JPH02500802A - 哺乳動物宿主細胞における組込部位非依存性遺伝子発現のためのベクター - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ベクター 発」坏と１賢 本発明は、組み換えＤＮＡ技術に関し、特に、イン・ビボおよびイン・ビトロで 哺乳動物細胞を形質転換して所望の構造遺伝子の発現が得られるようにするのに 有用であるベクターに関する。

２１廊と１量 高レベルの発現を示す、改良されたベクターに対する要求が絶えない。特定の発 現においては、所要のポリペプチドの製造のためにも遺伝子障害治療の発展のた めにも、哺乳動物の細胞系に用いる発現ベクターがますます重要になっている。

特徴的な構造遺伝子の例が多数知られており、これらは適切な調節配列と一緒に 適当なベクターに挿入され、宿主細胞の形質転換に使用することができる。この ような構造遺伝子と調節領域を哺乳動物のゲノムに組み込む際に重要となってい る問題は、発現が挿入された配列のゲノム中の位置に大きく依存することがわか ったことである。この組込部位依存の問題が、本発明により解決される。本発明 は、本明細書において「優性アクティベーター配列（ｄｏｍｉｏｎａｎｔ　ａｃ ｔｉｖａｔｏｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　）　Ｊ　（または、「優性調節領域（ｄ ｏｍｉｎａｎｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｉｏｎｓ）　Ｊ　（ＤＣＲｓ）　）と 呼ばれる配列の発見に基づいており、これは連鎖した遺　伝子系に、細胞型（ｃ ｅｌｌ−ｔｙｐｅ）により限定され、組込部位非依存性であり、およびコピー数 依存性の特徴を与える性質を持っている。

ヒトのβ一様グロビン遺伝子は、第１１染色体の短腕（ｓｈｏｒｔａｒｍ　）に 約６０ｋｂのＤＮＡからなる、５　’　−εＧ　ｒ　Ａ　ｒ−δ−β−３′の順 序にある５遺伝子のクラスターである。それぞれの遺伝子が発展的にかつ組織特 異的に発現される。即ち、胎児ε−遺伝子は卵黄嚢で発現され、胎児Ｇｒ−およ び＾Ｔ−遺伝子は主に胎児の肝臓で発現され、成人Ｔ−およびβ−遺伝子は主に 骨髄で発現される（Ｍａｎｉａｔｉｓほか、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、。

（１９８４）　１４．１４５−１７８参照）。この遺伝子群の変異体は遺伝子疾 患の最も広範な遺伝子群を構成し、その大多数が、点変異による単純なアミノ酸 変化から遺伝子座の完全な欠落に到るまで既に特徴付がわかっている（［ａｌｌ ｉｎｓほか、Ｆｒｏｇ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ。

Ｒｅｓ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、、（１９８４）、　３１．３１５−４６２参照 ）。これらは、深刻な治療上の問題や早死を引き起こすことが多い。こうした疾 患の通常の治療（輸血）は、費用が高くつき、リスクが伴い、しかも多くの場合 不十分である。本発明は、例えば遺伝子治療（ｌｏｃｋほか、Ｎａｔｕｒｅ、（ １９８６）、　３２０．２７５−２７７）による、このような障害の治療法を提 供するものである。

ヒトβ−グロビン遺伝子を調節するＤＮＡ配列は、翻訳部位の５′および３”の 両方に存在する（Ｗｒ　ｉｇｈｔほか、Ｃｅ１１．　（１９８４）、３８．　２ ６５−２７３；　Ｃｈａｒｎａｙほか、Ｃｅ１１．　（１９８４）、３８゜２５ １−２６３）。マ　ウスの赤白血病細胞（ＭＥＬ）とに５６２細胞を使用して、 ヒトβ−グロビン遺伝子の適切な発現に必要である少なくとも４つの別々の調節 要素（ｅｌｅｍｅｎｔ　）が確認されている：正に作用するグロビン特異的プロ モータ、負と推定される調節プロモータ、および２つの下流にある調節配列（エ ンハンサ−）であって、１つはその遺伝子内にあり、他の１つは該遺伝子から約 ８００ｂｐ下流にある（Ａｎｔｏｎｉｏｕほか、［ＥＭＢＯＪ、。

（１９８８）、　７（２）、３７７−３８４　’）。同様のエンハンサ−が、培 養されたニワ）　ＩＪの赤芽球細胞を用いて、ニワトリβ−グロビンの下うした 下流エンハンサ−は、形質転換したマウスを用いて、発生段階特異的エンハンサ −であることがわかっている（７０６０）。したがって、こうした結果のすべて が、β−グロビンの多数の発生特異的調節領域がβ−グロビンの厘バー５°側内 側と３′側に位置していることを示している。

しかし、これらの調節遺伝子全部を含むβ−グロビン遺伝子を形質転換したマウ スに導入すると、この遺伝子はマウスβ−グロビンと同レベルでは発現されず、 組込部位依存の影響が示される。これは、形質転換遺伝子の発現が大きく変化し 易いという特徴を示すが、このことはマウスのゲノムに注入された遺伝子のコピ ー数とは相互関連性を有しない形質転換されたマウスで研究されたほとんどすべ ての遺伝子において、同じ現象が認められている（Ｐａｌｍｉｔｅｒほか、Ａｎ ｎ、　Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔｏ、＜１９８６）。

遺伝子の発現レベルは、良くても、内生のマウス遺伝子の大きＫｏｌｌｉａｓほ か、Ｃｅ１ｌ、（１９８６）、　４６．８９−９４＞　。同様の問題が、β−グ ロビン遺伝子または他の遺伝子をトランスフェクションあるいはレトロウィルス 感染によって培養細胞に導入した時にも認められる。このことは、幹細胞に遺伝 子を追加することで行う遺伝子治療を考慮すると、大きな問題を提起するもので ある。これはまた、組繊細胞から組み換えＤＮＡ産物を発現させるに当たっても 大きな問題である。高生産性クローンを得るだめの広範囲のスクリーニングはそ のベクターが最適に発現される細胞系を同定するのに必要であり、ベクター増殖 のために選択を行うことは天然に存在する遺伝子、例えば赤白血痰細胞系のβ− グロビン遺伝子の発現レベルに匹敵する発現レベルを達成するのに一般に必要で ある。

β−グロビン系の研究は、地中海貧血（タラセミア）のようなヘモグロビン異常 症の解析により助けられてきた（νａｎ　ｄｅｒＰｌｏｅｇほか、Ｎａｔｕｒｅ 、（１９８０）、　２８３．６３７−６４２；　Ｃｕｒｔｉｎほか、Ｉｎ：　Ｈ ａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ：　Ｆｉｆｔｈ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎ ｃｅ　ｏｎ　Ｈａｅｍｏｇｌｏ−ｂｉｎ　Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ、　Ｗａｓｈｉｎ ｇｔｏｎ　ＩＪ、　Ｇ、　Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ、ＡｌａｎＲ ９Ｌｉｓｓ　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８７）　ｏオランダ地中海貧 血（Ｄｕｔｃｈ　ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ）は、β−グロビン遺伝子の上流１ ００ｋｂを除去する大規模な欠落によるヘテロ接合であるが、上記の調節領域を 含めβ−グロビン遺伝子は無傷のまま残している（Ｃｅ１ｌ、（１９８４）、　 ３８．２６５−２７３；　Ｔａｒａｍｅｌｌｉほか、ＮＡＲ，（１９８６）。

１４．７０１７−７０２９）。患者はへテロ接合の状態にあり、正常な遺伝子座 を同じ核内で転写するので、ある調節メカニズムが変異遺伝子座中の遺伝子を直 に囲んでいる調節配列の働きに対し優先して働いているのかもしれない。オラン ダＴβ−地中海貧血の場合には、観測された影響について２つの説胡が可能であ る。

即ち、シス（ｃｉｓ　）作用の正の要素（ｅｌｅｍｅｎｔ　）が除かれているか 、あるいは不活発なりロマチン配置内に負に作用する因子が挿入されていて古典 的な位置効果のごとく挙動する（Ｋｉｏｕｓｓｉｓほか、Ｎａｔｕｒｅ、（１９ ８３）、３０６．　６６２−６６６）。

染色体では、遺伝物質はＤＮＡの利用を一定の機能に限定する効果を有するクロ マチンと称されるＤＮＡ／タンパク質複合体の中に包み込まれている。多くの遺 伝子系（β−グロビン系を含む）が所謂ＤＮアーゼ過敏部位（ｈｙｐｅｒｓｅｎ ｓｉｔｉｖｅ　５ｉｔｅ）を持つことが、はっきりしている。このような部位は 、推定調節領域の一例であり、ここでは正常なりロマチン構造が、トランス作用 する調節領域との相互作用が可能であるように変えられている。

ε−グロビン遺伝子の上流、β−グロビン遺伝子の下流の領域（複数）であって 、多数の「超」過敏部位を含んでいる領域が確認されている。これらの部位は、 発現されるとき、個々の遺伝子中にまたはその周りに見出される部位に比べ、核 内でのＤＮアーゼに対してより感受件が高い（Ｔｕａｎほか、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ 。

す、どのグロビン遺伝子が発現するときにも存在する。

テユアン（Ｔｕａｎ）ほかは、「β一様」グロビン遺伝子の５゜境界域にある４ つの主要なりＮアーゼＩ過敏部位の広い地図作成（ｍａｐｐｉｎｇ）を記載して いる。著者らは、これらの部位のある配列特徴が多くの転写エンハンサ−にも見 出されることを示し、これら部位もエンハンサ−機能を有し赤芽球細胞因子によ ってＷａｌｌされる可能性のあることを示唆している。

本発明は、無傷の５°および３゛境界域を伴うβ−グロビン遺伝子座は組込部位 依存性を示さないという発見に基づいている。この重要な特性を担う遺伝子座の 領域が決定され、ＤＮアーゼ超過敏部位に対応することがわかった。これらの優 性アクティベーター領域は、エンハンサ−とは全く異なり、公知のエンハンサ− によって示されない組込部位非依存性等の性質を示す。公知のプロモーター／エ ンハンサ−要素と結合して用いられる優性アクティベーター配列は、天然の遺伝 子の完全な発現を再構成する。ＤＮアーゼ■「超」過敏部位と優性アクティベー ター領域の間の本発明の一部として形成された結合は、β−グロビン遺伝子系以 外の遺伝子系にまで本発明を数行させる。

例えば、ヒトのβ−グロビン遺伝子を、組込部位非依存状態で形質転換マウスで 機能的に発現させることができる。ヒ）Ｔ−リンパ球（Ｔ−細胞）は骨髄で生産 され、体内で異物抗原に応答する免疫学的性質を発達させる胸腺内で成熟する。

Ｔ−細胞は高度に組織特異的に製造される。Ｔ−細胞は特異的細胞マーカーを有 することがみとめられた（Ｂｅｒｎａｒｄほか、“ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＴｙｐｉ ｎｇ”、Ｂｄ、Ｂｅｒｎａｒｃｌほか、ｐ４１．　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌ ａｇ、Ｂｅｒｌｉｎａｎｄ　Ｎｅｗ　ＹＯｒｋ、　１９８４）このようなマーカ ーのひとつが、ＣＤ２の記号で知られるＥ−ロセット　（ｒｏｓｅｔｔｔｅ）　 レセプターである。このＣＤ２の構造およびＣＤ２遺伝子は大きな研究テーマで あった（Ｂｒｏｗｎほか、Ｍａｔｈ、　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍ、、（１９８７）、　 １５０゜５３６−５４７　ａｎｄ　Ｌａｎｇ、　Ｇ、ほか、ＢＭＢＯＪ、（１９ ８８）、　７（６）、　１６７５−１６８２　’）。本発明の優先日ののちに公 表された論文において、ＣＤ２遺伝子を含む大きなフラグメントのコピー数依存 性の性質が述べられ、このようなフラグメントがβ−グロビンで見出される配列 と類似の配列を形成する遺伝子座を含むことが示唆されている。ＤＮアーゼ「超 」過敏部位が該フラグメントのなかにすでに確認され、本発明の優性アクティベ ーター配列であることがわかった。

