JPH02500977A

JPH02500977A - 新規ペプチド類及びその用途

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Publication number: JPH02500977A
Application number: JP62506690A
Authority: JP
Inventors: バルトフエイ，タマス
Original assignee: トリオン、フォルスクニング‐オホ、ウドベクリングス、アクチェボラーグ
Priority date: 1986-10-20
Filing date: 1987-10-19
Publication date: 1990-04-05
Anticipated expiration: 2012-07-30
Also published as: US5225193A; SE8604445L; EP0266325A1; DK312088D0; IE872802L; SE8604445D0; DE3781863T2; SE455946B; FI891872A0; ATE80895T1; JP2635641B2; PT85960A; WO1988002754A1; DK312088A; PT85960B; FI891872A7; DE3781863D1; AU624066B2; AU8152487A; EP0266325B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規ペプチド類及びその用途本発明は、新規ポリペプチド類、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応するペプチド配列から主に構成される新規ポリペプチド類及びその部分から選択される人工百日咳毒素抗原、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する上記抗原を診断抗原として含む診断免疫アッセイ用キット、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する上記抗原から選択される抗原を免疫成分として含むワクチン組成物、並びに天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する上記抗原から選択される抗原を含む皮内皮膚試験用組成物に関する。

背景現在まで、百日咳毒素の一部を構成するペプチド抗原については当業界で何も確認されていない。このような抗原が得られていないことから、診断抗原としてかかる抗原を含む診断免疫アッセイ用キットを開発することも、かかる抗原に基づき百日咳に対するワクチンを開発することも不可能であった。

ボーデテラ伊パーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗体に対する抗原又はＢ、パーツシスにより産生されるタンパク質の補助による百日咳の診断法は公表済であるが、但し診断抗原としてふさ状（ｆｔｍｂｒｉａｌ）赤血球凝集素〔例えば、グランストレーム、　Ｍ、（Ｇｒａｎｓｔｒ２ｉｏ、Ｍ、）、グランストレーム、Ｇ、（Ｇｒａｎｓｔｒ６ｓ、Ｇ、）、リントフォース。

Ａ、　（Ｌｉｎｄｆｏｒｓ、Ａ、）及びアスケレフ、　Ｐ、　（Ａｓｋｅ１６ｆ ’、Ｐ、）。

１９８２年、抗原としてふさ状赤血球凝集素を用いた酵素結合免疫吸着剤アッセイによる百日咳の血清学的診断法、ジャーナル争オブ・インフエクシャス拳デイジージズ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ’　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、第１４６巻、第７４１−７４５頁参照〕又は超音波処理Ｂ、パーツシス細菌〔例えば、グツド？　ン、　Ｙ、Ｅ　、　（Ｇｏｏｄａ＋ａｎ　、　Ｙ、Ｅ、）％ワード、　Ａ、’Ｊ、（Ｗｏｒｔ、Ａ、Ｊ、）及びジャクソン、Ｆ、Ｌ。

（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｆ、Ｌ、）、１９８１年、初期感染の指標としての鼻咽腔分泌物中の百日咳免疫グロブリンＡ検出用酵素結合免疫吸着剤アッセイ、ジャーナルーオブ・クリニカル−フィクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒＣ１１ｎｉｃａ１’）　＋第１３巻、第２８６−２９２頁、並びにピルジャネン、　Ｍ、　Ｋ、　（Ｖｌｌｊａｎｅｎ、Ｍ、に、）　％ルースカネン、００（Ｒｕｕｓｋａｎｅｎ、Ｏ，）、グランバーブ。

Ｃ（Ｇｒａｎｂｅｒｇ、Ｃ，）及びサルミ、　Ｔ、　Ｔ、　（Ｓａｌｓｉ、Ｔ、Ｔ、）。

１９８２年、百日咳の血清学的診断法：酵素結合免疫吸着剤アッセイにより測定されるボーデテラ・パーツシスに対するＩｇＭＳＩｇＡ及びＩｇＧ抗体、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ（Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ’　Ｔｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）。

第１４巻、第１１２−１１７頁参照〕が用いられた。

当業界で周知のように、不活性化ボーデテラ・パーツシス細菌に基づいた百日咳に対するワクチンがＵＳＡ及び他の多くの国で現在使用されている。Ｍ、ピットマンは百日咳が外毒素（百日咳毒素）により媒介されていると１９７９年に発表したが〔ピットマン、Ｍ、。

１９７９年、百日咳毒素：百日咳の有害作用及び遷延免疫の原因、ハイポセシス・レビュー争オブ・インフニクシャス９デイジージズ（Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ’　ｌｎｆ’ｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ）　、第１巻、第４０１−４１２頁〕、日本では不活性化百日咳毒素を含有した非細胞ワクチンが現在使用されている。

最近、百日咳毒素のヌクレオチド配列が公表された〔ロッテ、Ｃ，（Ｌｏｃｈｔ、Ｃ，）及びキース、Ｊ、　Ｍ、（Ｋｅｉｔｈ。

Ｊ、Ｍ、）、１９８６年、百日咳毒素遺伝子：ヌクレオチド配列及び遺伝組織、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、第２３２巻。

第１２５８−１２６４頁〕。この論文において、著者らは、感染防御エピトープを含んだ合成オリゴペプチド類が新世代のワクチンの開発にとっても有用であると抽象的に述べているが、但しこのようなエピトープについては教示又は示唆すらない。

