JPH02501113A

JPH02501113A - リンパ球機能関連抗原―３（ｌｆａ―３）を製造するためのｄｎａ配列、組換ｄｎａ分子及び方法

Info

Publication number: JPH02501113A
Application number: JP63505208A
Authority: JP
Inventors: ウォルナー，バーバラ　ピー; スプリンガー，ティモシー　エイ; ヘッション，キャサリン; ティザード，リチャード; マタリアノ，ロバート; ダスティン，マイケル　エル
Original assignee: Biogen Inc
Current assignee: Biogen Inc
Priority date: 1987-06-03
Filing date: 1988-06-03
Publication date: 1990-04-19
Anticipated expiration: 2012-09-30
Also published as: AU1955288A; DE3856301D1; AU634464B2; SG49653A1; US4956281A; JP2659781B2; WO1988009820A1; EP0315683A1; ATE176502T1; EP0315683A4; HK1009291A1; EP0315683B1; HU211627A9; DE3856301T2; MX9202970A; CA1340232C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子及びリンパ球　。−Ａ合した　原−３の製造方法本発明は、ＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ及びリンパ球機能の会合した抗原−３（ＬＦＡ−３）の製造方法に関するものである。更に特別には、本発明は、ＤＮＡ配列が、ＣＤ２、即ちトリンノ寸球の表面のレセプターに結合したＬＦＡ−３又はその誘導体に対して、適切な単細胞宿主中の発現にコード付けすることを特徴とするＤＮＡ配列に関するものである。

更に好適には、本発明のＬＦＡ−３及びその誘導体はＴ−リンパ球の表面のＣＤ２に結合する。

最も好適には、これらはまた、Ｔ−リンパ球と標的細胞との間の粘着を防止する。本発明によると、これらのＤＮＡ配列で変換された単細胞宿主とこれらを含む組換ＤＮＡ分子は、ヒト起源の他のタンパクが本質的に無いＬＦＡ−３を製造するのに使用されて良い。それ故にこの新規な抗原は、治療と診断の組成物において及びこの発明の方法において使用されて良い。

星及■旦背遣Ｔ−リンパ球は、標的細胞及び抗原提示細胞と相互作用することにより免疫応答に主要な役割を演する。例えば、標的細胞の致死を仲介するＴ−リンパ球は、細胞溶解のトリンバ球の標的細胞への粘着を含む多段階工程である。更に、ヘルパーニー９フ３球は、抗原−提示細胞へ粘着することにより免疫応答を開始する。

Ｔ−’Ｊンバ球の標的及び抗原−提示細胞とのこれらの相互作用は、高度に特異的であって、かつ標的又は抗原−提示細胞上の抗原は、Ｔ−リンパ球の表面上の多くの特異的抗原レセプターによる認識に左右される。

Ｔ−リンパ球と他の細胞のレセプター−抗原相互作用はまた、各種のＴ−リンパ球表面タンパク、例えば、抗原レセプター複合体のＣＤ３（Ｔ３）と補助分子のＣＤ４．　ＬＦＡ−１，ＣＤｌｌ１．及びＣＤ２により促進される。それはまた、標的又は抗原−提示細胞の表面に発現されるＬＦＡ−３、ＩＣＡｋｌ−１及びＭＢＣのような補助分子に左右される。事実、Ｔ−リンパ球上の及び標的又は抗原−提示細胞上の補助分子は、相互作用して細胞間の粘着を仲介すると仮定されている。従って、これらの補助分子は、リンパ球−抗原−提示細胞とリンパ球− 標的細胞との相互作用を促進し、かつ白血球−内皮細胞相互作用とリンパ球再循環に重要であると考えられている。

６７７−９２頁（１９８７）　：　スブリンゲル等、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（アトリンパ球−仲介された細胞溶解と抗原会合した３つの異なる抗原：　ＬＦＡ−１，ＬＦＡ−２，及びＬＦＡ−３Ｊ　、Ｐｒｏｃ、？１ａｔ１．Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ（プロシーディングナショナルアカデミ−サイエンス、米国）、第７９巻、第７４８９−９３頁（１９８２）］。

ＬＦＡ−３は、抗原−提示細胞、及び標的細胞、特に単球、顆粒球、ＣＴＬ細胞、Ｂ−リンパ芽球細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、及び繊維芽細胞に見いだされる（スプリ５ンゲル等１．ヒ記プ（献）。

ヒトＬＦＡ−３は、ヒト赤血球から精製されている（ダスチン等、上星文厘）。

これは、糖含有盟約５０％の分子量ａｏ、　ｏｏｏ〜７０．０００の糖タンパク質である。この精製ＬＦＡ−３は、Ｔ−リンパ球の表面のＣＤ２へ結合しており、かつＴ−リンパ球と赤血球の粘着を防止する（ダスチン等１．ヒ起プ二献）。

しかし、治療と診断における基本的使用に対して、多量のより安価なＬＦＡ−３が、赤血球からの精製で入手されるものよりも要望されている。更に、治療の使用に対して、Ｂ型肝炎ウィルス又はエイズウィルスのようなウィルスで汚染されているかもしれないヒト赤血球と異なる他の原料からのＬＦＡ−３を得ることがより好ましいであろう。

＆肌旦適里本発明は、これらの問題を解決する。本発明は、ＣＤ２、即ちＴ−リンパ球の表面のレセプターに結合するＬＦＡ−３とその誘導体を多量に提供する。更に好適には、本発明のＬＦＡ−３及びその誘導体は、Ｔ−リンパ球の表面のＣＤ２へ結合しており、かつこれらはまた、Ｔ−リンパ球と標的細胞の間の粘着を防止する。更に特別には、本発明は、可溶性形態のＬＦＡ−３に関するものである。本発明はまた、ヒト起源の他のタンパク質の本質的に無くかつエイズ又はＢ型肝炎のようなウィルスにより汚染されていない形態のＬＦＡ−３を提供する。

本発明は、これらの目的を、適切な単細胞宿主中の発現にＬＦＡ−３又はこれらの誘導体に対してコード付けするＤＮＡ配列を提供することにより達成するものである。更に、本発明は、可溶性形態のＬＦＡ−３に対する発現にフード付けすることを特徴とするＤＮＡ配列を提供するものである。

本発明はまた、これらのＤＮＡ配列とこれらで変換された単細胞宿主とを含む組換ＤＮＡ分子を提供するものである。

これらの宿主は、広範囲の各種治療及び診断の組成物と方法に使用するための本発明の新規なＬＦＡ−３と誘導体を多量に製造することを可能とする。

本発明のＤＮＡ配列は：（ａ）　ＤＮＡ配列：ファージλＨＴ１６に担持されるＤＮＡ挿入断片；（ｂ）　前記ＤＮＡ配列に対してＴｌ１１以下の約２０〜２７°Ｃに等しい条件下にハイブリッド形成され、かつＣＤ２、即ちＴ−リンパ球の表面のレセプターへ結合するポリペプチドに対して発現にコード付けするＤＮＡ配列；及び（Ｃ）　前記ＤＮＡ配列のいずれかにより発現に対してこれにコード付けされたポリペプチドに対して発現にコード付けするＤＮＡ配列から成る群から選択される。

区ｆＬｌ！即引反更第１図は、Ｎ−末端のアミノ酸配列と、免疫親和性クロマトグラフィーを使用してヒト赤血球から精製したヒトＬＦＡ−３の各種ペプチド断片を表している。

第２図は、ヒト赤血球から精製したヒ）　ＬＦＡ−３のアミノ酸配列から誘導した化学的に合成したオリゴヌクレオチドＤＮＡの２つのプールを表している。

第３図は、ファージλＨＴ１６に担持されるＤＮＡ挿入断片のＤＮＡ配列を表している。第３図はまた、ヒトＬＦＡ−３とこれから推定されるアミノ酸配列に対して発現にコード付けするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を表してしる。

第４図は、配列決定のプラスミドｐＮＮＯ１の関係部分を表している。

第５図は、プローブＬＰ−１０，ＬＦ−１１，ＮＮ−Ａ、　ＮＮ−Ｂ、　ＮＮ− Ｃ。

及びＮＮ−Ｄを表している。

聚匪旦罷徊皇翌男発明者等は、２つのライブラリーから本発明のＤＮＡ配列を単離した：白血球泳動＃９からの末梢血液リンパ球から誘導したλｇｔｌＯｃＤＮＡライブラリーとヒト扁桃から誘導したλｇｔｌＯｃＤＮＡライブラリーである。しかし、発明者等は、ＬＦＡ−３を発現する他の細胞から調製したライブラリーも使用することが出来た。これらは、例えば、単球、顆粒球、ＣＴＬ’ｓ、　Ｂ−！Ｊンパ芽球類細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞及び繊維芽細胞を包含する。発明者等はまた、ヒトゲノムバンクを使用することも出来た。

これらのライブラリーをスクリーニングする為に、発明者等は、一連の化学的に合成した非転写オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを使用した。発明者等は、発明者等がヒト赤血球から精製したＬＦＡ−３を使用して決定したＬＦＡ−３の各種断片のアミノ酸配列を考慮してこれらのプローブを選択した。

これらの断片は、第１図に表している。発明者等は、最少縮重のオリゴヌクレオチドプローブの構成を可能にするＬＦＡ−３の各種領域からアミノ酸を選択した。

発明者等は、プローブの２つのプールニＬＦＩとＬＦ２−５を調製した。これらのプールを第２図に表している。ＬＦＩは、３２−ホールド縮重２０−マーであり。かつＬＦ２−５は、３８４−ホールド縮重２０−マーである。この後者のプールの高い縮重の為に、発明者等は、プールを各々が９６−ボールド縮重の４つのサブプールー−ＬＦ２．　ＬＦ３．　ＬＦ４及びＬＦ５−一に細別した。

スクリーニングする為に、発明者等は、プラークハイブリッド形成スクリーニング検定を利用する発明者等のｃＤＮＡライブラリーに対して、発明者等のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリッド形成した。発明者等は、幾つかの発明者等のプローブに対してハイブリッド形成するクローンを選択した。更に、選択したクローンのｃＤＮＡ挿入断片を単離しかつプラスミド中にサブクローン化した後に、発明者等は、これらのヌクレオチド配列を決定し、かつこれらのヌクレオチド配列から推定したアミノ酸配列を、発明者等が以前に発明者等の精製したヒ）　ＬＦＡ−３から決定したアミノ酸配列と比較した。これらの比較の結果として、発明者等は、総ての発明者等が選択したクローンは、ヒトＬＦＡ−３のアミノ酸配列に対してフードするｃＤＮＡ挿入断片により特徴ずけられることを決定した。

