアッセイにおいて、非保護トリペプチドの場合には １０μｇ〜１００＋ａｇ／ｋｇ程度の有効用量範囲が観察され、全体的用量依存 的にコントロールよりも約２５〜約７０％程度熱を低下させた。しかも、保護ト リペプチド（ジアセチル−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−ＮＯ３）の場合には重量ベ ースで非保護種の活性よりも約２倍の活性を示した。

トリペプチドの抗炎症作用は、組織膨張（例えば、局所性浮腫）及び毛細血管透 過性を含めた炎症の様々な総合的症状を阻害しうる試験薬の能力を調べうるよう に考案された許容されるインビボアッセイで立証される。

１つのアッセイ、即ち皮膚発青試験によって、トリペプチドが外来性ヒスタミン の効果を遮断するその作用によりヒスタミンの毛細血管透過作用を阻害しうるそ の能力に関して試験された。このアッセイを用いて、本発明者により低量の薬剤 に感受的であることが判明し、即ち保護トリペプチド約１μｇ／ｋｇ程度の低い 投与量で生体染色に対するヒスタミン媒介性血管透過性上昇の低下から測定され るような証明可能な効果を発現することが見出された。

カラゲチン／ラット足浮腫アッセイとして当業界で知られる第二の試験では、本 トリペプチドは周知の抗炎症剤ヒドロコルチゾンの場合にほぼ匹敵する抗炎症作 用を発揮することが示されている。このアッセイにおいて、ラットには最初にコ ントロール（塩水）、トリペプチド又はヒドロコルチゾンのいずれかが等しい腹 腔内用量で投与される。次いで、ラットの足が抗原性物質、通常力ラゲナンで侵 襲され、発生した膨張量が測定され、データが比較される。このようなアッセイ から、はぼ等量の保護トリペプチド（ジアセチル−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｎ Ｏ３）及びヒドロコルチゾンがカラゲナン起因性膨張度の減少に関してほぼ同等 の全般的応答性を示すことが見出された。

前記の及びそれ以外の観察に基づき、保護トリペプチド０．　２〜約３ａ＋ｇ／ ｋＣｇ体重／日程度の投与量で効果的抗炎症作用に関し本発明の効果を発揮する ことが判明している。通常、最大度の抗炎症効果を得るためには、保護トリペプ チド０．３５〜約１．　５＋ｎｇ／ｋｇ体重／日程度の用量を投与することが好 ましいであろう。これらの用量範囲は、トリペプチド及びヒドロコルチゾンがほ ぼ同効力であるという前記観察並びにヒドロコルチゾンの有効用量範囲に関する 当業界の常識から導かれている〔例えば、グツドマンら、１９８５年、治療の薬 理学的基礎。

第７版（Ｇｏｏｄｎａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）、Ｔｈｅ　ＰｈａｒＩＩｌ ａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓ　ｏｆ’　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｅｓ、７ｔｈ 　Ｅｄｉｔｉｏｎ）参照〕。

本発明では、例えば筋肉内又は静脈内のように非経口的にトリペプチドを投与す ることが通常好ましい。しかしながら、その低分子量、膜透過性及び比較的酸安 定的な構造に基づき、本トリペプチドは若干高用量となるが経口投与も可能であ る。この場合には、約０．　２〜約３．５ｍｇ／ｋｇ／日程度の用量で本発明の 効果を得ることができると考えられる。

トリペプチド、好ましくはジアセチル−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＯ３のよう な保護トリペプチドの医薬製剤は、通常薬学上許容される緩衝液、希釈剤、安定 化剤等と共に活性剤を含有している。許容される医薬組成物の製造に際して有用 な様々な薬剤及び添加剤を含めた各種技術のほぼ完全なリストに関しては、参考 のため本明細書に組込まれるレミントンの医薬科学、第１６版、１９８０年、フ ック０パブリツシング社（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ　ｅｄ、、１９８０．Ｍａｅｋ　Ｐｕｂｌｉｓ ｈｉｎｇ　Ｃｏ、）を参照することができる。