本発明は形質転換動物の生産にも適用でき、そのような製造技術は今日広く知ら れている。参考に、ジエーニッシュ、サイエンス（Ｊａｅｎｉｓｈ、　５ｃｉｅ ｎｃｅ）、　（１９８８）、２４０．１４６８〜１４７４頁参照。　本発明は、 発現の組込部位依存性の問題を解決し、機能的に活性な遺伝子系を、イン・ビト ロおよびイン・ビボの両方において哺乳動物のゲノムのなかに挿入することを可 能にする。転写レベルを有利に増加させる特定の配列も確認された。

発明の要約 本発明によると、遺伝子を哺乳動物の宿主細胞の遺伝物質に、該遺伝子が宿主細 胞により発現されるように組込むためのベクターであって、プロモーター及び前 記の遺伝子を含有するものにおいて、該ベクターが、前記遺伝子の発現にあたり 、宿主細胞型（ｃｅｌｌ−ｔｙｐｅ　）により限定され、組込部位非依存性で、 コピー数依存性の発現を誘導することができる優性アクティベータ配列を含むこ とを特徴とするベクターが提供される。

本明細書で用いられる、「優性アクティベーター配列」の用語は、この優性アク ティベーター配列と調和する宿主細胞のゲノムに組み込まれたときに、宿主細胞 の型に限定され、組込部位に依存せず、コピー数に依存する発現をする性質を、 結合された遺伝子発現系に与えることができるＤＮＡ配列を意味する。

このような優性アクティベーター配列は、宿主細胞の染色体内に完全に再構成さ れたときにはこの性質を維持する。宿主細胞の型に限定された発現を有効に指示 する能力は、相同の染色体（たとえば、β−グロビンの染色体１１番）の異なる 部分または全く異なる染色体とともに異種のバックグラウンド中に完全に再構成 されたときでも保持される。

本発明の優性アクティベーター配列はＤＮＡのクロマチン構造を開き、それをよ り接近しゃすいものにして遺伝子座オルガナイザーとして作用するものと仮定さ れる。優性アクティベーター配列は、天然に存在する遺伝子系に対応するもしく はそれに由来する単一の隣接した配列によるかもしれないし、またはポリヌクレ オチドが介在しあるいは介在しないで相互に結合された２以上のこのような配列 からなるかもしれない。

優性アクティベーター配列は組み換えＤＮＡ技術によって、天然に存在する遺伝 子系から誘導することができ、または天然に存在する遺伝子系に関係する配列デ ータからポリヌクレオチド合成の公知技術を用いて製造できるという意味におい て、天然に存在する遺伝子系に対応しているかもしれない。優性アクティベータ ー配列の機能を変更しないで配列の変更をおこなうことはできる。

好ましくは、優性アクティベーター配列が誘導される、またはそれが対応する天 然に存在する遺伝子系は、高度に宿主細胞の種類によって限定された発現特性を 好ましくは高いレベルで示す系である。このような系の具体例は、β−グロビン 系のようなヘモグロビン系およびＣＤ２にのようなリンパ球である。

優性アクティベーター配列は、誘導されたものでも、あるいは１または２以上の ＤＮアーゼＩ「超」過敏部位に対応するものでも、細胞特異的発現をおこなうこ とができるいずれかの遺伝子系のみからなることがこのましい。しかし、その他 の配列が、優性アクティベーター配列の機能的な特徴を示す可能性はある。天然 に存在する優性アクティベーター配列が１または２以上のポリヌクレオチド配列 を介在させることによって分離された２以上のサブ配列を含む場合には、１また は２以上の介在配列の全てまたは一部が存在しない状態で結合された２以上のサ ブ配列を含んでいてもよい。すなわち、天然に存在する遺伝子座の優性アクティ ベーター配列が、非機能的配列の介在によって分離された２以上の別々のサブ配 列を含む場合には、（たとえば、２以上の「超」過敏性部位）、本発明のベクタ ーは、除去された介在配列の全てまたは一部と共に結合した、２以上のサブ配列 を含む優性アクティベーター配列を備えていてもよい。　本明細書で用いられる 「ベクター」の用語は、ＤＮＡを一つの細胞から別の細胞に移すことができる組 み換えＤ　Ｎ’　Ａ物質を、その最も広い意味において意味する。

ベクターは、線状または環状である単一のＤＮＡ片であってもよいし、本発明の 本質的に機能的な部分に加え、特定の利用に必要なようなその他の配列を含んで いてもよい。例えば、ベクターは、一種または二種以上の選択可能なマーカー遺 伝子のような別の特徴、および／または翻訳もしくはクローン化産物の生産の側 面を助ける特徴を含んでいてもよい。組み込みに適したベクターは、優性アクテ ィベーター配列と非依存性構造遺伝子発現系を含む孤立したＤＮＡ配列からのみ なる。

このＤＮＡ配列はいずれの末端においても他の実質的なりＮＡ配列には結合され ない。しかし、この孤立したＤＮＡ配列には、複製のためのベクターに結合する だめのリンカ−が備わっていてもよいし、またはその一端もしくは両端にゲノム への組み込みを助ける配列が備わっていてもよい。

このベクターは哺乳動物の宿主細胞のなかに組み込むことができる「小遺伝子座 」　（“ｍ１ｎｉ　１ｏｃｕｓ”）を決定し、この宿主細胞において宿主細胞の 型に限定され、組込部位に依存せず、コピー数に依存した状態で自らを再構築す ることができる。

本発明は、好ましくはプラスミドの形で、優性アクティベーター配列を含む伝達 ベクターをも提供する。このようなベクターは、組み込み用ベクターの構築に有 用である。

本明細書で用いる「遺伝子」の用語は、ＤＮＡ配列、好ましくはポリペプチドを コードする構造遺伝子を含む意味を有する。

このポリペプチドは例えば薬物として商業的に有用であるポリペプチドであって もよいし、宿主細胞にとって全く異種ものもであってもよい。あるいは、この遺 伝子は宿主細胞内で欠落しているまたは変異するポリペプチドをコードするもの でもよい。

哺乳動物の宿主細胞は、本発明のベクターを取り込みやすい如何なる哺乳動物の 宿主細胞でもよい。ベクターＤＮＡは、トンスフェクション、感染、マイクロイ ンジェション、細胞融合、またはプロトプラスト融合によって哺乳動物の宿主細 胞に伝達することができる。宿主細胞は生きているヒトまたは動物の細胞でもよ い。特に、宿主細胞はマウスのような形質転換動物の細胞でもよい。宿主細胞は 骨髄細胞のようなヒトの幹細胞でもよい。宿主細胞は優性アクティベーター配列 が機能する組織、例えばβ−グロビン遺伝子座の場合の赤芽球細胞、から誘導さ れてもよい。

プロモーターは、宿主細胞内で機能できる何れのプロモーターでもよく、例えば 哺乳動物もしくはウィルスのプロモーターでもよい。場合によっては、該プロモ ーターは優性アクティベーター配列の遺伝子座と相同的であってもよいしく例え ば、β−グロビン遺伝子　プロモーター）、また別のプロモーターと一列に並ん で存在してもよい（例えば、β−グロビンプロモーターとウィルスのｔｋもしく はＳＶ４０プロモーター）、１以上のエンハンサ一部分を含んでいてもよい。

以下に説明する本発明の一実施態様においては、優性アクティベーター配列はβ −グロビン遺伝子座から誘導される。上述したように、β−グロビン遺伝子座は 、優性アクティベーター領域を構成する、多数のＤＮＡアーゼ■「超」過敏部位 を含んでいる（’ｌ”ｕａｎ他、上掲）参照。優性アクティベーター配列はβ− グロビン遺伝子内にｉｇ忍されているＤＮアーゼＩ「超」過敏部位を１または２ 以上含んでいる。好ましくは、これらは該遺伝子座の５′境界に由来し、場合に よっては３゛境界配列を伴ってもよい。優性アクティベーター配列は、β−グロ ビン遺伝子座内のε−グロビン遺伝子の直ぐ上流側にある一１ｋｂ　Ｃ１ａｌな いし一２２ｋｂ　Ｂｇ］Ｉｔの２１ｋｂのフラグメント内にあるこの領域は四つ のＤＮアーゼ■「超」過敏部位を介在したポリヌクレオチドとともに含む（五つ の異なる部位のうち二つは互いに非常に接近している）。好ましくは、介在する ヌクレオチドの一部または全てが公知の技術例えばエキソヌクレアーゼによる消 化を用いて除去される。

β−グロビン遺伝子座の優性アクティベーター配列のきりつめた形（ｒｅｄｕｃ ｅｄ　ｆｏｒｍ）のものを製造した。これは遺伝子発現連鎖系をかなり高いレベ ルで発現する。これは次の四つのフラグメントを結合して製造された。

この優性アクティベーター配列（ここでは「小遺伝子座」という）は、特定の遺 伝子発現系を活性化するために「カセット」として用いられる６、５ｋｂのフラ グメントである。

以下に説明する本発明の第二の実施態様においては、優性アクティベーター配列 はＣＤ２遺伝子座から誘導される。ＣＤ２遺伝子座は三つの「超」過敏部位を含 む。一つは該遺伝子座の５′境界にあり、他の二つは該遺伝子座の３°境界にあ る。好ましくは、この優性アクティベーターはＣＤ２遺伝子座内に、１または２ 以上のＤＮＮアーゼ「超」過敏部位を含む。最も好ましくは、優性アクティベー ター配列は遺伝子座の３′境界に由来する両方の「超」過敏部位を含み、介在配 列の全体またはその一部は場合によっては除去されていてもよい。この優性アク ティベーター配列は、ＣＤ２遺伝子に対して３′の位置にある５、５ｋｂのＢａ ｍＨＩないしＸｂａＩのフラグメント内に含まれている。本発明の別の様相にお いては、本発明のベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養することを含 むポリペプチドの製造方法が提供される。

この方法は、イン・ビトロで所要のポリペプチドを製造するのに適用できる。さ らに、この方法はイン・ビボで動物にとってなんら治療的価値のないポリペプチ ドを製造するのにも適用できる。このようなポリペプチドの製造方法はヒトまた は動物の体を治療する方法として考えられるものではない。

本発明の別の様相においては、欠陥のある哺乳動物の遺伝子を置き換えまたは補 充することによってヒトまたは動物の体を治療する方法にベクターを使用できる 。

ヒトまたは動物の体の多くの疾患が一定の遺伝子産物の生産不全によっている。

本発明のベクターの特徴により、このベクターはイン・ビボにおける遺伝子治療 により欠陥を治療するのに広汎に適したものとなっている。

本発明により遺伝子治療の方法が提供され、これはヒトもしくは動物の体から幹 細胞を除去し、体内に残っている幹細胞を殺し、除去した幹細胞をヒトもしくは 動物の体内に不足または、欠けている遺伝子を含む本発明のベクターで形質転換 し、その形質転換した幹細胞をヒトまたは動物の体内に戻す工程を含んでいる。

この方法は、ヒトまたは動物内に欠けている遺伝子を置き換えたり補充するのに 使用することができる。例えば、β−地中海貧血のようなヘモグロビン異常症を 患うヒトは、活性で高発現性β−グロビン遺伝子座を挿入して不十分なβ−ヘモ グロビンを完全にすることで治療可能であろう。あるいは、免疫系の不全は、Ｃ Ｄ２遺伝子座ベクターで治療可能であろう。

この方法はアデノシン・デアミナーゼ欠乏症（ＡＤＡ症候群）または重度の免疫 不全合併症候群（ＳＣＩＤ症候群）を治療するのに使用できよう。

骨髄は幹細胞の適切な供給源であり、リンパ球と赤芽球細胞の両者の前駆体を含 有しているという利点がある。あるいは、その他の組織を体から取り除きき、ト ランスフェションするかあるいは他の方法で本発明のベクターを供給し次いで体 内に戻し入れることができよう。