発明者等は、これらのｃＤＮＡの最長のヌクレオチド配列（ファージλＩ’１Ｔ１６のＤＮＡ挿入断片）とＬＦＡ−３とそれから推定されるアミノ酸配列に対してコード付けするＤＮＡ配列を第３図に表現している。第３図に示すように、このｃＤＮＡ挿入断片は、７５０ｂｐの読取り枠（２５０アミノ酸）、１６　ｂｐ　５°翻訳しない領域及び２０１　ｂｐ　３°翻訳しない領域を有する。発明者等がヒト赤血球から精製したＬＦＡ−３から決定したＮ−末端アミノ酸配列を有する第３図の推定アミノ酸配列の比較は、アミノ酸−２８〜１は、信号配列から成り、かつアミノ酸１〜２２２は成熟ＬＦＡ−３のタンパク質配列から成ることを暗示している。

第３図に示されかつ預けたクローンλＨＴ１６に含まれるｃＤＮＡ配列は、本発明に従って各種方法で使用される。これは、その一部、又はこれらの合成又は半合成フビーは、Ｄ）ＩＡプローブとして使用して、他のヒトのｃＤＮＡ又は動物のｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーンして良く、このゲノムライブラリーは、ＬＦＡ−３に関する他のＤＮＡ配列を、ハイブリッド形成により選択するためのものである。代表的に、普通のハイブリッド形成条件、例えば、Ｔｍ以下約２０〜２７°Ｃが、このような選択に適用される。しかし、より少ない緊縮条件は、ライブラリーがライブラリーと異なる種からのプローブでスクリーンされる場合に、例えば、ヒトプローブでマウスライブラリーのスクリーンニングする場合必要である。

第３図のｃＤＮＡ、その一部、又はこれらの合成又は半合成コピーはまた、各種変異を調製する出発原料として使用される。このような変異は、どちらかの縮重であって良く、即ち、変異は、変異コドン又は非縮重によりこれに対して暗号化されるアミノ酸配列を変えず、即ち、変異は、変異したコドンによりこれに対して暗号化されるアミノ酸配列を変える。例えば、これらの変異は、より容易な精製又はより高いＬＦＡ−３活性のような、より高いレベルの製造を可能にする。

これら総ての理由に対して、本発明のＤＮＡ配列は：（ａ）　ＤＮＡ配列：ファージλ）ｌＴ１６に担持されるＤＮＡ挿入断片：（ｂ）　前記ＤＮＡ配列に対してＴｌ１１以下の約２０〜２７℃に等しい条件下にハイブリッド形成され、かつＣＤ２、即ちＴ−リンパ球の表面のレセプターへ結合するポリペプチドに対して発現にコード付けするＤＮＡ配列；及び（ｃ）前記ＤＮＡ配列のいずれかにより発現に対してこれにコード付けされたポリペプチドに対して発現にコード付けするＤＮＡ配列から成る群から選択される。

好適には、本発明のＤＩＩＡ配列は、第３図のアミノ酸１〜２２２（追加Ｎ−末端メチオニンを有する又は有しない）又はこれらの一部に対して示される配列を有するポリペプチドに対してフード付けする。更に好適には、本発明に対するＤＮＡ配列は、より小さいタンパク質の製造を可能にする為に、疎水性トランスメンブラン部分に対してコード付けするこれらの部分を、それから、例えば、約６６２〜７１５ヌクレオチドから除去する為に、第３図のもの（アミノ酸１〜２２２）に比較して修飾されるだろう。最も好適には、本発明のＤＮＡ配列は、可溶性タンパク質又はＣＤ２に結合するペプチド、Ｔ−リンパ球の表面のレセプターに対してフード付けする。更に好適には、本発明のＬＦＡ−３と誘導体は、Ｔ− リンパ球の表面のＣＤ２に結合する。

最も好適には、これらはまた、Ｔ−リンパ球と標的細胞の間の粘着を防止する。

本発明のＤＮＡ配列はまた、ＬＦＡ−３又はこの誘導体の製造に有用であり、これらは、これらにより、これらのＤＮＡ配列で変換される単細胞宿主において、発現にフード付けされる。この分野で周知のように、本発明のＤＮＡ配列の発現に対して、ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクターにおいて発現制御配列に作用的に結合され、かつ適切な単細胞宿主を変換する為にこの発現ベクター中にて利用されるべきである。

本発明のＤＮＡ配列の発現制御配列に対するこのような作用的結合は、ＤＮＡ配列の上流の正しい読取り枠における翻訳開始信号の提供を包含する。若し発現されるべき本発明の特別なりＮＡ配列が、例えば、フェニルアラニンで開始する成熟ＬＰＡ−３のようにメチオニンで開始されないならば、開始信号は別のアミノ酸において起こり一一メチオニンーー生成物のト末端に位置される。一方、このようなメチオニル−含有−生成物は、本発明の組成物と方法に直接に利用されて良いが、使用する前にメチオニンを除去するのが一般的により望ましい。このようなＮ−末端メチオニンをメチオニンで発現されるポリペプチドから除去する方法は、技術分野において得られる。例えば、幾らかの宿主と発酵条件により生体内のＮ−末端メチオニンの実質的に総てを除去出来る。他の宿主は、試験管内においてＮ−末端メチオニンの除去を必要とする。しかし、このような生体内の及び試験管内の方法は、この技術分野において周知である。

高範囲の各種宿主／発現ベクター組替えは、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに利用される。有用な発現ベクターは、例えば、染色体の、非染色体の及び合成のＤＮＡ配列の断片から成り、このようなりＮＡ配列は、ＳＶ４０の各種誘導体及び公知細菌プラスミド、例えば、ｃｏｌ　Ｅｌ、ｐｃＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びこれらの誘導体を含む大腸菌からのプラスミド、高範囲の宿主領域プラスミド、例えば、ＲＰ４、ファージＤＮＡ５．例えばファージλの多くの誘導体、例えば、ＮＭ９８９、及び他のＤＮＡファージ、例えば、Ｍ１３及び繊維状一本鎖ＤＩＩＡファージ、２μプラスミド又はその誘導体のような酵母プラスミド、及びファ・−ジＤＮＡ又は他の発現制御配列を利用する為に修飾されたプラスミドのようなファージＤＮＡ５である。動物細胞発現に対して、発明者等は、好んでプラスミドＢＧ３１２、アデノウィルス２の主後期プロモーターを含むプラスミドを使用する。

更に、どの高範囲の各種発現制御配列−−ＤＮＡ配列に作用的に結合する時にこのＤＮＡ配列の発現を制御する配列−一これは本発明のＤＮＡ配列を発現する為に、これらのベクターに使用して良い。このような有用な発現制御配列は、例えば、ＳＶ４０又はアデノウィルスの初期と後期のプロモーター、Ｉａｃシステム、肋２システム、υ匹又はす匹システム、ファージλの主オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄフートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他のグルツース分解酵素の為のプロモーター、酸ホスファターゼ、例えば、ＰｂＯ２のプロモーター、イーストα−交配因子のプロモーター、及び原核細胞又は真核細胞又はこれらの誘導体の遺伝子の発現を制御するのに公知な他の配列、及び各種のこれらの配合物を包含する。動物細胞発現に対して、発明者等は、好んでアデノウィルス２の主後期のプロモーターから誘導した発現制御配列を使用する。

高範囲の各種単細胞宿主細胞も、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに有用である。これらの宿主は、大腸菌、９ｘ−トモナス、バシラス、ストレプトミセスの菌株、イーストのような真菌、及びＣ）１０及びマウス細胞のような動物細胞、Ｃ０５Ｉ、Ｃ０Ｓ７、Ｂ５Ｃｌ、Ｂ５Ｃ４０及びＢＭＴＩＯのようなアフリカミトリサル細胞、及びヒト細胞及び組織培養の植物細胞のような周知の原核細胞と真核細胞宿主を包含する。動物細胞発現に対して、発明者等はマウスＬ−細胞を好む。

勿論、総てのベクター及び発現制御配列が、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに充分に等しく作用するとは限らないことを理解すべきである。また総ての宿主も、同じ発現システムで充分に等しく作用しないであろう。しかし、当業者は、不適切な実験をすることも無く、かつ本発明の範囲から離間すること無く、これらベクター、発現制御配列及び宿主の間で選択をすることが出来る。例えば、ベクターを選択する際に、宿主は、ベクターがその中に複製しなければならないことを考慮されねばならない。ベクターのコピ一番号、このコピ一番号を制御する能力、及び抗生物質マーカーのようなベクターにより暗号化されるどの他のタンパク質もまた考慮されなければならない。

発現制御配列を選択する際に、各種の因子もまた考慮されなければならない。これらは、例えば、システムの相対的強さ、その制御受は易さ、及び本発明の、特に電位二次構造に関して特別なりＮＡ配列との適合性を含む。単細胞宿主は、選択されたベクターとの適合性、宿主に対して本発明のＤＮＡ配列により発現にコードされた生成物の毒性、宿主の分泌特性、タンパク質を正確に折り畳む宿主の能力、宿主の発酵要件、及び本発明のＤＮＡ配列により発現にコード付けされた生成物の精製の容易さを考慮することにより選択されなければならない。

これらのパラメーター内で、当業者は、発酵によって又は大規模の動物細胞、例えば、マウスＬ細胞培養において、本発明のＤＮＡ配列を発現するであろう各種ベクター／発現制御システム／宿主の組合せを選択して良い。

本発明のＤＮＡ配列の発現により製造されたポリペプチドは、発酵又は動物細胞培養から単離され、かっこの技術分野で周知の各種方法で精製されて良い。このような単離と精製技術は、各種因子、生成物がいかにして製造されるか、それが可溶性か不溶性かどうか、及びそれが細胞から分泌されるか又は細胞を破壊することにより単離しなければならないかどうかのような因子に左右される。しかし、当業者は、本発明の範囲から離間することなく、適切な単離と精製技術を選択して良い。

本発明のＤＮＡ配列、例えば、＋ｎｅｔ−ＬＦＡ−３（第３図のアミノ酸１−２２２）又はＬＦＡ−３（第３図のアミノ酸１−２２２）、これらの好適なより小さく疎水性でない誘導体、又は更に好適なこれらの可溶性誘導体の発現により製造されるポリペプチドは、本質的にヒト起源の他のタンパク質を含まず、かつＢ型肝炎ウィルスとエイズウィルスのようなウィルスにより汚染されていない。