好ましい医薬組成物の場合、約１００〜５００ｍｇのジアセチル−Ｌｙｓ−Ｐｒ ｏ−Ｖａｌ−ＮＯ３がほぼ中性のｐＨを保つために薬理学上許容される緩衝液を 含めた無菌等張塩水約１〜７ｃｃ中に分散される。静注投与の場合には、例えば 関節炎、重度アレルギー反応又は炎症過程に伴う様々な他の疾患がある患者に、 （数時間以内“の）時間にわたって緩徐的注入により約０．２〜約３．５ｍｇ／ ｋｇ／日の薬剤を投与することが通常望ましい。注入が実際的でない場合には、 薬剤は好ましくは親油性担体と共に若干高用量で筋注の形で投与される。軽度〜 重度の関節炎症状の治療の場合には、約０．３〜１−、　５　ｍｇ／　ｋｇ／日 、好ましくは約０．５〜約０．６＋ｎｇ／ｋｇ／日程度の非経口的用量が通常勧 められる。しかしながら、重度のアレルギー反応の場合には、約２．５〜約４ｍ ｇ／ｋｇ／日程度の高用量が必要であろう。

多くの変更が本発明のペプチドのアミノ酸配列に関して可能でありかつそれによ ってもなお生物学上機能的な同等の薬理活性を示すタンパク質を得ることができ る、と考えられている。例えば、あるアミノ酸は同様の水治療インデックス（ｈ ｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　１ｎｄｅｘ）を有する他のアミノ酸で代用されてもなお タンパク質の生物学的活性を留めていることは、カイトら、１９８２年、ジャー ナル・オブφモレキュラー・バイオロジー、第１５７巻、第１０５頁（Ｋｙｔｅ 　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉ ｏｌｏｇｙ、１５７：１０５）から判明する。下記表で示されているように、ア ミノ酸はそれらの疎水性及び荷電特性に基づき水治療インデックスが決定されて いる。アミノ酸の相対的水治療特性が得られるタンパク質の二次構造を決定して おり、ひいてはタンパク質とそのレセプターとの相互作用についても決定してい ると考えられる。

本ペプチドの場合には、生物学的機能同等物は類似の水治療値を有するアミノ酸 置換によって得られると考えられている。本明細書で用いられている生物学的機 能同等物とは、生物学的機能同等性に関して機能上同等であるタンパク質として 定義され、かつ生物学的活性に関して機能上同等であるタンパク質として定義さ れる。例えば、イソロイシン及びロイシンは各々＋４．５及び＋３．８の水治療 インデックスを有しており、バリン（＋４．２）の代替可能であって、同様の生 物学的活性を有するタンパク質をなおも得ることができる。一方、尺度上の他端 において、リジン（−３，９）はアルギニン（−４，５）等で代替可能である。

一般に、アミノ酸はかかるアミノ酸が代替アミノ酸として水治療インデックス単 位で約＋／−１以内の水治療値を有している場合にうまく代用することができる 。

アミノ酸　水治療インデックス フェニルアラニン　２．８ システイン／シスチン　２．５ トリプトフアン　−０．９ グルタミン酸　−３，５ グルタミン　−３，５ アスパラギン酸　−３，５ アルギニン　−４．５ 下記例は、好ましいトリペプチド及び様々な“保護”種の製造、並びにその活性 を証明するうえで許容される様々なインビボアッセイにおけるトリペプチドの用 法を説明するために本発明者により実施された実験について示している。これら の例は説明のためのみであって、各種バリエーションがそれに照らしてかつ当業 界の技術レベルに照らして可能であることは明らかであろう。例えば、異なる配 列又はより長いもしくは短いペプチジル鎖長を有するペプチドが望まれる場合、 通常下記のような操作が用いられることは当業者にとって明らかであろう。

したがって、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ配列（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌの生物学的 機能同等物）が望ましい場合には、ジベンジルオキシカルボニル化アルギニン（ “Ｚ−Ａｒｇ”）が“Ｚ−Ｌｙｓ　”の代わりに用いられるべきであることは明 らかであろう。更に、例えばＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌが望まれる場合に は、“Ｚ−Ｇｌｙ”が出発試薬として用いられるべきであって、Ｌｚｙｓ　、　 Ｐｒｏ及びＶａｌ残基を各々順次加える合成工程が前記のように用いられること は明らかであろう。様々なペプチドを得るためのこれらの及び他のすべての修正 法は周知であって、当業者にとり明らかであろう。