さて本発明を、添付の図面に関して実施例により説明する。

図面の簡単な説明 図１は、ε−グロビン遺伝子に対して５°のＤＮアーゼ■超過敏部位の地図付け を示す。パネルＡ−Ｃは地図付は実験を図解するニトロセルロースフィルターを 表し、パネルＤはこれらの実験で用いられた３種の制限酵素についてのε−グロ ビン遺伝子のβ−グロビン遺伝子座上流部の制限地図を示す。プローブの位置と 超過敏部位をマークしである。

図２は、β−グロビン遺伝子の超過敏部位３゛を地図づけるのに行われた図１の 実験に対応する実験を示す。

図３は、ヒトβ−グロビン「小」遺伝子座　の構成を示す。

図４は、ヒトβ−グロビン・形質転換遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の構造分析 を示す（図４には、４Ａ、４Ｂ、４Ｃが含まれる）。

図５は、マウス内におけるヒトβ−グロビン・形質転換遺伝子の発現分析を示す （図５には、５Ａ、５Ｂ、５Ｃ，５Ｄが含まれる）。

図６は、種々のマウス組織内におけるヒトβ−グロビンＤＮＡの生産を示す（ｙ ｓ＝卵黄嚢、１ｖ＝胎児肝臓、ｂｒ＝脳）。

図７は、形質転換された小β−グロビン遺伝子座上のＤＮアーゼエ過敏部位の再 構成を示す。

図８は、プラスミドＧ５Ｂ１３６４．１３６５．１３６６の構築を示す。

図９は、プラスミドＧ５Ｂ１３５９．１４００．１４０１．１３５７の構築を示 す。

図１０は、ヒトβ−グロビンの発現を示す。

図１１は、ＣＤ２過敏部位の地図付けを示す。

図１２は、Ｔｈｙ　−Ｉ　ＣＤ２構築体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　）を示す。

図１３は、形質転換マウスの胸腺と脳におけるＴｈｙ　−１の分布を示す。

図１４は、β−グロビンＣＤ２構築体の構築を示す。

図１５は、図１４の構築体を有する形質転換マウスのゲノムＤＮＡを示す。

実施例１ 優性調節領域がβ−グロビン遺伝子座のフランキング領域に存在するか否を決定 するために、β−グロビン構築体にこのような領域を含ませることにより、実験 を行った。このような配列が組込部位位置効果に感応するようであるならば、（ １）該構築体の発現レベルは形質転換マウス中のそのコピー数に直接関係してい る、（２）１つの遺伝子コピー当たりの発現レベルが各マウスにおいて同じであ る、（３）多分、導入された遺伝子はマウス遺伝子の発現レベルに匹敵するレベ ルで発現される、ことが予想される。５゛および３”配列を試験する前に、過敏 部位の位置を注意深く地図付けすることが重要であった、というのはこれらの正 確な位置、特に３°側において、は詳しく公表されていないからである（テユア ンはか、１９８５）。

赤芽球細胞の核の非常に限定されたＤＮアーゼ■消化が、ε−グロビン遺伝子座 の上流とβ−グロビン遺伝子の下流において、ＤＮアーゼに非常に高い感受性を 示す部位の存在を示した（テユアンほか、１９８５）。私達は、私らのコスミド （Ｔａｒａｍｅｌｌｉほか、１９８６）　。図１は、種々の制限酵素で再切断し 、サザーンブロッティングをし、ε−グロビン遺伝子の上流で多数のプローブと ハイブリッド形成させたＨＥＬ細胞（ＭａｒｔｉｎおよびＰａｐａｙａｎｎｏｐ ｏｕｌｏｕ、　１９８２　）とＰＵＴＫＯ細胞（Ｋｌｅｉｎほか、１９８０）の 核のＤＮアーゼエ消化の時間経過を示す（図１ｄ）。

４つの過敏部位が、ε−グロビン遺伝子の上流の１８ｋｂ（Ｎ［ｌ１）　、１５ ｋｂ　（ＮＣＬ２）　、１２．　Ｏｋｂおよび１１．　５ｋｂ　（Ｎｏ、３　ａ 。

３ｂ）、並びに５．４ｋｂに存在する。Ｎ（Ｌ　１．３ａ１４の部位が、消化の 時間経過の早い段階で現れることから判断されるように、強い過敏部位である。

ＮｃＬ２と３ｂの部位は、より弱い部位で消化の過程で遅く現れる。図１におい て、実験の詳細は下記のとおりであった： パネルＡ ＨＥＬ細胞の核をＤＮアーゼ（６０μｇ／−）と３７℃でインキュベートシ、ア リコート（一定分量）を各トラック（通路）の上に示した時刻（分）に反応物か ら除いた。約１０’のＨＢＬの核のアリコートを、ＤＮアーゼの不存在下（Ｏｅ ｎｚ、）、＾１ｕ）３０単位もしくは旧ｎｆ１６０単位の存在下、３７℃で１５ 分間インキュベートした。ＤＮＡをプロテアーゼにで消化後精製し、Ａｓｐ　７ １８で再切断し、０．６％アガロースゲルで分画し、ニトロセルロースに移し、 ε−グロビン遺伝子プローブ（Ｂａｍ−Ｂｃ。

１．４ｋｂ）で探査した。

パネルＢ ＤＮＮアーゼで消化したパネルＡの試料をＢｇｌＩ［で再切断し、３．３　ｋｂ 　ＢｃｏＲＩフラグメントで探査した。該フラグメントは、１２゜０および５． ８ｋｂのバンドのほかに、フィルターを０．３　Ｘ５ＳＣ６５℃のストリンジエ ンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）で洗浄後に６，８ｋｂの交差反応バンドも検知 するが、０．１　ｘ　ＳＳＣ６５℃での洗浄では認められない（図示せず）。

パネルＣ ＰＵＴＫＯ細胞の核をＤＮアーゼ■（２０μｇ／−）で３７℃において消化し、 １．２．４および８分後に反応物から試料を除いた。

約１０７の核のアリコートを３７℃で８分間ＤＮ了−ゼ■の不存在下で（レーン ０ｅｎｚ、）インキュベートした。ＢａｍＨＩによる再切断、ゲル電気泳動、お よびニトロセルロースへの移行の後、フルターを０．４６ｋｂ　ＢｃｏＲＩ−Ｂ ｇｌ　ＩＩプローブとハイブリッド形成させ、洗浄して最終ストリンジエンシー ０．３　ｘＳＳＣ／６５℃とした。

パネルＤ 該パネルは、これらの実験で使用された３種の制限酵素についての、ε−グロビ ン遺伝子の上流にあるβ−グロビン遺伝子座の制限地図を示す。プローブの位置 、およびＨＥＬおよびＰＵＴＫＯのクロマチン中のＤＮアーゼ過敏部位の推論さ れた位置がマークされている。

成人β−グロビン遺伝子のＤＮＮアーゼ過敏部位３°の正確な位置を、２種類の シングルコピーＤＮＡプローブと、ＤＮ了−ゼ■で消化されたＨＥＬ核の数種類 の制限酵素による消化物を用いて決定した。図２（Ａ−Ｄ）に要約したデータは ２．３ｋｂ　ＢｇｌＨのフラグメントと２．４ｋｂ　ＨｉｎｄｌＩＩのフラグメ ントの間で、ヒトβ−グロビン遺伝子の２０ｋｂ　３’　の位置に唯一のＤＮア ーゼ■過敏部位が存在することを示す（図２Ｅ）。（＠似の結果がＤＮＮアーゼ で消化したＰＵＴＫＯの核についても得られたくデータを示さず））。

図２において、実験の詳細は次のとおりであった。

パネルＡ−Ｄは、ＨＥＬ細胞のＤＮアーゼ１で消化した核由来のＤＮＡで、表示 した制限酵素で再切断し１．１５　ｋｂのＥｃｏＲＩまたは１．ｌｋｂのＨｉｎ ｄＩＩＩ−Ｂａｍ７ラグメントのいずれかでプローブしたものを示す。両方のＤ ＮＡプローブはいくつかのヒトの繰り返しＤＮＡを含み、該ＤＮＡは余備ハイブ リッド形成およびハイブリッド形成の緩衝液１ｉあたり剪断したヒ）ＤＮＡＩＯ μｇの使用を必要とするものであった。フィルターを洗浄し、６５℃における最 終ストリンジエンシーを０．３ｘＳＳＣとした。

パネルＥはβ−グロビン遺伝子のβ−グロビン遺伝子座３゛の制限地図を示す。

用いられた２種のプローブと、３’　Ｈ３Ｓ部位の位置がマークされている。Ｈ ３Ｓ５の位置はＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで再切断したＤＮＡ試料を１． １５　ＥｃｏＲＩプローブで探査することによって確認したくデータを図示せず ）。

β−グロビン「小」遺伝子座の構成 グロビン「小」遺伝子座の（図３）は、次の三つの領域から構築された（詳しい 説明は、後述の「材料および方法」参照）：ε−グロビン遺伝子（−１ｋｂ　Ｃ ］ａＩ　〜−２２ｋｂＢｇｌＩ［Ｉ）の直ぐ上流にあり、四つの過敏部位すべて （図１）を含む２１ｋｂ領域、β−グロビン遺伝子とこの遺伝子の直ぐ内側およ び周囲にあるすべての公知の調節配列を含む４．７ｋｂ（ＢｇｌＩＩｌ、）フラ グメント、並びにβ−グロビン遺伝子（＋１２ｋｂ　ＫｐｎＩ〜＋２４ｋｂ　Ｂ ａｍＨＩ）の下流にあり、下流の過敏部位（図２）を含む１２ｋｂ領域である。

これらの領域は独特のリンカ−を含みまたは備えていて、独特の制限部位（Ｓａ ｌｌ、　Ｘｈｏｌ、　Ｃ１ａｌ、　ＫｍｎＩ、　Ｐｖｕｌ）を創成しており、コ スミドｐ　Ｔ　ＣＦ　（Ｇｒｏｓｖｅｌｃｌほか、１９８２）の中にクローニン グされた。３８ｋｂの全挿入体が該コスミドから５ａｌｌフラグメントとして切 り出され、低融点アガロースから精製され、受精マウス卵（Ｋｏｌｌ　ｉａｓほ か、１９８６）内に注入された。

図３には、ヒトβ−グロビン遺伝子座が最上に示され、サイズはキロベース（ｋ ｂ）で示されている。第２のラインはβ−グロビン「小」遺伝子座を示し、いく つかの独特の制限部位もともに示しである。連結した直線は、フラグメントのβ −グロビン遺伝子座内における元々の位置を示す。ＥｃｏＲｌ、ＢａｍＨＩおよ びＨｉｎｄＩＩＩについての、「小」遺伝子座内の制限酵素フラグメントはｋｂ 単位で示されている。５′　フランキング領域（Ｅ　ｃ　ｏ　Ｂ　ｇ　Ｉ　Ｏ， ４６）、β−グロビン遺伝子（ＢａｍＥｃｏＯ，７ＩＶＳＩＩ）および３°　フ ランキング領域（Ｅｃ。