これらのポリペプチドは、免疫応答を遮断し又は増大する組成物と方法に有用である。例えば、本発明のポリペプチドは、標的細胞とのこれらの相互作用を妨げることにより細胞溶解Ｔ−リンパ球活性を防止するのに活性である。これらは、ヘルパー■＝細胞と抗原−提示細胞の相互作用を妨げる為に、免疫応答に対して同じ効果を有する。更に、本発明の化合物は、溶菌と免疫抑制の為の標的特異Ｔ細胞に、又はリンホカインのような分娩薬に、特異的に標的とするＴ−細胞に使用して良い。更に好適には、本発明のポリペプチドの可溶性誘導体は、Ｔ−リンパ球のＣＤ２部位を飽和するのに利用して良く、かくしてＴ−細胞活性化を防止する。この効果は、移植片対宿主疾患において、自己免疫疾患、例えば、慢性関節リウマチにおいて、及び同種異系移植拒絶反応の防止において明白に大きな有用性がある。更に、本発明のポリペプチドは、これが、ヒト以外の種に起こる抗体であるよりも、ヒトにおける免疫応答を惹起しそうも無い為に、ＬＦＡ−３又はＣＤ２に対するモノクロナール抗体以上に好まれる。本発明の治療組成物は、このようなポリペプチドの免疫抑制又は促進に有効量、及び薬学的に受け入れ可能な担体から代表的に成る。本発明の治療方法は、これらの組成物により薬学的に受け入れ可能な方法において患者を治療する段階から成る。

これらの治療に使用する為の本発明の組成物は、各種形態を取る。これらは、例えば、錠剤、丸剤、粉末、液体溶液又は分散体、リポソーム、座薬、注射可能な溶液、溶融可能な溶液のような固体、半固体、及び液体供与形態を含む。

好適な形態は、投与の意図するモード及び治療的適用に左右される。組成物はまた、好適には、当業者に公知の従来の薬学的に受け入れ可能な担体と補助剤を含む。好適には、本発明の組成物は、ユニット用量の形態であり、かつ普通−日一回又はそれ以上、患者に投与されるだろう。

一般的に、本発明の治療的組成物は、他の薬学的に重要なポリペプチド（例えば、α−インターフェロン）に対して使用されるものと同じ方法と組成物を使用して配合されかつ投与されて良い。従って、ポリペプチドは、凍結乾燥形態で貯蔵され、投与直前に殺菌水で戻し、かつ非経口投与、皮下、静脈内又は病巣内の経路のような普通の投与経路により投与される。

本発明のポリペプチド又はこれらに対する抗体はまた、診断組成物と方法にも有用であって、Ｔ−細胞サブセット又はＣＤ２＋細胞を検出し、又は自己免疫疾患、移植片対宿主疾患及び同種異系移植拒絶のような過剰又は激減Ｔ−細胞を特徴とする疾患の過程をモニターする。°　。

最後に、本発明のポリペプチド又はこれらに対する抗体は、Ｂ及びＴ細胞を分離するのに有用である。例えば、固体担体に結合する時に、本発明のポリペプチド又はこれらに対する抗体は、ＢとＴ細胞を分離するだろう。

本発明がより良く理解される為に、次の実施例を説明する。これらの実施例は、説明の目的のみのものであり、従って、如何なる方法においても、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。

！旌画ヒトＬＦＡ−３の精製と配列形　：発明者等は、ヒトＬＦ＾−３を精製し、それをダスティン等、煎Ｅの方法を改良した方法を使用して、使用期間を過ぎたヒト赤血球（アメリカ赤十字、ニードマン、マサチューセッッから入手）からトリプシン断片を生成し、かつ第１図に示される部分アミノ酸配列を決定するのに利用した。

発明者等は、（ＮＨ，）２ＳＯ，沈澱にょるハイブリドーマ培養とタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーとによるハイブリドーマ培養上清からモノクロナール抗体（ＭＡｂ）ＴＳ２／９（サンチェズーマドリード等、凱Ｅ）を精製した。次いで発明者等は、この精製ＭＡｂを使用して次の精製に使用、する為の親和性カラムを調製した。

発明者等は、カトレヵサスの方法［マーチ等、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（アナリティヵルバイオヶミストリー）第６０巻、第１４９頁（１９７４）］の方法の改良によりセファローズＣＬ−４Ｂに対して精製１１Ａｂを結合した。発明者等は、洗浄セファローズＣＬ−４Ｂ（ファルマシア、ウプサラ、スエーデン）をＩＭＮａｔＣＯｓ中の４０＋ｏｇ／ｍｌ　ＣＮＢｒで氷上１ｏ分間活性化し、次いでそれを蒸留水と０．１ｍＭ　ＨＣＩで洗浄した。発明者等は、活性化セファローズを濾過して湿ったケーキとし、次いでそれを０．０５Ｍ　ＮａＣ１と０．１ＭＮａＨＣＯｓ　（ｐＨ８，４）中の２−４ｍｇ／＋１　ＩｇＧ（ＬＦＡ−３１ｉ１Ａｂ又はマウス　ＩｇＧ）と共に洗浄抗体溶液へ添加した。次いで発明者等は、この分散体を回転しながら２０時間混合し、次いでエタノールアミン５０ｍＭの添加と１時間の装置により残留反応性基を封鎖した。

発明者等は、２８０ｎｍにおいて吸光度を測定することにより未結合抗体に対して上清を検査した。結合は普通９０％のオーダーであった。次いで発明者等は、カラム中にＭＡｂ−結合セファローズを注ぎ、次いで親和クロマトグラフィーに対して使用する前に、それを１サイクルのｐ）ＩｌｌとｐＨ３緩衝液（下記参照）で洗浄した。

発明者等は、前記の親和クロマトグラフィー（ケスチン等、ＲＭｅ）によりトリトンＸ−１００で可溶化した後ＬＦＡ−３を精製した。発明者等は、総ての段階を４℃で実施した。

発明者等は、使用期間を過ぎたヒト赤血球をアメリカ赤十字に−ドマン、マサチューセッツ）がら得た。発明者等は、２ユニツトの全血液からの細胞をＰＢＳ（ｐＨ７，２）で３回洗浄した。次いで発明者等は、充填細胞を約５００ｍ１まで沈澱物とし、次いで撹拌しながら赤血球へ２％トリトンＸ−１００，１ａ＋Ｍフェニールメチルスルホニルフロライド、５ＩＩＩＭヨードアセトアミド及び０．２トリプシン阻害剤ユニツト／＋１アプロチニンを添加した。１時間後、発明者等は、溶解物を１５０．０００ｇで２時間遠心分離した。次いで発明物等は、透明溶解液を流速２０ｎ＋ｌ／ｈで２つのカラムに順々に通した＝（１）幾らがの不純物を吸着しかつどの粒状物も濾過する為にマうすＩｇＧ−セファローズカラム（２ｍｇ／ｍｌで２ｍ１）、及び（２）　ＬＦＡ−３ＭＡＢ−セファローズカラム（２ｍｇ／ｍｌで５−１５−１Ｏ。発明者等は、ＬＦＡ−３ＭＡＢ−セファローズカラムを、５カラム容量の５０ｍＭ？−’Ｊ酸ナトリウム（ｐＨ７，２）、０．２５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％トリトンＸ−１００，次いで５力−フＡ容ｉｉノ２０ａ＋Ｍトリエチルアミ：／　（ｐＨ１１）、０．２５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％トリ）　７Ｘ−１００及び再び２カラム容量のｐＨ７，２の緩衝溶液で、総て１ｍ１７分の流速で洗浄した。次いで発明者等は、残留ＬＦＡ−３を５力ラム容量ノ５０ｍＭグ’Ｊ　シンＨｃｉ（ｐＨ３）、０．２５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％）　リ）　／Ｘ−１００で２０ｍ１／時間の流速にて溶出した。発明者等は、溶出ＬＦＡ−３を１Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，６）、０．１％トリドアＸ −１００中に集めることにより中和した。

発明者等が、ＬＦＡ−３を溶出する為にオクチル−β−Ｄ−グルコピラノサイド（ＯＣ）　（カルビオケミ−）を使用した時に、総ての段階は、高ｐＨ洗浄の後まで同じであった。この時点で、発明者等は、カラムを５倍量の燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，２）、１％ＯＧを含む０．１５　Ｍ　ＮａＣｌ、で洗浄し、次いでグリシン緩衝液（ｐＨ３）、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１％ＯＧを使用してＬＦＡ−３を溶出した。溶出プロフィルは、トリトンｘ−ｉｏｏで得たものと同じであった。発明者等は、続いてこのＬＦＡ−３を”−ＬＦＡ−３ＭＡｂで「ドツト　ブロード」検定法［ハウケス等、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（アナリティ力ルバイオケミストリー）第１１９巻、第１４２頁、（１９ｇ２）］を使用して半定量的方法で精製した。

トリプシン消化とアミノ酸配列決定に対して精製ＬＦＡ−３を調製する為に、発明者等は、Ｎ−グリコシダーゼＦを使用して、供給者（ゲンザイム、ボストンマサチューセッツ）の指示に従って、僅かに改良した方法で脱グリコシレートした。先ず発明者等は、エタノール沈Ｒ（トリトンＸ−１００）又は限外濾過（ＯＧ）によりデタージェントからＬＦＡ−３を分離した。

次いで発明者等は、ＬＦＡ−３を２５μｇの０．５％ＳＤＳ、　０．２Ｍ　２− メルカプトエタノールと共に５分間沸騰することにより変性した。

次いで発明者等は、変性ＬＦＡ−３を、最終容量５０μＱにおいて、３％トＩＪ　）　ンＸ−１００と１０＋ｎＭ（７）　１．１０−７　：Ｌ　＋　７トＬ１０７を含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐｌ（８゜６）中の５０／ｎモルのＮ−グルカナーゼと３７℃で２０時間処理し、次いでエタノール中の脱グリコシレートしたＬＦＡ−３（ＮＧ−ＬＦＡ−３）を沈澱させた（５容、ｆｉ）１００％エタノール中−２０℃で一晩）。

