JPH02501576A - 新規な抗レトロウイルス剤および供給系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な抗レトロウィルス剤および供給系本発明はレトロウィルスおよびレトロウ ィルスによシ引き起こされる疾病を予防する、または治療する方法に関する。さ らに本発明は、後天性免疫不全症候群〔エイズ（ＡＩＤＳ））と深いつながシが あるヒト免疫不全症ウィル：Ｘ、（ＨＩＶ）、新規な抗ＨＩＶ剤およびその新規 な抗ＨＩＶ剤の供給用ビヒクルに関する。 本技術の状態 後天性免疫不全症候群（エイズ）は、ＨＴＬＶ−１、ＬＡＹまたはＡＲＶとして 従来よシ知られているが、しかし最近°ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ　）と 新しく命名されたレトロウィルスに対して追跡されてきた。エイズによシ引き起 こされる主な免疫学的病変は、ＣＤ４陽性（°Ｔ４陽性陽性間義）Ｔリンパ球の 数の減少である。ＣＤ４陽性リンパ球はほとんど全ての免疫プロセスに包含され るから、そしてその他の免疫系の細胞タイプもまた影響されるから、エイズウィ ルスでの感染が免疫機能を無力化することは篤くべきことではない、その結果が 、前記ウィルスで感染された患者は致死的な日和見感染、ガンおよびその他の様 々な徨の病気にかかシやすくなることである。現在、疾病の進行を遅らせる以外 に行なう治療がない、有効な療法がな込ので、エイズは１００％致命的であるこ とが知られている。 アジドチミジン（ＡＺＴ　）は、ＨＩＶ感染の進行に影響を及ぼすと信じられて いる抗ＨＩＶ剤の一つである。しかしながら、ＡＺＴはある種の欠点を有し、そ して明らかになるであろう有用性を限定している。 本発明の要約 それ故に、新規でそして有効な抗レトロウィルス剤を提供することが本発明の目 的である。 リポソーム内にカプセル化された新規でそして有効な抗レトロウィルス剤を提供 すること、およびそれから製造された組成物を提供することが本発明のその他の 目的である。 感染された宿主内で実際にまたは潜在的にレトロウィルス活性な部位を標的とし て抗レトロウィルス剤を向けるだめの有効な供給系を提供することも本発明のそ の他の目的である。 エイズを治療するまたは予防する化学療法を提供することは本発明の付加的な目 的である。 本発明のその他の目的および利点は、以下の開示から明らかとなるであろう。 図面の簡単な説明 本発明のこれらのおよびその他の目的、特徴および多くの付随する利点は、添付 図面と関連して考えた場合に以下の明細書を読んでよシ良く理解されるであろう ：第１図は、ａ　ｏ　ｍＭ　ｄｄｃＴＰを含有するリポソーム（上図）およびリ ン酸緩衝液を含有するリポソーム（下図）を示す、電子顕微鏡写真（×７５，０ ００−１５３オングストロ一ム／ｗ１）は、リンタングステン酸ナトリウムでネ ガティブ染色した像を示す。 第２図は、典型的なｄｄＣＴＰリポソーム調製物のサイズプロフィールを示す。 第３図は、ヒト免疫不全症ウィルスでの洗浄された単球の感染後のｐ２４発現の 時間的経過を示す。横棒は、４重の微量滴定プレートウェルの平均値の標準誤差 （Ｓ、Ｅ。 Ｍ）を表わす。 第４図は、４０　ｍＭ　ｄｄｅＴＰを含有するリポソームでのＨＩＶ感染ヒト単 球の処理後５，７．１０および１４日でのｇ　ｓ　図ａ、セファロース４Ｂゲル 濾過クロマトグラフイーを用いるリポソーム結合抗体から遊離抗体の分離を示す ０画分１１に集中する最初のｍＩのピークは結合ＩｇＧを表わす。 本発明の好ましい実施態様の詳細な記載本発明の上記のおよび種々のその他の目 的並びに利点は、レトロウィルス活性な部位への抗レトロウィルス剤を供給する 特有な方法によシ、そしてレトロウィルス逆転写酵素活性の活性阻害によるレト ロウィルスの複製を阻害するための、リポソーム内にカプセル化された有効量の 連鎖停止剤ホスホリル化ヌクレオシドおよび薬学的に許容性の担体からなる抗レ トロウィルス組成物によシ達成される。 