更に最近、百日咳毒素遺伝子に関する論文が公表された：ニコシア、　Ａ、　（Ｎｉｃｏｓｉａ、Ａ、）、ペルギニ、　Ｍ。

（Ｐｅｒｕｇｉｎｉ、Ｍ、）　、フランジ＝、Ｃ，（Ｆｒａｎｚｉｎｉ、Ｃ，）　、カサグリ、　Ｍ、　Ｃ，（Ｃａｓａｇｌｉ、Ｍ、Ｃ，）、ポリ−、Ｍ、　Ｇ。

（Ｂｏｒｒｉ　、Ｍ、Ｇ、）、アント＝、　Ｇ、　（Ａｎｔｏｎｉ、ＩＣ，）　、アルモニ。

Ｍ、（Ａｌｍｏｎｉ、Ｍ、）　、　ネリ、Ｐ、（Ｎｅｒｉ、Ｐ、）　、ラツテイ。

Ｇ、　（Ｒａｔｔｉ、Ｇ、）及びラポーリ、　Ｒ，（Ｒａｐｐｕｏｌｉ、Ｒ，）　。

１９８６年、百日咳毒素遺伝子のクローニング及び配列決定：オペロン構造及び遺伝子複製、プロシーデイングズ争オブ拳ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ’　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｒＳｃ４ｅｎｃｅＵＳＡ）、第８３巻、第４６３１−４６３５頁。この文献において、“遺伝子工学による毒素遺伝子操作は大量の無毒化タンパク質を産生ずるための方法である″ことが、抽象的に述べられている。これは単なる示唆にすぎず、操作された毒素遺伝子については何も開示されていない。

更に別の文献がこの分野に存在する：エングストレーム、　０．　（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ、Ｏ，）　、ｏドマルム、Ｋ、　（Ｒｏｄｌｌａｌｍ、に、）。

ジエルンバール、　Ｈ，（Ｊ６ｒｎｖａｌｌ、Ｈ，）　、ルンドクイスト。

Ｇ、（Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ、Ｇ、）、カルマン、　Ｍ、　（ＫＡｌｍＡｎ、Ｍ、）　、シモンシッツ、　Ａ、（Ｓｉｍｏｎｓｃｉｔｓ、Ａ、）　、バートファイ、Ｔ。

（Ｂａｒｔｆａｌ　、Ｔ、）、レフダール、Ｓ、　（Ｌ６ｆｄａｈｌ、Ｓ、）、及びアスケレフ、　Ｐ　、　（Ａｓｋｅ１６ｆ’、Ｐ、）、１９８６年、百日咳毒素サブユニットＳ１のＮ末端構造の特徴及びオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブとボーデテラ・パーツシスＤＮＡ断片とのハイブリッド化、ＦＥＭＳマイクロバイ３６巻、第２１９−２２３頁。この論文では、“遺伝子は毒素を産生ずる他の生物中にも導入される。遺伝子の配列決定は毒素の抗原エピトープに相当するペプチドの合成を可能とし、したがって合成百日咳ワクチンの開発を可能にする°ことも示唆している。しかしながら、百日咳毒素の抗原エピトープは確認、合成されていず、試験もされていなかった。

皮内皮膚試験用組成物に関して、百日咳に対する免疫試験用のかかる組成物は今まで当業界で開示されたこと本発明の一面において、５種の下記新規ポリペプチドが提供される：即ちａ）ポリペプチドＨ−Ｘｌ　−Ａｓｐ−＾ｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｘ２−Ｙｂ）ポリペプチドＨ−Ｘ’　−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｌｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒ。

−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ −Ｘ２−ｙＣ）ポリペプチドＨ−Ｘｌ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｔ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ｓｅｒ −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｘ２−Ｙｄ）ポリペプチドＨ−Ｘ’　−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−９ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｘ２−Ｙ、及びｅ）ポリペプチドＨ−Ｘ’　−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−）１ｉｓ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｘ２−Ｙ（上記式中、Ｘ　及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は −ＮＨ２を表す）適切な任意アミノ酸残基の例は−Ｌｙｓ−及び−Ｃｙｓ−である。これらの任意アミノ酸残基は、上記ポリペプチド類に対する牛血清アルブミン等の担体のカップリングを促進する。

これらのポリペプチド類は、共通の本質的性質、即ち、百日咳患者の回復期血清からの抗体と反応しうる能力を有している。

本発明のポリペプチド類は、それ自体公知の固相技術に従い合成される。

本発明のもう一面によれば、下記からなる群より選択される、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する少なくとも１種のペプチド配列から主に構成される人工百日咳毒素抗原が提供される：ａ）ポリペプチドＨ−Ｘ’　−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｘ２−Ｙ（上記式中、Ｘｌ及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨっを表す）及びその部分；ｂ）ポリペプチドＨ−Ｘ’　−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−＾ｒｇ−＾ｒｇ−］　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒ。

−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ −Ｘ２−Ｙ（上記式中、Ｘｌ及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；Ｃ）ポリペプチドＨ−Ｘｌ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−８ｅｒ−Ｓｅｒ −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｘ２−Ｙ（上記式中、Ｘｌ及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｄ）ポリペプチドＨ−Ｘ’　−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（ｉｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｖａｔ−Ｘ２−Ｙ（上記式中、Ｘｌ及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｅ）ポリペプチドＨ−Ｘ’　−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｌｓ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｈｌｓ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｘ２−Ｙ（上記式中、Ｘｌ及びＸ２は各々任意のカップリング促、進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は −ＮＨ２を表す）及びその部分。