例Ｉ：Ｌ−リシン−し一プロリンーＬ−バリンの化学的トリペプチドは、下記の ようにカリフォルニア州トランス（Ｔｏｒｒａｎｅｅ）のバチエム社（Ｂａｅｈ ｅｍ、　Ｉｎｃ、）により外注合成された： １、２−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＯＭｅの製造塩化メチレン２００ｍ１中ジベンジルオ キシカルボニル化リジン（“Ｚ−Ｌｙｓ　”　）　５０ｍｍｏｌ　（２０，７ｇ ）をジメチルホルムアミド１００ｍ１中プロリンメチルエステル（Ｐｒｏ−ＯＭ ｅ）　５０ｍ１ｏｌ　（８，３ｇ）と混合した。混合物を円錐フラスコに加え、 攪拌下−５℃に冷却した。Ｎ−メチルモルホリン５０畦ｏｌ　（５’、５ｍ１） を加え、しかる後塩化メチレン２０ｍ１中ジシクロヘキシルカルボジイミド１０ ．３ｇを加え、反応混合物を一夜攪拌した。次いで、混合物から尿素を濾去し、 濾液を真空下で濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、重炭酸ナトリウム液、水 、ＩＮ塩酸及び水で連続的に洗浄した。酢酸エチルを真空下で除去し、油状生成 物を精製せずにケン化した。

２、−ＯＭｅカルボキシ末端“保護°基の除去前記実験からの油状生成物をメタ ノール（２００ｍｌ）に溶解し、２Ｎ水酸化ナトリウム（２５ｍｌ）で１時間処 理した。メタノールを減圧下で除去し、残渣を水に溶解し、６Ｎ塩酸で酸性化し た。生成物を酢酸エチルで抽出し、有機層を水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥させ た。酢酸エチルを真空下で除去し、残渣をヘキサンで摩砕した。

生成物を薄層クロマトグラフィーによりクロロホルム：メタノール：酢酸（９５ ：４：１）を用いてチェックした。

３、　Ｚ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−ＯＢｅの製造トリペプチドの合成に関する 次の工程では、カルボキシ保護バリン残基（Ｖａｔ−ＯＢｅ）の付加を要した。

この場合の保護基はベンジルエステルであった。

上記工程２から得られたＺ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　３７　ＩＤｌｌ１ｏｌ　（１９ｇ 　）を蒸留テトラヒドロフラン２００ｍ１に溶解した。この溶液及びＮ−メチル モルホリン４．１ｍｌを互いに混合し、攪拌下−１５℃に冷却した。クロロギ酸 イソブチル（５ｍｌ）を加え、混合物を一１０℃で５分間攪拌した。上記と平行 して、バリンベンジルトシレートエステル３５ｍｏ＋ｏｌ　（１３，２ｇ）をジ メチルホルムアミド１’００ｍ１に溶解した。混合物を一１０℃に冷却し、Ｎ− メチルモルホリン（４ｍｌ　）で中性化した。これを上記混合無水物に加え、− 夜攪拌した。次いで、混合物から尿素を濾去し、濾液を真空下で濃縮した。残渣 を酢酸エチルに溶解し、重炭酸ナトリウム液、水、ＩＮ塩酸及び水で連続的に洗 浄した。粗生成物をシリカゲルカラム上でクロロホルム：メタノール（９５：　 ５）を用いて精製した。純粋生成物含有分画を薄層クロマトグラフィーにより工 程２の場合と同様の溶媒を用いて調べた。適切な分画をプールした。

上記工程３で製造された保護トリペプチド９ｇにＰｄ／　Ｂ　ａ　Ｓ　Ｏ４存在 下酢酸−水−メタノール混合物中で一夜水素添加した。それから触媒を濾去し、 濾液を真空下で蒸発させて、油状残渣を得た。これを無水エタノール無水エーテ ルで摩砕し、結晶生成物３ｇを得た。生成物を薄層クロマトグラフィーによりブ タノール：酢酸：水：ピリジン（２０：６：１１：２４）からなる溶媒系を用い てチェックした。

ジアセチル−し−リシル−し−プロリル−し−バリル−ＮＨ２の裸護トリペプチ ドは、工程１〜３で上記された化学的技術によっても製造することができる。例 えば、工程１における出発物質はジアセチル化リジンになる。