発明者等は、調製用５ＤＳ−ＰＡＧＥと電気泳動溶出によりＬＦＡ−３（２５Ｋｄ）を処理して高度に精製したＮ−グルカナーゼを調製した。発明者等は、アルゴン下１００’Ｃで５分間、Ｎ−グルカナーゼ−処理ＬＦＡ−３（約３５０ｐモル）を２５０＋＋＋Ｍ（７）ｎ−エチルモロホリン７　セテ−）中（７）　５ｍＭＤＤＴ、　１ｍＭＥＤＴＡ、０．２％５ＤＳ（ｐＨ８，２５）　テ還元し、次いでそれを暗所で２３℃にて３０分間、１１１ＩＩＭヨード酢酸ナトリウムでアルキル化した。発明者等は、生成物（ＣＭ−ＮＧ−ＬＦＡ−３）を、０．２％ＳＤＳ、　２５０ｍＭ　Ｎ−エチルモルホリンアセテート（ｐＨ８，２５）で平衡させたセファデックスＧ−２５Ｍでゲル濾過することにより脱塩し、それを凍結乾燥した。次いで発明者等は、凍結乾燥したＬＭ−ＮＧ−ＬＦＡ−３を１０ｍ＋１！７）無水エタノール中分散し、−２０″Ｃで７日間貯蔵し、ＬＦＡ−３を４ ℃で３０分間６０００ｘｇニて遠心分離することにより戻した。発明者等は、沈澱物を４００μＱの０．１ＭＮＨ，Ｉ（Ｃｏ３中に溶解し、次いでそれをベビンスキー等、上（ジャーナルバイオロジカルケミストリー）第２６１巻、第４２３９頁、（１９８６）に記載のようにしてＴＰＣＫ−トリプシン（１５％ｖ／ｖ）で消化した。発明者等は、消化物を蟻酸で最終蟻酸濃度２ｏ％まで酸性とし、直ぐに狭い口径Ｃ，カラム（アクアボーレＲＰ３００．０．２１Ｘ１０ｃｍ、ブラウンリーファブス）で逆相高圧液体クロマトグラフィーにより断片を分画した。

発明者等は、得られりベフチドを、流速０．３ｍｌ／分（０，５分の分画を収集）で０．１％トリ弗素酢酸中のアセトニトリル（０−７５％）勾配で溶出した。

発明者等は、２１４ｎｍと２８０ｎｍの両方でカラム溶出物をモニターした。

発明者等は、各々の無傷ＬＦＡ−３（３００ｐモル）、ＮＧ　ＬＦＡ−３（５０ｐモル）及びＣＭ−ＮＧ　ＬＦＡ−３（５−５０ｐモル）＜７）　）　’ｊブシンノ断片を、ポリブレンの存在下らアブライドバイオシステムズ４７０Ａガス相シークエンサーを使用する自動エドマン分解［ヘビツク等、ＪＢＣ，（ジャーナルバイオロジカルケミストリー）第２５６巻、第７９９０頁、（１９８１）］に付した。発明者等は、アプライドバイオシステムズ１２０Ａ　ＰＴＨ分析機を使用するオンラインでＰＴＨ−アミノ酸を同定した。無傷タンパク質の配列決定は、第１図に示すように３８個のアミノ酸の配列を与えた。

オリゴヌクレオチドプローブの柩発明者等は、最少核酸縮重により特徴ずけられるＬＦＡ−３のアミノ酸末端配列（第１図の下線部参照）からの領域に対してコード付けする非転写オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブの２つのプールを、アプライドバイオシステムズ３０ＡＤＮＡ合成機により化学的に合成した。各々の選択したアミノ酸配列に対して、発明者等は、総ての可能なコドンへ相補のプローブのプールを合成した。発明者等は、ａ＋ＲＮＡのみならずＤＮＡの対応配列へこれらのハイブリッド形成を可能にする非転写プローブを合成した。発明者等は、［γ−’　”　Ｐ］−ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼ［マツフスマとギルバート、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（プロシーディングナチュラルアカデミ−サイエンス）第７４巻、第５６０頁（１９７７）］を使用して発明者等のオリゴヌクレオチドプローブに標識した。

第２図に示すように、オリゴヌクレオチドプールＬＦＩは、３２−ホールド縮重を有する２ｏ−マーであった。プローブプールＬＦ２−５は、３８４−ボールド縮重を有する２ｏ−マーであった。しかし、その縮重を縮小する為に、発明者等は、Ｇｌｙに対する縮重したコドンを各々のサブプールに対してその４つの可能なヌクレオチドの一つに開裂することにより、９６−ボールド縮重の４個のサブプールの各々の中にこのプールを合成した。次に発明者等は、前記したように、ヒト扁桃＋ｎＲＮＡを含有するノーサンプロット法に対して［ウオルナー等、Ｎａｔｕｒｅ（ネイチャー）、第３２０巻、第７７−８１頁（１９８６）］、各々のサブプールのハイブリッド形成により、不正確な配列を含む３個のプールから正確な配列を含むサブプールを選択した。

ヒト無傷ＲＮＡ中の１３００ヌクレオチド転写に対してハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドプローブサブプールＬＦ２は、正確な配列を含んだことを暗示した。従って、発明者等は、発明者等の各種ライブラリーをスクリーニングする為に、それとプールＬＦＩを使用した。

シｔ１０末　血液リンパ球ｃＤＮ＾ライブラリーの構成発明者等の末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）ＤＮＡライブラリーを調製する為に、発明者等は、単球を除去する一巡の吸収を介して白血球泳動＃９によりＰＢＬを操作した。次いで発明者等は、非粘着細胞をＩＦＮ−７１０００Ｕ／＋１１１とＩＯＡｔｇ／ｍ１ＰＨＡテ２４時間刺激した。発明者等は、フェノール抽出を使用してこれらの細胞からＲＮＡを単離し［マニアティス等、立五又ヱニヱ進、第１８７頁（コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−）（１９８２）１次いで一巡のオリゴｄＴセルローズクロマトグラフィーによりポリ＾”ｍＲＮ＾を調製した。発明者等は、このＲＮＡをエタノール沈澱し、それを高速真空乾燥し、次いでこのＲＮＡを１０μｅＨｔｏ（ｏ、　ｓμｇ＃ｚ　（１）中に再分散した。発明者等は、ＣＨｓ　Ｈｇ　ＯＨ（５ｍ　Ｍ最終濃度）及びβ−メルカプトエタノール（０，５μｇ／μ０中で室温にて１０分間処理した。次いで発明者等は、メチル水銀処理しｆニーＲＮＡを、４３℃テＯ，１Ｍ　）　’）　ｘ　−ＨＣＩ（ｐＨ８，３）、０．０１Ｍ　ＤＴＴ、　２ｍＭバナジル複合体、５μｇオリゴｄＴ＋ｔ−＋＊’　２０ｍＭＫＣｌ、　１ｍＭｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、０．５＋＋＋Ｍ　ｄＡＴＰ、２０ｍ１４　ＫＣＩ、１ｍＭ　ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ。

０．５ｍＭ　ｄＡＴＰ、総容量５０μρ中の２μＣｉ　［ａ　−３２Ｐ］ｄＡＴＰ及び３０Ｕ１゜５μＱ　ＡＭＶ逆転写酵素（セイ力ガタ　アメリカ）へ添加した。発明者等は、混合物を３分間室温にて、次いで３時間４４℃にて培養し、次いで０．５Ｍ　ＥＤＴＡの２．５μＱを添加することにより反応を停止させた。

発明者等は、反応混合物を等容量のフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、水溶液層を０．２容量のＩＯＭ　ＮＨＪＡｃと２．５容量のＥｔＯＨで２回沈澱させ、次いで真空下に乾燥したつｃＤｌｌＡの収率は１．５μｇであった。

発明者等は、合成中にＤＮＡポリメラーゼ１大型断片を使用した以外は、オカヤマとベルブ［Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　（モレキコラ　セルラーバイオロジカル）第２巻、第１６１頁、（１９８２）及びグブラーとホフマン（遺伝圧、第２５巻、第２６３頁、（１９８３）］の方法に従って第２鎖を合成した。

発明者等は、８０μＱＴＡ緩衝液［０，０３３Ｍ　）リスアセテート（ｐＨ７，８）　：　０．０６６Ｍ酢酸カリ；０．０１Ｍ酢酸マグネシウム；０．００ＭＭ　ＤＴＴ；　ＳＯμｇ／ｍ１ＢｓＡ］、５ＭｇＲナーゼＡ、　４ユニツトのＲナーゼＨ，５０μＭβＮＡＤ、　８ユニツトの大腸菌リガーゼ、０．３１２５ｍＭｄＡＴＰＳｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、　１２ユニツトのＴ４ポリメラーゼ中にＤＮＡを再分散し、次いで１／２０容量の０．５ＭＥＤＴＡを添加して３７℃で９０分間反応混合物を培養することにより二本鎖ｃＤＮＡを平滑末端とし、次いでフェノール：クロロホルムで抽出した。

発明者等は、Ｏ，ＱＩＭ　）リス−ＨＣｌ　（１）Ｈ７，５）、Ｏ，ＩＭ　ＮａＣ］、０．　ＯＯＩＭＥＤＴＡ中の０１５０セフアデツクス　カラムで水溶液相をクロマトグラフし、次いで二本鎖ｃＤＮＡを含む先行ピークを収集し、これをエタノール沈澱させた。収率：６０５ＭｇｃＤＮＡ。

発明者等は、標準方法を使用して、二本鎖ｃＤＮＡをリンカ−３５／３６に結合した。

５°ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣ３゜３°　ＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＣＣＧＧＣＧ５゜次いで発明者等は、５５００セフアクリルカラムで８００ｂＰ用のｃＤＮＡとより長い断片に大きさ分別し、それを匹１１培養 λｇｔｌＯに結合した。発明者等は、製造者の協定付随書に従ってギガバク（計画遺伝子）中に結合反応物の一定量を充填した。

発明者等は、充填ファージを使用して、大腸菌ＢＮＮ１０２細胞を感染させ、次いで増幅の為に細胞を塗布した。得られたライブラリーは、１．１２５ｘｌＯ” の独立組換え体を含んでいた。

ライブラリーのスクリーニング発明者等は、ヒト扁桃λｇｔｌｏ　ｃＤＮ＾ＤＮＡライブラリーング等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（プロシーディンブナチュールアカデミ−サイエンス）、第８２巻、第７７１１−７７５頁、（１９８５）コ、及びベントンとディビス［Ｓｃ　１ｅｎｃｅ、　（サイエンス）、第１９６巻、第１８０頁、（１９７７）］のプラーク　ハイブリッド形成スクリーニング技術を使用して、上記調製したＰＢＬ　ｃＮＮ＾ライブラリーをスクリーンした。

発明物等は、Ｌ培養液と０．２％マルトース中で、ＢＮＮ１０２細胞の一晩培養物をペレットとし、それを等容量のＳＭ緩衝液［５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４、及び０．Ｏ１％ゼラチン］中に再分散した。続いて、発明者等は、９ｍｌの細胞を、室温で１５分間１．５Ｘ１０”のファージ粒子で予備吸収し、これらを３０ＬＢ　ＭＧプレートに塗布した。

３７℃で８時間培養した後、発明者等は、プレートがラフィルターヲ引キ上ケ、これらを０．５Ｎ　ＮａＯＨ／１．５Ｍ　ＮａＣｌノプールに５分間置くことにより溶解し、次いでこれらを同じ緩衝液中に５分間浸漬した。発明者等は、これらを０．５ＭｌスーＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１．５Ｍ　ＮａＣ１中に、５分間づつ２回浸漬することによりフィルターを中和し、これらをＬＭ　ＮＨ，ＯＡｃ中で２分間洗浄し、次いでフィルターを乾燥し、次にこれらを８０”Ｃ，で２時間ベータした。

