JPH02500440A - レトロウイルス疾患の予防および治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 と上止シし仁に２遣］しλｉ漁＃、ｌ；ｆｆ央羞発明の背景 本発明は、一般的には、レトロウィルス疾患の予防および治療のための薬剤およ び方法に関し、さらに詳しくは、ヒト免疫不全症ウィルスに対する予防接種およ び免疫治療に使用する外側エンベロープを含まないウィルスプレバレージョンに 関する。

後天性免疫不全症候群はエイズ（ＡＩＤＳ＞とも呼ばれ、最近の疫病として報告 されている。それがはじめて報告された１９８１年から７年間に、約６万人の犠 牲者がいるといわれ、アメリカ合衆国だけでも３２．０００人を越える死亡が数 えられている。しかしながら、この疾患の真の衡撃はまだ隔りに感じられるには 至っていない。このウィルスは感染患者内に５年またはそれ以上もの期間潜伏し たのち、症状を発現する。多くのアメリカ人が知らない間に感染し、体液が接触 すればさらにそれを他人に感染させる可能性がある。このまま放置されれば、エ イズによる個人的、社会的、経済的影響は測り知れないものになろう。

エイズの原因は、レトロウィルスに属するヒト免疫不全症ウィルス（ｌ（ＩＶ） である。レトロウィルスは、ウィルス複製情報をコードする遺伝子物質がＲＮＡ であることによって識別される。宿主細胞に感染すると、それは、逆転写酵素と 呼ばれる酵素に触媒されるＤＮＡへの転写に際し、鋳型として作用する。このよ うにして産生きれたＤＮＡは細胞核へ侵入し、ここでプロウィルスとして宿主Ｄ ＮＡ中に組み込まれる。適当に活性化されると、このレトロウィルス由来ＤＮＡ は転写され、ｖＡ訳されてＲＮＡ含有ウィルス粒子を生成し、ついで出芽過程に よって細胞から放出される。

レトロウィルスを含めである種のウィルスは、活性化されてウィルス粒子を生成 するまで、何か月も何年もの間、潜伏状態に維持されることがある。無症候性で あっても、宿主はウィルスをプロウィルス型で含有していて、発症および他人へ の感染の恐れがある。

個体がＨＩＶに感染すると、ウィルスは、ＣＤ４と命名された細胞表面マーカー の存在によって特徴づけられるＴ４リンパ球と呼ばれる特定の種類のＩｆ胞に好 んで付着し、それに侵入する。これらの白血球は、免疫系において総合的な役割 を果たし、体液性および細胞性免疫応答の両者の１！要な成分として機能してい る。ＨＩ　Ｖの有害な作用の多くは、Ｔ４リンパ球の機能低下または破壊に帰因 するということができる。

無傷のＨＩＶウィルス粒子はほぼ球形で、直径は約１１０１■である。このウィ ルス粒子は、糖タンパク質ｇｐ１６０／１２０からできたノブまたはスパイクで 被覆された外膜を有する。さらに、９ｐ４１と呼ばれるトランスメンブレンタン パク質が存在する。ウィルス粒子の内部には２種の構造タンパク質が存在し、リ ンタンパク質ｐ１７で構成された外殻とリンタンパク質ｐ２４で作られた内核ま たは中心核がある。ウィルスＲＮ　Ａは核の内部に、逆転写酵素の２個のコピー 、ｐ６６１５１とともに存在する。この逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型からウィルス ＤＮＡを合成するのに必要である。ｌ−１１Ｖの模式的モデルを第１図として示 す。

第２図に示すように、ＨＩＶ　ＲＮＡゲノムは３種の主構造遺伝子、１１．ＤＯ ｌおよびｅｎｖをコードし、これらはいずれかの端で、長い末端反復（ＬＴＲ） 配列に接している。ＬＪ遺伝子は群特異的な核タンパク質、Ｄ５５．Ｄ３９．０ ２４．　ｐ１７およびｐ１５をコードする。ｐｏ１遺伝子は逆転写酵素Ｄ６６／ Ｄ５１およびプロテアーゼｐ３１をコードする。ｅｎｖ３ｆｉ伝子は、外側エン ベプローブ糖タンパク質Ｇ１１）１２１５よびそのプレカーサーａｐｉｓｏ、な らびにトランスメンブレン糖タンパク質ＱＯ４１をコードする。一部の遺伝子、 とくにｅｎｖ遺伝子はきわめて変動しやすい。さらに、他のレトロウィルスには ない５種の他の遺伝子があり、これらは転写もしくは翻訳の調節に関与している かまたは他の構造タンパク質をコードしているかのいずれかである。