工程３において、バリン−ベンジルエステルはバリル−アミドで代用される。

白血球性発熱物質は咄乳動物において一過性発熱を生じうる分子であって、これ はウサギ白血球をサルモネラ・チフォサ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｏｓ ａ）−ｎンドトキシンとインキュベートすることにより産生される。更に詳しく は、白血球性発熱物質を産生ずるために、ドナーウサギを最初に断頭により殺し た。血液をヘパリン処理無発熱物質ビーカー中に集めた。５０ｍ１のヘパリン処 理ガラス遠心管を全血で３／４まで満たし、塩水を加えて各管を一杯にし、溶液 を穏やかに混合した。次いで、管を低速で２０分間遠心分離した。軟膜を取除き 、無発熱物質フラスコに入れた。赤血球層の半分量に等しいラクテートリンゲル 溶液を、同じくリンゲル溶液（１ｇｇ／ｍｌ）中サルモネラ・チフォサエンドト キシン〔ジフコ（Ｄｉｒｃｏ）Ｎα０９０１）と共に軟膜に加えた。混合物を振 盪水浴中３８℃で４時間インキュベートした。溶液を遠心分離し、濾過し〔ナル ゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）　、０．　２０ミクロン〕、白血球性発熱物質含有濾液 を４℃で貯蔵した。白血球性発熱物質のサンプルを７０℃で２時間加熱し、エン ドトキシン汚染に関して試験するために静注した。唯一の特徴である白血球性発 熱物質による発熱のみが生じて、長時間の発熱が観察されなかったことは、白血 球性発熱物質がエンドトキシン及び他の熱安定性発熱物質を含有していないこと を示していた。

注射液は容量５０μｍであって、塩水２０μｌが追加された。耳縁部の静脈から 注射した。白血球性発熱物質静注液は、ドナー４体から得られた白血球性発熱物 質の混合物からなる貯蔵溶液０．０７ｍ１であった。注射時、白血球性発熱物質 貯蔵溶液を非発熱性等張塩水で希釈した。注射は市販非発熱性シリンジで行われ た。ガラス製品をクロム酸で洗浄し、脱イオン水で再洗浄し、最少２時間にわた り２００℃に加熱して、それが確実に無発熱物質であるようにした。

動物の取扱法 成熟ニューシーラント種白ウサギを解熱アッセイ操作に用いた。ウサギを２１− ２３℃の１２時間明／暗サイクル環境下で個々に飼育したが、食物及び水は無制 限に与えられた。解熱剤の中枢神経系注射を以下のように行った：動物を塩酸ケ タミン及びプロマシン〔ケタセット・プラス（Ｋｅｔａｓｅｔ　Ｐｌｕｓ）、プ リストール・ラプス（Ｂｒｉｓｔｏｌ　Ｌａｂｓ）、０．４ｍｌ／ｋｇ、筋注〕 で前処理し、麻酔をメト牛シフルオラン〔メタファン（Ｍｅｔａｆ’ａｎｅ）、 ピットマンームーア社（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ、　Ｉｎｃ、））及びＮ２〇 −０２の吸入により誘導しかつ維持させた。ウサギをコツ（Ｋｏｐｒ）ウサギ定 位装置におき、ステンレススチールカニユーレ（ＮＯ，２０１，デビット・コツ ・インスッルメンツ（Ｄｅｖｌｄ　Ｋｏｐｆ’　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を 前頂部の１．Ｏｍｍ前でかつ中線の２．７ｍｍ側部の箇所の側部脳室内に挿入し た。

脳を髄液がカニユーレのウェル内に現れるまで、カニユーレを押し下げた。ステ ンレススチールネジ及び歯科用アクリル樹脂を用いて、カニユーレを頭蓋冠に固 定した。

ベニ／ブチンペニシリンＧ〔ピシリン（Ｂｉｃｌｌｌｌｎ）、　ウェス・ラボラ トリーズ（Ｗｙｅｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を術後投与した（１５０ ，０００単位筋注）。