発明者等は、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％フィコ／Ｌ’　（ＭＹ４００．０００）、０．２％牛血清アルブミン、０．０５Ｍ）−！Ｊ　ス−）１ｃＩ（ｐＨ７，５）、１Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、１％ＳＤＳ、　１０％硫酸デキストラフ　（ＭＹ５００．０００）及び１００μｇ／＋ｌ　ｔＲＮＡ中で、オリゴヌクレオチドプローブＬＰ［に対してフィルターに予備ハイブリッド形成及びハイブリッド形成した。発明者等は、オートラジオグラフィーによりハイブリッド形成するλ−ｃＤＮＡ配列を検出した。

発明者等は、ＰＢＬライブラリーがら２６正フアージをかつ扁桃ライブラリーがら１２正フアージを始めに選択した。

次いで発明者等は、これらのクローンと、同じプローブを使用して低い密度でこれらを精製したプローブを再スクリーンした。

発明者等は、こりらクローンから単離したＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、次いでこれらをサザンブロート技術［Ｅ、　Ｍ。

サザン、ＪｌＭｏｌ、　Ｂ＋ｏ１．　（ジャーナルモレキコラバイオロジー）第９８巻、第５０３−１８頁（１９７５）コを使用してオリゴマープローブＬＦＩ及びＬＦ２に対してこれらにハイブリッド形成した。次いで発明者等は、更に扁桃ライブラリーの２つのクローン（λＨＴ１６とλ）ＩＴ１２）からのＤＮＡとＰＢＬライブラリーからの２つのクローン（λＰ２６とλＰ２４）からのＤＮＡをＤＮＡ配列決定分析により性質を調べた。

ｃＤＮ＾クローンの配列決定発明者等は、配列分析を促進する為に、クローンλＨＴ１６とλＰ２６からのＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡを、ｐＮＮＯｌ中にサブクローン化した。′λＨＴ１６は、２　ＥｃｏＲＩ断片を有しており、発明者等は、プラスミドｐＨＴ１６ＨとｐＨＴ１６Ｌに終わるｐＮＮＯｌ中に前記断片をサブクローン化した。λＰ２６の総ての挿入断片は、単−Ｎｏｔｌ断片上に含まれている。サブクローン化の為に、発明部位又はＳ＋ａ１部位を使用した。

発明者等は、制限消化により合成ポリリンカーＰＵＣ８を除去し、かつそれを新しい合成断片で置換することにより配列決定プラスミドｐＮＮＯ１を構成した。

ｐＵｃプラスミドに共通す２．５ｋｂ背骨は、複製開始点を付与し、がつアンピシリン抵抗性を与えるものであるが、変化なかった。ｐＮＮＯｌの新規な合成部分は第４図に示されている。

ＥｎｚｙｍｏユＪ■、（酵素学方法）１９８０］により発明者等のサブクローンのＤＮＡ配列を大部分決定した。しかし、幾つかの断片に対して、発明者等は、チャーチとギルバートの関連方法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（プロシーディングナチュラルアカデミ−サイエンス米国）第８１巻、第１９９１頁、（１９８４）］を使用した。ｐＮＮＯｌの構成は、Ｎｏｔｌ消化と４つの２０−ヌクレオチド長プローブ：　ＮＮ−Ａ、　ＮＮ−Ｂ、　ＮＮ −Ｃ，及びＮＮ−Ｄを使用する挿入した断片の末端の配列決定をチャーチーギルバート研究法により可能にする。第５図参照のこと。

２つの重要な配列決定の結果が、チャーチーギルバート方法により発明者等のサブクローンからえられた。一つの実験において、発明者等は、２２４ｂｐ　ＥｃｏＲＩ断片を結合するに関係無くλＨＴ１６からＰＶｕ１１消化ＤＮＡを証明した。このことは、このファージの２つの影響Ｒ１サブクローン（ｐＨＴ１６ＨとｐＨＴ１６Ｌ）の分析は、小さいＥｃｏＲＩ断片への５°又は２つのＥｃｏＲＩ断片の間の５”のいずれかの配列を見落としていた可能性を直接的に反論した。

発明者等はまた、このＥｃｏＲ１部位を無傷に有する凪Ｉサブクローン形成したｐＰ２６の分析によりこの結果を確認した。発明者等はまた、ｐＶｕ　Ｉ　ＩでｐＰ２６を消化し、かつハイブリッド形成プローブとしてＬＦＩＯ（第５図）を使用するチャーチーギルバート方法により断片の配列を決定した。このことは、挿入断片の５゛末端はλＨＴ１６の５′末端と全く同じであったことを証明した。

第３図は、ファージλＨＴ１６のｃＤＮＡ挿入断片のＤＮＡ配列を示している。

これはまた、ＬＦＡ−３に対してコード付けするＤＮＡ配列とこれから推定したアミノ酸配列を表している。

この後者のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓ例えばり、ＦＡ−３に対してコード付けするものは、発明者等が、ト末端領域とヒト赤血球から精製したＬＦＡ−３の４トリプシン断片に対して決定したアミノ酸配列に対して、フード付けするＤＮＡ配列を含んだ。

Ｃ）ｔｏ細胞中にＬＦＡ−３ＨＴ１６　ｃＤＮＡの発現下記ｐ２４ＨＴ１６ＬＦＡ３＃８の９６０ｂｐ　Ｎｃｏｌ−Ｍａｅｌ断片を、ＢＧ８発現ベクターを与える為に、ＢＧ３１２発現ベクターの５ＩＩｌａ　１部位中に挿入する。ベクターＢＧ８は、イン　ビトロインターナショナルカルチャーコレクション、６１１Ｐ、ハモラドス　フェリーＲｄ、、リンチカム、マリ−ランド、２１０９０５月２４日、１９８８年で預けられており、かつ受け入れ番号ＩＶＩ−１０１７０で譲渡されている。ＢＧ３１２［ケイト等、釦旦（細胞）、第４５巻、第６８５頁、（１９８６）］において、挿入断片ＤＮＡ配列の発現は、アデノウィルス２後期プロモータの制御下にある。Ｒ２４ＨＴ１６ＬＦＡ３＃８は、ｐＨＴ１６の８００ｂｐＥｃｏＲＩ断片をプラスミド部分を含むＲ２４の大型Ｅｃｏ旧断片と結合することにより構成された。Ｒ２４のＥｃｏＲＩ断片のＤＮＡ配列は、第３図の塩基対１−２２３のＤＮＡ配列に一致する。安定な）ＩＴ１６−ＣＨＯ細胞系を確立する為に、発明者等は、ｌＸ１０’ＣＨＯ（ＤＩ’１ＰＲ−）細胞［カジンとウルバン、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ　ｄ、　Ｓｃｉ、（プロシーディングナチュラルアカデミイーサイエンス）、第７７巻、第４２１６頁（１９８０）］を、１８０λｇ（７）Ｘｍｎｌ線状化ＢＧＩＩＩ　ＤＮＡ、　２０λきの５ｊｕｌ線状化ｐＡｄＤ２６　ＤＮＡ［カウフマンとシャープ、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、（モレキコラーセルバイオロジー）、東２巻、第１３０４頁、（１９ｇ２）］、及び９６０μＦＤに設定したキャパシタンスで０、２９ＵＶにてビオラド（リッチモラド、カルホルニア）遺伝子パルサーを使用して、エレクトロポレーションにょる２００λｇの音波処理サケ精子ＤＮＡキャリアーと共に共移入した。

次に発明者等は、エレクトロポレーションしたＣＨＯ細胞ヲ、３日間、非選択性アルファ÷（改良イーグル培地（ＭＥＭ）中に塗布し、次に１００＋ａｍプレート当たりｌＸｌ０’細胞の細胞密度にて４日間アルファーＭＥＭ培地に変えた。

次に細胞は、アルファー−１ｉｌｌｌＪプラス２００ｎＭ、　４００ｎＭ又は６００ｎＭメトトレキセートのいずれか中にて成長させた。フロニーは、２００ｎＭメトトレキセート中で最も良く成長し、このコロニーから、発明者等は、個々のコロニーを単離し、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）　（ベクトンディキンソン、マウンティンビュー、カルホルニア）で間接的免疫蛍光の強度を測定することによりＬＦＡ−３の発現ニ対して、かつ下記のようにロゼティング（細胞粘着）に対して検定する為に、１００＋ａｍプレート当たりｌＸｌ０＠細胞までこれらを成長させた。

ＦＡＣＳにより分析する為に、各ＨＴ１６−ＣＨＯメトトレキセート　クローン当たりｌＸｌ０’細胞と制御ＣＩＯ細胞は、４℃で１５分間、ハングのＢ５５（スペルアウト）緩衝液、０．５Ｍ　ＥＤＴＡと共に培養することにより、組織培養皿から除去された。次に分離した細胞は、ペレットとされ、５０μＱ（７）ＰＢＮ緩衝液（ＩＸＰＢＳ、　０．５％ＢＳＡ、　０．１％ナトリウムアジド）中に再分散し、４５分間氷上で１００μ（２モノクロナ一ル抗体ＴＳ２／９（１，２＋ａｇ／ｍ１）（チム　スブリンゲルの贈り物）で培養した。次に発明者等は、１ｍｌのＰＢＮ緩衝液で２回細胞を洗浄し、遠心分離器でペレットとした。この細胞ベレットを、ＰＢＮ中の１＝５０希釈ＦＣＩ　［蛍光共役親和精製Ｆ（ａｂ’）２断片ヒツジアンチマウスＩｇＧ（カベル、バイオケミカル、ペンシルバニア）］の１００μに中に再分散し、次いで３０分間氷上で培養した。細胞を遠心分離器でベレットとし、過剰のＦＤＩを細胞ベレットを、１ｍｌのＰＢＮ　（スペルアウト）緩衝液中に２回再分散することにより除去した。次いで発明者等は、細胞を１ｘＰＢｓｌｌｔＧｏμｇ中に再分散し、次いでＦＡＣＳにより蛍光強度を決定した。５つのクローンが、対照ＣＩＯ細胞とＬＦＡ−３発現に関して均一細胞集団よりもより高い蛍光を示した。