１、１５）についてのハイブソッド形成プローブは一番下に示されマウス卵の最 初の注入は、ＤＮＡ濃度２μｇ／ｍｐ！で行い、該卵をマウスへ移植により戻し たが、全く成果（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）は得られなかった（理由は不明）。一連 の注入をＤＮＡ６度０．５〜１μｇ　／　ｍｌで数回行い、懐胎の１２．５日後 または１３．５日後に胎児を集めた。ＤＮＡを各胎盤から調製し、サザーンブロ ッティングを行い、ヒトβ−グロビンプローブでハイブリッド形成させて形質転 換されたマウスの数を測定した（Ｋｏｌｌｉａｓほか、１９８６、により説明さ れているように）。形質転換ＤＮＡを次にＥｃｏＲＩで消化させ、サザーンブロ ッティングを行い、ヒトβ−グロビンプローブとマウス’ｒｈｙ−１プローブ（ 単一コピー）とハイブリッド形成させて各マウスに組み込まれた遺伝子数を測定 した（図４Ａおよび表■、頁参照）。これらの数値は１回の挿入（マウス３３と ３８）から細胞当たり１００コピー（マウス２１）まで変化した。次いで、挿入 されたＤＮＡがそのまま組み込まれたか、あるいは欠落および／または再配置が 注入後に起こったかどうかを測定した。全ＤＮＡをＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩ ＩＩで消化し、サザーンブロッティングを行い、完全な構築体（ｃｏｎｓｔｒｕ ｃｔ）の存在を探査した。特に、０．４６ｋｂＢｇｌＩＩプローブ（図３）を構 築体の５′末端における１５ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントを検出するのに用い （図４Ｂ）、また１、１５ｋｂ　ＥｃｏＲＩプローブ（図３）を構築体の３゛末 端における１４，６ｋ　ｂ　Ｂ　ａ　ｍＨＩまたは１８ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩフ ラグメントを検出するのに使用した（図４Ｃ）。形質転換マウスの一つの除いて 全てが、正確に大きさが定められたフラグメントの存在により判断されるように 、−列に並んで組み込まれた（図示せず）無傷の「小」β−グロビン遺伝子座を 有するようであった。しかし、コントロールの混合ＤＮＡが完全に消化されたに もかかわらず（方法参照）、遺伝子座の３°末端における１３ａｍＨＩおよびＨ ｉｎｄＩ［部位（図４，６）は、切断に対し大きな抵抗性を有することは注目す べきである。これにより、完全に消化されるＢａｍＨＩフラグメント（１４，６ ｋｂ）およびＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（１８ｋｂ）よりも大きい部分的切断 バンドを生じる。形質転換マウス３８が、β−グロビン「小」遺伝子座の完全な コピーを保持しなかった唯一のマウスである。このマウスに存在する唯一のコピ ーは、β−グロビン遺伝子の上流においてＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩの部位を 喪失していた、Ｅ　ＣＯＲＩ　Ｂは残存されているのに。このことは、このマウ スでは、過敏部位領域全体を含む３゛フランキングＤＮＡ全てが欠落してしまっ たことを示す。

図４において、実験の詳細は次のとおりである。

パネルＡ 約５μｇの胎盤または卵黄嚢のＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ゲル電気泳動の後 サザーンブロッティングし、ヒトβ−グロビン　Ｂａｍ−Ｅｃｏ　ＩＶＳＩＩプ ローブまたはマウスＴｈｙ　−１プローブとハイブリッド形成させた。ゲルは、 種々の照射量でデンシトメータ走査して定量した。マウス１７のＤＮＡは部分的 に劣下していたので、低Ｍ、Ｗ、交差反応バンド（ｃｒｏｓｓｈｙｂｒｉｄｉｚ ｉｎｇ　ｂａｎｄ）を用いて、該試料の定量を行った。挿入物（ｉｎｓｅｔ）　 （グロビン・ハイブリッド形成の高照射）は低いコピ胎盤または卵黄嚢のＤＮＡ をＢａｍＨＴで消化し、サザーンブロッティングし、５゛　フランキングプロー ブ（Ｅｃｏ−Ｂｇｌ　０．４６．図３）とハイブリッド形成させた。

パネルＣ 胎盤または卵黄嚢のＤＮＡをＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、サザー ンブロッティングし、３°　フランキングプローブ（ＥＣＯ１，１５，図３）。

全パネルにおいて、Ｂｓ　ｔＥＩＩまたはＨｉｎｄＩＩで消化されたＤＮＡ由来 のマーカーＤＮＡ混合物を用いた。形質転換マウスは最上に示され、空白のレー ンは非形質転換マウス由来のＤＮＡ試料を含む。サイズはキロベース（ｋｂ）単 位である。

コントロールの混合ＤＮＡは完全に消化された（図示せず）にもかかわらず、Ｄ ＮＡ試料のいくつかが部分的に消化される。

これにより、−列の並びにおける次のＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ部位での 切断によって、１４．６ｋｂ　ＢａｍＨＩ　（１４，６ｋｂ十３．２　ｋ　ｂ＋ ３．３　ｋ　ｂ）または１８ｋｂ　ＨｉｎｄＩｎのフラグメント　（１８ｋ　ｂ ＋２．４　ｋ　ｂ＋３．４　ｋ　ｂ）より大きいバンドヒトβ−グロビン遺伝子 の活性を測定するために、ＲＮＡをすべての形質転換したおよび非形質転換のマ ウス（肝臓、血液および脳）から調製し、Ｓ１ヌクレア一ゼ保護分析法により分 析した。図５Ａは肝臓ＲＮＡの５“　ヒトβ−グロビンによる分析を示し、図５ Ｂは内部コントロールとして３°マウスβ−グロビン・プローブとマウスα−グ ロビン・プローブの存在下におけるヒトβ−グロビンＲＮＡの３′末端の分析を 示す。これらの結果は、ヒトβ−グロビン遺伝子が正しく開始されポリアデニル 化されていること、およびＲＮＡの濃度が各マウスの「小」遺伝子座のコピー数 に比例することを示す（ただし、２４および３８を除く。下記参照）。さらに、 非赤芽球組織では全く発現がみられなっかった（図示せず）。ヒトβ−／マウス β−グロビンＲＮＡのレベルの比（頁、表１参照）をＨｕｌｌ細胞コントロール （Ｚａｖｏｄｎｙほか、１９８３）に比較すると、発現レベルは、明らかに非常 に高い。後者の細胞系は、ヒトｘ−１１イ１イブリッド染色体上のヒトβ−グロ ビン遺伝子座を含有する、マウスの赤白血痰（ＭＥＬ）細胞系である。これらマ ウスでの発現レベルを注意深く定量するために、β−グロビン遺伝子座の無傷の コピーをそれぞれ一つおよび二つもっているマウス３３と１２におけるＲＮＡレ ベルを分析した。二つの例外であるマウス２４と３８は、同一の特異的活性を有 するマウスおよびヒトのβ−グロビン・プローブで分析した。図５０は、ヒトβ −グロビン遺伝子のシグナルが、マウス３３でのマウスα−グロビンニ倍体のシ グナルの約半分であり、マウス１２におけるものと同じであることを示す。この ことは、マウス１２の赤血球と時間経過を合わせたコントロールとを溶菌し、タ ンパク質をトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）酸尿素ゲル（Ａｌｔｅｒほか、１９８０） を通した際に、タンパク質濃度において確認される。

形質転換マウス１２が等しいレベルでマウスおよびヒトのβ−グロビン・タンパ クを発現することは明らかである（図５Ｄ）。

これらの全データから、マウス２４と３８では発現が減退するが、前記マウスに おける各ヒトβ−グロビン遺伝子は完全に活性であると、即ちマウスβ−グロビ ン遺伝子と同等のレベルで活性であると結論された。マウス２１と１７では、− 風変わった状況が見出される。これらのマウスではマウスβ−グロビンＲＮＡの レベルが非常に低く、これは多分ヒトβ−グロビン遺伝子のコピー数が非常に多 く、その結果、ｍＲＮＡ　（およびタンパク）のレベルが非常に高いためである と考えられる。この大きなコピー数は、多分、転写因子に対する競合をもたらし くマウスβ−グロビンＲＮＡがマウスα−グロビンＲＮＡより少なくなる。図５ Ｂ）、他方高レベルのβ−グロビン・タンパクは明らかに貧血（α−地中海貧血 ）をもたらす。マウス２１と１７は、成熟赤血球の破壊およびそれに伴うｍＲＮ Ａの喪失とをもっていた。

二つのマウス（３８と２４）は比較的低量のヒトβ−グロビンを発現するので、 例外である（図５Ａ、　Ｂ、　Ｃ，表１゜頁参照）。マウス３８の状況は、これ が遺伝子座の５“末端に欠落があるただ一つの形質転換マウスであるという事実 により説明される。結果として、ヒトβ−グロビン遺伝子はなお発現されるが、 小さいβ−グロビン・フラグメントをマウスに導入した時にちょうど見出される ように、位置依存的にかつ低レベルで発現される（Ｋｏｌｌ　ｉａｓほか、１９ ８６　；　Ｍａｇｒａｍほか、１９８５　；　Ｔｏｗｎｅｓほか、１９８５）。

マウス２４は遺伝子座に一見してわかる欠陥はもたない。このマウスが真に例外 である可能性、即ちこのマウスがキメラマウスであるのか、または不活発なＸ− 染色体上に組み込まれた形でβ−グロビン遺伝子座をもっているのかを調べた。

ＤＮＡを卵黄嚢、脳および胎児肝臓（“赤芽球”組織）から分離し、サザーンプ ロット上のＥｃｏＲＩで消化したＤＮＡをヒトβ−グロビンプローブおよびマウ スＴｈｙ−１プローブとハイブリッド形成させて、内生単一コピー遺伝子に対す るβ−グロビン・トランス遺伝子を検出した。図６は、胎児の肝ｍＤＮＡ１０μ ｇは卵黄嚢ＤＮＡ５μｇがもつ半分よりも少ないグロビンシグナルを含み、即ち ２５％の肝臓細胞よりもはるかに少ないβ−グロビン遺伝子を含むことを示す。

従って、これはキメラマウスであり、これにおいてはβ−グロビン小遺伝子座は 赤芽球組織（胎児肝臓）で体現が劣るのであり、これによりこれら細胞における ヒトβ−グロビンｍＲＮＡの低レベルが説明される。このことから、遺伝子座が 影響されない場合には発現レベルとＤＮＡコピー数との間には完全な相互関係が あること、各遺伝子はすべての形質転換マウスで完全に発現されることが、結論 される。図５において、実験の詳細は下記のとおりであった。

パネルＡ 種々のマウス（番号を最上に付す）由来の１２．５日または１３．５日経過の肝 臓からのＲＮＡ５μｇを、先に説明されているようにして（Ｋｏｌｌ　ｉａｓほ か、１９８６）Ｓｌヌクレアーゼ保護法により分析した。５°　ヒトβ−グロビ ンプローブの保護されたフラグメント（β−グロビン遺伝子を欠＜ＩＶＳ　Ｉ由 来の５２５　ｂｐ　Ａｃｃ　Ｉ）は１６０ｎｔ　（５’　βｇｌｏ　）である。

入力（ｉｎｐｕｔ）プローブは、ｉｐと示す。マーカー（ｍ）は旧ｎｆ　Ｉで消 化されたｐＢＲ３２２ＤＮＡであり、サイズはヌクレオチド単位で示されている 。

パネルＢ パネルＡと同様にして、ただし２種のプロニブを用いてＲＮＡ５μｇを分析した 。一つは、ヒトβ−グロビン遺伝子の３゛プローブ（７６０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ− ＭｓｐＩ）であり、２１０ｎｔ保護フラグメント　（Ｈベータ）を生じる。もう 一つは、マウスα−グロビンプローブ（２６０ｂｐ　ＢａｍＨＩ第２エフソン・ プローブ）であり、１７０ｎｔの保護フラグメント（Ｍアルファー）を生じる。

正のコントロールはハイブリッドＭＥＬ細胞系Ｈｕｌｌ由来のＲＮＡである。マ ーカー（ｍ）はｐＢＲ３２２ｘ　Ｈｉｎｆである。

パネルＣ パネルＢと同様にしてＲＮＡ５μｇを分析した。ただし、さらに、マウスβ−ｍ ａｊ−グロビンプローブ（７３０ｂｐ第２エクソン・プローブ）を加え、１００ ｎｔ保護フラグメント（Ｍベータ）を生じた。これらプローブは同等の特異的活 性であった。プローブの活性は、Ｓ１ヌクレア一ゼ分析のために混合する前後に おいて、各プローブについて定量的アガロース、ゲル電気泳動およびオートラジ オグラフィーを施すことにより評価しｔこ（図示せず）。正のコントロールは、 Ｈｕｌｌ　ＲＮＡ　（ｈｕ）である。各プローブは、個別に、Ｈｕｌｌ由来のＲ ＮＡ　（ｈｕ）または非形質転換マウス胎児肝臓のＲＮＡ　（ｍｌ）を用いて試 験する。