解熱研究に用いられる実験ウサギを慣用的ホルダーで拘束し、サーミスタープロ ーブ〔イエロー・スプリングス・インターナショナル（ＹｅｌｌＯｖ　Ｓｐｒｉ ｎｇｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、　ｋ　７０１　）を直腸内に約１００１ １１１挿入し、尾にテープで結び付けた。ある実験では、他のサーミスター（イ エロー・スプリングス・インターナショナル、Ｎ（Ｌ７０９）を耳の背側表面に 付着させた。温度記録をデジタル温度記録計〔データ０−／ガー（Ｄａｔａｌｏ ｇｇｅｔ）　。

ユナイテッド・システムズ社（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｒｐ、）） に接続されたＭＩＮＣ１１オンラインコンピューターで１０分間毎に行った。プ ローブ挿入後生なくとも１時間経過した後、注射を行ったが、すべての実験で少 なくとも４８時間の間隔をあけた。実験は環境室中２３℃で行った。

平均熱応答性、即ち数時間にわたり測定された応答期間中における温度の平均変 化（”Ｃ）を各応答毎に計算したが、その際にデータの統計学的分析に関して対 を検定を用いた。実験的解熱温度応答性が測定された時間は、通常側々の動物の コントロール応答時間に応じて設定された。コントロール応答はベースライン温 度から最初の偏差を生じた時点で始まり、温度がベースライン又は５時間以内で 最もベースラインに近いところに戻るまで続く。この時間内において各々１０分 間隔毎の平均温度変化が合計され、１０分間の総数で割られる。

アッセイプロトコール及び結果 上記のようにトリペプチドＬ−ＬｙＳ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｖａｔが合成された後 、直ちにそれを無菌非発熱性等帳場水に溶解し、使用直前までアリコートを凍結 貯蔵した。いずれのトリペプチド注射が行われる前に、発熱物質に対するその感 受性を確認しかつエンドトキシン活性を調べるために、各動物毎に白血球性発熱 物質について試験した。

試験動物を発熱させるために、白血球性発熱物質の貯蔵溶液０．１５ｍ１を耳縁 部の静脈から注射した。いくつかのバッチからの発熱物質を用いたが、但し各動 物は各種の実験全体を通して同一バッチからの発熱物質を受容した。

トリペプチド注射液を発熱物質投与３０分後後脳室内カニユーレ中入れた。トリ ペプチドの中枢投与により、解熱が観察された。熱低下率は、見かけのペプチド 作用期間（１，５時間）にわたるコントロール熱曲線下の面積減少率として計算 された場合に、０．５．１．０及び２．０ｍｇ用量のときで各々２４％、３１％ 及び４８％であった。同様に、トリペプチド２．２０及び２００＋ｎｇ静注投与 の場合には、白血球性発熱物質注射後１．５時間にわたり各々３４９６．２７％ 及び６７％熱を低下させた。

コントロール塩水注射では、中枢投与された場合に、体温の有意な低下がなかっ た。同様に、２００ｏ＋ｇ注射が無熱ウサギに行われた場合にも、体温の低下は 観察されなかった。

リシン−し−プロリン−Ｌ−バリン−ＮＨ２トリペプチドの品種投与により、観 察される解熱作用が増強すると共に作用期間が増加した。白血球性発熱物質の静 注投与による発熱は、保護ペプチド０．５ｍｇで５０％以上低下した。作用期間 は、非保護トリペプチドの場合：こ観察される１、５時間（例Ｉ参照）に対して 少なくとも４時間であった。保護トリペプチドの用量を少なくさせる【こ従い、 それに対応して解熱効果も低下した。

保護ペプチド０．５ｍｇを中枢投与しかつ銅イオン（塩化第二銅１〜１０ｍｇ） を中枢又は末梢のいずれ力１力１ら投ＭＳＨで観察された場合と同様の体温低下 が生じた。このような保護ペプチドは、非保護トリペプチドより少なくとも４倍 有効のようである。正常温度では効果を有しない用量で銅イオンを付加した場合 には、保護ペプチドの解熱及び体温低下効果を著しく高めた。