現在ではすべてのＨＩ　Ｖゲノムの配列が決定されている。

ＲａｔｎｅｒらによりＮａｔｕｒｅ３１３　：　２７７　、１９８５に報告され ているとおりで、この文献を参考として本川ＩＢ占に導入する。

ＨＩＶは、エンベロープ糖タンパク質と細胞表面受容体との相互作用により宿ｉ ｍａに付着する。Ｎ　Ｉ　ＶがＴ４細胞と接触した場合には、０１）１２０がＣ Ｄ４受容体と相互作用するように思われる。ついでウィルスエンベロープが細胞 膜と融合し、ウィルスの内核が感染細胞内に侵入し、ここでＲＮＡのＤＮＡプロ ウィルスへの転写が逆転写酵素によって触媒される。プロウィルスは、この細胞 内に何カ月も何年も潜伏型で維持され、この間は感染個体は無症候型である。し かしながら、その後にウィルスが活性化されると、ウィルスの複製と免疫抑制が 起こり、癌を含めたエイズに伴う日和見感染の危険が生じる。他のヒトレトロウ ィルスは外側エンベロープタンパク質を有する。

エイズ症候群に対して有効なワクチンも処置もまだ知られていない。ワクチンを 開発する試みもまだ成功していない。ＨＩＶと反応するある種の抗体、とくに抗 −ＱＤ１６０／１２０およびウィルス中和抗体がＨＩＶ感染の無症候期および症 状発症剤の雨期を通じて高レベルに存在することは、これらの抗体はむしろ防御 的役割を果たしていることを示唆している。実際、これらの抗体は、ウィルスの 宿主細胞への付着および侵入を促進することがある。

したがって、レトロウィルス感染症とくにＨＴＶに起因する感染症の予防および 治療に使用される有効な薬剤の要求がある。本発明は、これらの要求を満足し、 同時にそれによる利点を提供するものである。

発明の要約 本発明は、外側エンベロープタンパク質をもたないレトロウィルス粒子、または レトロウィルスから単純される選ばれた抗原を含有する非感染性免疫源を提供す る。

この免疫源は、−態様においては、ＨＩＶを含めたレトロウィルスに感染した個 体を免疫感作し、感染の進行に対して防御的な免疫防御因子を誘発するのに有用 である。

他の態様においては、この免疫源は、前にＨＩＶｌ、：！Ｊｉ染したことがない 個体の、以後の感染を予防するための、免疫感作に有用である。他の態様として は、ウィルス免疫源を非感染性にする方法を提供する。この免疫源はまた、ＨＩ Ｖを含めたレトロウィルス感染個体に受動免疫治療用の抗体を産生させるために 、単独でまたは能動免疫治療と併用して用いることができる。

図面の簡単な説明 第１図は、各種遺伝子生成物の配置を示すＨＩＶの模式図である。

第２図は、ＨＩＶの遺伝子およびそれにコードされた遺伝子生成物の図である。

第３図は、ＨＩＶ感染症ないしエイズのＨＩＶ＊ｆｆｉ陽至る進行過程に存在す るある種の抗体および抗原のレベルを図式的に示す。

第４図は、例１のようにして製造した免疫原のウェスタンプロットであり、外側 エンベロープタンパク質に対する抗体の高力価を含有する対応および非対応血清 でスクリーニングした場合、外側エンベロー７タンパク質を含まないことを示し ている。Ａ：非対応チンパンジー血清でスクリーニングした市販ＨＩＶウェスタ ンプロットストリップ、Ｂ：非対応チンパンジー血清でスクリーニングした免疫 原のウェスタンプロットストリップ、Ｃ：対応ヒトｆｋＵｍでスクリーニングし た市販ト１１Ｖウェスタンプロットストリップ、Ｄ：対応ヒト血清でスクリーニ ングした免疫原のウェスタンプロットストリップ発明の詳細な説明 この出願は、１９８７年６月１０日の出願に係るアメリカ合衆国特許出願第０６ ０．２８０号の一部継続出願であり、上記出願の全明細書を参考として本明細書 に導入する。

本発明は、ＨＩＶ感染とその後ＨＩＶが原因となるエイズ関連症候群（ＡＲＣ） およびエイズの予防、ならびにＨＩＶを含むレトロウィルス感染の進行を停止さ れる感染後処置に有効な手段を提供するものである。ＨＩＶウィルスに曝露され た個体では、ＨＩＶに特異的なある種の抗体が血清中に瑛れる。このような個体 をＨＩＶに対して「ｌ１１１清陽性」であるといい、一方、そうでない一体を「 自涜陰性」であるという。ＨＩ　Ｖ特異的抗体の存在は市販の検定システムで測 定できる。これらの抗体のレベルは、エイズ症候群の進行の指標となる。第３図 に図式的に示したように、ＨＩＶ感染の無錠候性相に認められる抗−Ｑｐｌ　６ ０／１２０　（外側エンベロープ）抗体の高レベルは、症候性相にも持続する。

