JPH02500564A - 細胞培養に由来するヒト上皮 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞培養に由来するヒト上皮 ｌ１二１遣 本発明は培養ヒト細胞から表皮或はその他の密着した上皮を産生ずることに関す る。

バンクスーシュレーゲル（Ｂａｎｋｓ−５ｃｈｌｅｇｅｌ）及びグリーン（Ｇｒ ｅｅｎ）　、　２９　トランスプランテーション３０８・１９８０年はヒト表皮 細胞を離解した（ｄ　ｉｓａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）細胞の媒質懸濁液中に接種す ることによって表面培養において増殖させることを記載している。これらの細胞 は増殖してコロニーになり、コロニーは融合して融合上皮を形成し、該融合上皮 を剥離して無胸腺症（ａｔｈｙｍｉｃ）マウスに移植することができる。特に、 全厚みの皮膚を無胸腺症動物からはがし、胸壁をおおう筋膜に移植片を適用した 。このような移植片は角質層を含む全ての細胞層を有する表皮を形成する。「移 植片は面積がかなり縮小されるようになるが、移植した後１０８日の長い間健全 なままである。」同上、３０８頁、しかし、移植して１０日した後に、「ヒトの 表皮はネズミのものと確実に区別することができなかった・・・・・・ことから 、移植片を検査して情報を得ることができなかった」同上、３１２頁、ヒトの外 皮は種特異性抗血清及び顕微鏡用切片を用いて識別された。

ワースト（Ｗｏｒｓｔ）　等、５３　Ｊ、Ｎａｔ、Ｃａｎ、Ｉｎ５ｔ。

１ｏ６１．１９７４年及びカラセフ（Ｋａｒａｓｅｋ）　、５１Ｊ、　Ｉｎｖｅ ｓｔ、　Ｄｅｒｍ、　２４７．１９６８年は移植した表皮細胞培養から表皮を増 殖させるためにガラス或はシリコーンチャンバーを用いることを記載している０ 表皮及び真皮を切除して筋膜にした後に創傷縁の内側にチャンバーを挿入する。

このようなチャンバーは創傷収縮を防止するが、「あらゆる移植部位において激 しい過形成が通例であった。」同上、２５１頁、更に、「移植した細胞の完全な 衰退が６週間以内にあった・・・・・・」、かかる衰退は「・・・・・・正常の 結合組織環境における変化の直接の結果・・・・・・」であろう（同上、２５１ 頁）、カラセフは、このような体外移植組織培養が「細胞培養における上皮細胞 の体性安定性に影響を与える因子の研究に実験的アプローチをもたらし得る。」 ことを示唆した（同上、２５１頁）。

クルーガ−（Ｋｒｕｅｇｅｒ）等、５フアンダメンタルアンドアプライトドクシ コロジー５１１２．１９８５年は４段階で皮膚移植するプロセスを記載している 。第１段階で、皮膚移植片をラットの小窩部片の内側に入れる。後の段階で、こ の移植片を供給する大腿血管を分離し、弁を皮下トンネルに通してラットの背側 に取り出して適所に縫合する。

及豆二ＪＪ１ 本発明等は、ケラチノサイトと生きている非ヒト動物の皮下結合組織とを接触さ せることによって培養ケラチノサイトから上皮を産生ずる方法を見出した。ケラ チノサイトなる用語は表皮を形成するそれらの細胞のみならず、また上述した湿 潤表面をした鱗状上皮を形成するそれらの細胞をも含む。

離解したケラチノサイトを初めに培養して融合性培養を形成し、次いでこれと動 物の皮下結合組織とを接触させるのが好ましい。例えば、表皮細胞を増殖させて 上皮を形成し、これをベッセル表面から剥離してその結合組織に接触させて置く 、別法として、細胞をプラスチック膜上で増殖させてサブ融合（ｓｕｂｃｏｎｆ ｌｕｅｎｃｅ）にし、膜に依然結合させたまま、直接移植床に適用することがで きよう。どちらの場合でも、移植片を、皮筋層を含有する皮下結合組織から成る 弁の内面に適用する。

