JPH02501572A

JPH02501572A - レクチンおよびその抽出方法

Info

Publication number: JPH02501572A
Application number: JP63500426A
Authority: JP
Inventors: ブラウン，ロバート・ジヨージ; ギル，シーカンデル・シング
Original assignee: メデイカーブ・アクチエボラーグ
Priority date: 1986-12-11
Filing date: 1987-12-03
Publication date: 1990-05-31
Also published as: AU603411B2; WO1988004303A1; FI892848L; DK446088D0; FI892848A0; EP0344159A1; DK446088A; AU1044788A; FI892848A7

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】レクチンおよびその抽出方法本発明はペクチニダエ（Ｐｅｃｔｉｎｉｄａｅ）科（ホタテガイ科）のホタテ貝（ｓｃａｌｌｏｐ）特に海ホタテ貝（ｓｅｅ　５ｃａｌｌｏｐ）であるプラコペクテン・マゲラニカス（Ｐｌａｃｏｐｅｃｔｅｎｍａｇｅｌｌａｎｉｃｕｓ）の消化腺からホタテ貝レクチンを抽出する方法、およびその生成物を凝集および分離操作手順に用いることに関する。

レクチン類は、酵素活性を示さない炭水化物結合性物質であり、またそれらは特異的免疫応答の結果として生成するものではない。レクチン類は様々なタイプの細胞を凝集でき、そしてこの凝集は特異的炭水化物によって阻害され得る。様々な微生物、植物、無を推動物およびを推動物がレクチン類を有し、広範な存在を示している。

無を推動物については、レクチン類は、オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ　；マダコ）、リムラス（Ｌｉｍｕｌｕｓ　；カブトガニ）、カルシノスコルピウス（Ｃａｒｃｉｎｏｓｃｏｐｉｕｓ　；カブトガニ）、トリダクナ（Ｔｒｉｄａｃｎａ　；シャコ貝）、アプリシア（Ａｐｌｙｓｉａ；アメフラシ）、タキプレウス（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　；カブトガニ）、ケリセラタ（Ｃｈｅｌ　１ｃｅｒａｔａ　；鋏角類）およびトラベラ（Ｄｏｌａｂｅｌ　ｌａ　；タツナミ貝）の血リンパに見出されている。

その他の組織、例えばアプリシアの生殖腺、ヘリックス（Ｈｅｌｉｘ；マイマイ）のアルブメン腺、アントシダリス（Ａｎｔｈｏｃｉｄａｒｉｓ　；ムラサキウニ）の卵およびセリアンタス（Ｃｅｒｉａｎｔｈｕｓ　；ハナギンチャク）の触手などもレクチン類を含み得る。

様々な働きがレクチン類によるものとされている。血リンパレクチン類は、病原体に対する防御メカニズムにおいて働き、ヘリックスのアルブメン腺は卵を守り、ウニレクチンは受精に関与し、そしてアプリシア・レクチンは、受精卵をカプセルに結合させることができる。

レクチン結合特異性は様々である。例えば、リムラスおよびカルシノスコルピウスのアグルチニン類はグラム陰性細菌の特異的成分である２−ケト−３−デオキシ−オフトン酸に結合する。アプリシアの血リンパレクチンはＮ−アセチルアミノ糖含有物質に結合する。

特に現在、カブトガニ（リムラス）レクチンは、例えば、臨床検体に存在するグラム陰性細菌の測定に、そして様々な材料の細菌内毒素含量の測定に用いられている。

しかしながら、このレクチンの使用には、生成物が熱に不安定であること、およびタンパク質分解酵素による分解を受けやすいこと、そして更には入手可能性が限られていること、またカブトガニレクチンの抽出に現在高コストを要することを含め、いくつかの欠点および制約が伴う。

本発明の目的の一つは、前述の欠点のない有用なレクチン生成物を抽出する方法を提供することにある。

従って、一つの観点において、本発明は、ａ）ペクチニダ工科およびハリオチス（Ｈａｌｉｏｔｉｓ　；ミミ貝）属より選択されたホタテ貝、例えば海ホタテ貝であるプラコペクチン・マゲラニカスの消化腺から、例えばトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液で処理することによりレクチン含有生成物を抽出し、そしてｂ）得られたレクチン含有抽出物を精製することより成るホタテ貝レクチンの抽出方法を提供するものである。

前記精製は、ａ）熱処理に続く硫酸アンモニウム沈澱、ゲルクロマトグラフィ、クロマトフオーカシングおよびヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフィｂ）熱処理、硫酸アンモニウム沈澱、ゲルクロマトグラフィ、および等電フォーカシング：およびＣ）熱処理、硫酸アンモニウム沈澱およびアフイニテイクロマトグラフイを含む様々な方法により行うことができる。こ“れらの方法の他の組合せも可能である。

もう一つの観点において、本発明は、ａ）約１０，０００〜２０．０００１特に約１４，０００の変性条件下の分子量；ｂ）ヒツジ赤血球を凝集する能力；Ｃ）スピノバクター（Ｓｐｉｎｏｂａｃｔｅｒ）およびシネココツカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）に属す種のピコブランクトンを凝集する能力；ｄ）次の種、すなわちアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　；大腸菌）およびセラチア・マルセツセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　；　電画）のグラム陰性細菌、特に近接可能表面内毒素（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅｓｕｒｆａｃｅ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）を有するもの、を凝集する顕著な能力；ｅ）約ｐＨ４〜５の範囲、特に約４．５２の等電点；ｆ）後記表Ａに示されＩ；ものと類似したアミノ酸組成；および、ｇ）タンパク質分解酵素プロテイナーゼに１プロナーゼおよびトリプシンに対する抵抗性により特徴付けられる、ペクチニダエ科およびハリチオス属より選択されｔ；ホタテ貝の消化腺より抽出され、そしてグラム陰性細菌に対する活性を有するレクチン−赤血球凝集素を提供するものである。