抗−ｐ２４抗体のレベルは無症候性相には高いが、症候性相には低下するようで ある。同様に、ＨＩＶ血清陽性血清は、逆転写酵素の機能を阻害する抗体（抗− ＲＴ抗体またはＲＴＩ）を含有する。ＲＴＩが高レベルに存在する個体では、そ れがない個体に比べて、ウィルス単離を試みると陽性を示す頻度が小さい。した がって、Ｔ４細胞のような細胞性および体液性免疫防御因子、ならびに抗−１） ２４を含めた抗−ＧＡＧ抗体およびＲＴＩを含めた抗−ＰＯＬ抗体の低下が、Ｈ ＩＶ感染からエイズへの進行に伴って生じるものと考えられる。

免疫防御因子の産生は、個体に有効な免疫原を予防接種することによって誘発す ることができる。以前に、ある種のウィルスタンパク質たとえばエンベロープタ ンパク質に基づくワクチンの開発が試みられたことがある。

本発明は、非感染個体における感染の予防と、感染個体におけるＨＩＶ感染のエ イズへの進行の緩徐化および予防に有効な免疫防御因子の産生を刺激するのに有 効な、外側エンベロープタンパク質を除いたＨＩＶ遺伝子生成物を含有する免疫 原に関する。この免疫原は、外側エンベロープを除去しただけの無傷のウィルス 粒子からなるか、またはＱＤｌ　２０またはａｐ１６０以外の１種もしくは２１ 以上のＨＩＶ遺伝子生成物からなる。

Ａ、定義 本川ａｍに用いる「レトロウィルス」の語は、遺伝子物質としてリボ核酸（ＲＮ Ａ）を有し、これがり、ＮＡに転写されて宿主のゲノム中に挿入されるウィルス をいう。

レトロウィルスの例には、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩＳＴＬＶ−Ｉ、ならび にＨＩＶ、ビスナウィルス、ウマ伝染性貧血ウィルス、ネコ免疫不全ウィルスお よびウシ免疫不全ウィルスを含むレンチウィルスがある。これらニツイテはＦａ ｕｃ　ｉにより５ｃｉｅｎｃｅ　、　２３９　：　６１７　（１９８８）に記載 されている。この文献およびそれに引用されている参考文献を、参考として本用 細寓に導入する。

本川ｍｉｇｔに用いられるｒ）−１１ＶＪの詔には１型および２型を包含し、Ｈ ＴＬＶ−ＩＩＩならびにＬＡＶ−１６よびＬＡＶ−２と同義である。ＨＩＶはそ の属のウィルスを指し、すべてのタイプ、サブタイプおよび変異体を包含する＠ ＨＩＶウィルスを永久感染させた様々な細胞系が開発され、ＡＴＣＣに寄託され ている。たとえば寄託番号ＣＣＬ２１４．ＴｌＢ１６１、ＣＲＬ１５５２および ＣＲＬ８５４３であり、これらはすべて米国特許第４゜７２５．６６９号および Ｇａ１ｌｏ　：　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ２５６：４６（１９ ８７）に記載されている。この両者を参考として本明細書に導入する。

本明細書に用いられる「外側エンベロープタンパク質」の語は、レトロウィルス の膜部タンパク質の、トランスメンブレンタンパク質ＱＤ４１とは逆に、膜の外 に突出している部分をいう。外側エンベロープタンパク質は、ＨＩＶ（７）場合 、ｇｐ１２ｏおよびその前駆体ＱＤ１６０と同義である。

本川ａｌ！に用いられる［外側エンベロープを含まない」の語は、外側エンベロ ープタンパク質を除いたレトロウィルス粒子プレバレージョンまたはレトロウィ ルス遺伝子生成物を指す。

本明細書に用いられるｒｇｐ１２０ＪまたはｒｇＤ１６０／１２０Ｊのｚａは、 外側エンベロープタンパク質の抗原特異性または生物学的機能を有する糖タンパ ク質をいう、ＱＤ１６０はｇｐ１２０の前駆体と考えられている。

本明細書に用いられる「エイズ」の語は、ＡｄｌｅｒによってＢｒ１ｔ、　Ｈｅ ｄ、　Ｊ、２９４　：１１４５　（１９８７）に記載された後天性免疫不全症候 群をいう。これはｍｓ＋と一連の日和見感染によって特徴づけられる。ｒＡＲｃ Ｊはエイズ関連症候群（ＡＩＤＳ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ）を意味し 、上述のＡｄｌｅｒによって記述されている。ＨＩＶ５１染の症候性相は、ＡＲ Ｃまたはエイズに特徴的な症状の発現を意味する。「エイズ症候群」は、エイズ およびＡＲＣの両者を包含する。

本明細書に用いられる「遺伝子生成物」の玉は、遺伝子によってコードされてい るポリペプチドまたはタンパク質を指す、この語は、タンパク質誘導体、たとえ ば糖タンパク質を包含するものである。遺伝子生成物やアミノ酸配列に限られた 修飾を行っても、その遺伝子生成物の生物学的機能や免疫原性は破壊されないこ と、また−次配列のごく一部のみが免疫原性に必須であることがわかっている。