例Ｖ：抗炎症活性 トリペプチドの抗炎症活性は、参考のため本明細書に組込まれるスパロー及びウ ィルヘルム、１９５７年、ジャーナル・オブ・フィジオロジー、第１３７巻、第 ５１−６５頁（Ｓｐａｒｒｏｗ　ａｎｄ　Ｗｉｌｈｅｌｎ　（１９５７）、Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ’Ｐｈｙｓ１ｏ１ｏｇｙ、１３７：５ｌ−８５）により開発さ れた動物モデルを用いて立証された。このモデルは、ヒスタミンの局所皮下注射 が毛細血管透過性を局所的に増加させるという原理に基づいている。試験動物を 青色色素の静注で前処理した場合、局所ヒスタミン注射は注射部位周辺で青色の “はれ°を発現させる。したがって、効果的抗炎症剤の前投与により、ヒスタミ ン起因性はれの青色が著しく抑制され、その場合に発色抑制量は使用された抗炎 症剤の相対量及び／又は効力に依存する。

非脱毛（ｎｏｎ−ｍｏｕＨｉｎｇ）ニューシーラント白ウサギをスパロー／ウィ ルヘルムアッセイに用いた。ウサギ背皮膚から実験の１〜２日前に脱毛せずに毛 を十分に刈り込み、試験開始までウサギを暖めておいた。様々な量の保護トリペ プチド（ジアセチル−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｖａｔ−ＮＯ３）を青色色 素静注の約１５分前に耳静脈から注射した。コントロールウサギは偽薬注射を受 けた。薬物及び偽薬注射の１５分後に、ウサギに０．４５％塩水中２．５％溶液 としてボンタミン（Ｐｏｒ＋ｔａＩＩｉ；ｔｅ）青色色素３０ｍｇ／ｋｇを露出 静脈から投与した。

色素注射後直ちに、ヒスタミンをを椎の各側の数箇所において０．１０ｍ１容量 （ヒスタミン１．２５ｍｇ１０．１ｍｌ容量）皮内注射した。すべての場合に、 縦１列で６回の注射がを椎の各側で行われた。生じた青色はれの相対的強度は、 ヒスタミン注射の３０分後に独立の観察者によって評点された。結果は下記第１ 表で示されている。

試験動物Ｎα　チド用量“　結果 ２　（ＩＥ、ＩＣ）　１０　・　ＥはＣより軽度２（ＩＥ、ＩＣ）　５　ＥはＣ より軽度２　（ＩＥ、ＩＣ）　１．２５　ＥはＣより軽度２　（ＩＥ、ＩＣ）　 ０．６２５　差異なし＊Ｅ−実験；Ｃ−コントロール １静注投与された政体重当たりの保護トリペプチドμｇ用量 第１表に示された結果から明らかなように、トリペプチド１．２５μｇ／ｋｇ体 重以上の静注用量ではヒスタミン起因性青色はれの明らかな抑制がみられ、その 結果有効な抗炎症作用を示している。５〜１０μｇ／ｋｇの用量でも、観察され た応答性は一層顕著であった。同様に明らかなように、トリペプチドの抗炎症効 果はその解熱効果に比較して一層低い用量で観察される。

例■：カラゲナン／ラット足浮腫アッセイ抗炎症活性に関する第二のインビボバ イオアッセイでは、トリペプチドの作用をヒドロコルチゾンの場合と比較して行 われた。このアッセイでは、２種の薬剤が同用量で投与され、ラット足のカラゲ チン起因性膨張を阻害しうるそれらの独立した能力に関して試験された。このラ ット足浮腫試験アッセイは、例えばウィンターら。

１９６２年、プロシーディング・オブ・ザ・ソサエティ・フォア・エクスベリメ ンタル・バイオロジー拳アンド・メディシン、第１１１巻、第５４４頁（Ｗｉｎ ｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ（１９Ｂ２）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｏ ｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅ ｄｉｃｉｎｅ、１１１：５４４）又は米国特許第４゜１５０．１３７号明細書で 記載されているように、通常当業界で典型的な実施法に従い行われた。

簡単に言えば、アッセイは下記のように行われた。

２４匹の雄性スブラーグードーリー系（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｖｌｅｙ）ラット の各々を、４群：即ちトリペプチド処理及びコントロール（体重及び初期定容量 が同等）並びにヒドロコルチゾン処理及び対照コントロールのうちの１つに振り 分けた。試験及びコントロール動物の右後足容量を、標準的方法で水銀置換容量 測定技術により測定した。トリペプチド（Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｎ８ ２．　１００＋ｎｇ／ｋｇ、Ｎ　＝６）、ヒドロコルチゾン（１００ｎｇ／ｋｇ 、Ｎ＝６）又は塩水（同容ｉｔ、Ｎ−１２）の腹腔内注射を各ラットに行った。