ケラチノサイトと動物組織とを接触させる一つの方法は動物の皮膚の弁を切開し 、融合性培養（例えば上皮シート）を弁の下に入れ、次いで元の位置で縫合する ことを含む、第２の方法では、融合性培養成は上皮シートを同じようにして適用 し、細胞にヒト表皮を形成させ、弁を次いで外転して表皮を保持する内面を慕露 させる。第３の方法では、皮膚の弁を外転して動物に定着させた後に融合性培養 成は上皮シートを所定の位置に置く、移植片として用いる上皮シートを表皮細胞 から培養で増殖させ及びそれを簡便に移植床に適用するためにプラスチック膜上 に置いてもよい。

本発明は代表的なヒト表皮を、生きている動物に移植する培養ヒト表皮細胞から ７日以内で産生ずる方法を提供する。生成した表皮は収縮を相対的にほとんど受 けず、及びどの層がヒト表皮であって、どの層が受容動物の表皮であるかが容易 に明らかである０作り出された表皮もまた組織学的に正常である。

上記の方法は、調査研究及び毒物学研究に十分なヒト表皮を提供する０例えば、 化粧品等の化学物質をヒト表皮上で、或は他の種類のケラチノサイトー角膜、結 膜、口、食道及び腟−全で表皮細胞について説明したのと同じ技法によって増殖 させることができるーから成るヒト湿潤表面をした鱗状上皮上で試験することが 可能である。その他の研究は特定の化学物質のトランス表皮吸収、老化作用、表 皮機能に関する変異の発現を含む、最後に、予め細胞に導入した外因性遺伝子の ヒト表皮における発現を研究することが可能である。

発明のその他の特徴及び利点は下記の発明の好ましい実施態様の記載及び請求の 範囲の記載から明らかになる初めに、図を簡単に説明することにする。

【■ 第１図及び第２図は移植技法を図示するものである。

第３図はマウス表皮及びヒト表皮移植片の断面図である。

第４図はヒト表皮移植片の断面図である。

友蓬 発明の好ましい移植方法は、総括的には基底の細胞層を有する培養ヒト上皮を宿 主動物の皮膚の下面上の皮下結合組織に接触させて置くことを含む、この結合組 織層を最も容易に分裂される層において高められる皮膚弁の内面において暴露さ せ、げっ歯頚動物では、この結合組織は皮筋層を含有する。こうして、弁に存在 する層は表皮、真皮及び皮下結合ａ織（上に挙げたバンクスーシュレーゲル及び グリーンに述べられていることに反して皮筋屡を含む）を含む、動物の体幹上に 露出される層は胸壁筋である。

上皮を一旦皮下結合組織に適用すれば、弁はその元の位置か或は新しい位置のい ずれかで取り替えられる。このような方法の２つの例を下記に挙げる。これらの 例は発明を制限する意味ではなく、当業者であれば、多くの均等の技術を創案す ることができ及びそれらは発明に含まれることを了解するものと思う。

下記の例において、動物は全てタコニック（丁ａｃｏｎｊｃ）ファームにューヨ ーク）から得た。雄或は雌のマウスはＮＩＨスイスホモ（ｎｕ／ｎｕ）或はＣ５ ７Ｂ　１／６ホモ系のものでかつ少なくとも８−１００週齢或は体重１９〜２０ ｇ）であった、ラットはＴａｃ：Ｎ：ＮＩＨ−ｒｎｕ系のものであり及び少なく とも５週齢或は体重１２０ｇであった。マウスは、ナトリウムベンドパルビター ル（０，０３８ｍｇ／体重１ｇ、カリホルニア、アルカディア在アントニー（Ａ ｎｔｈｏｎｙ）プロダクツカンパニー）及びキシラジン（Ｘｙｌａｚｉｎｅ）　 ０．０７５　ｍ　ｇ　／体重１ｇ（カンサス在ハウアーーロツクハルト（Ｈａｕ ｅｒ−Ｌｏｃｋｈａｒｔ）をワースト等（５３Ｊ、Ｎａｔ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ ｓ、　１０６１゜１９７４年）に従って皮下注射して麻酔した。ラットを同様の 混合物を用い、投与量十分の−で麻酔した。