パネルＤ 胎児肝臓の試料（約２０μｇ）またはヒト赤血球を８．０４０μβ中で溶解（溶 血）し、説明されているようにして（Ａｌｔｅｒほか、１９８０）グロビンタン パクを分離した。ゲルを染色してグロビンタンパク鎖を可視化した。マウス９は 、マウス１２の時間経過を合わせた非形質転換の（同−腹から生まれた）対応体 である。マウスα−グロビン、マウスβ−グロビンおよびヒトβ−グロビンの位 置を示す。

β−グロビン遺伝子座に隣接するＤＮアーゼ■過敏部位は、そのβ一様グロビン が発現されるかどうかに関係なく、検討した全ての赤芽球組織に見出される。高 レベルでヒトβ−グロビンｍＲＮＡを発現する形質転換マウスの小β−遺伝子座 においてＤＮアーゼｌ過敏部位が再構成されるかどうかを決めるために、マウス ２１　（β−遺伝子小遺伝子座のコピー数が最大のもの）の肝臓および脳の試料 少量について、ＤＮアーゼを次第に消失させるようにした。限定的なりＮアーゼ ■消化をキャリアである胎児肝臓または脳の核の存在下で行い、精製した核のＤ ＮＡをＢａｍＨＩで再切断し、分画し、サザーンブロッティングを行い、次いで 全構築体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）にわたるフラグメントをハイブリッド形成プロ ーブとして使用した。ＨＥＬおよびＰＵＴＫＯの細胞内の３゛過敏位を検出する のに用いられた１、１５Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩプローブは、１７．８ｋｂ　ＢａｍＨ Ｉフラグメントを検出するが、これは注入されたフラグメントの３”末端にある ＢａｍＨＩ部位の部分的消化によるものである。１７．８ｋｂＢａｍＨＩフラグ メントは、マウス２１の肝臓の核における限定的なりＮアーゼ１消化に対しては 完全に不感受性である（図７Ｅ）、６００ｂｐ　ＡｃｃＩ　５’　ヒトβ−グロ ビンプローブで同じフィルターを再探査したところ、高度に転写されたヒトβ− グロビン遺伝子の５°末端（−１４６０ｂｐまで）を含む２．Ｏｋｂ　ＢａｍＨ ＩフラグメントがＤＮアーゼ１消化に対し少々感受性があり、約１ｋｂのＤＮア ーゼ１サブバンドを示しく図７Ｄ）、β−グロビン遺伝子プロモーター内の過敏 部位（Ｇｒｏｖｄｉｎｅほか、１９８３）と合致することがわかった。

同じフィルターを０．４６ＥｃｏＲＩ　ＧｂｌＩＩプローブで再探査したところ （図ＩＣ）、過敏部位２．３ａおよび４を含む１５ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメン トが胎児肝臓の核でのＤＮＮアーゼ消化に非常に感受性が高いこと、部位３およ び４での切断に対応するサブバンドが明確に肉眼で認めることができる。トラン ス遺伝千手β遺伝子座の同じ１５ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントは、同じ動物の 脳の核でＤＮアーゼ消化に対し不感受性である（図示せず）。形質転換遺伝子座 の３．ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメン）（過敏部位Ｎ［ｌ　１を含む）も、肝臓で ＤＮＮアーゼ消化に対し非常に感受性が高いガ、マウス２１の脳の核ではそうで はない（図７Ａ、Ｂ）。

要するに、５°フランキング領域はＤＮアーゼ消化に対し非常に感受性が高く、 組織特異的に過敏部位を保持している。驚くべきことに、３゛　フランキング領 域はＤＮアーゼ消化に対し不感受性であり、超過敏憧部位は保持されていない。

プロモーターにおける通常の過敏１生は存在する（Ｇｒｏｕｄｉｎｅほか、１９ ８３）。

図７において、実験の詳細は下記のとおりである。

マウス２１組織の核を、１−当たり５μｇのＤＮアーゼとともに、３７℃で０． １．２．４および８分間インキュベートしく肝臓の核）、または０，１，２．５ および１０分間インキュベートした（脳の核）。核のアリコートを、ＤＮアーゼ の不存在下で８または１０分間インキュベートした（レーンＯｅｎｚ、　）。

精製ＤＮＡをＢａｍＨＩで再切断し、０．６％アガロースゲル上テ分画し、ニト ロセルロースへ移し、形質転換ヒトβ−グロビン小遺伝子座の範囲にわたるＤＮ Ａフラグメントで探査（プローブ）した（パネルＡ−Ｅ）。

パネルＥにおいてプローブＤによって検出された１４．０ｋｂＢａｍＨＩフラグ メントは、小β−グロビン遺伝子座の一列の並びの接合フラグメントである。１ ７．５ｋｂバンドは不完全なりａｍＨＩ消化の結果である。

パネルＦは、マウス２１における小遺伝子座の一列の並びの繰り返し単位を概略 的に表したものであり、ＤＮアーゼ過敏部位がマークされている。部位５は胎児 肝臓の核内で再編成されない（パネルＦ）。Ｈ３ＳＩおよび２に対応するＤＮＮ アーゼサブバンドは、ＤＮＮアーゼ消失（ｆａｄｅｏｕｔ）実験では見られない が、それらが中に存在しているＢａｍＨＩフラグメントは肝臓でＤＮＴ下ゼ■消 化に対し感受性がある（パネルＡおよびＣ）、しかし脳ではそうではない（パネ ルＢ１データ示さず）。

表　１ ヒトβ−グロビンのＲＮＡ及びＤＮＡのレベル１７　４２、　０４　４７．　２ ’　０．９２１　Ｎ、Ｄ、”　＞１００　Ｎ、Ｄ。

２４　０．３　キメラ’　Ｎ、Ｄ。

２７　１０．２　１１．８　０．８５ ３３　０．５　０．５　１．０ ３６　１０．１　８．７　１．１５ ３８　＜　０．１　０．４　＜　０．２５１全数値が、いくつかの実験の、種々 の時間感光させたオートラジオグラフィーのデンシトメータ走査の後、マウス１ ２を１．０として標準化された（例、図４Ｄ、５Ｃ参照）。

２これらの比は、ヒトβ−グロビンＲＮＡおよびＤＮＡのシグナルを、それぞれ 、マウスα−グロビンＲＮＡおよびＴｈｙ　−ＤＮＡについて得られたシグナル で除して得られた。マウス３４ＲＮＡはただ１つの実験で測定され、含まれてい ない。

３マウス１７のＤＮＡは部分的に劣化させられた（図４参照）。

そこで、コピー数を定量するために、（劣化した８ｋｂ　ＥｃｏＲＩＴｈｙ−１ バンドよりもむしろ）　Ｔｈｙ　−１プロツト上の低Ｍ、　Ｗ、交差反応バンド を用いた。

４ヒトβ−グロビン／マウスグロビンＲＮＡの比はこのマウスでは正確に測定さ れなかった（Ｎ、　Ｄ、　）。マウスＲＮＡシブナルに対してヒトのシグナルが 余りに強かったからである（本明細書本文参照）。

５マウス４２４はヒトβ−グロビン遺伝子についてキメラであり、（図６）、そ のため定量できなかった。

３８ｋｂの５ａｌＩフラグメントをゲル電気泳動によってコスミドベクターから 精製し、説明されているように注入用に調製した（Ｋｏｌｌ　ｉａｓほか、１９ ８６　；　Ｂｒ１ｎｓｔｅｒほか、１９８５）。

形質転換胎児を胎盤ＤＮＡのサザーンプロット分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ。

１９７５）ｌこよって確言忍した。

ＲＮＡ分析 種々の組織のＲＮＡ抽出およびＳ１ヌクレア一ゼ保護分析を、先に記載のように して実施した（Ｋｏｌｌｉａｓほか、１９８　Ｂ）。

ＤＮアーゼエ感受性 ＤＮアーゼ■感受性分析をＥｎｖｅｒほか（１９８４）によって説明されている ようにして、分離した核について行った、ただし緩衝液Ａに１ｍＭ　ＣａＣ１， を加えたもののなかでＤＮアＴＡを加えた。形質転換肝臓および脳の場合には、 時間経過を合わせた正常な胎児由来の４種の肝臓と脳をキャリアとして加えて、 十分な材料を供給して分析を行った。

（１）　１２　ｋ　ｂ　Ｂ　ｇ　ＤＩフラグメント　（β−グロビンの１０〜２ ２ｋｂ　５°）をＣｌａＩ部位のないコスミドｐＴＣＦ　（Ｇｒｏｓｖｅｌｄほ か、１９８２）のＢａｍＨＩ部位にクローニングした一＋ｃｏｓＨｇ　Ｂ１２゜ （２）ｃｏｓＨＧ　Ｂ１２をＡｓｐ７１８で切断しくε−グロビンの１３．５ｋ ｂ　５°）、独特のＸｈｏｌリンカ−を挿入した→ｃｏｓ　ＨＧ　Ｂ１２Ｘ０ （３）ε−グロビン上流域全体を含むｃ　ｏ　ｓ　ＨＧ　１４．２　（Ｔａｒａ ｍｅｌ　ｌｉほか、１９８６）もＤｐｎＩで切断し、ＸｈｏＩリンカ−を挿入し 、パッケージングした→ｃ　ｏ　ｓ　ＨＧ　１４．２Ｘ。

（４）ｐＵｃ１８のＸｂａＩ部位にＣ１ａＩリンカ−を挿入した→ｐＵｃ１８ｃ ０ （５）β−グロビン遺伝子を含む４．７ｋｂ　ＢｇＩ［Ｉフラグメントを、ｐＵ ｃ１８ｃのＢａｍＨＩ部位に挿入した一ｐＵｃ１８ｃｍＢ（６）Ｃｌａ部位を欠 くコスミドｐ’ｒｃＦのＨｐ　ａ　Ｉ−ＢａｍＨＩの中に１２ｋｂ　ＨｐａＩ− ＢａｍＨＩフラグメント（β−グロビンの１２〜２４ｋｂ　３’）をクローニン グした→Ｃ０５ＨＧ　ＨＥ１１゜ （７）最後のコスミド構築体を４種のフラグメントの結合およびパッケージング として組み立てた。当該コスミドと上流側配列の一部を含むｃｏｓ　ＨＧ　ｂ１ ２Ｘ由来の１６．５ｋｂ　ＰｖｕＩ−ＸｈｏＩ　フラグメント；上流側配列の残 りの部分を含むＣｏｓ　ＨＧ　１４．２Ｘ由来の１ｌｋｂ　Ｘｈｏｌ−Ｃ１ａｌ フラグメント；β−グロビン遺伝子を含むｐＵｃ１８ｃｍＢＧ由来の４．７ｋｂ 　ＣｌａＩ−Ｋｐｎｌフラグメント；および３”　フランキング領域を含むｃｏ ｓ　ＨＧ　ＨＢ由来の１９ｋｂ　ＫｐｎＩ−ＨｐａＩフラグメント、並びにパッ ケージングのための第２のコスミド→ｃｏｓＨＧｒ小」遺伝子座（図３）。