１時間後、１％λ−カラゲナン塩水溶液０．５ｍｌを動物の右後足に注射し、定 容量を再度記録した（ベースライン測定）。しかる後、定容量を４時間にわたり 毎時間測定した。２つの処理効果の比較のために、１時間間隔で測定された実験 動物の定容量をそれら各々の対照コントロールに対する容量変化率として示した 。

この実験結果は第２図に示されている。このデータから明らかなように、ヒドロ コルチゾンが膨張を著しく阻害した（ｐ＜０．０５，７ンーホイツト、＝−−（ Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）試験〕最初の１時間を除き、トリペプチド及びヒド ロコルチゾンによる足浮腫阻害に関して有意差はなかった（ｐ＞０．２０）。こ れらの結果は、若干の時間経過に差異があるものの等重量用量で投与された場合 にトリペプチドが古典的抗炎症剤の場合と同様に炎症を阻害することを示した。

本結果並びにヒトにおけるヒドロコルチゾン及び炎症の公知の効果に基づき、本 トリペ２ブチドＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌはヒドロコルチゾンの場合と著しく異な らない投与量でヒトの炎症を抑制するために使用しうるちのと結論付けられた。

前記発明は、実例及び例としてかつ本発明者により用いられた標準的実験技術に 関して記載されてきた。これらの方法のある変更及び修正が本発明の精神及び範 囲から逸脱することなく行いうろことは、当業者にとって明らかであろう。例え ば、化学的合成トリペプチドがその解熱活性を立証するために用いられたが、天 然源から単離されたトリペプチドも同じく十分に機能しうるちのと本発明者によ り考えられている。更に、いずれの銅塩の投与であっても、それが硫酸塩、塩化 物であるか又は他のある類似の銅塩であるかにかかわらず、トリペプチドの活性 を高めるうえで塩化物塩と同様に活性であるにちがいないことは明らかであろう 。同様に、活性は静注又は中枢のいずれかで投与されたトリペプチドを用いて立 証されたが、更に高い用量であれば経口投与されたトリペプチドであっても熱を 低下させるうえで活性であろう。

これらの及び他の修正及び変更が添付された請求の範囲の中に属することは、当 業者であれば明らかであろう。

浄書（内容に変更なし） 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　１　年　２　月？　１ く 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０１９９４ ２、発明の名称 解熱及び抗炎症性ペプチド類 ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国テキサス用、オースチン、ウェスト、セブンス、ストリ ート、２０１ 名　称　ボード、オブ、リージエンッ、ザ、ユニバージティー、オブ、テキサス 、システム４、　代　理　人 （郵便番号１００） 東京都千代田区丸の内三丁目２番３号 １９８８年９月２９日 ６、　添付書類の目録 （１）　補正書の翻訳文　１　通 １、　和文明細書第３頁第２０行目〜第４頁第１５行目を下記のように補正する 。

「α−ＭＳＨの解熱効力及びこのペプチドが末梢投与された場合であっても熱を 低下させうるという事実は、　・臨床上重要であろう。当業界において、ＡＣＴ Ｈ（ヒト副腎皮質刺激ホルモン）が臨床的及び実験的発熱を低下させるために用 いられていることは既に公知であった。

プロオビオコルチンのアミノ酸１−３９に相当するＡＣＴＨは、炎症の治療に際 して活性であることも公知であワた。この活性はＡＣＴＨの副腎皮質ステロイド 刺激作用の結果であって、繰返し投与時に望ましくない副作用としてクッシング 症候群を引き起こすことがある。

証拠１〔ジャーナル・オブ・リューマトロジー、第１２巻、１９８５年、第９７ １−９７５頁（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ’Ｒｈｅｕｗａｔｏ１ｏｇｙ、１２（１９ ８５）、ｐａｇｅｓ　９７１−９７５））から、短鎖ＡＣＴＨ由来ペプチドα− ＭＳＨ（ＡＣＴＨのアミノ酸、１−１３）が尿酸塩結晶と共にラット後足に注射 された場合に膨張低下作用を有することは既に公知であった。