従って、本発明の方法によれば、ホタテ貝レクチンは、例えばプラコペクテン・マゲラニカスの消化腺から抽出される。レクチン収量は、約１ポンドの湿重量を有する３０個のホタテ貝消化腺から一般に約２０すである。消化腺はレクチンの主な供給源であるが、その他の組織からも抽出可能でレクチンを生じ得る。

消化腺は現在海に捨てられているが、潜在的にホタテ貝漁場から入手し得る。カナダ東部では毎年５．０００　）ンのホタテ貝筋部（ｓｃａｌｌｏｐ　ｍｕｓｃｌｅ）が収穫され、そして同様の量の消化腺が抽出に利用可能となろう。ホタテ貝レクチンの潜在的利用可能は２００Ｊ１９／年である。同様の特異性を有するカブトガニ（リムラス）レクチンの現在の価格は約８１００票９である。

本発明の好ましい一態様においては、レクチンは、ホタテ貝消化腺を、塩化ナトリウム含有トリス緩衝剤、またはｎ−アミノカプロン酸、ＥＤＴＡ、ベンズアミジン、ジチオトレイトール、フェニルメチルスルホニルフルオライド、ナトリウムアジド、および塩化ナトリウムを補給したトリス緩衝剤中でホモジナイズすることによりそれら消化腺から抽出することができる。ｎ−アミノカプロン酸、ＥＤＴＡ、ベンズアミジン、およびフェニルメチルスルホニルフルオライドは消化腺酵素による分解を抑えるために添加され、一方、ナトリウムアジドは微生物の増殖を抑えるために添加される。消化腺をホモジナイズして目的とする抽出を行った。

レクチンは、古典的なタンパク質技術およびアフイニテイクロマトグラフイを含む様々な手順によって抽出物から精製することができる。

標準的なタンパク質精製方法、すなわち、熱処理、硫酸アンモニウム沈澱、ゲルクロマトグラフィ、クロマトフオーカシング（または等電フォーカシング）およびヒドロキシルアパタイトでのクロマトグラフィを用いて、５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動において単一バンドを与えるレクチン調製物を得ることができる。分子量の分っているマーカーとの比較から、レクチンは約１４．０００の分子量を有することが示された。非変性条件下でのＰＡＧＥ電気泳動およびゲルクロマトグラフィは、レクチンがより高い分子量の凝集物へと集合し得るサブユニットから構成されていることを示唆している。精製レクチンは還元剤として放射性ホルムアルデヒドおよびナトリウムシアノポロハイドライドを用いた還元メチル化により（１４ｃ）標識することができる（ＪｅｎｔｏｆｔおよびＤｅａｒｂｏｒｎ、１９７９）。電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は１４，４００の分子量を有する放射性の単一バンドを与える。

あるいはまた、レクチンはアフイニテイ精製により抽出物より精製することができる。この手順は、レクチンの迅速かつ特異的な精製を可能にするので商業的生産により適している。適肖なリガンドは２−ケト−３−デオキシ−オクトネート（ＫＤＯ）まｔ；はシアル酸（重合体として）を含む。アフイニテイクロマトグラフイに用いられるリガンドは、エシェリヒア・コリのへプトースレス変異株（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ　ｍｕｔａｎｔ）から、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）をトリフルオロアセトリシスすることにより得られる。

そのＬＰＳはＤａｒｖｅａｎおよびＨａｎｃｏｃｋ（１９８３）またはＧａ１ａｎｏｓ。

ＬｕｄｅｒｉｔｚおよびＷｅｓｔｐｈａｌ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、９　；２４５〜２４９（１９６９）の方法により抽出することができる。後者の手順はより簡単であり従って好ましい。ＬＰＳ調製物の電気泳動は、ＬＰＳ調製物が銀染色により検出される高易動度の単一バンドを含んでいることを示した。ＬＰＳ調製物のトリフルオロアセトリシスにより３分子のＫＤＯ（２− ケト−３−デオキシ−オクトネート）および２分子のグルコサミンより成るペンタサツカライドが生成した。

このペンタサツカライドはエーテルによる抽出、脱アセチル化（メタノール中水酸化アンモニウム、ＩＭ、１時間、２０℃）、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５でのクロマトグラフィおよびポラシル（ｐｏｒａｓｉｌ）のカラムおよび酢酸エチル：酢酸：水（３：　ｌ　：　１）を溶媒として用いたＨＰＬＣにより精製される。グルコサミンの遊離アミノ基は、リガンド（ＫＤＯ）をアフィゲル（ａｆｆｉｇｅｌ）１５（Ｂｉｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｔｄ、）に結合させるために用いられる反応性基である。消化腺の抽出液を加熱しく　１００℃、１時間）、２℃に冷却しそして遠心分離した（９０００Ｘ９．２０分間）。硫酸アンモニウムを上溝液に添加しそしてタンパク質を４０〜６０％飽和の間で沈澱しそして遠心分離により集めた（９０００Ｘ９．２０分間）。タンパク質画分を蒸留水に溶解し、透析し、そして凍結乾燥した。アリコート（１ｇ）を塩化ナトリウム（０，９％）およびナトリウムアジド（０，０２％）を含有するトリス緩衝剤（０，０２Ｍ、　ｐＨ７，６，１０＋ｍ（１）に溶解した。その溶液をＫＤＯリガンド・アフィゲルカラム（１，５Ｘ　１５ｃａｔ。

１．６ｍ９ＫＤＯ）に１０１ＡＱ／時の流速で通した。カラムをトリス緩衝剤（５０ｍ＜２）で洗浄し、そして結合したレクチンをＫＤＯ−グルコサミンペンタサツカライド（４ｔｎｓ’）を含有するトリス緩衝剤（５ｒｎＱ’）で溶出後、トリス緩衝剤（２０ｍ１２）で洗浄した。タンパク質含有画分をプールしモしてＵＭ　１０フィルターを備えたアミコン限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ− ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）セルに入れた。そのペンタサツカライドは限外濾過セルを蒸留水で溶出しそしてその炉液中のＫＤＯ含有糖を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５でのクロマトグラフィにかけることにより回収した。レクチンは限外炉液セルから凍結乾燥により回収した。