本発明のポリペプチド類は、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応することができ、しかも動物体内で天然毒素と反応する抗体を誘導することができる。

したがって、それらは抗原と考えられる。抗原であるとした場合、本発明のポリペプチド類は、天然百日咳毒素により誘導される抗体とそれ自体が反応する更に短いペプチド配列を含んでいるものと思われる。本発明において天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する人工百日咳毒素抗原は、たとえそれがいくつかのかかる短鎖ペプチド配列を含むことが好ましいとしても、担体と一緒に本発明のポリペプチド類のうちの１つの一部分であるこのような短鎖ペプチド配列を必ずしも２以上含んでいるとは限らない。

“人工百日咳毒素抗原゛という表現は、それが本明細書及び添付の請求の範囲で用いられている場合に、人工的方法で産生される、即ち人間の活動から離れた自然原因によらず人間の努力で得られる百日咳毒素抗原を含んだ意味である。本発明の人工百日咳毒素抗原から構成される又はそれから部分的に構成されるペプチド配列がそれ自体公知の固相技術に従い化学的に合成されたとしても、上記ペプチド配列は一部の他の技術、例えば液相中公知の方法で１アミノ酸を次のアミノ酸にカップリングさせる合成、分解、クローニング等を用いて産生ずることもできるのであって、“人工２という表現はこのようないかなる技術によって産生された産物をも含む。

“含む（含有する）゛という用語は、本明細書及び添付の請求の範囲において、ある物が含まれていることを示すために用いられているが、但しある物とは必ずしも唯一の物でなくてよい。

“天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応するペプチド配列′に関連した“ から主に構成される″という表現は、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する人工百日咳毒素抗原の能力が上記ペプチド配列に由来することを示すために用いられている。

“担体°という用語は広義に解釈されるべきであって、担体とは問題のペプチドが共有結合、イオン結合、水素結合又は疎水結合のような物理的／化学的相互作用によって結合されればいかなるものであってもよい。このような担体の例としては、例えば水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム等のような無機物担体、例えばマイクロプレート、ビーズ等のようなプラスチック表面、脂質、リポソーム、炭水化物、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質がある。

本発明の更に別の面として、生物学的液体サンプル中において天然百日咳毒素により誘導される抗体測定用の診断免疫アッセイ用キットが提供される。本キットは・本発明に従い天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する人工抗原から選択される少なくとも１種の抗原を診断抗原として含んでいる。天然百日咳毒素により誘導される抗体測定のために用いられる免疫アッセイに応じて、キットは、他の適切な試薬、例えば上記診断抗原がカップリングされる担体、陽性標準血清サンプル、陰性アターゼもしくはペルオキシダーゼ、酵素複合体用の基質、例えばｐ−ニトロフェニルホスフェート、寒天もしくはアガロースゲル、放射性同位元素標識抗原、緩衝液及び／又は洗浄液を含んでいてもよい。場合により、キット中のすべての試薬は、特定の標識でマークされた別個の密封試験管又はバイアル中に含まれる。

生物学的液体サンプルは、動物、例えばヒトからの鼻咽腔分泌物、唾液、血液又は血清サンプルであることが好ましい。

本発明のキットが使用可能な免疫アッセイの例としては、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着剤アッセイ）、免疫拡散、放射線免疫アッセイ（ＲＩ　Ａ）及び免疫電気泳動（ＩＥ）がある。

ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着剤アッセイ）が用いられる場合、本発明のキットは：ａ）本発明の診断抗原ｂ）場合により、上記診断抗原用の担体Ｃ）場合により、陽性標準血清サンプルｄ）場合により、陰性標準血清サンプルｅ）酵素複合体ｆ）場合により、上記酵素複合体用の基質ｇ）場合により、緩衝液、及びｈ）場合により、洗浄液を含む。

免疫拡散又は免疫電気泳動（ＩＥ）が用いられる場合、本発明のキットはｅ）及びｆ）を除きＥＬ　Ｉ　ＳＡの場合と同様のものを含む。代わりに、寒天又はアガロースゲルのようなゲルが必要とされるが、但しこのようなゲルは普通入手可能であることからキット中には通常含まれない。

放射線免疫アッセイ（ＲＩ　Ａ）が用いられる場合、本発明のキットはｅ）及びｆ）を除きＥＬ　Ｉ　ＳＡの場合と同様のものを含むが、但し代わりに放射性同位元素標識抗原が用いられる。場合により、トリクロロ酢酸又は二次抗体のような、抗体に結合した放射性同位元素標識抗原の沈降用溶液を含めてもよい。

本発明のもう一つの面では、免疫成分として好ましくは百日咳疾患から被検者を保護するために有効な量で天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する本発明の人工百日咳毒素抗原から選択される少なくとも１種の抗原並びに無毒性の薬学上許容される担体及び／又は希釈剤を含有したワクチン組成物が提供される。

担体とは本明細書中で前記のように定義された担体であり、希釈剤は塩水溶液のような当業界で用いられる慣用的希釈剤でよい。本発明のワクチン組成物は、上記量の抗原と共に、百日咳疾患から被検者を保護するために有効な量で抗原アジュバントを更に含有していてもよい。ヒト用ワクチンで通常用いられるアジュバントの例は、問題の抗原が吸着される例えばカルシウム又はアルミニウムのリン酸塩又は水酸化物のようないわゆる無機担体である。通常用いられる獣医学用ワクチンアジュバントの例は、フロイント完全アジュバントである。ワクチン組成物は適宜緩衝液及び／又は保存剤を更に含有していてもよく、適切な緩衝液及び保存剤は例えばＵＳ薬局方中に開示されている。