次ぎに発明者等は、ＣＨＯ細胞中に発現した組換えＬＦＡ−３が、ロゼツト形成分析によりＣＤ２発現細胞に粘着出来るかどうか試験した。発明者等は、対照ＣＩ（０細胞と、ウェル当たり３Ｘ１０５細胞の細胞密度で６ウ工ル組織培養プレートの９．６ｃｍ’ウェル中でＬＦＡ−３（ＨＴ１６−ＣＨＯ＃３０）を発現するＣＨＯ細胞とを増殖させた。プレートを、４℃でツルバール遠心分離器中で２分間４００ｒｐｍで回転しただ。細胞を２時間４℃で培養した後、細胞をＲＰＭ１１０６０メディウムで洗浄して過剰のジュルカット細胞を除去した。ジュルカット細胞は、顕微鏡下に決定した時に、ＬＦＡ−３発現のＨＴ１６−ＣＨＯＪ１３０細胞とロゼツト形成した。

発明者等は、ＨＴＩ６−ＣＨＯ＃３０中のＬＦＡ〜３の表面発現のレベルをＪＹＢリンパ芽球的の細胞（チムスブリンゲルの贈り物）の発現レベルと、２．５Ｘ１０’ＪＹ細胞、ＣＨＯ細胞及びＨＴ１６−ＣＨＯ１ｔ３０細胞を使用して、前記したようにＦＡＣＳ分析を使用して両方の細胞系の相対的蛍光強度を比較することにより比較した。ＨＴ１６−ＣＨＯ細胞は、ＪＹ細胞より６倍高い蛍光強度を示した。

Ｒ１，１細胞中にＬＦＡ−３ＨＴ１６　ｅＤＮＡの発現２、６ｘｌＯ’Ｒ１，１細胞を、前記したような９０μｇＮｒｕＩ線状化した発現ベクターＢＧ８．１０ μｇ　Ｎｒｕｌ線状化したプラスミドｐＴＣＦ　ＤＮＡ［Ｆ、グロスベルト等、Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５−（核酸レサーチ）、第１０巻、第６７１５頁（１９８２）コ、及び前記したようにエレクトロボレーシラン（２８０ポルト、９６０μＦＤ）により３００μｇ音波処理したサケ精子ＤＮＡと共に共移入した。ＲＰＭ１１０６０プラス１ｍｇ−ｎ＋１　Ｇ４１８中の移入細胞を選択した後に、発明者等は、２００μＱ　ＲＰＭＩ　１０６０メデイウムプラスＩＨ／ｍｌ　Ｇ４１ｇを含む、９６ウエルマイクロタイタープレート中、ウェル当たり１０３細胞まで希釈することによりクローンを単離した。８つの耐性クローンを繁殖させ、前記したようにＦＡＣ３分析によりＬＦＡ−３表面発現に対して検定ｌまた。発明者等は、総ての８つのＨＴ１６−Ｒ１，１クローンが、Ｒ１，１対照より約２５倍のレベルでＬＦＡ−３を発現したが、しかし総てはＬＦＡ−３発現に関して均一細胞集団を示したことを見いだした。

更に発明者等は、ＦＡＣＳ上の高い発現用の２つのクローンーー＃１３と１１１５−−を選別した。各々のクローンのｌＸｌ０“ＨＴ１６−Ｒ１，Ｉ細胞を、ＰＢＮ緩衝液（ＩＸＰＢｓ％０．５％ＢＳＡ、　０．１％ナトリウムアジド）中、氷上で４５分間、１００μＱＴＳ２／９　Ｍａｂで培養した。細胞をベレットとした後に、発明者等は、１ｍｌ　ＰＢＮ緩衝液中に再分散することにより、ペレットを２回洗浄し、次いテ細胞ペレットを１００μｇの１：５０希釈ＦＣＩ中に再分散した。氷上に３０分間装いた後に、細胞を洗浄し、次いで８００μ（ＩＸＰＢＳ中に再分散した。１］Ｔ１６−Ｒ１，１＃１３と１１１５の選別した均− 集団中でＬＦＡ−３の表面発現は、ＪＹ細胞のものの１０％である。

次ぎに発明者等は、Ｒ１，１細胞中に発現したようなｔｌＴ１６−ｃＤＮＡからのＬＰＡ−３が、ＣＤ２　ｃＤＮＡ（Ｌ１１４）（キャサリンヘションの贈り物）を発現するＬ−細胞と、かつＨＴ１６−ＣＩＯに対して前記したような同じ方法を使用するジュルカット細胞（チムスブリンゲルの贈り物）とロゼツト形成することにより他の細胞へ粘着するかどうか試験した。発明者等は、ロゼツト形成を観察した。このロゼツト形成は、ＬＦＡ−３（ＴＳ２／９）に対するＭａｂ、又はＣＤ２　（ＴＳ２／１８）　（チムスプリンゲルの贈り物）に対するＭａｂで防止され得た。このことは、ＬＦＡ−３が、ジコルカット細胞上の天然に発現されたＣＤ２レセプターと、又はマウスし＝細胞上に発現されたＣＤ２と相互作用可能とする配Ｅ−中でＲ１，１細胞の細胞表面上に発現されることを示した。

ＨＴＩ６−Ｒ１，１細胞又は未移入Ｒ１，１細胞は、未移入マウスＬ−細胞とロゼツト形成せず、これらの細胞の相互作用の特異性を示すものである。

Ｌ−細胞中にＬＦＡ−３ＨＴ１６　ｅＤＮＡの発現発明者等は、ｘｘｘｏ’Ｌ（ｔｋ−）細胞［Ｃ，Ｐ、　ｆ　ルホ／１／　ス）、Ｊ、　Ｉｎ＋＋＋＋ｕｎ、　（ジャーナルイムノロジー）、第１３１巻、第２０３２頁（１９８３）］を、前記９０μきＸｍｎ　Ｉ線状化ＢＧ８プラスミドＤＮＡ、　１０μｇＳｃａｌ線状化ＰＯＰＦプラスミドＤＮＡ（グロスベルト等、上記文献）（移入細胞を選別するのに使用出来るチミジンキナーゼ担持プラスミド）、及び前記エレクトロポレーシヨンにより音波処理Ｉ、たサケ精子ＤＮＡ３００μｇと共に共移入した。細胞を洗浄し、次いで１００■ベトリー皿に移した後に、発明者等は、これらを４８−７２時間、非選択的メディウム（ＤＭＥ）Ｉ）中で増殖させた。次いで移入された細胞を、１００＋ｓａ皿当たりｌＸｌ０’細胞の細胞密度で、ＤＭＥＭ＋ヒボキサンチンアミ／プテリンチミジン（ＨＡＴ）中で選択した。発明者等は、１４日後に１３クロ一ン発現するチミジンキナーゼを拾い上げ、これらを１００＋ｍｍプレート当たりｌＸｌ０”まで引き伸ばし、前記したようにＦＡＣＳ分析によりＬＦＡ−３発現に対して検定した。１１個のＨＴ１６−Ｌクローンが、対照ＣＨＯ細胞より１０〜２０倍高い表面蛍光を示した。

発明者等はまた、蛍光顕微鏡下に直接に可視化された免疫蛍光により、ＬＦＡ− ３表面発現に対して１１７１６−Ｌクローンを検定した。発明者等は、４つのクローンー−ＨＴＬ６Ｌ　１１？３．１゜７、及び２７−−が高度に蛍光性であり、ＬＦＡ−３発現の高度なレベルを示すことを見いだした。次ぎに発明者等は、前記のようにＦＡＣＳ上の高い発現細胞に対する４つのクローン総てを分離したが、その理由は、これらクローンは、ＬＦＡ−３発現の均一細胞集団を示したからである。ＨＡＴ−ＤＭＥＭメディウム中に選択された６つのクローンー−）ＩＴ１６−Ｌ　＃ＩＡ、　ＩＢ、　ＩＣ，？、　２７．及び１０７−−は、ＦＡＣ３分析によりＬＦＡ−３発現に対して検定された。

発明者等は、対照ＣＨＯ細胞の蛍光強度より３５倍高かったクローンＨＴ１６− Ｌ−ＩＣ以外は、２０〜３０倍の蛍光強度を示す総てのクローンを見いだした。

発明者等はまた、ＨＴ１６　ｃＤＮＡからのＬＦＡ−３が、Ｌ−細胞中に発現された時に、Ｒ１，１細胞中に発現されたＬＦＡ−３に対して上記同じロゼツト形成の検定を使用して、他の細胞に粘着するかどうか試験した。発明者等はロゼツト形成を観察した。

大腸菌中にＬＦＡ−３の発現大腸菌中にＬＦＡ−３ｃＤＮＡを発現する為に、発現ベクターｐＬＦＡ３ｔｒｃｌを構成した。このベクター（ｐＫＫ２３３−２の誘導体）は、成熟ＬＦＡ−３タンパク質を発現する。シグナル配列に対してコード付けするＨＴ１６　ｃＤＮＡのＤＮＡ配列は削除された。ｐＬＦＡ３ｔｒｃｌを構成する為に、プラスミドｐＫＫ２３３−２　［Ｅ、アマンとＪ。

プロフィウス、江胚、（遺伝子）、第４０巻、第１８３頁、（１９８５）］を制限酵素Ｎｃｏｌと旧ｎｄｌｌｌで消化し、かツｐＬＦＡ３ＨＴ１６の単離７００塩基対Ａｖａ２／Ｂｉｎｄ３の断片と２本鎖リンカ−ＬＰ０１−２２へ結合した。このリンカ−は、ｌｌＴ１６　ｃＤＮＡの塩基対１０１〜１７５（Ａｖａ２部位へ）の間の配列を置換する（第１表）。

第１表５’　ＣＡＴＧＴＴＴＴＣＣＣＡＡＣＡＡＡＴＡＴＡＴＧＧＴＧＴＴＧＴＧＴＡＴＧＧＧＡＡＴＧＴＡＡＣＴＴＴＣＣＡＴＧＴ　ＡＣＣＡＡＧＣＡＡＴＧＴＧＣＣＴＴＴＡＡＡＡＧＡＧ　３’　７９　ｍｅｒＬＦ２２：５“ＧＡＣＣＴＣＴＴＴＴＡＡＡＧＧＣＡＣＡＴＴＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＴＧＧＡＡＡＧＴＴ＾ＣＡＴＴＣＣＣＡＴＡＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡＡ　３’　７８　ｍｅｒ発明者等は、得られた組換え発現ベクターでＪＡ２２１細胞を形質転換した。ｐＬＦＡ３ｔｒｃｌで形質転換した大腸菌を０Ｄｓｓｏ　１．０へ成長させ、続いて２時間１ｍＭ　ＩＰＴＧで誘導し、かつ遠心分離器により細胞を収集した。細胞をＬＢ中に再分散し、当量の０．２０Ｄｓｓ。を除去した。次いで発明者等は、遠心分離器によりペレットとし、この細胞ペレットを５ＤＳ−ゲルを有する緩衝液５０μＱ中に再分散し、次いで３分間沸騰した。２５μｇの試料を、電気泳動によりタンパク質を分離する為に、５ＤＳ−変性ポリアクリルアミドゲルに装填した。ＬＦＡ−３を検出する為に、タンパク質をニトロセルロース膜へ電気転移させ、続いて抗体のｈ−ＬＦＡ−３，Ｋ６４（チムスブリンゲルの贈り物）に対する１：１０００希釈で膜を培養した。発明者等は、抗−ＬＦＡ−３（Ｋ６４）抗体は２５　ｋｄタンパク質を検出し、形質転換細胞がＬＦＡ−３を発現したことを示したことを観察した。