本明細書に用いられるＨＩＶ感染者またはＨＩＶ非感染者の藷は、それぞれＨＩ Ｖウィルスもしくはプロウィルスが存在するヒトまたは存在しないヒトを意味す る。

レトロウィルス感染者またはレトロウィルス非感染者は、それぞれレトロウィル スもしくはプロウィルスが存在する個体または存在しない個体を意味する。現時 点では、このウィルスに対する抗体の存在を検出する血清学的試験が、感染を調 べるために最も広く用いられている方法である。しかしながら、このような方法 は、個体がウィルスに羅患していてもまだ免疫応答が生じていない場合の偽陰性 、また胎児が母体から抗体は取得していてもウィルスには感染していない場合の 偽陽性のようないずれもの誤った結果を招くことがある。ウィルスの存在を決定 する他の方法はまだ実用化されていない。血清学的試験で感染を示す結果が出て も、常に、血清陽性が実際に感染を示すものかどうか考慮する必要がある。さら に、のキャリアーとの接触等が満足される場合には、実際に感染者としての処置 を要することもある。「血清陽性」および「血清陽性」の語は、最も簡単にわか る感染の指標として本明細書でも用いられるが、これらの詔がそれぞれｒｉ染」 または「非感染」と同義に用いられるものではない。

ＨＩＶ特定の遺伝子および遺伝子生成物の同一性は、第１図に示すＨＩＶＩ型の 用語に基づいている。しかしながら、ＨＩＶＩ型の特定の遺伝子または遺伝子生 成物に対するその分子量に基づく言及は、相当するＨＩＶ２型および、相同性の 遺伝子が存在する場合は他のレトロウィルスの遺伝子および遺伝ｆ生成物をも包 含するものである。たとえば、ＨＩＶＩ型のＱＩ）４１は２型のＱｐ３６と同等 であり、また１型のＱρ１２０は２型のＱＤ１３０に相当する。遺伝子はイタリ ックの小文字の記号でたとえばｍで表示し、相当する遺伝子生成物は大文字の記 号でたとえばＧＡＧのように表する。ＨＩＶのすべての遺伝子は配列が決定され ていて、Ｒａｔｎｅｉｒら：Ｎａｔｕｒｅ、３１３：２７７　（１９８５）に報 告されている。

この論文を参考として、本川ＩＩＩに導入する。

ＨＩＶは感染個体の末梢血液サンプルから培養することができる。たとえばリン パ球のような末梢血液からの単核細胞は、ヘパリン加静脈血サンプルをＦｉｃｏ ｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配上に載せて、サンプルを遠心分離することにより 得られる。ついで単核細胞を集め、たとえばフィトヘマグルチニンで２〜３Ｇ間 活性化し、適当なメジウム好ましくはインターロイキン２を補給したメジウム中 で培養する。ウィルスは、逆転写酵素の検定、ｐ２４についての抗原捕捉検定、 蛍光抗体法または電子頻微鏡法により、細胞内のウィルス粒子の存在を検出する ことによって行われる。これらの方法は、本技術分野の熟練者にはすべてよく知 られた方法である。いったん単離したならば、ウィルスは他のｉｔ胞に伝達する ことができる。

宿主に感染を起こすことを避けるために、非感染性ワクチンを使用することが重 要である。病原を非感染性にするには、様々な方法がよく知られている（たとえ ばＨａｎｓｏｎ：　ＨＥＤＩＣＡＬ　ＶＩＲＯＬＯＧＹＩ［、１９８３、ｄｅ　 ｌａ　Ｈａｚａ　＆ＰｅｔｅｒＳＯｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　ＮＪ、参照）。

ウィルスを不活性化してもよいし、また複製欠損にしてもよい。しかしながら、 β−プロピオラクトンとガンマ照射の組合せで処理することが好ましい。この場 合の使用量については、β−プロピオラクトンがウィルスと少なくとも２．５時 間接触しなければならない。残ったβ−プロピオラクトンを完全に除去するため には、β−プロピオラクトンを３７℃で少なくとも５時間、溶液中に維持しなけ ればならない。

単離されたウィルスを、次に、外側エンベロープタンパク質を除去する処理に付 す。この除去は、ウィルスの凍結と解凍の反復と、ウィルス粒子の膨潤と収縮を 生じるような物理的方法とを組合せることによって行うのが好ましいが、他の物 理的または非物理的方沃たとえば超音波処理を単独でまたは組合せて使用するこ ともできる。

別法として、レトロウィルスたとえばＨＩＶの、外側エンベロープタンパク質以 外の精製遺伝子生成物を、免疫源として使用することもできる。このような遺伝 子生成物には、ｌ且ユ遺伝子（ｐ５５．ｐ３９．ｐ２４．　ｐ１７および１）１ ５）、ＤＯＪ遺伝子（１）６６／ｐ５１＃よびｐ３１−３４）によってコードさ れる生成物、ならびにトランスメンブレン糖タンパク質ＱＤ４１が包含される。