この論文では、ペプチドのいずれのペプチジル部分が炎症に関して有用であるか 否かについて示しておらず、実際上、長鎖ペプチドが抗炎症性の傾向があり、一 方短鎖化合物が炎症を促進させる傾向のあることを示唆しているようである（第 １欄、第９７５頁参照）。

証拠２〔ベプタイデス、第５巻、１９８４年、第８１５−８１７頁（Ｐｅｐｔｊ ｄｅｓ、Ｖｏｌ、５（１９８４）、ｐａｇｅｓ　８１５−８１７））は、中枢又 は末梢いずれかの投与後のウサギにおける熱低下のためのＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａ ｔ　トリペプチドの使用について開示している。この論文では、炎症に治療に際 して本トリペプチドのいかなる効果についても説明又は示唆すらしていない。

本発明は、炎症治療用の薬剤として使用されるペプチドの製造に際してのトリペ プチド配列Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌの用法について提供する。」 ２、　第１７頁第１行目〜第５行目を下記のように補正する。

ｒ下記例で用いられたトリペプチドは、下記のようにカリフォルニア州トランス （Ｔｏｒｒａｎｃｅ）のバチエム社（Ｂａｃｈｅ＋ｓ、　Ｉｎｃ、）により外注 合成された二」３、　第１９頁第１８行目を下記のように補正する。

「下記実験は、上記で合成されたペプチドの解熱活性について説明している。

実験１　：　Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｖａｌの解熱活性」４、　第２４頁 第２行目〜第３行目を下記のように５、　第２４頁第１３行目〜第１４行目を下 記のように補正する。

６、　第２５頁第１行目〜第７行目を下記のように補正する。

「例１：抗炎症活性 トリペプチドの抗炎症活性は、スパロー及びウィルヘルム、１９５７年、ジャー ナル・オブ・フィジオロジー。

第１３７巻、第５１−６５頁（Ｓｐａｒｒｏｗ　ａｎｄ　Ｗｉｌｈｅｌｌｌ（１ ９５７）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１３７：５１−６５ ：ｌにより開発された動物モデルを用いて立証された。」７、・　第２７頁第２ 行目を下記のように補正する。

請求の範囲 １、　炎症治療用薬剤として使用されるペプチドの製造に際する、トリペプチド 配列Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ又はかかる配列の生物学的機能同等物の用法。

２、　ペプチドがトリペプチドＬｙｓ−Ｐｒｏ−■ａ　ｌである、請求項１に記 載の用法。

３、トリペプチドがそのアミノ又はカルボキシ末端で保護されている、請求項２ に記載の用法。

４、　保護トリペプチドがそのアミノ末端でアシル化されているか又はそのカル ボキシ末端でアミド化されている、請求項３に記載の用法。

５、　保護トリペプチドがそのアミノ末端でアシル化されかつそのカルボキシ末 端でアミド化されている、請求項３に記載の用法。

６、　保護トリペプチドがそのアミノ末端でアセチル化されかつそのカルボキシ 末端でアミド化されている、請求項３に記載の用法。

手続補正書坊式） １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０１９９４ ２、発明の名称 テキサス、システム ４、代　理　人（郵便番号１００） 平成１年９月２０日 （発送日　平成１年１０月　３日） ６、補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の出願人及び発明者の欄、委任状 、図面翻訳文 ７、補正の内容 （１）別紙の通り （２）図面翻訳文の浄書（内容に変更なし）国際調査報告

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．炎症治療用薬剤の製造に際する、α−ＭＳＨの配列に相当する配列でアミノ 酸３〜１３個を有するペプチドの用法であって、 ペプチドがＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ配列を含んでいることを特徴とする用法。
2. ２．ペプチドがα−ＭＳＨである、請求項１に記載の用法。
3. ３．ペプチドがトリペプチドである、請求項１に記載の用法。
4. ４．トリペプチドがそのアミノ又はカルボキシ末端で保護されている、請求項３ に記載の用法。
5. ５．保護トリペプチドがそのアミノ末端でアシル化されているか又はそのカルボ キシ末端でアミド化されている、請求項４に記載の用法。
6. ６．トリペプチドがそのアミノ末端でアシル化されかつそのカルボキシ末端でア ミド化されている、請求項５に記載の用法。
7. ７．トリペプチドがそのアミノ末端でアセチル化されかつそのカルボキシ末端で アミド化されている、請求項６に記載の用法。