手術を完了した後に、動物を暖かい雰囲気（３０’Ｃ）中で回復させ、別々のか ごに入れた。ヌードマウスの代りに、免疫系を例えばシクロスポリン等の薬品で 抑制した動物もまた下記の方法に適している。動物は免疫応答によってヒト移植 片を拒絶しないことが必要なだけである。

旦１昌Ｅ叉 ヒト表皮細胞を新生児の包皮から得て３Ｔ３−Ｊ２細胞（ラインワルド（Ｒｈｅ ｉｎｗａｌｄ）等、６Ｃｅｌ１３３１．１９７５年）の致命的に照射したフィー ダー上で培養した。細胞接種物は培養ベッセルの寸法に応じて細胞２ＸＩＯ’か ら２Ｘ１０’に変った。培養は３〜４日毎に供給し、通常１週間以内で融合性で あった。シモン（Ｓｉｍｏｎ）及びグリーン４０Ｃｅｌ１６７７．１９８５年が 媒質の組成を記載した。任意の齢の供与体からの任意の層化鱗状上皮（角膜、結 膜、口、食道及び腟）に由来する他の細胞系を発明の方法において用いることが できる。既知の変異或は成育変化を有する系或は系統を成育させてこれらの変化 が生成する表皮に与える作用を研究することができる。

蔓」Ｌ左１」」胴 融合性培養を血清の存在しない媒質で洗浄し及びグリーン等が７６　Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ　５６６５（１９７９年）に記載する通 りにしてジスペース（Ｄｉｓｐａｓｅ）　ＩＩ　（インディアナ、インディアナ ポリス在ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ）マンハイム）の溶液で培養す ることによって培養皿の表面からそのまま剥離した。培養の元の極性を保った（ 皿の底部に面する基底細胞層）。

剥離した上皮シートを血清の存在しない媒質で２回洗浄し、次いで、該媒質を完 全に取り除いた。シリコーンゴムの矩形シートを前もって製造業者の推奨に従っ て洗浄して作った（シラスチック■（Ｓｉｌａｓｔｉｃ■）、ニューシャーン− 、ダウコーニング、厚さ　、００５或は　、０１ｍｍ）、上皮シートよりわずか に大きいシラスチック■＃１の滅菌したシートを静かにその上に付着させ及び閉 じ込められた気泡を絞り出した　（ｅｐｒｅｓｓ）　、移植片を、適用するまで 、湿ったままにしかつ３７℃で１０％のＣＯ２に暴露させた。また、他の物質で 構成される均等の不活性プラスチックシートも使用することができる。

隻１ 麻酔した動物に、全ての外科手順を、層流フードを用いて滅菌した条件下で行っ た。

Ｌ： 第１図を参照すれば、動物１２の背側の皮膚ｌＯをアルコールで消毒し、矩形弁 １４をはさみで切開して持ち上げた。弁の十分に血管化した内面を損傷しないよ うに特に基を付けた。弁よりわずかに大きいシラスチック■＃２（１６）のシー トを胸壁１８の上に装入した。鉗子の助けにより、シラスチック■＃１　（２０ ）を、その密着している上皮シート２２と共に注意深く培養皿から持ち上げて、 上皮の基底面を上に向けてシラスチック■＃２の上に付着させた。上皮をゴム冠 ポリスマンによって広げ、媒質の液滴で湿らせ続けた弁１４を移植片の上に、結 合組織２４が上皮と接触状態になるように、元の場所に戻した（第１ａ図）。次 いで、切開を縫合か或は外科用クリップで閉じた。全手順は通常１５〜２０分か かった。