これらの遺伝子生成物は単独でも組合せても使用できる。また、ＨＩＶゲノムの 残りの５種の遺伝子の遺伝子生物を使用してもよい。遺伝子生成物はウィルスか ら単離して精製してもよいし、また細菌、菌または哺乳動物細胞のような宿主生 物体中に本技術分野においてよく知られた方法により、クローニングし、発現さ せることによっても製造できる。また、抗原は、本技術分野でよく知られた方法 たとえば自動ペプチド合成法を用いて、合成することもできる。遺伝子生成物の アミノ酸配列はヌクレオチド配列から推定することができる。

レトロウィルスたとえばＨＩＶによる感染症と決定された息者群は、レトロウィ ルスから製造した非感染性免疫原を用いる能動免疫療法によって効果的に治！Ｉ Ｉ￥ることができる。レトロウィルス感染を有することがわかっている動物も、 このような方法で治療できる。ＨＩＶの場合、血清陽性個体を、外側エンベロー プを含まない免疫原で、好ましくはアジュバント中にとり、免疫感作する。別法 として、免疫原を、アジュバントを含まない水性剤型として投与することもでき る。用量は免疫学的に有効な用量を選択する。一般にタンパク質として約１〜１ ００μグ、好ましくはタンパク質約３０μシである。

能動免疫感作は、計画に従って実行し、少なくとも１回少なくとも９０日の間隔 を置いて反復することが好ましい。しかしながら、たとえば外側エンベロープタ ンパク質以外のＨＩＶ遺伝子生成物に対する抗体の低下を基準とした免疫担当細 胞レベルの変化に応じて付加的ブースターは適宜変更してもよい。このような免 疫感作は、最初筋肉内、以後は皮肉注射で行うのが好ましいが、筋肉内および皮 肉注射の任意の組合せを使用することができる。

血清陽性個体の免疫応答性または免疫担当機能は、免疫感作に先立って、適当な 治療経過を決定するために測定しておくことが好ましい。この測定方法としては 、個体の血清についてのｐ２４に対する抗体の存在（ＥＬＩＳＡによる）や、Ｒ ＴＩ抗体および／またはＴ４細胞レベルの本技術分野においてよく知られた方法 によるスクリーニングがある。免疫担当機能の指標が低い患者、たとえばＤ２４ もしくはＲＴＩ抗体力価が低いまたはＴ４１１１！数が低い恋壱は、受動免疫療 法を好ましくは能動免疫療法に先行してまたは同時に併用して行うのに適当な候 補者である。

血清陽性個体には感染を予防する免疫防御因子を誘発するために、予防接種を行 うことができる。ワクチンは、最初筋肉内注射でついで筋肉内もしくは皮肉のい ずれかへのブースター注射により投与される。生理学的に有効な用量、好ましく は１〜１００μ９の範囲、さらに好ましくは約３０ｔ１９の免疫原が１回あたり 投与される。ワクチンはアジュバント、好ましくは水中油型アジュバントと組合 せて投与するのが好ましい。適当な様々のアジュバントが本技術分野においてよ く知られていて、たとえば−ａｒｒｅｎ　＆　Ｃｈｅｄｉｄ　：　ＣＲＣＣｒ１ ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　１ｎ１ｓ＠ｕｎｏｌｏ（ＩＬ　８　：　８３　（ １９８８）にまとめられている。

この論文は参考として本用細自に導入する。

さらに、ＣＩＤ１６０／１２０に対する抗体は細胞へのウィルスの吸収を促進す る可能性があるので、これらの特異的抗体は、免疫療法に先立ってＨＩＶ感染者 から除去することができる。中空のセルロース繊維からなる免疫＠看カラムに、 抗−ａｐ１６０／１２０抗体と反応性のリガンドを共通結合させて改変する。こ のようなリガンドとしては、新たに収穫したウィルス粒子またはＨＩＶ産生Ｔ４ リンパ球の培養上澄液から得られる釉製糖タンパク質より調製されるａｐｌ　６ ０／１２０抗原がある。また、このようなリガンドは、トランスフェクションし たｌＩ胞を用いた組換えＤＮＡ法によって製造することもで゛きる。またさらに 、抗−Ｇｐｌ　６０／１２０抗体と反応性の抗イデイオタイプを使用することも できる。

この抗イデイオタイプ抗体は、たとえばＲｉｏｔｔら二Ｌａｎｃｅｔ、　１９８ １年５月９日、１０４１頁以ｒ転記載されている本技術分野でよく知られた方法 によって製造できる。この論文は参考として本明細書に導入する。誘発抗体の対 外除去のためのこの種のカラムの使用法は、Ｌａｒｕｅ　ら　：　５ｙｓｐ、ｏ ｎ　ＰＩａ＋ｖａ　Ｅｘｃｈａｎｏｅ　ｉｎ　Ｎｅｐｈｒｏ＋ｏｇｙ　：Ｉｎｔ ’１．Ｊ、　ｏｆ　Ａｒｔ、　Ｏｒｇａｎｓ、８　：　２３　（１９８４）　ニ 記載されている。この論文は参考として本明細書に導入する。