本発明の更にもう一つの面では、特定の抗体力価において被検者に免疫学的皮膚反応を生じさせるために有効な量で本発明による天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する本発明の人工百日咳毒素抗原から選択される少なくとも１種の抗原並びに無毒性の薬学上許容される担体及び／又は希釈剤を含有した皮内皮膚試験用組成物が提供される。本発明の皮膚試験用組成物は、適宜緩衝液及び／又は保存剤を更に含有していてもよい。

有用な担体、希釈剤、緩衝液及び保存剤については、本明細書中前記で定義されている。

本発明によるペプチド配列の合成本発明によるペプチド配列の固相〔メリフィールド（Ｍｅｒｒｙ’　ｊｅｌｄ））合成は常法に従いアミノ酸を互いにカップリングさせることにより行われたが、それによりペプチド結合が形成され、最初のアミノ酸のＣ末端が結合された固相（樹脂）から開始し、しかる後火のアミノ酸の組み立てられたペプチドが固相がら放出される。

詳しくは、下記ペプチド配列が合成されたＳＡ）　Ｈ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ −Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ −Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ２Ｂ　）　Ｈ−Ｌｙｓ−９ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ＯＨＣ）　Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−９ｅｒ−Ｔｈｒ−９ｅｒ−８ｅｒ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２Ｄ）　Ｈ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｃｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ａ　Ｉａ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＮＨ２Ｅ　）　Ｈ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ− Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−＾１ａ− Ｇｌ　ｕ−Ａｒｇ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｒｇ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｔｈ　ｒ− Ｇ　ｌ　ｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｉ　Ｉ　ｅ−Ｌｙ　ｓ　−Ｎ　Ｈ２ペプチド断片の合成は、バイオサーチ・サム・ツー（Ｂｌｏｓｅａｒｃｈ　ＳａｍＴｗｏ）　（バイオサーチ社（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、）。

カリフォルニア州ＵＳＡ）ペプチド合成機を用いてｔ−ＢＯＣアミノ酸に関するバイオサーチペプチド合成オートメーションソフトウェアのバージョン２．３８により実施された。標準（欠失）カップリング定数が、出発物質１ｇについて適用された（置換度−０，３３ｍｅｑ／ｇ　）。

ペプチド配列Ａ）及びＣ）〜Ｅ）（アミド形）の合成のために用いられた樹脂はｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂であり、Ｂ）の合成のために用いられた樹脂は標準メリフィールド樹脂であった。適切な保護アミノ酸は下記のとおりであった：Ｂｏｃ−Ａｌａ−０）Ｉ　Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−０Ｈ（Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン）　（ａ−ＢｏＣ−Ｎ−）シルーＬ−アルギニン）Ｂｏｃ−Ａｓｎ−０）Ｉ　Ｂｏａ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−０Ｈ（Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギン）　（Ｂｏｃ −Ｌ−アスパラギン酸り−ベンジルエステル）Ｂｏａ−Ｇ　ｌ　ｕ　（ＯＢｚ　ｌ　）−ＯＨＢｏａ−Ｇ　Ｉ　ｎ−０Ｈ（Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸　（ＢｏＣ−Ｌ−グルタミン）γ−ベンジルエステル）ＢｏＣ−Ｇ　ｌ　ｙ−ＯＨＢｏｃ−旧５（Ｔｏｓ）−０Ｈ（ＢｏＣ−グリシン）　（ＢｏＣ−Ｎ４シル−Ｌ−ヒスチジン）Ｂｏｃ−１１ｅ−ＯＨ，ｌ／２　Ｉ２０　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｉ２０（Ｂｏａ−Ｌ−イソロイシン　（ＢｏＣ−Ｌ −ロイシン−Ｉ２０）−ｔ／２Ｈ２０）Ｂｏａ−Ｌｙｓ　（ＣＬ−Ｚ）　−ＯＨＢｏｃ→伯ｔ−０Ｈ（Ｂｏｃ−ｅ−ｏ− りｏｏベンジル　（Ｂｏａ−Ｌ−メチオニン）オキシカルボニル−し−リジン）Ｂｏｅ−Ｐｈｅ−ＯＨＢｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｂｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン）　（Ｂｏｃ−Ｌ−プロリン）Ｂｏｃ−８ｅｔ（Ｂｚｌ）−０）Ｉ　Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−０Ｈ（ＢｏＣ−０−ベンジル−し−セリン）　（Ｂｏｃ−０−ベンジル−し−トレオニン）Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（ＣＩ２−ＢＺＩ）−０ＨＢｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨベンジル−し− チロシン）アミノ酸濃度、溶媒容量、反応時間等に関する詳細について、製造者（バイオサーチ）の推薦は下記のとおりであった。

詳しくは、下記に掲載の化学物質が合成ペプチドの合成、開裂及び精製に用いられた。

物　質　グレード　供給者アセチルイミダゾール　ｐ、ａ、　アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）ジメチルホルムアミド　ｐ、ａ、　フル力（Ｆｌｕｋａ）ジイソプロピル　ニンヒドリン　アルドリッチエチルアミン　Ｉｇ／ＩＬかる後ＫＯＨ５ｇ／ｌから二重蒸留：最初の１０％蒸留液廃棄ヒドロキシベンジル　ｐ、ａ、　アルドリッチトリアシー、ル塩化メチレン　ＨＰＬＣフイソンズ（ＵＫ）（Ｆｉｓｏｎｓ）ニンヒドリン　ｐ、ａ、　アルトリ・ソチ水酸化カリウム　ｐ、ａ。