上流領域および下流領域によって隣接されたヒトβ−グロビン遺伝子を遺伝子転 換マウスに導入すると、位置非依存性でコピー数に直接関係した発現パターンが 得られ、そのヒトβ−グロビンｍＲＮＡの発現レベルはマウスβ−グロビンｍＲ ＮＡの高い発現レベルと同等である。これは、β−グロビン遺伝子のみ（Ｍａｇ ｒａｍほか、１９８５　：　Ｃｈａｄａほか、１９８５　；　Ｔｏｗｎａｅｓほ か、１９８５　；　Ｋｏｌｌｉａｓほか、１９８６．１９８７）、またはイムノ グロブリン遺伝子のような他の遺伝子（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｔｌほか、１９８’４ ）、アルブミン遺伝子（Ｐｉｎｋｅｒｔほか、１９８７）、Ｔｈｙ−１遺伝子（ Ｋｏｌｌｉａｓほか、１９８７）、ΔＦＰ遺伝子（Ｈａｍｍｅｒほか、１９８７ ）並びに多くのその他のものを用いた従来の形質転換マウスでみられた発現パタ ーンとは異なっている。今日までの全ての形質転換マウス実験における位置効果 の結果として、形質転換による発現のレベルは最高のレベルには到らず、種々の マウス間でも異なっていた。即ち、形質転換遺伝子のコピー数と発現レベルの間 にははきつりした相互関係が存在しなかった。従って、全ての実験が正確に定量 測定することが非常に困難であったし、その結果、例えばある遺伝子における複 数の調節要素間の協力関係を調べることは不可能であった。本実施例で述べられ た結果は、この問題がβ−グロビン遺伝子について克服できることを示す。無傷 の小遺伝子座を含有するマウスにおいて見られる発現レベルは、組み込まれた遺 伝子数に正比例することは明らかである（表１）。さらに、そうしたマウスの全 てにおいてヒトβ−グロビン遺伝子一つあたりの発現レベルは、内生のマウスβ −グロビン遺伝子についてみられるそれと全く同等である（図５）。従って、β −グロビン遺伝子座フランキング配列は、それ自体は赤芽球特異的であるβ−グ ロビン遺伝子に位置非依存性発現を付与する、と結論される。さらに、β−グロ ビン遺伝子発現に関与する調節配列の全てがこの構築体の中に含まれている、と 結論される。

遺伝子治療 優性調節領域の諸性質にとって最も興味深い応用は、し）。

ウィルスベクターまたはトランスフェクション系においてβ−グロビン（および おそらくその他の遺伝子）の発現を完全に調節できそうであるということである 。このような系における遺伝子発現は現在のところ位置依存性であり非効率的で ある。特に、現在遺伝子を造血の（またはその他の）幹細胞に移入するただ一つ の効率的な方法であるレトロウィルスベクター系は、そのレトロウィルスベクタ ーの組み込み位置に対し非常に感受性が高い（［：ｏｎｅほか、１９８７）。し かし、グロビン優性調節領域を含めるとこの問題を解決することができ、十分に 活性で単一コピーのヒトグロビン遺伝子を造血幹細胞に効率よく伝達追加するこ とによる遺伝子治療の基礎を形成することになろう。

実施例２ 五つの５’　ＤＮＮアーゼ「超」過敏部位（Ｈ３Ｓ）のうち四つを含むβ−グロ ビン「小遺伝子座」を構築した。下に説明した方法は一般的であり、得られた小 遺伝子座は発現レベルの有利な向上を示す。従って、下記に説明する方法は、他 の遺伝子の優性アクティベーター領域から他の小遺伝子座を構築するのにも適用 できる。

β−グロビン小遺伝子座の構築方法 ｔｋｎｅｏ遺伝子を含有するベクターに、四つの５°　ＤＮＮアーゼ過敏部位と ヒトβ−グロビン遺伝子を入れるのに必要なりＮＡ！作を容易にするために、プ ラスミドベクターｐＵＣ１８のＡａｔ　２およびＢｖｕ　２の部位の間にオリゴ ヌクレオチドを挿入することによって一連のポリリンカーベクターを構築し、プ ラスミドＧＳＥ　１３６４、ＧＳＥ　１３６５、およびＧＳＥ　１３６６を発生 させた（図８参照）。種々のポＩＪ　ＩＪンカーベクター内につくられた独特の 制限部位に、必要なり　Ｎ　Ａフラグメントをクローニングした。特に：１、Ｄ Ｎアーゼ　Ｈ３Ｉを含む２．１ｋｂ　ＸｂａＩ　−ＸｂａＩフラグメントを、Ｇ ＳＥ１３６４のＸｂａＩ８位へクローニングした。

２、　１．９ｋｂのＨｉｎｄ　ｌｌｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉｎ７ラグメントをＨ３Ｉを 有するプラスミドのＨｉｎｄ　ＩＩＩＲ位にクローニングし、正常なヒトβ−グ ロビン遺伝子座においてみられるのと同じ方向性でＨ３Ｓ　１および２を有する プラスミドを得た。３゜ＤＮ了−ゼＩ　Ｈ８Ｓ　３を含む１．５ｋｂ　Ａｓｐ７ １８−３ａｌＩフラグメントを、ＤＮＡポリメラーゼ・デオキシヌクレオチド・ ポリフォスフェートのクレノーフラグメントで処理して平滑末端とし、ＧＳＥ１ ３６５のＨｉｎｄ　ＩＩ部位へクローニングした。

４、ＤＮアーゼＩ　Ｈ３Ｓ４を含む１．ｌｋｂの部分的な５ａｃＩフラグメント を同様にして平滑末端とし、Ｈ３Ｓ３を有するプラスミドのＳｍａ　Ｉ部位にク ローニングしてＨ３Ｓ３およびＨ３Ｓ４を正常なヒトβ−グロビン遺伝子座で見 出されるのと同じ方向性で備えたプラスミドを得た。

５、　１．５６ｋｂの５′　フランキング配列と１．８４ｋｂの３“　フランキ ング配列を備えたヒトβ−グロビン遺伝子の正常なコピーを含有する４、９ｋｂ のＢｇｌｌＩフラグメントを、ＧＳＥ　１３６６のＢａｍＨＩ部位にクローニン グした。

６、　ヘルペス・シンプレックス・ウィルス（Ｈ３Ｖ）チミジン・キナーゼ（ｔ ｋ）プロモーターであって、Ｔｎ５ネオマイシン耐性遺伝子の発現を誘導するも のと、Ｈ３Ｖ　ｔｋ遺伝子の３°ポリアデニル化配列とを含む、２．Ｏｋｂの部 分的Ｎａｒ■フラグメントを、ヒトβ−グロビン遺伝子を有するプラスミドのＮ ａｒＩ部位にクローニングした。

７、四つのＨ３Ｓ、ヒトβ−グロビン遺伝子およびｔｋｎｅｏ遺伝子を三つのフ ラグメント結合反応で結合した。該結合反応で、Ｈ８Ｓ　１および２のＰｖｕＩ −ＢｓｔＥ］Ｉ７ラグメントを、Ｈ３Ｓ３および４のＢｓｔＥＩＩ　Ｃ１ａＩ７ ラグメント、並びにβ−グロビン遺伝子とｔｋｎｅｏ遺伝子を含有するプラスミ ドのＣ１ａＩ−ＰｖｕＩフラグメントと用いた。

最終構築体は、マウスの赤白血病細胞（ＭＥＬ＞内でヒトβ−グロビン遺伝子の 宿主細胞染色体内における組み込み位置に依存しないで該ＤＮＡの高レベルでの 発現を指令することがわかった。β−グロビン発現のレベルは遺伝子のコピー数 に関係β−グロビン遺伝子に対するＤＮアーゼＩ　Ｈ３Ｓの位置の変化の影響を 試験するために、上記の実施例２に記載したＤＮアーゼＩ　Ｈ３Ｓフラグメント を、６，５ｋｂのＮｏｔｌ制限フラグメントが得られるようにクローニングした 。このＤＮＡフラグメントをｔｋｎｅｏ遺伝子を２．７ｋｂ部分的ＥｃｏＲＩフ ラグメントを、そしてヒトβ−グロビン遺伝子を４．９ｋｂ　Ｂｇｌ■フラグメ ントとして含む２種類の異なるプラスミドの中の独特のＮｏｔ１部位に、上述の ようにして、両方の方向性でクローニングした。

二ツ（７）ｔｋｎｅｏ　β−グロビンプラスミドはβ−グロビン遺伝子の方向性 が異なり、両方の方向性を持つ６．５ｋｂ　Ｎ５ＴＩフラグメントのクローニン グによって４種のプラスミドＧＳＥ１３５９、ＧＳＥ１４００、ＧＳＥ１４０１ およびＧＳＥ　１３５７が図９に示す様に生成した。

図９に示した４種のプラスミドのＤＮＡは制限酵素Ｐｖｕ　Ｉで消化することに よって直線化された。ＤＮＡはエタノール沈澱法によって回収され、１０％子牛 脂児の血清および抗生物質が添加されたαＭＥＭ培地で指数関数的に増殖するＭ ＥＬ細胞中に導入された。

ＭＥＬ細胞（約１０７）は遠心分離（１０００ｇ、１０分間）で集められ、ＥＳ Ｖ緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，０，１４０ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ 　ＫＣＩ）で一度洗浄し、直線状にされたプラスミドＤＮＡ　１００Ｍｇを含む ＥＳＶ１ｍｌ中に再浮遊された。氷上で１０分間インキュベーションを行った後 、２４ウ工ル組織培養プレー）　（Ｎｕｎｃ）のウェル内に細胞を入れ、フエツ ハー（）Ｉａｅｆｆｅｒ）の“プロ・ジェニタ−（Ｐｒｏ　ｇｅｎｉｔｏｒ）” 電気シＢ’／り装置を用い２５０　Ｖ／Ｃｍの電圧勾配で１０ｍｓのショックを 与えた（Ａｎｔｏｎｉｏｕｓほか、ＥＭＢＯＪ、（１９８８）、？、３’？？− ３８４）。

細胞を、３７℃のαＭＥＭおよび１０％の子牛血清４０ｒｎ１の中に２４時間に わたり回収した。そして、組織培地を１０％の子牛血清と１ｍ１．当り８００■ のＧ４１８　（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を含むαＭＥＭに変えることによって、０ ４１８選択を適用した。１１日間の選択の後、０４１８耐性細胞集団を遠心分離 で回収した。１０％の子牛血清と２％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ＢＤ Ｈ）を含むαＭＥＭにおいて増殖させることにより、ＲＮＡとＤＮＡを生産させ 、培養の一部を赤芽球の分化がおこるように誘導した。４日間の後、集団を回収 し、ＲＮＡを細胞を３Ｍ　ＬｉＣ１６Ｍ尿素中でホモジナイズすることによって 調製した。

４℃で一夜音波処理とインキュベーションを行った後、ＲＮＡを沈澱させノーザ ンプロット分析で分析した。非誘発（−）または誘発（＋）のＭＥＬ細胞集団（ １０ｍｇ）由来のＲＮＡを、６０％に加熱された、１ｘＭＯＰＳ緩衝液に５０％ のホルムアミド、１５％のホルムアルデヒドを加えたものの中で１０分間変性処 理し、氷上で冷し、１％アガロースゲルにかけた。ゲルには、１　ｘ　ＭＯＰＳ 緩衝液（２０ｍＭ　ＭＯＰＳ　ｐＨ？、５Ｍ　酢酸ナトリウム　２０ｍＭ　ＥＤ ＴＡ）の中で、７０Ｖ／　ｃｍにおいて８時間流した。そのゲルを２０　ｘ　Ｓ ＳＣ（３Ｍ　ＮａＣ１０，１５Ｍ　クエン酸トリナ゛トリウム）の中に３０分間 浸した後、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよび５ｃｈｕ ｌｌｅｒ−０，１ＭＭ）に−夜かけて直接プロットした。そのフィルターを８０ ℃で２時間ベータした後、ニック（Ｎ　ｉｃｋ　）翻訳によって高い特異的活性 にラベルされたＤＮＡプローブにハイブリッド形成させた（Ｒｉｇｂｙほか、Ｊ 、　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、　（１９７７）１１３　２３７−２５１）。

ハイブリッド形成は、５０％のホルムアミド、６　ｘ　ＳＳＣ，１０ｘ　デンハ ルト　１％　ＳＤＳおよび１−当り２００Ｍｇのサケの精子ＤＮＡを含有する緩 衝液内で行った。Ｌａｎｇほか、ＢＭＢＯＪ（１９８８）、７　（６）、１６７ ５〜１６８２）。