８０例 以下の例は、本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。こ れらは使用回部なものの代表であるが、本技術分野の熟練者によく知られた別の 操作を別法として使用することも可能である。

例工 外側エンベロープを含まないウィルス粒子の製造ＨＩＶを感染させた細胞を、１ ０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ＞、２５ｓＨＨＥＰＳ、５０ｏｇ／ｄゲ＞タマイシン および１００μｇ／−ストレプトマイシンを含有するＲＰＭ１１６４０からなる メジウムＡ中で生育さゼた。　回転フラスコに保存細胞を加えて培養液を増量し 、予め加温したメジウムＡで容量を約８１にした。分裂比は約１：５であった。

２回目の分裂も前回と同様に実施し、分裂比は１：３とした。

ＨＩＶ感染細胞の５〜７日ＷＩＪ懸濁液の上澄を０．４５ミクロンフィルター（ Ｐｒｏｓｔａｃｋ　；　Ｈｉ　Ｉ　Ｉ　１ｐｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　、 　Ｂｅｄｒｏｒｄ、　ＨＡ　）で濾過した。β−プロピオラクトン（Ｓｉｇｍａ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

ＮＯ）の１：４０保存溶液を使用前に新たに調製し、上澄液に最終濃度１：４０ ００になるように添加した。この溶液を３７℃で５１ｉ間インキュベーションし 、ＤＨをたβ−プロピオラクトンの量を確認した。ついで上澄液を一７０℃に凍 結した。次に凍結した上澄液に４．５ｓＲ６０コバルトガンマ線（Ｒａｄｉａｔ ｉｏｒｉ　５ｔｅｒｉｌｉｚｅｒｓ　Ｉｎｃ、。

Ｔｕｓｔｉｎ、　ＣＡ）を照射した。

上澄液をついで解凍し、１００．０ＯＯＨ１４カツトオツフポリスルホンフイル タ一つきＨｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅｌｌｉｃｏｎｓｙｓｔｅｍを用い、製造業者 の指示に従って４０倍に濃縮した。濃縮液を予め７０％インプロピルアルコール （ＩＰＡ）で処理したＴ−２１１回転ホトＬｔ　（ＢｅｃｋｓａｎＩｎＳｔｒＵ ＩｌｅｎｔＳ、　Ｂｒｅａ、ＣＡ）中２８．ＯＯＯｒｐｍで１時間遠心分離した 。チューブから上澄液を除去し、ベレットをナトリウム・トリスＥＤＴＡ　（Ｎ 丁Ｅ）に、最終容量が約２４ｄＮＴＥになるように再懸濁した。この懸濁液４− を、予め７０％ＩＰＡで処理したボリアＯマーチューブ中３’Ｏ％庶糖８Ｉｄ上 に置き、２８．ＯＯＯｒｐｍで１時局遠心分離した。上澄液を３０％庶糖から排 水し、ベレットをＮＴＥ中に完全に再懸濁した。

７０％ＩＰＡで予め処理した無菌遠心チューブに４５％庶糖３ｍｌを加え、３０ ％庶糖６メを重ねて、勾配を確立した。上記懸濁液３Ｍｌをその上に置いた。こ のチューブを２８．ＯＯＯｒｐｍで６０分間遠心分離した。

３５％の界面における上記溶液のバンドをピペットで取って捨てた。全チューブ からのバンドをひとつのコニカルチューブに合し、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ ）で１：１０に希釈した。この溶液を、７０％ＩＰＡで前処置したボリア０マー チユーブ中、２８，０ＯＯｒｐ園で１時間遠心分離した。上澄液を除去し、ベレ ットを、出発原料１０１あたり１１１！の濃度でＦＢＳ中に再懸濁した。

また、とくに免疫原を大量に製造する場合には、照射工程はバンドを合したのち に実施することができる。ついでウィルスを１５〜ｂ ルスのバンドを合し、ＰＢＳに再懸濁した。ウィルスを２８．０ＯＯｒｐ−で１ Ｗ＃間ベレット化し、最終濃度が１．０μｌｇ／−になるようにＦＢＳ中に再懸 濁した。

存在するタンパク質の鑑は、８ｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２　：　２４８．１９７６）に従って定量した。