特記しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発 明が属する分野の通常の熟練者の一人によシ一般に理解されるものと同じ意味を 有する０本明細書に記載されたものに類似するかまたは同等のあらゆる方法およ び材料が本発明の実施または試験において使用され得るけれども、好ましい方法 および材料を今記載する。下記の全ての刊行物は参照によシ本明細書内に編入さ れる。特記しない限シ、本明細書で使用される全ての技術は、この分野における 通常の熟練者の一人に十分に公知の標準的な方法論である。 本明細書で使用されるよりな゛抗レトロウィルスの。 試薬、薬剤、製剤、組成物およびその類似物という用語は、該試薬、製剤、組成 物およびその類似物が、感受性宿主におけるレトロウィルスの増殖または複製を 制御または阻害し得ることを意味し、レトロウィルス病原体の中でＨＩＶが最も 重要である。 本明細書で使用される°連鎖停止剤ホスホリル化ヌクレオシドまたは°連鎖停止 剤ヌクレオチド°とｂう用語は、その化合物には３′−ヒドロキシル部分が無い ことを意味し、それによシ該ホスホヌクレオシドの５′部位へのもう１つのヌク レオチドの付着が阻害され、結果として逆転写＃累（ＲＴ）の影響下でレトロウ ィルスＤＮＡ　ｄ伸長の終結を主する。 本発明の抗ウィルス剤は次式： （式中、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミンおよび煩似体からなる群 から選択されるか、または伸長するＤＮＡ鎖内に取込まれ得るそれらの誘導体ま たは塩を表わし： ＢはＨ、アジド基まだはもう１つのヌクレオチドの付着を阻害し、逆転写＃素の 影響下でレトロウィルスのＤＮＡ鎖伸長を妨害する基を表わし；そしてＰはモノ 、ジ、トリまたはその他のホスフェートのいずれかを表わす、）で表わされる。 一般式（１）で表わされる化合物が２′−デオキシヌクレオチドであるものが好 ましい、そのような連鎖停止剤ホス；ｔｌ＃化（）リホスフェートが好ましく） ヌクレオシドの代表例は以下の通シである： （ａ）　アジドチミジン５′−トリホスフェート（ｂ）　２’、５’−ジデオキ シシチジンー５′−トリホスフェート （ｃ）　２’、３’−ジデオキシアデノシンーダートリホスフェート （ｄ）　２’、５’−ジデオキシチミジン−５′−トリホスフェート （ｅ）　２’、３’−ジデオΦシグアノシンーダートリホスフェート。 Ｐはまたホスフェートよシ伏謝的によシ安定なものを含むその他のリン含有部分 を表わしても良い０代表例はメチルホスホネートおよびホスホロチオエートであ る。 予想され得ることに反して、非ホスホリル化ヌクレオシドそれ自体は、相当する ホスホリル化化合物に比べて本明細書に記載した供給系における抗レトロウイル ス剤として劣ることを、とこに記載することは重要である。 従って、例えば抗レトロ９イルス剤として現在利用できる未ホスホリル化アジド チミジンは劣り、そしてリポソームから実際に漏れ出る。 対照的に、ホスホリル化された特にトリホスフェート、連鎖停止剤ヌクレオシド の誘導体は、以下に説明する少なくとも３つの理由のために本発明に係るリポソ ーム製剤のためによシ有効であり、そして潰れている。 （ａ）トリホスフェートは、ヌクレオシドそれ自体に比べさらに水溶性であシ、 そして従ってよシ長くリポソーム内にカプセル化されたままで残る（下の実施例 １に記載のリポソームからの漏れ、４℃で１１／２＞６０時間）。 アジドチミジンは迅速にリポソームから放出され（同様のリポソームからの漏れ 、４℃でｔ　１／２　＜　２時間）、そして従ってリポソームの供給のための候 補として劣っている。 （ｂ））！