ホタテ貝レクチンのサンプルについて行われたアミノ酸分析はつぎの結果を与えた：第１表フラコペクテン・マゲラニ力スレクチンのアミノ酸組成物アルギニン　２．４　２．４アスパラギン酸　？、４　８．６システイン酸　２．２グルタミン酸　７．４　７．３グリシン　８．７　１３．５ヒスチジン　２．０　２．０イソロイシン　６．０　５．０ロイシン　６．０　６．０リジン　３．２　３．３メチオニン　１．０　０．４フエニルアラニン　２．９　２．７プロリン　４．６　３．９モル比セリン　１０．７　９．４トレオニン　２０．５　１７．４１　各分析においていくつかの未確認ピークが検出された。

２　レクチンを６Ｎ　ＨＣＱにより１００℃で２４時間加水分解した。

コ　レクチンを過蟻酸で酸化後、６Ｎ　ＨＣＱにより１００°Ｃで４８時間加水分解した。

ホタテ貝レクチンは次の第２表に例示されるように大部分のグラム陰性細菌を凝集するが、このことは、レクチンが大部分のグラム陰性細菌に共通した細胞表面特徴部を認識することを示している。

■　赤血球−ヒツジ　５１２２スピノバクタ−ｓｐ、　３２比活性　結合レフシネココツカスｓｐ、　（ＷＨ７８０３）シネココツカスｓｐ−（ＷＨ７８０５）　３２Ｂ、ダラム陽性バチルス・セレウス　− （Ｒａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　；セレウス菌）バチルス・メガテリウム　 − （Ｒａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　；巨大菌）バチルス・ズブチリス　１６（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　；枯草菌）ブレビバクテリウム・リネンス　− （Ｂｒｖｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｉｎｅｎｓ）Ｃ，グラム陰性エーロモナス・ハイドロフイラ　− （Ａｅｒｏ＋ｎｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉ　ｌａ）エーロモナス・ブンクタータ　２（Ａｅｒｏ＋ｎｏｎａｓ　ｐｕｎｃｔａｔａ）アグロバクテリウム・チュメファシエンス　３２（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｕｅｕｎｄｉｉ）エンテロバクタ −・エーロモナス　８９（Ｅｎｔｅｒｏｈａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）比活性　結合レフエルウィニア・アムロポラ　４　２１（Ｅｒｗｉｎｉａ　ａｍｕｌｏｖｏｒａ）エシェリヒア・コリＢ　１２８エシエリヒア・コリ（ヘプトースレス”）　６４　５７（ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　；尋常変形菌）セラチア・マルセツセンス　６４シゲラ・フレクスネリ　４（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｉｅｘｎｅｒｉ）ビブリオ・アングイラールム　４（Ｖｉｂｒｉｏ　ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）エルシニア・エンテロコリチカ　４（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）■　植物プランクトンイソクリシス・グラパナＮＤ　４１（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ　ｇｌａｈａｎａ）比活性　結合レフ細胞のタイプ　（単位７′ｒｎｇ）　＋　Ｚ±２ケト七ロス・グラシリス　ＮＤ　１８（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）−は凝集なしを、ＮＤは測定されないことを表わす、１植物プランクトンは自己凝集傾向が著しく、そこで１４（標識レクチンを用いて植物プランクトンに対するレクチンの結合を実証した。かかる結合は表面バクテリアによるものとし得よう。

最少量のレクチン（最大の特異活性）により凝集を受けたグラム陰性細菌は、粗面（ｒｏｕｇｈ）株、例えばヘプトースレス大腸菌、または中間面（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ　５ｕｒｆａｃｅ）を有する例えば大腸菌Ｂであったが、このことはレクチンの認識部位が細胞表面近傍に存在し、そして細胞表面様々であることの説明を助ける。ホタテ貝レクチンにより凝集を受けない２つのグラム陰性細菌はエーロモナス・ハイドロフイラおよびザイモモナス・モビリスであった。

これらの細菌はＫＤＯを含有しないＬＰＳを有しているが・このことはホタテ貝レクチンによって認識されるＬＰＳの特徴部がＫＤＯを含有することを示唆している。このことは、アフイニテイクロマトグラフイにより、７０％以上の（目Ｃ）認識レクチンがリガンドとしてＫＤＯ含有ペンタサツカライドを有するアフイニテイ力ラムに結合したことから確認された。その結合レクチンの一部（２９％）は、ヘプトースレス大腸菌のＬＰＳからのペンタサンカライドでアフイニテイ力ラムから溶出することができた。モノマーＫＤＯは、ＫＤｏ含有ペンタサツカライドが結合レクチンを溶出できる同じ条件下に結合レクチンを全く溶出できなかった。このことは、レクチン結合部位が２個以上のＫＤＯ糖残基から成っている可能性のあることを示唆している。

細菌性ＬＰＳは３個のＫＤＯ残基を含んでいる。

ホタテ貝レクチンはヒツジ赤血球、およびＯ，Ａ、ＢおよびＡＢ型のヒト赤血球を凝集する。フェツイン（Ｆｅｔ−ｕｉｎ）、甲状腺グロブリン（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）およびヒト酸性グリコプロティンはすべてシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を含有し、またホタテ貝によるヒツジ赤血球の凝集を阻害することができた。シアル酸を含まないタンパク質はヒツジ赤血球の凝集を阻害し得なかった。

シアル酸は構造上ＫＤＯに類似している。シアル酸含有物質は、前述のアフィニティカラムから結合レクチンを溶出し得たが、レクチン溶出量の少いことから、レクチンがシアル酸よりもＫＤＯ含有ペンタサツカライドに対してはるかに高い親和性を有していることがわかる。

本発明のホタテ貝レクチンは、熱安定性をはじめとするいくつかの有利で独特な特徴を有している。例えばレクチンの溶液を１００℃で１時間加熱しても凝集力価は低下しなかった。カブトガニレクチン（これは現在ホタテ貝レクチンに知られている目的に一部に用いられている）は熱に不安定であり、また水和されてしまうと速やかにその活性を減じる。