この文献は参考として本明細書に導入する。タンパク質はＦＢＳ中、最終濃度１ ．０１１１７−に希釈した。

例工の方法によって製造した免疫原中の残留β−プロピオラクトンのレベルは、 毛細管気液クロマトグラフィー　（Ｃａｒｌｏ　ＥＲＢＡ　５ｅｒｉｅｓ４１０ ０　）を用い、製造業者の指示に従って定量した。濃度１ｐｐ■〜５００　ｐｐ ｍのβ−プロピオラクトンおよび酪酸の標準溶液を調製した。２μｌのサンプル を毛細管クロマトグラフに、製造業者の指示に従って導入した。検出限界は０． １ＤＤｌと測定された。免疫原のβ−プロピオラクトン含量は０．０５ｐｐ−未 満と測定された。

上述のプロトコールに従って製造した免疫原の８種のサンプルについて、β−プ ロピオラクトン含量を、毛細管気液クロマトグラフィーにより内部標準として酪 酸を用いて分析した。クロマトグラフィー条件は次のとおりとした。カラム：３ ０ｍｘ０．２５ｏｍ溶融シリカのオープン細管型：固定相：ｉｏｏ％シアノプロ ピルシリコン：インジェクタ一温度＝１４０℃；温度プログラムニア０”Ｃ／１ 分、２０’Ｃ／分〜１３０’Ｃ：インジエクション方法ニスブリットなし。上記 条件下におけるβ−プロピオラクトンおよび酪酸の保持時間はそれぞれ７．５２ 分および６．７０分であった。β−プロピオラクトンの１ｐｐＩ溶液２μｌのイ ンジェクションでは定量可能なピークを生じた。ｉ　ｐｐｍ溶液を、減圧下４０ ’Ｃで溶媒蒸発により、その客層を１／１ｏ＆：Ｉｉ！縮しても、β−プロピオ ラクトンの有意な喪失は生じなかった。濃縮後の検出限界は０．１１１１１１　 （０，１μ９７ｄ）であった。

免疫原が外側エンベロープタンパク質を含まないことを確認するために、免疫原 を最初、１１．０％５ＯＳ−ＰＡＧＥゲル上でＬａｅｉｓｌｉ　、　ｔｌ、に、 の方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２２７：６８ｏ、１９７０）に従って分離した。この 文献は参考として本明細書に導入する。分離された物質を次に、ｒｏｗｂ　ｉ　 ｎらの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７６　：　４３ ５０．１９７９）に従ってニトロセルロース濾紙に移した。

この文献は参考として京間ｍｉｉに導入する。第４図から明らかなように、抗− にｌＤ１６０／１２０の高力価を含有する血清と反応させた場合の対照に認めら れるｇ＋）１２０／１６０に相当するバンドは、１述のようにして得られた免疫 原のウェスタンプロットにはみられなかった。

第４図に示すように、ｌ−１１Ｖタンパク質を有する市販ウェスタンプロットス トリップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｇ＋ａｎｄ。

ＣＡ）　（市販ウェスタンプロットストリップ）の、外側エンベロープタンパク 質、Ｏｐｌ　６０／１２０に対する高力価抗体含有非対応血清（チンパンジーＡ ３６−ＣおよびＡ−３）によるスクリーニングでは、例■の方法による外側エン ベロープを含まない免疫原で製造したウェスタンプロットストリップは陰性（非 反応性）であった。

外側エンベローブタンバク質ｏ１６０／１２０に対する抗体の高力価を含有する 対応ヒト血清（００３および０１０）は市販ウェスタンプロットストリップと反 応したが、外側エンベロープを含まない免疫原から調製したウェスタンプロット ストリップとは反応しなかった。対応および非対応血清はいずれも、他のＨＩＶ 遺伝子生成物とは反応した。

免疫原粒子上における外側エンベ０−ブタンバク質の欠如は電子顕微鏡によって 確認された。免疫原プレバレージョンは２．５％グルタルアルデヒドで固定し、 ＯｓＯ４で固定を完了し、一連の勾配のエタノール溶液によって脱水し、ＥＰＯ Ｎ−８１２中に包埋した。

ＬＫＢミクロトーム（ＬＫＢ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）よりダイア モンドナイフを用いて幼い切片を調製した。切片の厚さは６０ｎ−であった。切 片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、観察し、７ｅｉｓｓ　１０９電子 顕微鏡で撮影した。同じ操作によってＨＩＶ感染細胞を対照として調製した。ウ ィルス表面上のにＩｔ）１６０／１２０を反映する、対照にみられる暗色に染色 された外側被覆は、免疫原には欠くことが観察された。

例■ 面清陽性患者の免疫療法 ＨＩＶに対して血清陽性を示す９例の患名を免疫療法で治療した。外側エンベロ ープタンパク質を欠く非感染性ＨＩ　Ｖ粒子からなる免疫原を例Ｉの方法に従っ て製造した。免疫原は、乳化器＜５ＤｅＸ　８０００　Ｍｉｘｅｒ　Ｈｉｌｌ　 ；Ｓｃ＋ｅｘ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｅｄｉｓｏｎ、　Ｎ、　Ｊ 、　）を用い、７０インドの不完全アジュバント（ＩＦＡ）中に１：１の割合で 乳化した。１１００Ｌ１のタンパク質を含む溶液１．０ａｅを筋肉内に投与した 。９０日後に、アジュバントを加えないでタンパク質１００μ９を皮肉注射によ ってブースター投与した。