ジイソプロピル　ｐ、ａ、　アルドリッチカルボジイミド窒素　４．１（乾燥）　ＡＧＡ物　質　グレード　供給者ｔ−Ｂｏｃアミノ酸　ベーチェム（Ｂａｃｈｅｍ）フッ化水素　ＡＧＡレゾルシノールジメチルスルフィドヒドロキシベンジル　ｐ、ａ、　アルドリッチトリアゾール　（合成）トリフルオロ酢酸　シクアナル　アルドリッチ（ｓｅｑｕａｎａｌ）　（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）アセトニトリル　ＨＰＬＣラスバーン（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）酢酸　ｐ、ａ、　メルク（Ｍｅｒｃｋ）ジエチルエーテル　フル力完成した樹脂結合ペプチドは合成室から取り出され、メタノールで洗浄され、真空下で一定重量まで乾燥された。

樹脂支持体からのペプチドの開裂洗浄及び乾燥された樹脂結合ペプチドの一部（０，５ｇ）をレゾルシノール１ｇ１ジメチルスルフイド６．５ｍｌ及びポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）被覆マグネット含有円筒形ＰＴＦＥ室に移した。室をドライアイス−エタノール洛中で一８０℃に冷却した。次いで、フッ化水素酸（ＨＦ）（最終容ｆｆ１１０ｍ１）を室に入れ、しかる後磁気スターラー上０℃で１２０分間維持した。

次いで、酸を水アスピレータ−で除去した。室を再度−８０℃に冷却し、ＨＦ１０ｍ１を室に入れ、磁気スターシー上に０℃で４５分間装いた。酸を再度水アスピレータ−で除去し、残留混合物を焼結ガラスフィルターに移した。次いで、樹脂／ペプチド混合物を１０％（ｖ　／　ｖ　）酢酸１００ｍ１でしかる後ジエチルエーテル５０ｍ１で洗浄した。酢酸洗液も分液ロート中ジエチルエーテル５０ｍ１で洗浄し、エーテル相を水相から除去した。次いで、プールされたエーテル洗液及び酢酸洗液を各々蒸発、凍結乾燥させて、ペプチド生成物を回収した。すべての場合において、ペプチドは水相のみから回収された。

粗生成物をデシケータ−内のガラスバイアル中室温で貯蔵した。

合成ペプチドの精製粗合成生成物の様々な成分は、移動相としてアセトニ（ＴＦＡ））を用いた逆相Ｃ−１８シリカ高圧クロマトグラフイーカラムにそれらを適用することにより分離された。粗ペプチド２０μｇ〜１１００１ＩをＨ２Ｏ（０，１％ＴＦＡ）１ｍ１以内に溶解させ、遠心分離し、レオダイ′　ン（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）　（カリフォルニア州、ＵＳＡ）ＨＰＬＣインジェクターの１　ｍｌループ中に注入した。溶液を２１５２勾配コントローラー及び２つの２１５０ＨＰＬＣポンプ（ＬＫＢ、スウェーデン）により注文バックされた１０１０Ｘ５００オリゴシル（０１１ｇｏｓｉ　ｌ）逆相Ｃ−１８カラム〔スカンジナビス力・ゲネテック（ＳｋａｎｄｉｎａｖｉｓｋａＧｅｎｅｔｅｃ）、スウェーデン〕中にポンプ導入した。

勾配は、６０分間にわたり０〜１００％アセトニトリルで直線的であった。流速は２ｍｌ／ｗｉｎであった。合成生成物の溶出は、ＬＫ８２１３１可変波長吸収モニターを用いて２０６〜２３８ｒ＋ａ＋でモニターされた。画分を手で集め、必要であれば関連画分の凍結乾燥、再溶解及びクロマトグラフィー操作の繰返しにより再精製した。最終生成物を凍結乾燥し、ガラスバイアル中−２０℃で貯蔵した。

免疫アッセイ用ペプチド抗原の作製前記合成ペプチド配列Ａ）〜Ｅ）の各々は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡで用いられるａｖ診断抗原（コーティング抗原）を形成させるために、下記方法で担体、即ち牛血清アルブミン（ＢＳＡ）にカップリングさせた。

ペプチド１１１１１ｇ及びＢ５Ａ３．６＋ｎｇをｐＨ７，４のリンこの溶液に、２．５％（Ｗ／Ｖ）グルタルジアルデヒド水溶液３０μｇを加える。

反応混合物を室温（２０〜２５℃）で１時間インキュベートし、５Ｍエタノールアミン水溶液０．−５ｍ１の添加により反応停止させ、しかる後＋４℃モ４時間ＰＢ５１ｇに対して透析し、３０分間後及び２時間後に透析液を交換する。

次いで、透析バックの内容物をＰＢＳで平衡化されたセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ　−３００ゲル〔ファルマシア（ＰｈａｒＩＩａｃ！ａ）　、　ウプサラ、スウェーデン〕含有カラム（２，５Ｘ６０（至））に通してゲル濾過する。３．Ｏｍ１画分を集める。