Ｊホスフェートは細胞膜を容易に通過せず、従ってそれらは遊離薬剤 はど有用なものではない、しかしながら、細胞の細胞質内にリポソームから放出 されたホスホリル化薬剤の分子が外部媒体内に容易に流出しないであろうから、 そしてリポソームから細胞外に放出されたいくつかの薬剤は非特異的に細胞に容 易にはいシ込まないであろうから、それらがリポソームによシ細胞内に輸送され 得る々らば、上記の事実は選択性における利点を付与する。 （Ｃ）トリホスフェートは、ウィルスＲＴにより実際に識別され、そして伸長す るウィルスＤＮＡ　鎖内に取込まれる形態である。それ故に、遊離体で細胞には いり込むヌクレオシド類似体は、それらが鎖の伸長を停止させるように機能し得 る前に最初にホスホリル化されなければならない０種々のその他の代謝経路がホ スホリル化と競合するから、依然ホスホリル化される必要のある細胞の細胞質に はいり込むヌクレオシドの分子は、既にホスホリル化された分子よシウイルスに 対して効果が低いでおろう。 しかしながら、たとえリポソームがエンドサイト−シスにより取込まれたとして も、リポソーム内にカプセル化された抗ウィルス剤は、連鎖停止剤として作用す るように、細胞の細胞質へその活性な形態で放出され、そして利用可能になるで あろうと先験的に仮定することはできないと理解するべきである。 ７　／ｌ／　Ｗ　ン（Ｆｕｒｍａｎ　）等、１９８６　ＰＮＡＳ、８３：　８３ ３３−７は、ＡＺＴのトリホスフェ−）誘導体はＨＩＶ　ＲＴに結合すると報告 している。しかしながら、本明細書に記載された様に、トリホスホリル化ＡＺＴ の遊離体またはその他のそのような化合物は、細胞に容易にはいシ込まない、従 って、それらは°薬剤゛はど有効ではオシ得ない。 上記の特性および特徴に基づいて、実際の試験なしＫ、非ホスホリル化化合物に 対するホスホリル化連鎖停止剤ヌクレオシドの浸位性および利点は、先験的に推 定されるかまたは予測され得ないことは全く明らかである。さらに、従来技術に おいて、実際の試験を行なうことなしに、ホスホリル化連鎖停止剤ヌクレオシド から作られたリポソーム製剤の実際の抗レトロウイルス有効性を示唆したものは 何もない。 よく知られているように、リポソームはあらゆる非常に多くの標準法によ）形成 され得、そして非常に大きくても（最大約１００ミクロンまで）、または非常に 小さくても（最小的２５ｎｍまで）良い、　大きさは、細胞との相互作用の機碑 および生体分布の両方に影響する１例えば約８０ｎｍより小さいリポソームは、 リガンドを介して細胞表面上のレセプターまたは抗原に結合の後被榎ピッ）　（ ｃｏａｔｅｄ　ｐｉｔ　）　を通って細胞にはいり込むことができる。従ってリ ガンドが結合されるならばリポソームは小さい程好ましい。一方、リポソームが よシ大きいならば食菌作用が有利に働くであろう、生体分布に関して、約１００ ｎｃｏよシ小さいリポソームは、肝臓、牌臓および骨髄のよう゛な器官の湾曲し た裂は目を通過できるが、それ以上の粒子はできない。 もちろん、リポソームはまた多くの異なる組成物と共に形成されることもできる 。はとんどが二鎖リン脂質例エハホスフ了チジルコリンおよびスフィンゴミエリ ンに基づいている。リポソームはまたその他の脂質例えばコレステロール（脂質 構造に“強度”を付与するためにしばしば添加される）、ステアリルアミン（陽 電荷のために）、および負電荷のために種々のその他の脂質を包含しても良い。 最も慣用的に添加される論性の脂質は、ホスファチジルグリセロール、ホスファ チジルセリン、ジアセチルホスフェート、およびカルシオリピンである。 負電荷は食細胞によるリポソームの取込みの活性を高める傾向がある。ホスファ チジルセリンは特に、食細胞による認識のための特定の信号を構成すること、お よびそれらの細胞の活性化における役割を果たすことが報告されている。