１〜２週間後に移植片を収穫するために、動物を麻酔するか或は犠牲に供するか した。皮膚弁を、移植片を作るときのようにして持ち上げた。この弁は外面上に 動物表皮を及び内面上に移植片から産生されたヒト表皮を含有した。

生検材料を作り、包埋した３、７％ホルムアルデヒド及びパラフィン中に固定化 するか或は液体窒素中でスナップ凍結させるかした。５μｍのパラフィン包埋セ クションをヘマトキシリン及びエオシンで染色した。６μの凍結セクションを、 ウサギ血清抗インボルクリン（ａｎｔ−ｊｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）のＩｇＧフラク ションを用いた免疫ベル才キシダーゼ技法によって染色した。第３図を参照すれ ば、上記の技法で作った移植片を通した顕微鏡断面図は、２つの表皮被覆、すな わち、げっ歯動物表皮３０から外側とヒト表皮３２の内側とから成るサンドイッ チを示し・２つの表皮被覆は支持結合組織３４によって分離されている。マウス 表皮を最も左側に、次いで、真皮３６、皮下組織３８、筋肉４０（皮筋層）、疎 性（ルース）及び稠密（デンス）皮下結合組織３４及びヒト表皮３２を示す、ヒ ト表皮はよく発達したマルビギ一層及び粒状層、並びに厚い閉じ込められた層４ ２を含有する。

ヒト表皮は実質的にげっ線類動物表皮よりも厚く及び毛包及び脂腺等の付属器構 造を欠く、２つの上皮を結合組織で分離することは各々の部分の由来の種に関し ての混同を防止する。それでも再生された表皮のヒト由来をタンパク質抗血清を 使用して免疫ペルオキシダーゼが明らかにする通りのインボルフリンの存在する ことによって確認した。

［＝ この技法は主にラットに関して用いた。第２図を参照すれば、皮膚弁５０　（２ ｘ３ｃｍ）を例１の通りにして持ち上げたが、次いで、その内面の半分を暴露さ せるように外転した（第２図）６次いで、外転した弁を、シアノアクリレートセ メント５２（オハイオ、クリーブランド在、クイックゲル、ロックタイトコーポ レーション）を適用して所定の位置にスポット接合した。隣接する皮膚を第２ａ 図の５４に太い線で示す通りにして切開し、弁の各々の縁（周りを囲む番号１． ２．３として及び矢印４．５．６によって示す）を切開した皮膚の隣接する縁に 縫合５６で縫い合せた（第２ａ図）０反対の縁の治癒は弁に固定を与え、それで 収縮を妨げた。外転した弁５０の頂度先の皮膚５４を切開し及び同様に縫合した 。

この切開は良好な固定をもたらす程に長いが、血管新生の破壊を最小にする程に 短くするように注意した。ｏ、５〜１ｃｍの切開が有効であるようであった（第 ２ａ図）、弁の血管新生路を第２ａ図に矢印５８で示す。

第２ｂ図を参照すれば、培養した上皮６２を保持するシラスチック■のシート（ 第２ｃ図に側面図を示す）を、次いで基底層を弁５ｏの血管化の面に向けて適用 した。接着性透明ドレッシング６４にュージャージー、ニューブランズウィック 在バイオクルーシブアンドダーミクリア、ジョンンンアンドジョンソン）を適用 してシラスチック■を所定の位置に保った。ドレッシングを通常５〜７日の後に 取り除き、次いで移植片を空気に暴露させた。

この技法は例１の通りのげっ書類動物の表皮と比べて同じ位置においてであるが 、弁を外転することによって空気に暴露させたヒト表皮を形成するに至る０表皮 は同様に厚く、よく組織化され、丈夫であり（第４図）、高い倍率で、ヒト表皮 ７０及び下層の結合組織７２のみを示す。

別法として、第３の例で、弁を、例１の技法によって移植した後にいつか外転す ることができた。これは、培養上皮が、外部空気に暴露される前に成熟した表皮 を形成するのを可能にする。例えば、例１の通りに移植して８日の後に、弁を露 出させて十分に形成されたヒト表皮が２週間或はそれ以上の期間にわたって観察 された。