次ぎに細胞は、３７°Ｃで０Ｄｓｓ。０．１まで、ＩＱ　ＬＢ　４５０μｇ／ｍｌアンピシリン中で増殖させた。ＬＦＡ−３の発現は、２時間２ｍＭ　ＩＰＴＧで誘導された。細胞は、３０分間４０００ｒｐｍ７４℃でペレットとされた。発明者等は、このペレットを、１０ｍ１　）リス緩衝液当たりＩｇｒＱ細胞ベレットで２５ｍＭ）リス（ｐＨ７，０）中に再分散し、細胞圧力１２．０００−１４．０００ｐｓｉでフランス　プレッシャーセルプレス中に溶解させた。次ぎに膜分画を、４℃で３０分間１０、　ＯＯＯｒｐｍにて５Ｓ３４ツルバール中で遠心分離により可溶性タンパク質から分離した。膜ペレットを、２５Ｉｆ１Ｍトリスｐｈ７．０の１ｍｌ、８ｇアリコートの上清中に再分散させ、次ぎに膜ベレットを、１５％５ＤＳ−変性ＰＡＧ上で電気泳動させた。膜ペレットをＳＤＳ緩衝液に溶解し、タンパク質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、汚染クーマシー及びサブシークエンドタンパク質の配列決定用のゲルから切除されたＬＦＡ−３とにより分離された。発明者等のアミノ酸配列決定は、ＭＦＳＱＱＩＹＧＶＶＹＧ）ＩＶＴ−ＬＦＡ−３とＦＳＱＱＩＹＧＶＶＹＧＮＶＴ−ＬＦＡ−３としてＮ−末端配列を確認し、これはヒト赤血球から精製したヒ）　ＬＦＡ−３に対して決定したＮ−末端配列に一致した［ハルナー等、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　（シャーナルエクスビャリアンスメディスン）、第１６６巻第９２３頁（１９８７）］。従って、この構成により製造した生成物は、メチオニンを有する又は有しないＮ−末端を有する。

発明者等はまた、疎水性トランスメンプラン領域のタンパク質をＤＮＡ配列から削除する為に、ＬＦＡ−３を暗号化するＤＮＡ配列を修飾して、可溶性形態のＬＦＡ−３の高いレベルの発現を得た。発明者等は、第３図に表したようにトランスメンブラン領域を含むＬＦＡ−３に対してコード付けするｐＨＴ１６からの発明者等のＬＦＡ−３ｃＤＮＡを使用した。

ＬＦＡ−３Ｍ１７欠失５０μｇのプラスミドｐＨＴ１６ＬＦＡ３　ＤＮＡを、３７℃で１時間制限酵素５ｃａｌの１００ユニツトで消化した。発明者等は、１％アガロースゲル上電気泳動により未カットプラスミドから線状化プラスミドを分離し、ゲルから切除し、電気溶出した。他のアリコートの５０μｇのｐ１１Ｔ１６１．ＦＡ３プラスミドＤＮＡを、１００ユニツ）ＥｃｏＲｌと１００ユニツト旧ｎｄｌｌｌで３７℃ にて１時間消化して、このプラスミド中の大部分のＬＦＡ−３ｃＤＮＡ配列を切除した。次いでベクターを、１％アガロースゲル上で電気泳動によりＥｃｏＲｉ／）１ｄｌｌ＋断片から分離し、切除し、次いで電気溶出した。

発明者等は、欠失を導入する為に、　オリゴヌクレオチドＬＦ１７を使用した。

これは、第３図に表したＨＴ１６ｃＤＮＡ配列の塩基対６３２で開始する２１ヌクレオチドと塩基対７６４位置で開始する２２ヌクレオチドに相当する４３ｍｅｒ（第１Ｉ表に表す）である。

３°ＴＡＧＧＧＴＴＣＧＴＣＧＣＣＡＧＴＡＡＧＴＴＡＣＴＴＡＣＣＡＴＡＡＧＡＣＴＴＴＡＣＡ　５゜２　ｍｅｒＬＰ０１：３°ＴＡＧＧＧＴＴＣＧＴＣＧＣＣＡＧＴＡＡＧＴＴＴＡＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＧＴＣＴＴＣＴＡＣ５”５°ＴＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＴＡＣＣＡＡＴＣＡＴＣＴＧＴＧＴＣＴＴＧＡＡＴＧＡＣＣＧＣＴ　３゜１　ｍｅｒ（第１１表続き）ＬＰ２ｇ＋５’　ＣＡＧＧＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧＴＣＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡＡＣ３’　３Ｃ１ａｅｒ■ このオリゴヌクレオチドが、一本鎖ＨＴ１６ｃＤＮＡに対してハイブリッド形成される時に、これはＨＴ１６ｃＤＮＡの１１１塩基ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌ！Ｉ断片の２０ｐモルは、燐酸化ＬＦ１７の２０ｐモルと混合され、次いで１００ｍＭ　ＮａＣ１，６ＩＩＩＭ）リス（ｐＨ７，６）及び８ａ＋Ｍ　ＭｇＣ１を中で５分間９０°Ｃにて変性され、３７℃で１時間、４℃で１時間、次いで氷上で１０分間培養することにより再変性された。反応混合物の半分に、発明者等は、０．５１１ＱＴ４リガーゼ、１ｍＭ　ＡＴＰ。

１μＱクレノウ及び５ｍＭ　ＮＴＰを添加し、次いで混合物を一晩１５°Ｃで培養した。反応混合物の他の半分を、ＭＣ１０６１適格細胞中に転移させた。欠失ＬＦＡ−３ｃＤＮＡを含むコロニーを、次のように、ＬＰ０１にハイブリッド形成することにより同定した。形質転移したＭＣ１０６１コロニーを、ニトロセルロースフィルターに移し、溶解し次いでＤＮＡを０．５Ｎ　ＮａＯＨで処理することにより変性した。ニトロセルロースフィルターは、−晩６５°Ｃで、１ｘｌｏ’ｃｐａ＋／ｍｌ　”Ｐ−キナーゼオリゴヌクレオチドＬＦ１７を含むＰＳＢ中でハイブリッド形成させた。フィルターをＯ，ｌＸ５ＳＣ（０，０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム）中で洗浄し、Ｘ−線フィルムに露光させた。正コロニーを、拾い上げ次いで３７℃で増殖し、次いで溶解した。次いで発明者等は、ＤＮＡを調製した［マニアティス等、“分子クローン化：実験室マニュアル”コールドスプリングハーハ−（１９８２）参照］。

正確な欠失を証明する為に、ＤＮＡをＥｃｏＲＩと）ｌｉｎｄｌｌ＋で消化した。

４つのｐＬＦＡ３Ｍ１７コロニーが、正確な制限パターンを有した。

一つのクローンの正確なりＮＡ配列を、マクスマとギルバートの方法（前記文献）を使用してＤＮＡ配列決定により確認した。

ＬＦＡ−３Ｍ１６プラスミドｐＬＦＡ３Ｍｌ　６−２−４Ｈを、欠失を導入する為にオリゴヌクレオチドＬＦ１６（第１Ｉ表）を使用した以外は、ＬＦＡ−３Ｍ１７に対して本質的に記載したようにして構成した。ＬＰ０１は、２１ヌクレオチドが塩基対６３２〜６５２（第３図）に対して相同であり、かつ２１ヌクレオチドがＬＰ０１　ｃＤＮＡの塩基対７１６〜７３６（第３図）に対して相同であるところの４２ｍａｒ（マー）である。オリゴヌクレオチドＬＦ１６による変位誘発は、ＬＦＡ− ３の疎水性電位膜貫通領域に対してフード句けする６３塩基対配列を除去して、細胞質の領域を無傷のままにされた。発明者等は、プラスミドｐＬＦＡ３Ｍ１６を分離し、かつ上記のようにその正確な配列を証明した。

ＬＦＡ−３Ｍ２３プラスミドｐＬＦＡ３）Ａ２３をｐｌ、ＦＡ３Ｍ１７に対して記載した方法により構築した。変位誘発に対して使用したオリゴヌクレオチドは、ＬＰ０１（第１Ｉ表）であって、その４１マーは、２１ヌクレオチドが塩基対６４１〜６６１（第３図）に対して相同であり、かっ２０ヌクレオチドがＨＴ１６　ｃＤＮＡの塩基対７６７〜７８６（第３図）に対して相同であるところの４１７−である。ＬＰ２３による変位誘発は、電位膜Ｎ通領域及びＨＴ１６−ＬＦＡ−３の細胞質領域を除去した。

次ぎに発明者等は、総ての除去したＬＦＡ−３ｃＤＮＡｓを、選択標識を更に担持する発現ベクター中に挿入した。発明者等は、組込み中にＬＦＡ−３遺伝子に近接する同じプラスミド上に、選択標識を有することは、これら２つの遺伝子の共組込みと、従って、これらの共選択を確実にするであることを信じる。発明者等は、発現ベクターｐＪＯＤ−ｓを使用した。ベクターｐＪＯＤ−ｇは、１９８８年５月２６日に、メリーランド州、リンチカムのインビトロインターナショナルインク、カルチャーフレクションに預けられ、受は入れ番号１ｖ１−１０１７１カ譲渡されている。ＬＦＡ−３Ｍ１７、Ａ１６及びＡ２３の構築の為に、ｐＪＯＤ−ｓベクターを制限酵素５ａｉｌにより線状化し、クレノーにより平滑−末端とし、クレノー−プラント末端Ｎｏｔ　Ｉ断片のｐＬＦＡ３Ｍ１７゜ｐＬＦＡ３Ｍ１６又はｐＬＦＡ３Ｍ２３により連結した。次ぎに夫々の連結反応混合物を、ＭＣ１０６Ｉ中に形質転換し、夫々のＤＮＡを含むコロニーを、オリゴヌクレオチドプローブ（第１１表参照）、ＨＴ１６　ｅＤＮＡの塩基対２０〜４９に相同の３０マーへＬＰ０１　ＰＳＢ中にて６５℃でハイブリッド形成することにより選択し、６５℃で０、５ＸＳＳＣ（０，７５Ｍ　ＮａＣ１，０１０７５Ｍ　ＮａＣ１）にて洗浄した。正コロニーを拾い上げ、ＬＢ　＋　ａｍｐ　５０μｇ／＋ｏｌ中で一晩増殖させ、かくしてＤＮＡを調製した。挿入断片の正確な大きさは、制限酵素マツピングにより証明された。ｐＬＦＡ３Ｍ１７の４つのクローン、ｐＬＦＡ３Ｍ１６の３つのクローン及びｐＬＦＡ３Ｍ２３の一つのクローンは、正確な制限酵素パターンを示した。ＤＮＡを、ｐＬＦＡ３Ｍ１７、ｐＬＦＡ３Ｍ１６、及びｐＬＦＡ３Ｍ２３のクローンから調製し、かつ正確なりＮＡ配列を、マツフスマとギルバートの方法（上記文献）を使用してＤＮＡ配列決定により確認した。