本発明のホタテ貝レクチンのもう一つの特徴は、タンパク質分解酵素に対する抵抗性である。例えば、プロテイナーゼに１プロナーゼおよびトリプシンは、レクチン調製物を前記タンパク質分解酵素の各々と一部インキユベーションしてもその力価を低下し得なかった。この特質はおそらく、レクチンの解剖学的位置、すなわち、タンパク質分解酵素を含むであろうと推定されるホタテ貝の消化腺からくるものであろう。タンパク質分解酵素に対する抵抗性はレクチンの長期安定性を高め、そして独特な応用を可能にし得る。

ホタテ貝レクチンの特異性は、結合に少なくとも２個の隣接ＫＤＯ残基を必要とする点でユニークであると思われる。カブトガニレクチンもＫＤＯまたはシアル酸含有物質に結合し、また、カブトガニレクチンおよびホタテ貝レクチンがどの程度の類似結合部位を有しているかは現在のところ十分には分っていない。シアル酸含有物質を認識する多くの他のレクチンが知られているが、カブトガニレクチンが商業的に入手できる唯一のレクチンであると思われる。

本発明のホタテ貝レクチンは、グラム陰性細菌からのりポリサッカライドのアフイニテイ精製、生物学的材料、例えば注射用医薬からの細菌性内毒素の除去、およびシアル酸含有グリコプロティンおよびポリサッカライドのクロマトグラフィのために、グラム陰性細菌を凝集するのに有用である。

以下は、本発明のホタテ貝レクチンの潜在的な特異的応用例である。

ｌ）ホタテ貝レクチンを用いて大部分のグラム陰性細菌からＬＰＳをアフイニテイ精製して高度に精製されたＬＰＳ調製物とすることができる。多くの場合、グラム陰性細菌の抗原性または七ロタイブは、そのＬＰＳの性質によって決定される。ＬＰＳのアフイニテイ精製により、診断目的に単クローン抗体を選抜するための、またはＬＰＳ特異性の分っている抗体生産／精製用リガンドのための抗原として働く極めて純粋な抗原を得ることができた。

例えば、アフイニテイクロマトグラフイにより精製されたホタテ貝レクチンは大腸菌（ヘプトースレス粗面変異株、５１６２）の内側コアから抽出されたＬＰＳを認識することができる。このグラム陰性細菌の内側コア領域は、そのＫＤＯがポリマー形態にあればホタテ貝レクチンにより認識される２−ケト−３−デオキシ−オクトネート（ＫＤＯ）を含んでいる。

２）ホタテ貝レクチンは、シアル酸含有グリコプロティンを認識し、従ってホタテ貝レクチンはシアル酸含有グリコプロティンのアフイニテイ精製に用いることができた。

３）ホタテ貝レクチンは、ワクチン調製物またはその他の注射用医薬からＬＰＳを除くのに用いることができる。

ＬＰＳの脂質Ａ部は、哺乳動物において、多くの生物活性を生じる。従って、これらの毒性に着目してＬＰＳは内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）とも呼ばれる。接頭辞“内（ｅｎｄｏ）”はそれが細菌表面に結合していることを示している。多くのワクチン調製物は内毒素を含有し、またいずれの注射用医薬からも内毒素を除去するのが望ましい。この目的に利用できる市販品の一例はＤｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ■である。適当な支持用ゲルに結合したホタテ貝レクチンは同じ目的に役立つであろうが、特異性が高い点で有利であろう。（特にタンパク質が存在する場合）内毒素のほかにその他の成分が非特異的に結合してしまうことが、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ＠の場合の問題であることが時としてあり得る。

４）ホタテ貝レクチンは、現在カブトガニアメーバ様細胞溶解物（Ｌｉｍｕｌｕｓ　ａｍｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙｓａｔｅ　；略してＬＡＬ）アッセイを用いて行われている注射用医薬および食品中の内毒素レベルの測定にも有用であり得る。

ラニカス、からのレクチン抽出に関するものであるが、ペクチニダ工科の他の貝、例えばクラミス・イスランデイカ（Ｃｈｌａｍｉｓ　１ｓｌａｎｄｉｃａ）、クラミス・ルビダ（Ｃｈｌａｍｙｓｒｕｂｉｄａ）およびアルクチ力・イスランデイカ（Ａｒｃｔｉｃａｉｓｌａｎｄｉｃａ）などからも有用なレクチンを抽出し使用することができる。次の第３表は興味あるいくつかの他の貝の活性を示すものである。

第３表プラコペクテン・マゲラニカス以外の代表的な貝のレクチン活性レクチ　耐　ＬＰＳにンデイカ　ス力ロツプクラミス・ホスタタ　−ｌ　有　有（Ｃｈｌａｍｙｓ　ｈｏｓｔａｔｓ）クラミス・ルビダ　−　８　有　有りラツサドマ・キ　ビッグスカロツブ　ｌ　有　有ガンテア　（Ｂｉｇ　ｓｃａｌｌｏｐ）（Ｃｒａｓｓａｄｏｍａｇｉｇａｎｔｅａ）シストドリア・シ　ポルペラ−クラ　ｌ　有　有レクチ　耐　ＬＰＳにプラコペクテン・マゲラニカスの消化腺の抽出について実施例１に与えられた結果とは対照的に、レクチン活性は、ブラコペクテン・マゲラニカスの抽出に用いた方法による全動物の抽出に基づいている。

レクチン活性は、抽出物を１００℃に３０分間加熱後測定した。レクチン活性は、大腸菌ＬＰＳ　（血清型０５５の存在下に試験した。

プラコペクテン・マゲラニカス以外の抽出された貝のうち、クラミス・イスランデイカからのレクチンを最も集中的に試験した。クラミス・イスランデイカレクチンは、耐熱性、タンパク質分解酵素に対する抵抗性、細菌性ＬＰＳおよびシアル酸含有グリコプロティンによる凝集阻害に関しプラコベクチン・マゲラニカスからのレクチンに類似していた。プラコベクテン・マゲラニ力スレクチンの精製に用いられた方法をクラミス・イスランデイカレクチンに適用すると同様の結果が得られた。