患者の末梢血リンパ球中のＨＩＶウィルスの存在は、免疫感作の前後に、新たに 供給された、ＰＨＡおよびインターロイキン−２（ＩＬ−２）刺激末梢血リンパ 球と共培養してＧａ１ｌｏらの方法（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｈｉｃｒｏｂ、２５　 ：　１２９１．１９８７）により測定した。この文献は参考として本明細書に導 入する。ＨＩＶ抗原たとえば１）２４の存在を検出するキットは市販されている （たとえば、ＨＩＶ　ｐ２４アッセイ：　Ｅ、１．　ＤｕＰｏｎｔ　＆　Ｄｅ　 ＮｅｍｏｕｒｓＣｏ、、Ｉｎｃ、、　Ｗｉｌｇｉｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥ）　、各 患者ニツイテ、免疫感作前に３回、免疫感作後２．４．６，８．１２および１４ 週に試験を実施した。

第工表には、患者からのウィルス単離の結果を示す。

免疫感作前にはいずれもＨＩＶが重鐘された患者０１０および００３は、免疫感 作後は１２週を通じてウィルスは単離されなかった。患者Ｏｏ８および００９は 、免疫感作後８週まで培養によりウィルスは認められなかった。

これらの４例の患者はすべて、免疫感作前には抗−ｐ２４　（＞１　：５０００ ）およびＲＴＩ　（＞１　：１０００）の高力価を示していた。残りの５例の患 者は、免疫感作前の抗−ｐ２４８よＵＲＴＩ力価はもつと低かったが、免疫感作 後も単離可能なウィルスの検出が続いた。

以上、本発明を、現時点で好ましい態様を参照しながら説明したが、本発明の精 神から逸脱することなく様々な修飾が可能なことを理解すべきである。したがっ て、本発明は以下の請求の閣囲のみによって限定される。

ｆ−４ＸＶ講じ ＦＩＣｕＲε１ 国際調査報告 ｕｎｅ＋＋＋ａＩ４１１ａｌ　＾ｏｅ＋＜ａ＋ユｅ　ｂｓＰＣＴ／　ＵＳ　Ｐ　 ８　／　ｎ　１９５５−−１・−ｍ　１１４．ｐＣ〒／［１；ｌ！８１０１９５ ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．外側エンベロープタンパク質を欠く非感染性レトロウイルス粒子からなる免 疫原 ２．レトロウイルス粒子はＨＩＶ粒子である請求の範囲第１項の免疫原 ３．外側エンベロープタンパク質はｇＰ１６０およびｇＰ１２０である請求の範 囲第２項の免疫原４．レトロウイルス感染したヒトの免疫系を、そのレトロウイ ルスの非感染性プレパレーシヨンからなる免疫原の免疫学的有効量の投与によっ て刺激する方法５．レトロウイルスはＨＩＶである請求の範囲第４項の方法 ６．免疫原は、そのレトロウイルスの外側エンベロープを含まないプレパレーシ ヨンである請求の範囲第５項の方法 ７．ＨＩＶの非感染性の、外側エンベロープを含まないプレパレーシヨンを投与 することによるヒトのＨＩＶ感染を予防する方法 ８．１種または２種以上のレトロウイルスタンパク質と反応するが、そのレトロ ウイルスの外側エンベロープタンパク質とは反応しない抗体 ９．レトロウイルスはＨＩＶである請求の範囲第８項の抗体 １０．抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体である請求の範囲第９項 の抗体 １１．（ａ）レトロウイルスに感染し、高い免疫担当機能を示す個体を選択する 工程、および（ｂ）その個体によって産生された免疫グロブリンを回収する工程 からなるレトロウイルス感染症の処置に有用な免疫グロブリンの取得方法 １２．レトロウイルスはＨＩＶである請求の範囲第１１項の方法 １３．請求の範囲第１１項の方法で製造された免疫グロブリン １４．請求の範囲第８項の抗体を投与することによるレトロウイルスに感染した 個体の受動免疫治療方法１５．請求の範囲第１３項の抗体を投与することによる レトロウイルスに感染した個体の受動免疫治療方法１６．（ａ）ＨＩＶ感染した 個体からの血液をｇＰ１６０／１２０と反応性のリガンドが付着したマトリック スと体外で接触させてｇＰ１６０／１２０に対する抗体をこのマトリックスに結 合させる工程、および（ｂ）この血液を患者に戻す工程からなるＨＩＶに感染し た個体からｇＰ１６０／１２０に対する抗体を体外除去する方法１７．抗−ｇＰ １６０／１２０抗体と反応性の抗−イデイオタイプ抗体発明の詳細な説明