安定なＣＩＯ細胞細胞値立する為に、ＰＶｕ　Ｉで線状化されたｐＬＦＡ３Ｍ１７の１０μｇを、燐酸カルシウム法と前記エレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞中に移入した。同じ方法を、ｐＬＦＡ３ＭＩ６とｐＬＦＡ３Ｍ２３で安定ＣＨＯ細胞系を確立する為に使用した。

ｐＬＦＡ３Ｍ１７で移入されたＣＩＯ細胞は、３５Ｓメチオニンで代謝標識化することにより可溶性ＬＦＡ−３の分泌に対して検定された。６ウエルブｌノートのウェル当たり５Ｘ１０’細胞が、３５Ｓメチオニンで１８時間標識化され、かつ３ＳＳ−ＬＦＡ−３をＭａｂ　ＴＳ２／９で沈澱させた。発明者等は、Ｍ１７／Ｃｌｌ０がＬＦＡ−３を分泌したことを観察した。このことは、より高い発現を得る為に、Ｍ１７／Ｃ１（Ｏはメトトレキセートの高い濃度中で増幅されて、ＬＦＡ−３遺伝子を増幅するのが良いことが理解されるべきである。

上記の発明を更に可能にする為に、発明者等は、この発明のＬＦＡ−３ＤＮＡ配列を担持する次のファージを、メリーランド州、リンチカムのイン　ビトロ　インターナショナルイミク、カルチャー　コリクションに１９８７年５月２８日に預けた： λ　）ＩＴ１６　［λ　ｇｔｌＯ／１．ＦＡ−３コこのファージは、受は入れ番号ＩＶＩ　１０１３３が付与された。

以上、発明者等は、本発明の多くの実施態様を提示してきたが、発明者等の基本的構成は、変更することにより本発明の方法と組成物を利用する他の実施態様を付与出来ることは明らかである。従って、本発明の範囲は、実施例により提示された特定の実施態様によるよりも、添付される請求の範囲により規定されるべきことは理解されるであろう。

アミノ酸配列に相当する：＝＝：ｐ　ｌｙｓ　ｌｙｓ　ｇＬｒｓ　’、ｙｓ　ａｓｐ　１ｙｓ５１　τＣＧ　λλＡ　λλλ　Ｃ入Ｇ　λ入ＡＣ入Ｃλλ入ＧＧＡＣτ　Ｇプローブ配列：入ＣＣ’：τで　ττ″：　Ｃ″：：　τ：τ　Ｃ″：Ｇ　’：フＣＣＴＣ入アミノ酸配列に相当する：ｇ！ｉ　ｇｉｒ＋　ｉｉｅ　：ｙ＝　ｇｌｙ　ｖａｉ　ｖａ１５’　ＣλＧ　Ｃ入Ｇ　λτＣτ入ＣＧＣＮ　ＧτＮ　ＣτＮ−７５：　コ’Ｇ″：；　Ｇτ：　 τＡＧ　λ″：：　Ｃ：：　Ｃ，駅　ＣＡＮＯＴ　Ｔｏ　ＢＥ　ＴＡＫＥＮ　工ＮＴＯＣＯＮＳよりＥＲＡ’ｒＩＯＮ　ＦＯＲＴＨＥＯＦ　ＴＨＥ　ＡＤＭＩＮＩＳＴＲＡＴＩＶＥ工ＱＳＴＲＵＣＴ工ＯＮＳ　）国際調査報告ＰＣＴ／ＵＳ８８１０ｉ９２４

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）ファージλＨＴ１６中に担持されるＤＮＡ挿入断片：（ｂ）前記ＤＮＡ挿入断片に対してＴｍ以下の約２０〜２７℃に相当する条件下にハイブリッド形成し、かつＣＤ２、Ｔ−リンパ球の表面上のレセプターに結合するポリペプチドに対する発現上にコード付けするＤＮＡ配列；及び（ｃ）前記ＤＮＡ配列又は挿入断片のどれかにより発現に対して発現上にコード付けされたポリペプチドに対する発現上にコード付けするＤＮＡ配列から成る群から選択されたＤＮＡ配列。
２．前記ＤＮＡ配列（ｂ）がＴ−リンパ球の表面のＣＤ２に結合し、かつＴ−リンパ球と標的細胞の間の粘着を防止するポリペプチドに対する発現上にコード付けする請求項１記載のＤＮＡ配列。
３．前記ポリペプチドが可溶性である請求項２記載のＤＮＡ配列。
４．前記ＤＮＡ配列が、第３図の式Ｎ１−１０４７のＤＮＡ配列、第３図の式Ｎ１７−７６６のＤＮＡ配列、第３図の式Ｎ１０１−７６６のＤＮＡ配列、第３図の式Ｎ１０１−６１１−Ｎ７１６−７６６のＤＮＡ配列、第３図の式ＡＴＧ−Ｎ１０１−７６６のＤＮＡ配列、第３図の式ＡＴＧ−Ｎ１０１−６６１−Ｎ７１６ −７６６のＤＮＡ配列、第３図の式Ｎ１−６５２−Ｎ７１６−１０４７のＤＮＡ配列、及び第３図の式Ｎ１−８５２−Ｎ７８４−１０４７のＤＮＡ配列、並びに前記ＤＮＡ配列のどれかにに対する発現上にコード付けするＤＮＡ配列から成る群から選択される請求項１記載のＤＮＡ配列。
５．前記ＤＮＡ配列が、第３図の式Ｎ１７−７６６のＤＮＡ配列、第３図の式ＡＴＧ−Ｎ１７−７６６のＤＮＡ配列及び前記ＤＮＡ配列のどれかに対する発現上にコード付けするＤＮＡ配列から成る群から選択される請求項４記載のＤＮＡ配列。
６．請求項１〜５のＤＮＡ配列から成る群から選択されるＤＮＡ配列を含む組換ＤＮＡ分子であり、前記ＤＮＡ配列は前記組換ＤＮＡ分子中の発現制御配列に作用的に結合されている組換ＤＮＡ分子。
７．前記発現制御配列が、ＳＶ４０又はアデノウイルスの初期又は後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、ファージλの主オペレーターとプロモーター領域、ｆｄ被覆タンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他のグルコース分解酵素に対するプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター及びイーストα−交配因子のプロモーターから成る群から選択される請求項６記載の組換ＤＮＡ分子。
８．分子が、ｐＬＦＡ３ｔｒｃｌ、ＢＧ８、ｐＬＦＡ３Ｍ１６、ｐＬＦＡ３Ｍ１７及びｐＬＦＡ３Ｍ２３から成る群から選択される請求項６記載の組換ＤＮＡ分子。
９．請求項６、７又は８の組換ＤＮＡ分子から成る群から選択される組換ＤＮＡ分子により形質転換された単細胞宿主。
１０．前記宿主が、大腸菌株、シュードモナス株、バシラス株、ストレプトミセス株、真菌、動物細胞、植物細胞、及び組織培養のヒト細胞から成る群から選択される請求項９記載の宿主。
１１．動物細胞が、ＣＨＯ、Ｒ１．１及びＬ−Ｍ（ｔＫ−）から成る群から選択される請求項１０記載の単細胞宿主。
１２．請求項１〜５のＤＮＡ配列から成る群から選択されたＤＮＡ配列により発現上にコード付けされたポリペプチドであり、前記ポリペプチドはヒト起源の他のタンパク質が本質的に無いポリペプチド。
１３．前記ポリペプチドが、第３図の式ＡＡ−２２−ＡＡ２２２のポリペプチド、第３図の式ＡＡ１−２２２のポリペプチド、第３図の式Ｍｅｔ−ＡＡ１−２２２のポリペプチド、第３図の式ＡＡ−２８−１８４−ＡＡ２０６−２２２のポリペプチド、第３図の式ＡＡ１−１８４−ＡＡ２０６−２２２のポリペプチド、第３図の式ＡＡ−２８−１８４のポリペプチド、第３図の式ＡＡ１−１８４のポリペプチド、第３図の式ＡＡ−２８−１８７のポリペプチド、及び第３図の式ＡＡ１−１８７のポリペプチドから成る群から選択される請求項１２記載のポリペプチド。
１４．請求項９記載の単細胞宿主を培養する段階を含むポリペプチドの製造方法。
１５．形質転換した宿主が、ＣＨＯ（ＢＧ８）、Ｒ１．１（ＢＧ８）、Ｌ−Ｍ（ｔＫ−）（ＢＧ８）、大腸菌ＪＡ２２１（ｐＬＦＡ３ｔｒｃｌ）、ＣＨＯ（ｐＬＦＡ３Ｍ１６）、ＣＨＯ（ｐＬＦＡ３Ｍ１７）及びＣＨＯ（ｐＬＦＡ３Ｍ２３）から成る群から選択される請求項１４記載の方法。
１６．請求項１２又は１３のポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチドの免疫抑制又は促進に有効量と薬学的に受け入れ可能な担体とを含む医薬品組成物。
１７．請求項１６の組成物から成る群から選択された組成物により薬学的に受け入れ可能な方法で患者を治療する段階を含む患者を治療する方法。
１８．Ｔ−細胞サブセット、ＣＤ２＋細胞を検出し、又は請求項１２又は１３のポリペプチド又はこれらポリペプチドに対する抗体から成る群から選択されたポリペプチドの診断的に有効量を含む過剰な又は激減されたＴ−細胞により特徴ずけられる疾患の過程をモニターする診断組成物。
１９．Ｔ−細胞サブセット、ＣＤ２＋細胞を検出する、又は請求項１８の組成物から成る群から選択された組成物を診断薬として使用する段階を含む過剰な又は激減されたＴ−細胞により特徴ずけられる疾患の過程をモニターする方法。
２０．Ｔ−細胞サブセット、ＣＤ２＋細胞を検出する為の、又は請求項１８の組成物から成る群から選択された組成物を含む過剰な又は激減されたＴ−細胞により特徴ずけられる疾患の過程をモニターする為の手段。