以下の実施例は、本発明を例示するものである。

実施例　１１０〜２０ｃｍの範囲の貝直径を有する約３０個のホタテ貝をノバスコシア（Ｎｏｖａ　５ｃｏｔｉａ）、マツシャブーム（Ｍｕｓｈａｂｏｏｍ）（４４°５１ ’　；　６２°３４′）からダイパーにより採取された。生きたホタテ貝を海水中２〜６°Ｃに保った。２４時間内に、それらの消化腺を取り出し、そしてｎ− アミノカプロン酸（０，０１Ｍ）　、ＥＤＴＡ（０，００５Ｍ）　、ベンズアミジン（０，００５Ｍ　）、ジチオトレイトール（０，００１Ｍ）、フェニルメチルスルホニルフルオライド（０，００１Ｍ）およびナトリウムアジド（０，０２％）および塩化ナトリウム（０，９％）を補足したトリス緩衝剤（０，０２Ｍ、　ｐＨ７，６，５００ｍＱ）中でポリトロン（Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ超音波−機械的ホモジナイザーを用いて２分間ホモジナイズした。ホモジナイズされた抽出物を遠心分離しく　１０．０００ｘ　９．６０分間）、そして上溝液を４℃で２４時間蒸留水に対して透析した。２４時間の間にその蒸留水を２回変えた。透析した抽出液を凍結乾燥し、そして凝集活性を測定した。

精製レクチン生成物を得るために、抽出物を食塩水に溶解後、沸騰水浴を用いて９０〜１００℃に加熱し、そしてその温度に１時間保った。不溶物を遠心分離（１０，ｏｏｏＸ　９．６０分間）により除去し、そして上溝液を蒸留水に対し４ °Ｃで２４時間透析した後凍結乾燥した。乾燥抽出物を２００ｍａの蒸留水に溶解しそして不溶物を遠心分離（１０，０００ｘ　９．３０分間）により除去した。その上溝液に硫酸アンモニウムを０から１００％飽和まで２０％ずつ高まるように添加した。２０％高める毎に生じた沈澱を遠心分離（１０，０００Ｘ　ｙ、６０分間）により除去しｔ；。５つの沈澱を蒸留水を頻繁に変えながら蒸留水に対し４°Ｃで２４時間透析し、凍結乾燥し、そしてレクチン活性を測定した。

最も活性の高い画分（４０〜６０％硫酸アンモニウム飽和）をフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　６５Ｆ　）　（２−５Ｘ　４２ＣＩＱ）でのクロマトグラフィにかけ、レクチン抽出に用いたのと同じ緩衝剤を用いて５０！ＩＩＱ／時の流速で展開した。ＩＯ＋＋＋（Ｌずつ画分を集め、そしてレクチン活性を試験した。活性画分をプールし、蒸留水に対し４°Ｃで２４時間透析しそして凍結乾燥した。

乾燥物を、ｎ−アミノカプロン酸（０，ＯＩＭ）　、ＥＤＴＡ（０，００５Ｍ　）およびナトリウムアジド（０，０２％）を補足したイミダゾール緩衝剤（０，０２５Ｍ、　ｐＨ７，２）で平衡させたイオン交換ＰＢＥ　９６カラム（１，６Ｘ　２０ｃｍ）でのクロマトフオーカシングにかけた。イミダゾール緩衝剤とポリバッファー（ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ）　７４　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｔｄ、）の８：ｌ混合物を用いてレクチンをｐＨ３，９で溶出し、そしてＳｍｆｆずつ画分を集め、そして活性を試験しｔ；。選択された画分のｐＨおよび２８０　ｎｍにおける吸光度も測定した。活性画分をプールし透析しそして凍結乾燥した。

ゲル電気泳動による凍結乾燥物の分析は、ポリバッファー７４による汚染を示唆する低分子量物質の存在を示した。そのレクチンを更に精製するｔ；めに、その物質をナトリウムアジド（０，０２％）を補足したリン酸カリウム緩衝剤（０，５Ｍ　、　ｐＨ７，５）に溶解し、そしてヒドロキシルアパタイトカラム（１，５Ｘ　１６ｃ！ｌ）でのクロマトグラフィにかけ、０．０１Ｍ〜０．５Ｍのホスフェート緩衝剤ステップ濃度勾配を用いて展開した。活性画分をプールし、蒸留水に対して透析し、そして凍結乾燥した。

クロマトフオーカシングに続くヒドロキシルアパタイトでのクロマトグラフィによる精製は、等電フォーカシングにより置き換えることができる。等電フォーカシングのために、スクロースを用いて密度勾配を形成し、そして両性電解質（ｐＨ４〜６．５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｔｄ）を全容４４０ＩＩ！１２中１．５％の濃度で用いた。Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０００を軽および高密度溶液に添加し、最終濃度を２０％（ｖ／ｖ）とした。ゲルクロマトグラフィからの凍結乾燥レクチン含有物質（６００ｍｇ）を軽溶液（２１５＋ｌ１Ｑ）に溶解した。カラムを充填後、電圧を調節して電力入力を６ワツトに保った。５℃で３６時間後、フォーカシングを止め、カラムを１ＯＩＩｌＱ画分ずつ空にした。沈澱タンパク質を含む両分を遠心分離し、そしてペレットをその画分と同じｐＨの緩衝剤で４回洗浄した。各タンパク質画分の凝集活性を試験しそして活性画分をプールした。