４２℃における一夜のハイブリット形成の後、フィルターを洗浄して５５℃にお ける最終ストリンゼンシイーを０．１　ｘ　５ＳＣ０，１％　ＳＤＳとした。フ ィルターを、７０℃で補強スクリンーン（ｉｎｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇ　５ｃｒｅ ｅｎｓ）を用いてＸ線フィルムに当てた。図１０の実験に用いられた具体的なり ＮＡプローブは、次のとおりである。

ヒトβ−グロビン ヒトβ−グロビン遺伝子の三番目のエクソンを含む、８００ｂｐ　ＥｃｏＲＩ− ＭｓｐＩフラグメント。

マウスα−グロビン 二番目のエクソン由来の配列を含むマウスα−グロビン遺伝子の、３００ｂｐ　 ＢａｍＨＩフラグメント。

ｔｋｎｅ。

ｔｋプロモーターおよびＮｅｏ耐性遺伝子を含む、２．Ｏｋｂの部分的Ｎａｒ　 Ｉフラグメント。

マウス・ヒストンＨ４遺伝子 マウス・ヒストンＨ４遺伝子の、３００ｂｐ　ＨｉｎｆＩフラグメント。

上記の実験は次のことを示している： １、　誘発されたＭＥＬ細胞におけるヒトβ−グロビンＲＮＡ発現は、内生のマ ウスα−グロビン遺伝子の発現と同等またはそれ以上である。

２、β小遺伝子座構築体を用いるβ−グロビン発現は、ＭＥＬ細胞におけるβ小 遺伝子座について得られるものよりも高い。

３、　優性アクティベーター配列は、ｔｋｎｅｏ遺伝子からの転写を優性アクテ ィベーター配列を含んでいないプラスミドに比較して約１００倍高める。

４、　優性アクティベーター配列は、ヒトβ−グロビン遺伝子において、β遺伝 子の上流または下流の両方の方向性においてヒ）ＣＤ２遺伝子内にある優性アク ティベーター配列を確認するために、およびそれらの組み込み部位非依存性発現 を命令する能力を試験するために、実験を行った。形質転換マウスの胸腺で高い レベルで発現するヒ）ＣＤ２遺伝子の３゛に、二つのＤＮアーゼＩ過敏部位が見 出された。ＤＮアーゼＩ　Ｈ３Ｓを含むＣＤ２　３゛配列の５．５ｋｂ　Ｂａｍ ＨＩ−Ｘｂａ１７ラグメントを、次に、４．８ｋｂ　ＢｇｌＩＩヒトβ−グロビ ン遺伝子フラグメント（後述の実施例５）または９．５ｋｂ　マウス／ヒトハイ ブリッドＴｈｙ−１遺伝子フラグメントにクローニングした。βＣＤ２およびＴ ｈｙ−Ｉ　ＣＤ２の構築体から調製されたＤＮＡフラグメントを、マウスの受精 卵に導入した。

一定範囲のコピー数を有する形質転換マウスが得られ、分析したところ、ヒトβ −グロビン遺伝子（実施例５）および胸腺のマウス／ヒトハイブリッドＴｈｙ− １遺伝子ＭＲＮＡ　（本実施例）の高レベルの発現が示され、これはコピー数に 関係するが、マウスのゲノムへの組み込み部位には依存しなかった。

本実施例および実施例５に記載の実験は、ヒ）ＣＤ２遺伝子の５．５ｋｂ　Ｂａ ｍＨＩ−ＸｂａＩ７ラグメント３“の中に優性アクティベーター配列が存在する ことを明瞭に実証している。

ＣＤ２遺伝子内のＤＮアーゼＨ３Ｓの地図付はヒ）ＣＤ２遺伝子の２．８ｋｂ　 ＫｐＮＩフラグメントを有する形質転換マウスを層殺し、マウス系統ＣＤ２−４ およびＣＤ２−１の胸腺および肝臓から核を調製した（Ｌａｎｇほか、ＥλＩＢ ＯＪ。

（１９８８）、７　（６）、１６７５−１６８２）。ＤＮアーゼ■消化は、本明 細書に記載したように行った（Ｇｒｏｓｖｅ］ｄほか、Ｃｅ１ｌ、（１９８８） 、５１．９７５−９８５も参照）。

ＤＮＡ試料は、図１１に示した制限酵素で再切断し、５“または３′　ヒ）ＣＤ ２プローブを用いて探査した。形質転換胸腺にのみ、強いＤＮＡのＨ３Ｓが遺伝 子の５°　に存在し、またＣＤ２遺伝子の３′に二つの３“部位がみられたが、 肝臓の核にはみられなかった。

図１２は、Ｔｈｙ−１，１ＣＤ２構築体を示す。点線はヒト’ｒｈｙ−１配列を 示し、二本の矢印はＣＤ２フラグメント内のＤＮアーゼＩ　Ｈ３Ｓの位置を示す 。

二つの３°　ＤＮアーゼＩ　Ｈ３Ｓを含むことが示されたヒトＣＤ２遺伝子の３ °にある、５．５ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−ＸｂａＩフラグメント３゛を、ブルース クリプトベクターＫＳ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＢａｍＨＩの部位とＸｂａｌの部 位の間にクローニングした。マウス−ヒトハイブリッド遺伝子を含む、９．５ｋ ｂ　ＥｃｏＲＩフラグメント　（Ｋｏｌｌ　ｉａｓほか、Ｃｅ１ｌ、（１９８７ ）、５１．２ｌ−２３）を、５．５ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−ＸｂａＩフラグメント の隣にあるＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、図１２に示すプラスミドＴｈｙ− Ｉ　ＣＤ２　Ａを得た。

プラスミドの配列を制限エンドヌクレアーゼ５ａｌＩおよびＮｏｔ　Ｉで消化し て除去し、１５ｋｂ　Ｔｈｙ−Ｉ　ＣＤ２挿入体は、ゲル電気泳動およびバッセ イジオーバー（ｐａｓｓａｇｅｏｖｅｒ）およびエルウチップＤ　（８１ｕｔｉ ｐ　Ｄ）カラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒと５ｃｈｕｅｌ　１）によって生成した 。

精製したＤＮＡをマイクロインジェクションによって、受精したＣＢＡ　ｘ　Ｃ ５７ＢＬ−１０マウスの卵の核に導入した（Ｌａｎｇほか、［ＥＭＢＯＪ、（１ ９８８）　、７．１６７５−１６８２）注入された卵を擬妊娠した仮の母親の輸 卵管に標準的な方法によって移植した（Ｈｏｇａｎほか、“マウス胎児の操作” 、コールド・スプリング・ハーバ−・パブＩＪ　ケーションズ（１９８６））。

形質転換マウスは、先に説明されているようにしてテイル（ｔａｉｌ）　Ｄ　Ｎ 　Ａのサザーンプロット分析によって確認しくＬａｎｇほか　止揚）、動物が三 〜四週間年老いたときに組織をＲＮＡの調製のために切開した。

図１３において、形質転換マウス１．２．３．５．６．７および８（５μｇ）の 胸腺または肺由来のＲＮＡを、５゛末端標識Ｔｔｈ　ｍ　−Ｓａｃ　１７ウスＴ ｈｙ−１第■エクソンプローブおよび３′末端標識ＢｇｌＩＩＮｅｏＩ　ヒトＴ ｈソー１プローブと、５２℃で１２時間ハイブリッド形成させた。

これらのプローブまたはＲＮＡは８５℃で１５分間溶融させた後に用いた。

ＲＮＡ　ＤＮＡハイブリッドを、ヌクレアーゼＳｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍ ａｎｎｈｅｉｍ）を用いて先に説明されているように（Ｋｏｌｌｉａｓほか、Ｃ ｅ１ｌ、（１９８８）　、５１．２ｌ−３１）ｆＡ化させ、保護されたフラグメ ントを５％ポリアクリルアミド　８Ｍ　尿素配列決定ゲルを流通させた。内生マ ウスと形質転換マウスのヒトＴｈｙ−Ｉ　ＲＮＡの保護されたフラグメントの位 置を示す。

遺伝子転換胸腺内のハイブリッド・マウス　ヒ）’ｒｈｙ−１遺伝子の１遺伝子 コピー当りの発現レベルは、内生のＴｈ、ｙ−１遺伝子のそれと同程度に高く、 遺伝子のコピー数に関係している（マウス１は約２０コピーの形質転換遺伝子を 有し、マウス２は１０コピーの形質転換遺伝子を有する）。

実施例５ この実施例はβ−グロビンＣＤ２プラスミドの構成を示す図１４に関する。

形質転換マウスにおけるβ−グロビンＣＤ２の発現は、本発明の優件アクティベ ーター配列を用いて引き起こされた。

プラスミドβＣＤ２−Ａおよびβ−ＣＤ２−βの挿入体を、制限酵素Ｎａｔ　Ｉ とＳａｌ　Ｉで消化した後アガロースゲル電気泳動で分離した。ＤＮＡを前述の ようにしてマウスの受精卵の核に注入した（Ｇｒｏｓｖｅｌｄほか、Ｃｅ１ｌ（ １９８７）、５１９７５−９８５も参照されたい）。形質転換マウスは、ヒトβ −グロビン・インディケータ−・プローブ（９００ｂｐ　ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ Ｉフラグメント）を用いる、ティルＤＮＡのサザーンプロット分析によって確認 した。

図１５は、βＣＤ２−ＡまたはβＣＤ２−βのいずれかの構築体を有する、形質 転換マウス由来のゲノムＤＮＡ５ｇがスロット・プロット・マニホールドを用い てニトロセルロースフィルターに適用したものを示す。（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ と５ｃｈｅｕｌ　１）。このフィルターをニックトランスレーションされたβ− グロビン第２イントロン・プローブとハイブリッド形成させ、次いで最終ストリ ンジエンシーが２５℃において０．１ｘＳＳＣＯ，１％ＳＤＳになるまで洗浄さ れた。ハイブリッド形成のシグナルの強度は、各マウス上の遺伝子コピー数の直 接の尺度である。

図１５Ｂは、形質転換マウスから調製された胸腺ＲＮＡの８１ヌクレア一ゼ分析 を示す。ＲＮＡ（１ｍｇ）を、β−グロビンＣＤＮＡ構築体の５°末端標識５２ ．５　ｂｐ　ＡｃｃＩ７ラグメント　（Ｇｒｏｓｖｅｌｃｌほか、Ｃｅ１ｌ、　 （１９８７）、５１．９７５−９８５）および内部コントロールとしてのマウス ・ヒストンＨ４遺伝子の３００ｂｐ　Ｈｉｎｆ　Ｉフラグメントと、ハイブリッ ド形成させた。

５２℃における１２時間のハイブリッド形成ののち、試料をヌクレアーゼＳ１で 消化し、保護されたフラグメントを５％ポリアクリルアミド　８Ｍ尿素ゲルの上 で分析した。前記の位置は内生ヒストンＨ４についてフラグメントを保護した。

ヒトβ−グロビンのｍＲＮＡが示されている。ヒトβ−グロビンで保護されたフ ラグメントの強度は胸腺で転写されたヒトβ−グロビンｍＲＮＡの量の直接的な 尺度である。比較のために、形質転換マウス由来の、β−小遺伝子座の４コピー を有する胎児肝ｉｉＲＮ　Ａｏ、　１　ｍｇを、３３ＦＬと標識した通路（トラ ック）で用いた。

図１４において、ヒトＣＤ２遺伝子の５．５ｋｂ　ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグ メントを、ブルー・スクリプト・ベクターＫＳ十（ｐｒｏｍｅｇａ）のＢａｍＨ ＩとＸｂａ　Ｉの部位の間にクローニングした。ヒトβ−グロビン遺伝子の４． ９ｋｂＢｇ１２フラグメントをこのプラスミドのＢａｍＨＩ部位に、両方の方向 性で（βＣＤ２ＡおよびβＣＤ２−β）クローニングした。垂直の矢印はＣＤ２ 　ＤＮアーゼＩ　Ｈ３Ｓの位置を示す。