カップリング物質含有画分をプールし、プールされた物質をコーティング抗原としてＥＬ　Ｉ　ＳＡで用い、事前に希釈することなくマイクロプレートに直接加える。

酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ　：　ｓ）以下はＥＬＩＳＡ：ｓの一般的説明を補充するものである。抗原及びマイクロプレートのコーティングに用いられる抗原の量（下記参照）、複合体及び複合体の希釈、コントロール及びコントロールの希釈、並びにマイクロプレート読取り前の経過時間は、様々なアッセイ毎に異装備：微量滴定プレート〔グイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）。

ＩＩｏｄ、ｎｒ１２９Ｂ）マイクロプレートコーティング用抗原（例えば、ペプチド及びタンパク質）コーティング用緩衝液ニリン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）インキュベート用緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０　（ｖ　／　ｖ　）水性洗浄液：０．９％ＮａＣ１＋０．０５％ツイーン血清（例えば、ヒト及び動物参照並びに試験血清）複合体〔例えば、アルカリホスファターゼ複合化ブタ抗ヒトＩｇＧ抗体（オリオン・ジアグノスチ力（ＯｒｉｏｎＤｉａｇｎｏｓｔ　ｌｅａ乃、ヤギ抗つサギＩｇ抗体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））及びヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（シグマ）〕〕酵素基質：ｐ−ニトロフェニルホスフェート錠剤シグマ）、基質緩衝液（下記参照）１■／ｍ１基質緩衝液：ｐＨ９，８の１Ｍジェタノールアミン＋０、５ｍＭ　ＭｇＣ１２＋０．０２％Ｎ　ａ　Ｎ　３ピペツト及び試験管操作：１、マイクロプレートのコーティングマイクロプレートを室温（２０〜２５℃）で−夜ＰＢＳ中抗原０．１ｍｌと共にインキュベートする。

２、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び血清とのインキュベートプレートを４回洗浄し、しかる後３７℃で１時間ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡＯ６１ｍｌと共にインキュベートする。洗浄後、インキュベート用緩衝液で適宜希釈された血清０．１ｍｌをウェルに加え、ブレニドを室温で１時間インキュベートする。

３、複合体とのインキュベート洗浄後、インキュベート用緩衝液で適宜希釈された複合体０，１ｍｌをウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートする。

４、洗浄後、酵素基質溶液０．１ｍｌをウェルに加える。

プレートを室温で維持し、４０５ｒ＋ｒＡの吸光度を１時間以内の後で読取る。

ＥＬＩＳＡの具体的な説明酵素結合免疫吸着剤アッセイ：合成ペプチドＡ）〜Ｅ）と天然百日咳毒素での免疫化により特異的に誘導される抗体（１）又は自然疾患後の抗体（２）の各々との反応を測定するための酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）ＥＬＩＳＡにおいてコーティング用抗原として用いられるペプチドを最初に“免疫アッセイ用ペプチド抗原の作製”で記載されているように処理した。各アッセイを３回繰返した。

１、陽性血清サンプルは高精製百日咳毒素〔ナショナＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｌｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、スウェーデン〕で高度免疫化されたウサギ由来であり、陰性血清サンプルは免疫開始時に集められた同一ウサギ由来であった。双方の血清を１１５００希釈で使用した。用いられた複合体は、１１５００希釈されたアルカリホスファターゼヤギ抗つサギＩｇ複合体（シグマ）であった。

プレートを自動ＥＬ　Ｉ　ＳＡリーダー〔タイターチック（Ｔｌｔｅｒｔｅｋ）、　マルチスキャン（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ）　）で１５分間後に読取った。

結果は下記のとおりであったニスチュープントを検定における有意差は、ペプチドＡ）〜Ｃ）の各々の場合にｐ、＜０．００１であった。ペプチドＤ）及びＥ）の場合には、陽性及び陰性血清間の差異に関して有意レベルを計算することができなかったが、但し明らかに差異はペプチドＡ）〜Ｃ）の場合よりも更に大きい。

上記結果から、ペプチドＡ）〜Ｅ）のすべてが天然百日咳毒素により誘導される抗体と強く結合することは明らかである。

２、陽性血清サンプルは百日咳患者からの回復期血清サンプルであって、スウェーデンのナショナル・バクテリオロジカル・ラボラトリ−（ＮＢＬ）から受け取った。

ヒト陽性血清サンプルはそのようにして選択され、ＥＬＩ　ＳＡにおいてそれが抗原としての天然毒素と共にインキュベート１時間後に４０５ｎｔｘの吸光度的１．０を示すように調整される。陰性血清サンプルは同胞体からの血清プールであり、これもＮＢＬから受け取ったものであった。双方の血清を１１５００希釈で使用した。用いられた複合体は、１／１００希釈されたアルカリホスファターゼブタ抗ヒトＩｇＧ複合体（オリオン・ジアグノスチ力）であった。

プレートを自動ＥＬ　Ｉ　ＳＡリーダー（タイターチック。

マルチスキャン）で１時間後に読取った。

アッセイ結果は下記のとおりであったニスチュープントを検定における有意差は、ペプチドＡ）、Ｂ）　、Ｃ）及びＥ）の場合にｐ＜Ｑ、００１であり、ペプチドＤ）の場合に０．０１＜ｐ＜０．０２であった。