各精製段階におけけるレクチンサンプルの非活性が増大していく様子が次の第４表に示された結果から明らかである。

第４表粗抽出物　１４７０　５１２　７５２　−　１熱処理　１３０８　５１２　６６９　８９　１（ＮＨａ）ｚｓＯ＊沈澱　５５０　１．０２４　５６３　７５　２フラクトゲル６５Ｆ　３１０　２．０４８　６３４　８４　４トリス（０，０９Ｍ）　、ホウ酸（０，０８Ｍ　）　、Ｎａ、　、ＥＤＴＡ（０，９３ｙ／（２）を含有する緩衝剤（ｐＨ８，４）で平衡させた勾配ゲル（ＰＡＡ　４／３０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｔｄ、）を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行った。３００ポルトの電位を１０分間印加後、電圧を１６時間１５０ポルトに下げた。ゲルを酢酸中のクーマツシープルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅＸｏ、０２％）で（７％、２時間）、またはＰＡＳ染色で炭水化物を染色した。後者の手順においては、並行ゲルを水性過沃素酸、シック試薬（Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ　ｒｅａｇｅｎｔ）で処理後、メタ重亜硫酸カリウム含有（５％）ＩＭＨＣＱで脱色した。

トリス（０，０４Ｍ）　、酢酸ナトリウム（０，０２Ｍ）　、ＥＤＴＡ（２ｍＭ）および５ＤＳ（０，２％）を含有する緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡させた勾配ゲル（ＰＡＡ　４／３０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｔｄ、）を用いてタンパク質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。サンプルをトリス緩衝剤（１０ｍＭ、　ｐＨ８，０）、ＥＤＴＡ（ｌ　ｍＭ）中でＳＯ５（２，５％）およびメルカプトエタノール（５％）と共に加熱しく１００℃、１０分間）、そしてゲルに適用した。３００ポルトの電位を１０分間印加後、電圧を１５０ボルトに下げた。ブロモフェノールブルートラッカー色素の易動度を観察シ、そしてその色素がゲルの端縁にくるまで電場を印加した。

タンパク質を固定し、そしてＳＤＳを１０％酢酸含有２５％イソプロパツール中２４ボルトで３０分間電気泳動により除去した。ゲルを酢酸（７％）中クーマツシーブルー（０，０２％）で染色した。

２つの細胞タイプ、すなわちヒツジ赤血球およびシネココツカス・バチラリスの凝集を用いて比活性を測定しそして精製中に得られた画分中の活性を評価した。

両方の細胞タイプは同様の結果を与えたが、ヒツジ赤血球を用いて得られた結果だけを報告する。第２表に示されるように、消化腺の粗抽出物は５１２単位／１１ｇの比活性を有しまたそれは加熱しても低下することはなかったが、このことはそのレクチンが熱に対し安定していることを示す。硫酸アンモニウム沈澱により比活性が２倍に増加し、またフラクトゲル６５Ｆでのクロマトグラフィは、添付第１図に図示されるようにレクチンがボイドボリューム近くに溶出することを示したが、このことは高い見かけ分子量を有していることを示している。第２図かられかるようにクロマトフオーカシングはレクチンはｐＨ３，８〜４．２で溶出されることを示した。この段階は比活性を実質的に高めたが、ゲル電気泳動は、おそらくクロマト７オ−カシングに用いたポリバッファーを起源とする高易動度の汚染物質の存在を検出した。これは第３図に示されるようにヒドロキシルアパタイトでのクロマトグラフィーにより除去された。最終生成物は３５倍の精製倍率に相当する１８×１０３単位／１１ｇの比活性を有した。

ＳＤＳを用い、および用いないゲル電気泳動は１個の主要拡散バンドの存在を示した。それらバンドはＰＡＳ法によっても染色されたがこのことは炭水化物の存在を示している。ＳＤＳを用いないゲル電気泳動は高分子量凝集物の存在を実証した。これらの凝集物の分子量はＳＤＳの非存在下では約１４．０００に減少した。クロマトフオーカシング精製段階を等電フォーカシングで置き換えると６４倍の純度の最終生成物が得られ、また４〜６．５の両性電解質を用いてそのレクチンが４．５２の等電点を有していることが示された。

実施例　２実施例１で得られた精製レクチンの解剖学的分布を２つの方法により評価した。

まず、組織をフルオレセインイソチオシアネート標識大腸菌ＬＰＳに晒しく　１１１１９／　ｒｎＱ、　１０分間、血清型Ｑ、５５：　５　Ｂ　、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　、そして未結合ＬＰＳを食塩水で繰り返し洗浄することにより除去した。その組織を蛍光顕微鏡（Ｗｉｌｄ　Ｌｅｉｔｚ　Ｄｉａｌｕｘ　２０ＥＢ　顕微鏡、励起４５０４９０　ｎｍ、ビームスプリンター５１０ｎｍ、およびバリヤーフィルター５１５ｎｍ）により検査した。

対照組織は蛍光ＬＰＳには晒さなかったが、他の点では同じ処理を受けた。

第２に、組織を前述の如く抽出し、そして抽出物のレクチン活性を分析した。遠心分離（５，０ＯＯＸｓ、１０分間）により血リンパから血球（Ｈａｅｍｏｃｙｔｅｓ）を集め、そして食塩水で洗浄した。洗浄した血球を蒸留水に懸濁し、水浴中周いて１５ワツトで３０秒間処理した。細胞破砕片を遠心分離（５，０００Ｘ、、１０分間）により除去し、そして上溝液の凝集活性を測定した。上溝液のタンパク質含量をＷａｒｂｕｒｇおよびＣｈｒｉｓｔｉａｎ（１９４１）の方法により測定した。

蛍光鏡検から、消化腺、ラメラおよびマントルは蛍光ＬＰＳを同様の強度で結合することが実証された。他の組織はＬＰＳをさほどよくは結合せず、また筋部はＬＰＳを全く結合しなかった。組織抽出により消化腺およびマントル中にレクチンの存在が確認された。その他の組織の抽出物にはレクチン活性を全く無かったが、場合により、蛍光ＬＰＳを結合できる組織もあった。このことは、これらの組織中にレクチンがトリス緩衝剤では抽出できない形で存在していることを示し得る。血球を破壊すると赤血球凝集活性が生じたが、このことは、消化腺およびマントルのほか血球も抽出可能なレクチン活性を含むことを示している。