移植片の収縮はこれらの技法によって相当に低減される、これは、おそらく、皮 下結合組織及び真皮を除かないためであろう、加えて、例２の通りにして弁の縁 を切開して縫合すれば、移植片床を固定してその収縮をおくうせるようである。

友１立１月 本明細書に記載する移植技法は、ヒト表皮の構造及び機能に関する種々の研究に 応用することができる。例１に示す技法をヒト表皮細胞への遺伝子導入の研究に 用いた。このタイプの移植片は、また、角膜、結膜、口、食道、腟（全て表皮細 胞と同じ方法で培養して増殖させることができる）等の湿潤表面の鱗状上皮の研 究に用いることもできる。

例２に示す技法は、角化した層が脱水された自然状態のヒト表皮の研究用に好ま しい０例えば、トランスエビダーマル吸収及び毒性に関する研究をかかる移植片 について行うことができる０表皮機能に与える老化作用及び変異の発現もまた研 究することができる。受容床の一部が、移植片を小さくするか或は後に表皮の一 部を取り除くかのいずれかでヒト表皮によって被覆されないままである場合、細 胞は増加し、外側に移り、露出された結合組織を一層おおう。これはヒトの表皮 創傷の治癒についてのモデルであり、かかる治癒を促進すると考えられる薬剤の 効果を評価するのに使用することができる。培養を生成するのに極めて小さい生 検材料で十分であるので、多くの動物に関して均一な物質を産生ずることができ 、よって、実験を十分管理することができる。

その他の用途は下記を含む＝（ａ）毒性物質によるヒト表皮の交互作用を研究す ること、これらの研究では、物質を適用してから症候群が発症するまでの時間を 測定し、種々のクリームの保護作用を研究することができる。（ｂ）ヒトの皮膚 が化合物を新陳代謝させる能力を研究すること。（ｃ）薬剤が皮膚を通過する薬 物送出を増進させるのに与える作用を研究すること。

その他の実施態様は次の請求の範囲内にある。

特表平：２−５ｏｏ５６４（５） −ゝ＼ト ＦＩＧ、　４ 国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．離解ヒトケラチノサイトを培養し、ヒトケラチノサイトと生きている非ヒト 動物の皮下結合組織とを接触させることを含む、上皮シートの増殖方法。
2. ２．離解ヒトケラチノサイトを培養して融合性培養を形成し、該融合性培養と前 記動物の皮下結合組織とを接触させることを含む請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記融合性培養を接触させる前にプラスチック膜上に置く請求の範囲第２項 記載の方法。
4. ４．離解ケラチノサイトをプラスチック膜上で増殖させてサブ融合にして前記皮 下結合組織と接触させる請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．更に、前記動物の皮膚の弁を切開し及び前記培養ケラチノサイトを前記弁の 下に位置させることを含む請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
6. ６．更に、前記培養ケラチノサイトを前記弁に接触状態に位置させた後に前記皮 膚の弁を前記動物に定着させることを含む請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．前記ケラチノサイトを前記弁の下に位置させた後に、弁の下に成熟した表皮 を形成させ、弁及び表皮を外転する請求の範囲第５項記載の方法。
8. ８．更に（ａ）前記動物の皮膚の弁を切開し、（ｂ）前記皮膚を外転して該皮膚 の内面を露出させ、（ｃ）前記ケラチノサイトを該皮膚の内面に接触するように 位置させることを含む請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
9. ９．更に、前記ケラチノサイトを前記弁に接触するように位置させた後に、該皮 膚の弁を前記動物に定着させることを含む請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．離散させたケラチノサイトが、接触させる前に培養で増殖させて上皮を形 成する表皮細胞である請求の範囲第２項記載の方法。
11. １１．前記皮下結合組織が前記動物の真皮に隣接する請求の範囲第１項又は第２ 項記載の方法。
12. １２．前記皮下結合組織が皮筋層を含有する請求の範囲第１項又は第２項記載の 方法。