上記結果から明らかなように、本発明のすべてのペプチドＡ）〜Ｅ）は陽性血清サンプルの場合に陰性血清サンプルの場合よりも明らかに高い吸光度を有していた。

したがりて、試験されたペプチドＡ）〜Ｅ）は抗原として機能し、百日咳抗体と結合する。

結論として、ペプチドＡ）〜Ｅ）が百日咳患者の回復期血清サンプル中で天然百日咳毒素により誘導される抗体と特異的に結合することは、立証可能である。

合成ペプチドＡ）〜Ｅ）と全細胞ワクチンでのマウス（１）もしくは同胞体（２）の又は百日咳毒素ワクチンでの同胞体（３）の免疫化により特異的に誘導される抗体との反応を各々測定するための酵素結合免疫吸着剤アッセイ　（ＥＬＩＳＡ）。

ＥＬＩＳＡにおいてコーティング用抗原として用いられるペプチドを最初に“免疫アッセイ用ペプチド抗原の作製”で記載されているように処理した。各アッセイを３回繰返したが、読取りエラーは１０％以内である。

１、全細胞ワクチン〔ウェルカム（Ｗｅ　ｌ　ｌ　ｃｏａ＋ｅ）　、イングランド〕高度免疫血清サンプル及び陰性血清サンプルをマウス５匹から各々得た。すべての血清を１１５００希釈で試験した。用いられた複合体は、１１５００希釈されたアルカリホスファターゼヤギ抗マウスＩｇＧ複合体（シグマ）であった。

プレートを自動ＥＬ　Ｉ　ＳＡリーダー〔タイターチック。

マルチスキャン〕で１時間後に読取った。

結果は下記のとおりであった：ペプチド１　コントロール　０．１Ｂ　０．２３　０．１０　０．２４　０．１８２　コントロール　０．１０　０．１０　０．１０　０．１２　０．０８３　コントロール　０．１２　０．１４　０．１４　０．１６　０．１２４　コントロール　０．１２　０．１３　０．１２　０．１３　０．１０５　コントロール　０．１４　０．１４　０．１１　０．１４　０．１１６　免疫処理　０．２１　０．２９　０．２７　０．２９　０．２６７　免疫処理　０．４１　０，４９　０，５０　０．５５　０．４５８　免疫処理　０．７５　０．８０　０．７１　０．８４　０．７４９　免疫処理　１．４１　１．４５　１．４４　１．４８　１．４２１０　免疫処理　１．１４　１．４７　１．４１　１．５９　１．４２上記結果から、すべてのペプチドＡ）〜Ｅ）が全細胞ワクチン（百日咳毒素を含有する）で免疫されたマウス血清中の同量の抗体と特異的に結合しえたことは明らかである。

２、前−及び後ワクチン処理血清サンプルは全細胞ワクチン（ウェルカム、イングランド）を受けた同胞体５匹から集められた。すべての血清を１１５００希釈で試験した。用いられた複合体は、１／１００希釈されたアルカリホスファターゼブタ抗ヒトＩｇＧ複合体（オリオン拳ジアグノスチ力）であった。

プレートを自動ＥＬＩＳＡリーダー〔タイターチック。

マルチスキャン〕で１時間後に読取った。

結果は下記のとおりであった：１　前処理　０．０５　０．０７　０．０Ｂ　０．０７　０．０７後処理　０．０７　０．２６　０．２１　０．２２　０．２０２　前処理　０．１２　０．０７　０．０５　０．０７　０．０７後処理　０．４１　０；３０　０．２０　０．２６　０．２１３　前処理　０．２１　０．４９　０．５２　０．４９　０．４６後処理　０．ＯＢ　Ｏ，３１０，３１０，３１０，２８４前処理　０．１０　０．１８　０．１４　０．１９　０．１５後処理　０．２３　０．７２　０．７３　０．８７　’０．６２５　前処理　０．０Ｂ　０．１８　０．１２　０．１５　０．１３後処理　０．０６　０．１２　０．０ｇ　０．１０　０．１０上記結果から明らかなように、すべてのペプチドＡ）〜Ｅ）は全細胞ワクチン（百１日咳毒素を含有する）で免疫された同胞体血清中の抗体と特異的に結合することができた。

３、前−及び後ワクチン処理血清サンプルは百日咳毒素ワクチン（微研１日本）を受けた同胞体５匹から集められた。すべての血清を１１５００希釈で試験した。用いられた複合体は、１／１００希釈されたアルカリホスファターゼブタ抗ヒトＩｇＧ複合体（オリオン・ジアグノスチ力）であった。

プレートを自動ＥＬ　Ｉ　ＳＡリーダー〔タイターチック。

マルチスキャン〕で１時間後に読取った。

結果は下記のとおりであった：１　前処理　０．０５　０．０７　０．０５　０．０３　０．０４後処理　０．２１　０．１１　０．０７　０．０７　０．０７２　前処理　０．０５　０．１８　０．１２　０．１１　０．１１後処理　０．２１　０．５２　０．４Ｂ　０．４３　０．４０３　前処理　０．３９　０．２８　０．１６　０．１８　０．１７後処理　０．２９　０．０８　０．０Ｂ　０．０Ｂ　０．０８４　前処理　０．１３　０．１４　０．１１　０．０９　０．１０・後処理　０．６８　０！２　０．３０　０．２６　０．２５５　前処理　０．１２　０．０９　０．０Ｂ　０．０５　０．０Ｂ後処理　０．１０　０゜０８　０．０７　０．０５０．０７上記結果から明らかなように、すべてのペプチドＡ）〜Ｅ）は百日咳毒素ワクチン（ホルマリン不活性化百日咳毒素を含有する）で免疫された同胞体血清中の抗体と特異的に結合することができた。