結果を次の第５表に示す。

第５表レクチンの解剖学的局在消化腺　＋＋＋　５１２ラビアルパルプ（Ｌａｂｉａｌ　ｐａｌｐｕ）　＋　−生殖腺　＋＋　− 血球　Ｎ、Ｄ、　２１０後腸　Ｎ、Ｄ、　− 血漿　Ｎ、Ｄ、　４ ’　Ｎ、Ｄ、は測定されずニーは蛍光なし、または凝集なし２　対照例はすべての組織について蛍光を示さなかった。

＋＋十は強力な蛍光、＋＋は中等度の蛍光、十は弱い蛍光を示す。

３　凝集活性は、消化腺およびマントル抽出物については単位／ｍ９（乾重量）、血球抽出物については単位／ｍｇｃタンパク質）、および血漿については単位／ｍｇ（乾重量）として報告されている。

実施例　３ホタテ貝がピコプランクトンを海水から濾過する能力を評価するために、シネココツカス・バチラリスの懸濁液（４Ｑ１約４ＸＩＯ’細胞個／ｍＱ）を２個の４Ｑビーカーに等しく分けた。３個のホタテ貝をそれらビーカーの一方に入れ、そして両方のビーカーを通気し、そして同様の空気流および撹拌条件下に混合した。懸濁液中のシネココツカス・バチラリス数を、開始時、および１８時間後および２４時間後にＰｅｔｒｏｆｆ−Ｍａｕｓｅｒ細菌計数器を用いて直接計数により測定した。

シネココツカス・バチラリスへの暴露が消化腺のレクチン含量に及ぼす影響を、３０個のホタテ貝を流動海水中に５°Ｃで１ケ月間維持し、そしてそれらホタテ貝を２群に分けた。１０個より成る一方の群を、シネココツカス・バチラリス（３，７Ｘ　１０’細胞個／ｍＱ）の懸濁液が２３８ｍＱ／時の流速で連続添加される流速１５１２／時の流動海水を含む２００Ｑタンク内に維持しｔ；。１２個より成る他方の群をシネココツカス・バチラリスは添加されない、別の同様のタンクに維持した。ｌおよび２力月後、ホタテ貝５個の消化腺をプールし、そしてレクチン含量を抽出により測定した（各群に対し２つの測定を行った）。

結果は次の第６表に示すとおりである。

第６表ホタテ貝による海水からのシネココツカス・バチラリスのか過処　理　時間（ｈ）　細胞数１（個数／ｍＯ対照（ホタテ貝なし）　０　３．７±０．４Ｘ１０’ １８　４．４±０．３Ｘ１０’ ２４　４．８±０．８Ｘ１０’ ホタテ貝あり　０　４．２±０．４Ｘ１０’１８　１．８±０．３ＸｌＯ’ ２４　１．６±０．２Ｘ１０’ １５回の測定値の平均ホタテ貝は２４時間内に海水中に懸濁されたシネココツカス・パチラリス細胞の約２７３を除去したことが第６表かられかる。流動海水中に維持されたホタテ貝の消化腺のレクチン含量は、１力月内に５１２単位／ｍ９（抽出物）から８単位／ｍ９に低下した。ホタテ貝をシネココツカス・バチラリスに暴露するとレクチン力価は部分的に回復し、１力月後の力価は３２単位／ｍｙとにり、そして２力月後の力価は６４単位／１９となった。シネココツカス・バチラリスを添加せずに維持された対照例の１および２力月後の力価はそれぞれ４およびｌ対照／ｍｇであった。力価は５個の消化腺の抽出物を用いて測定した。

実施例　４ホタテ貝レクチンが溶液から細菌性ＬＰＳを除去する能力を評価するためにアフィニティゲルを次のとおり構築しｔ；。プランクトン・マゲラニカスからのレクチンを製造元の推奨する方法を用いてアフィゲル１５に結合した。

得られたアフイニテイゲルを５ｍｇ／ｍＱのレクチンを含有した。このゲルを用いてカラム（０，９Ｘ　６　ｃｍ）を作す、モしてＬＰＳ（１３４μ９のＫＤＯを含む４５ｍｇ）をそのカラムに載せた。

そのカラムをトリス緩衝剤（０，０２Ｍ％ｐＨ７，６，０，９％ＮａＣ＜１および０．０２％ナトリウムアジドを含有）で洗浄した。溶出液は９４μ９のＫＤＯを含有したが、このことは約３０％のＬＰＳ（４０μ９のＫＤＯ）がアフイニテイゲルに結合したことを示している。エタノールアミンでブロックしておいたアフィゲル１５から作られた同寸法のカラムは、溶出液にＫＤＯが定量的に回収されることにより示されるようにＬＰＳを全く結合しなかった。

実施例　５実施例１の手順に従って、いくつかのアワビ種から消化腺抽出物を採取した。前記抽出物のレクチン含量を、１００℃に３０分間加熱する前におよび加熱した後でヒツジ赤血球（ＲＢｃｓ）および大腸菌細胞の凝集により測定した。