黒い棒はヒ、トβ−グロビン遺伝子のエクソンを示し、水平の矢印は用いられた 遺伝子フラグメントの方向を示す。

本発明は実施例によって説明しただけであり、本発明の範囲内において改変が可 能であることは理解できよう。

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Ｃａｎｃ、Ｉｎ５ｔ、６４．７２５−７３８゜Ｋｏｌｌｉａｓ、　Ｇ、、　Ｈｕ ｒｓｔ、　Ｊ、、　ｄｅＢｏｅｒ、　Ｅ、およびＧｒｏｓｖｅｌｄ、　Ｆ。

（１９８７）　組織および発生特異的エンハンサ−は、ヒトβ−グＫｏｌｌｉａ ｓ、　Ｇ、、　Ｗｒｉｇｈｔｏｎ、　Ｎ、、　Ｈｕｒｓｔ、　Ｊ、およびＧｒｏ ｓｖｅｌｄ、　Ｆ。

（１９８６）　ヒト１γ−９β−１及び　ハイブリッドＴβ−グロビン遺伝子の 形質転換マウスにおける制御された発現二　発生Ｌａｗｓｏｎ、　Ｇ、、　Ｋｎ ｏｌｌ、　Ｂ、、　Ｍａｒｃｈ、　Ｃ，、Ｗｏｏ、　Ｓ、、　Ｔｓａｉ、　Ｍ、 およびＯ’Ｍａｌｌｅｙ、　Ｂ、（１９８２）　オブアルブミン・マルチ遺伝子 ファミリー含有クロマチン・ドメインの５°及び３′構造境界の決定　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５７．１５０１−１５０７゜Ｌｅｅ、　Ｗ、、　Ｍｉｔ ｃｈｅｌｌ、　Ｐ、およびＴｊｉａｎ、　Ｒ，（１９８７）　精製転写因子ＡＰ −１はＴＰ八−誘発エンハンサ−要素　Ｃｅ１ｌ　４４．２７３−２８２゜Ｍａ ｇｒａｍ、　Ｊ、、　Ｃｈａｄａ、　Ｋ、およびＣｏ５ｔａｎｔｉｎｉ、　Ｆ、 （１９８５）形質転換マウスにおけるクローン化成人β−グロビン遺伝子の発生 の調節　Ｎａｔｕｒｅ　３１５．　３３８−３４０゜Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、 、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｂ、　Ｆ、、　Ｌａｕｅｒ、　Ｊ、およびＬａｗｎ、　 Ｒ。

Ｍ、（１９８１）　ヒト・ヘモグロビンの分子遺伝学Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｇｅｎｅｔ、　１４．１４５−１７８゜１ａｒｔｉｎ、　Ｐ、およびＰａｐａｙ ａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ、　Ｔ、（１９８２）　ＨＥＬ細胞：自然で誘発されたグ ロビン発現を伴う新しいヒト白血病細胞系５ｃｉｅｎｃｅ　２１６．１２３３− １２３５゜Ｎ１ｃｈｏｌｌｓ、　Ｒ，、Ｆｉｓｃｈｅｌ−Ｇｈｏｄｓｉａｎ、　 Ｎ、およびＨｉｇｇｓ、　Ｄ。

（１９８７）　ヒトα−グロビン遺伝子クラスターでの組み換え：配列の特徴と トポロジカルな制限　Ｃｅ１ｌ　４９．３６９−３７８゜Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、　 Ｒ，Ｄ、およびＢｒ１ｎｓｔａｒ、　Ｒ，Ｌ、（１９８６）　マウスの生殖細胞 系形質転換　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、２０．４６５−４９９゜Ｐｉｎｋ ｅｒｔ、　Ｃ，、０ｒｎｉｔｚ、　Ｄ、、　Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ、　Ｒ，およびＰ ａ１ｍ１ｔｅｒ、　Ｒ。

（１９Ｂ？）　１０ｋｂ上流に位置するエンハンサ−は、そのロモーターととも に、形質転換マウス内で効率的で肝臓特異的発現を５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｂ、　 Ｍ、（１９７５）　ゲル電気泳動により分離された［ｌＮＡフラグメント中の特 定配列の検出　ＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、　９８．５０３−５１７゜ Ｔａｒａｍｅｌｌｉ、　Ｒ，、Ｋｉｏｕｓｓｉｓ、　ＤｌＶａｎｉｎ、　Ｂ、、 　Ｂａｒｔｒａｍ、　Ｋ、。

Ｇｒｏｆｆｅｎ、　Ｊ、、　Ｈｕｒｓｔ、　Ｊ、およびＧｒｏｓｖｅｌｄ、　Ｆ 、　Ｇ、（１９８６）γδβ−地中海貧血１及び２は、ヒトβ−グロビンクラス ター内の１００　ｋｂｐの欠落の結果である。Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 。

１４、７０１７−７０２９゜ Ｔｏｗｎｅｓ、　Ｔ、　Ｍ、、　Ｌｉｎｇｒａｌ、　Ｊ、Ｂ、、　Ｃｈｅｍ、　 Ｈ，Ｙ、、　Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ、　Ｒ。

Ｌ、およびＰａ１ｍ１ｔｅｒ、　Ｒ，Ｄ、（１９８５）　形質転換マウスでのヒ トβ−グロビン遺伝子の赤芽球細胞特異的発現。ＥＭＢＯＪ、４．１７１５−１ ７２３゜ Ｔｕａｎ、　Ｄ、、　Ｓｏｌｏｍｏｎ、　Ｗ、、　Ｑｉｌｉａｎｇ、　Ｌ、　Ｓ 、およびＩｒｖｉｎｇ、　Ｍ。

Ｌ、（１９８５）　ヒト赤芽球細胞内の“β一様グロビン″遺伝子ドメイン。　

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、３２．　６３８４−６３ ８８゜ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｌｏｅｇ、　Ｌ、　Ｈ，Ｔ、、　Ｋｏｎｉｎｇｓ、　 Ａ、、　０ｏｒｔ、　Ｍ、、　Ｒｏｏｓ、　Ｄ、。

Ｂｅｒｎｉｎｉ、　Ｌ、およびＦｌａｖｅｌｌ、　Ｒ，Ａ、（１９８０）Ｔβ− 地中海貧血：　Ｔ−及びδ−遺伝子の欠落は、ヒトのβ−グロビン遺伝子発現に 影響する。Ｎａｔｕｒｅ　２８３．６３７−６４２゜Ｗｒｉｇｈｔ、　Ｓ、、　 Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ、　Ａ、、　Ｆｌａｖｅｌｌ、　Ｒ，Ａ、およびＧｒｏｓｖ ｅｌｃｌ、　Ｆ、（１９８４）ネズミ赤白血病細胞におけるβ−グロＺａｖｏｄ ｎｙ、　Ｐ、　、　Ｒｏｇｉｎｓｋｙ、　Ｒｏおよび５ｋｏｕｌｔｃｈｉ、　Ａ 、（１９８３）Ｉｎ：　Ｇｌｏｂｉｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎ ｃｌ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、Ｅｄｓ。

Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ、Ｇ、ａｎｄ　Ｎ１ｅｎｈｕｉｓ、Ａ、 ）　Ａｌａｎ　Ｒ９Ｌｉ５ｓＩｎｃ、、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ、５３−６２゜ ＦＩＧ　、　１ にゲ、　１．４ｋｂａＭｒｎＥｃロ　３．３ｋｂ　ＥＣｏ　Ｏ，ａ６　Ｅｅｏ　 ＢｇｌＦＩＧ、３ −ＴＯ−丁　で　と　二 ｌｃｅＵｗ！し―＆ｅｌｌｌ　１ｃａＡ［ｌａ＋ＡｆＦＩＧ、９ β゛小走ｆミ＋ル°°　孤蕾伴 二−−−−−−−−−上−一一一一一一一一二一一一一一一一一一一−ＦＩＧ、 ４Ａ Ｃｍ　１２２１２４２７３３３４３６３８４０１７４１ｃｏＲ１ ｍ　２１　１２２４　２７３３３６３８４０　ｈｕ　４１ＲＧ、５Ｂ ｍ　１２　２１　２４　２７　３３　３６　３８４ｏ　ｈｕｍ　１２　３３２４ 　３８　ｈｕ　ｈｕ　ｍｌ　ｍｌＩＧ　５Ｄ ＦＩＧ、７ Ｂ（転）畦Ｓ１　胞Ｓ１ ＦＩＧ、８ Ｃ：ｌ／”’：　’１つ ｍ−中　−一Φ　−−φ　−一Φ　−少国際調査報告 ｒ′″ＩＵ、ｌＺ ・−警音１１−−１−ｎ１１階−＾ｅｅｍａ＋、ｍｔｎ、？Ｃ＝＝７ＧＢ８８１ ００６５５１１１＋＋ｍ＋ｍ＋＋ｌ　五＊５１１ｃｏイ、’−ＰＡＴ／６６　ｔ ｔ１０％５５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．遺伝子を哺乳動物の宿主細胞の遺伝物質に、該遺伝子が宿主細胞により発現 されるように組込むためのベクターであって、プロモーター及び前記の遺伝子を 含有するものにおいて、該ベクターが、前記遺伝子の発現にあたり、宿主細胞型 により限定され、組込部位非依存性で、コピー数依存性の発現を誘導することが できる優性アクテイベータ配列を含むことを特徴とするベクター。 ２．請求項１記載のベクターであって、優性アクテイベータ配列が、哺乳動物の 遺伝子系のＤＮアーゼ超過敏部位を含むベクター。 ３．請求項２記載のベクターであって、優性アクテイベータ配列がβ−グロビン ＤＮアーゼＩ超過敏部位を含むベクター。 ４．請求項３記載のベクターであって、優性アクテイベータ配列が、β−グロビ ン遺伝子座内のε−グロビン遺伝子の直ぐ上流の−１ｋｂＣｌａＩから−２２ｋ ｂＢｇＩＩＩまでの２１ｋｂフラグメント内にあるベクター。 ５．請求項３記載のベクターであって、優性アクテイベータ配列が、ここで定義 のとおり、次のフラグメントの１又は２以上を含むベクター： ２．１ｋｂ　ＸｂａＩ−ＸｂａＩ １．９ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ　ＨｉｎｄＩＩＩ１．５ｋｂ　ＫｐｎＩ−ＢｇｌＩ Ｉ、及び１．１ｋｂ　部分ＳａｃＩフラグメント６．請求項２記載のベクターで あって、優性アクテイベータ配列が、ＣＤ２　ＤＮアーゼＩ超過敏部位を含むベ クター。 ７．請求項６記載のベクターであって、優性アクテイベータ配列が、ＣＤ２遺伝 子に対し５．５ｋｂ　ＢａｍＨＩ〜ＸｂａＩ　フラグメント３′内にあるベクタ ー。 ８．前の請求項のいずれか１項によるベクターで形質転換された哺乳動物宿主細 胞。 ９．請求項１〜７のいずれか１項によるベクターで形質転換された哺乳動物。 １０．請求項１〜７のいずれか１項によるベクターで形質転換された哺乳動物宿 主細胞を培養することを含むポリペプチドの製造方法。 １１．次の工程を備える遺伝子治療方法：ｉ）哺乳動物の体から幹細胞を除去す る、ｉｉ）その体内に残る幹細胞を殺す、 ｉｉｉ）除去した幹細胞を、前記の体内に不足又は欠落している遺伝子を含む請 求項１〜７のいずれか１項で定義されたベクターで形質転換する、及び ｉｖ）該形質転換された幹細胞を前記体内に戻す。 １２．次の工程を有する遺伝子治療の方法：ｉ）哺乳動物の体から細胞を除去す る、ｉｉ）除去した細胞を、前記の体内に不足又は欠落している遺伝子を含む請 求項１〜７のいずれか１項で定義されたベクターで形質転換する、及び ｉｉｉ）該形質転換された細胞を前記体内に戻す。