天然毒素と合成ペプチドＡ）〜Ｅ）でのマウスの免疫化により特異的に誘導される抗体との反応を測定するための酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。

マウス免疫用抗原として用いられるペプチドを最初に“免疫アッセイ用ペプチド抗原の作製′で記載されているように処理した。

各群のマウス（ＮＭＲＩ　）を、担体として水酸化アルミニウムを用い各ペプチド抗原３Ｘ０．５ｍｌの１か刃間隔３回の皮下投与により免疫した。血清サンプルを３回目の投与から２か列後に集めた。ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートを濃度１μｇ／ｍｌの精製百日咳毒素でコーティングした。非特異的結合を阻止するために、ＢＳＡに代えてゼラチン（１％）を用いた（“ＥＬ　Ｉ　ＳＡの一般的説明”参照）。血清の終点力価を１／２０希釈から出発し１０回まで２倍希釈して測定したが、吸光度０．１の単位を切り捨てた。用いられた複合体は、１１５００希釈ヤギ抗マウスＩｇＧ複合体（シグマ）であった。

ブレー°トを自動ＥＬ　Ｉ　ＳＡリーダー〔タイターチック。

マルチスキャン〕で３０分後に読取った。

アッセイ結果は下記のとおりであった：ペプチド　魔　応答数　°平均力価　範囲Ａ　１１　９　６９６７　３２０−４０９６０Ｂ　１７　３　８４０　３２０ −２５６０Ｃ１７７５８０３２０−２５６０Ｄ　１２　１　２５６０Ｅ　１７　１０　１１９４　３２０−１０２４０コントロール　１２　０　６７　２０−１８０上記結果から明らかなように、本発明のすべてのペプチドＡ）〜Ｅ）は後ワクチン処理サンプルの場合に前ワクチン処理サンプルの場合よりも明らかに高い吸光度を有する抗体を免疫処理から誘導することができる。したがって、試験されたペプチドＡ）〜Ｅ）は抗原として機能し、百日咳毒素に対する抗体を誘導する。

結論として、毒素がマウス後免疫処理血清サンプル中で合成ペプチドＡ）〜Ｅ）により誘導される抗体と特異的に結合することは、立証可能である。

国際調査報告ｍｍｍ４＋＋ａｌＡ１１１１Ｍｍ１．１１−％＠、ＰＣτＳミ、８７ＣＣ”−６ｍ＋ｙａｍ−−Ａ−−−ｍ−哨”ｓ、　Ｆ’ＣＴ、５Ｅ８７ｉ０Ｃ”７す

Claims

【特許請求の範囲】

１．下記式のポリペプチド：ａ）【配列があります】ｂ）【配列があります】ｃ）【配列があります】ｄ）【配列があります】ｅ）【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かっＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）。
２．ａ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｂ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｃ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｄ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｅ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；からなる群より選択される、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する少なくとも１種のペプチド配列から主に構成されることを特徴とする人工百日咳毒素抗原。
３．生物学的液体サンプル中における天然百日咳毒素により誘導される抗体測定用の診断免疫アッセイ用キットであって、ａ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｂ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｃ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｄ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｅ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；からなる群より選択される、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する少なくとも１種のペプチド配列から主に構成される人工抗原から選択される少なくとも１種の抗原を診断抗原として含むことを特徴とする診断免疫アッセイ用キット。
４．診断抗原がカップリングされる担体；陽性標準血清サンプル；陰性標準血清サンプル；並びに場合により、緩衝液及び／又は洗浄液；が更に含有された、請求の範囲第３項に記載の診断免疫アッセイ用キット。
５．寒天もしくはアガロースゲル、又は放射性同位元素標識抗原、又は酵素複合体及び場合により酵素複合体用の基質が更に含有された、請求の範囲第４項に記載の診断免疫アッセイ用キット。
６．ａ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｂ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｃ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｄ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｅ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；からなる群より選択される、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する少なくとも１種のぺブチド配列から主に構成される人工百日咳毒素抗原から選択される少なくとも１種の抗原を無毒性の薬学上許容される担体及び／又は希釈剤と共に免疫成分として含むことを特徴とするワクチン組成物。
７．百日咳疾患から被検者を保護するために有効な量で百日咳毒素抗原を含む、請求の範囲第６項に記載のワクチン組成物。
８．ある量の百日咳毒素抗原と共に、百日咳疾患から被検者を保護するために有効な量で抗原アジュバントを更に含む、請求の範囲第６項に記載のワクチン組成物。
９．緩衝液及び／又は保存剤を更に含む、請求の範囲第６、７又は８項に記載のワクチン組成物。
１０．特定の抗体力価において被検者に免疫学的皮膚反応を生じさせるために有効な量で少なくとも１種の抗原〔この抗原は、ａ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｂ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｃ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｄ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；ｅ）ポリペプチド【配列があります】（上記式中、Ｘ１及びＸ２は各々任意のカップリング促進アミノ酸残基を表し、かつＹは−ＯＨ又は−ＮＨ２を表す）及びその部分；からなる群より選択される、天然百日咳毒素により誘導される抗体と反応する少なくとも１種のペプチド配列から主に構成される人工百日咳毒素抗原から選択される〕を無毒性の薬学上許容される担体及び／又は希釈剤と共に含むことを特徴とする皮内皮膚試験用組成物。
１１．緩衝液及び／又は保存剤を更に含む、請求の範囲第１０項に記載の皮内皮膚試験用組成物。