大腸菌単位は、トリブチツク・ソイ・ブロス（ＴｒｙｐｔｉｃＳｏｙ　Ｂｒｏｔｈ）（Ｄｉｆｃｏ）で３７℃で２４時間増殖させた大腸菌Ｂを用いて測定した。

細胞を食塩水で３回洗浄した後食塩水中に６９０ｎｍにおける光学密度が０．５となるように懸濁しｔこ　。

測定結果を下記第７表に示す。

第７表ハリオチス・ルフエッセンス　８００　０　２００　８００（Ｈａｌｉｏｔｉｓ　ｒｕｆｅｓｃｅｎｓ）ハリオチス・プルゲンス　６８３　０　１７１　１３６５（Ｈａｌｉｏｔｉｓ　ｐｕｌｇｅｎｓ）ハリオチス・クラクネロジ　８００　０　２００　１６００（Ｈａｌｉｏｔｉｓ　ｃｒａｃｎｅｒｏｄｉｉ）ハリオチス・フルガタ　６５６　０　８２　６５６（Ｈａｌｉｏｔｉｓ　ｃｏｒｒｕｇａｔａ）ハリオチス・カムチャツカマ　−３４２１３３（Ｈａｌｉｏｔｉｓ　ｋａｍｔｓｃｈａｔｋａｍａ）この開示において“ＲＢＣ単位／＋ｌＩｇ”として表わされるレクチン活性は次のようにして測定した：レクチン活性の測定：レクチン活性をヒツジ赤血球およびピコプランクトン、シネココツカス・バチラリスを用いて測定した。タック（Ｃｏｏｋ）微量測定プレートの各ウェルに、塩化ナトリウム（０，９％）およびナトリウムアジド（０，０２％）を補給したトリス緩衝剤（１００μＬ　０．０２Ｍ　、　ｐＨ７，６）を添加シタ。測定すべき物質を食塩水に溶解しく　２０ｍｇ／ｍｆｆ）、不溶物を遠心分離（５，ＯＯＯＸｇ、１０分間）により除去し、その上溝液（１００μＱ）を第１ウエルに添加し、混合し、そしてその混合物（１００μＱ）を第２ウエルに移した。この過程を続けて測定対象調製物の希釈剤を作った。希釈剤の各ウェルに、ヒツジ赤血球の懸濁液（１５μ（１１６２０ｎｍにおける吸光度帆３５または１．ＩＸ　１０’細胞／ｒｎ１２）または大腸菌細胞の懸濁液（１５μＱ、６９０ｎｍにおける吸光度帆５）を添加した。微量測定プレートは向るやかに振盪し、そして４℃ で２４時間インキュベートした。力価は細胞凝集可能な最高希釈度とした。

比活性はこの力価の逆数を希釈剤の第１ウエルに添加された物質の乾重量で除したものである。特に断らない限り、すべての比活性はヒツジ赤血球を用いて測定した。

レクチン精製中に得られた両分の凝集活性を測定するために、各画分のアリコート（１００μＱ）の活性を前述の如く試験した。

ハリチオス・カムチャツカマの大腸菌凝集レクチンは変性条件下でのＳＤＳ　− ＰＡＧＥ電気泳動により、１０．０００〜２０．０００の分子量を有することが示された。等電フォーカシングは凝集活性の等電点が４．０〜５．０、特に４．６の値にあることを示した。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成元年　６月　９日

Claims

【特許請求の範囲】

１．ａ）ベクチニダエ科およびハリオチス属より選択されたホタテ貝の消化腺からレクチン含有生成物を抽出し、そしてｂ）得られたレクチン含有抽出物を精製する。ことより成るホタテ貝レクチンの製造方法。
２．ホタテ貝がベクチニダエ科から選択される、例えば海ホタテ貝であるプラコベクテン・マゲラニカスなどである請求の範囲第１項記載の方法。
３．抽出が適当な緩衝剤で処理することにより行われる請求の範囲第１項記載の方法。
４．緩衝剤がトリス緩衝剤またはホスフェート緩衝剤である請求の範囲第３項記載の方法。
５．精製が、レクチン含有抽出物の熱処理後、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィ、クロマトフォーカシングおよびヒドロキシルアパタイトでのクロマトグラァイにより行われる請求の範囲第１、３または４項記載の方法。
６．精製が、レクチン含有抽出物の熱処理後、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィおよび等電フオーカシングにより行われる請求の範囲第１、３または４項記載の方法。
７．精製が、レクチン含有抽出物の熱処理後、硫酸アンモニウム沈殿およびアフイニテイクロマトグラフイにより行われる請求の範囲第１、３または４項記載の方法。
８．緩衝剤に分解抑制剤および／または抗微生物剤が補足される請求の範囲第３または４項記載の方法。
９．緩衝剤に、ｎ−アミノカプロン酸、ＥＤＴＡ、ベンズアミジン、ジチオトレイトール、フエニルメチルスルホニルクロライド、ナトリウムアジドおよび塩化ナトリウムより選択された一以上が補足される請求の範囲第３または４項記載の方法。
１０．ａ）海ホタテ貝であるプラコベクテン・マゲラニカスの消化腺からトリス緩衝剤またはホスフエート緩衝剤を用いてレクチン含有生成物を抽出し、そしてｂ）得られたレクチン含有抽出物を熱処理後、硫酸アンモニウム沈殿およびクロマトグラフィにより精製することより成る請求の範囲第１項記載の方法。
１１．クロマトグラフィ処理が、ゲルクロマトグラフィ、クロマトフオーカシング、ヒドロキシルアパタイトでのクロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィより選択される少なくとも一の処理を含む請求の範囲第１０項記数の方法。
１２．ａ）約１０，０００〜２０，０００の変性条件下の分子量；ｂ）ヒツジ赤血球を凝集する能力；ｃ）スピノパクターおよびシネココツカスに属する種のピコプランクトンを凝集する能力；ｄ）次の種、すなわちアグロバクテリウム、チユメフアシエンス、エシエリヒア・コリ（大腸菌）およびセラチア・マルセツセンスのグラム陰性細菌に対する顕著な凝集能力；ｅ）約ｐＨ４〜５の範囲の等電点；およびｆ）タンパク質分解酵素、プロテイナーゼＫ、プロナーゼおよびトリプシンに対する抵抗性を特電とする、ベクチニダ工科およびハリオチス属より選択されたホタテ貝、例えばプラコベクテン・マグラニカスの消化腺より抽出され、そしてグラム陰性細菌に対する活性を有するレクチン赤血球凝集素。
１３．変性時に約１４，０００の分子量を有し、そして前記第２および３表に実質的に規定されたグラム陰性細菌に対する比活性を有する請求の範囲第１２項記載のレクチン生成物。
１４．前記第１表に示されたものに類似したアミノ酸組成を有する請求の範囲第１２または１３項記載のレクチン生成物。