従って 、ホスファチジルセリンは、標的細胞が食細胞性または細胞内分裂性であるとき に、リポソーム内への包含には好ましいものであシ得る。 典型的には、水溶性物質のりポンーム形成およびカプセル化は、脂質を分散させ ること、薬剤を含有する溶液を添加すること、および脂質が該水溶液により有効 に水和されることを１笑にすることを含む、上記の工程は、もしあれば脂質混合 物の相転移を実行することは一般に必要である。′ｉた、リポソーム形成への別 のアプローチは、有機溶媒内での脂質の分散、コロイド懸濁液を形成するために 薬剤含有水溶液の添加、および薬剤を含有するリポソームを残すための有機溶媒 の除去を包含する。 これらの操作のいずれかの後に、リポソームは例えば超音波、小さいオリフィス を通す押出または適当な大きさの穴を有するフィルターを通す押出の方法によシ 小さい大きさに縮小させることができる。カプセル化されていないか、または遊 離薬剤は、カラムクロマトグラフィー、遠心分離、透析またはその同等のものに よシ外部溶液から通常除去される。もちろん、リポソームはまた凍結乾燥され、 そして形成後薬剤を詰めることもできる。 以下の実施例は、抗レトロウィルス剤としてジデオキシトリホスフェートを使用 する本発明の好ましい実施態様を説明する。それらはホスホリル化されていない 形はど容易には細胞にはいり込まないから、そのような化合物は通常では有効な °薬剤°として見なされな込であろうことを強調する；しかしながら、そのよう な化合物に本発明に係るリポソームを介して供給されるときレトロウィルスに対 して有効な薬剤である。 リポソームの形成に使用される材料は以下のものだったニジバルミトイルホスフ ァチジルコリン（ＤＰ、ＰＣ）およびジパルミトイルホスファチジルグリセロー ル（ＤＰＰＧ）をアパンチ　バイオケミカルズ（Ａｖａｎｔｉ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ　）（アメリカ合衆国、アラバマ州、バーミンガム）から入手し、第 一標準コレスチロールをイーストマン　コダック（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ 　）　（７メリ力合衆国、ニューヨーク州、口ｆニスター）かｌ、、１４Ｃ−コ レステリルオレエート（即チ、コレステリル−（ｉ　）　１４Ｃ−オレエート） ヲニューイングランド　ヌクレアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ 　）　（７メリ力合衆国、マプチーーセッツ州、ビレリカ）から、そして２／　 、　ｓ／−ジデオキシシチジンーヒートリホスフエー）　（ｄｄｅＴＰ）を７７ 　＃　？　シフ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　（７メリ力合衆国、ニューシャー シー州、ビス力タウエイ）から入手した。 ＤＰＰＣ（６２，５岬）、ＤＰＰＧ　（１２，５■）、　コレステロール（２ｔ ３４）、および１４Ｃ−コレステリルオレエート（α１２５μＣｉ　）を、窒素 ガス流下、ガラスビンの壁土クロロホルムで乾燥させた。高真空下凍結乾燥機で 数時間によジクロロホルムの最後の除去を行った。滅菌蒸留水ＣＬ６ｍｌおよび 滅菌リン酸緩衝液［１６ｍでジデオキシシチジン６０マイクロ の溶液を製造した，ｄｄｅＴＰＯ最終濃度は４　０　ｍＭだった。 次にｄｄＣＴＰ溶液１ｄを、酸素除外のために窒素ガスを流したガラスビンに添 加した．そのビンを４５℃に肌熱し、そして断続的に渦巻状に混合（５ｘ１５秒 間）しながら、その温度に１５分間保った．リポソーム懸濁液を次にプラスチッ ク製りリオチ為−ブに移し、そして液体窒素および３７℃　の水浴を用いて凍結 −融解サイクルを５回行なった．ＬＬ４ミクロンポリカーボネートフィルターを ２つ備えたエクストルーダー（　Ｅｘｔｒｕｄｅｒ　）　（リペックス　バイオ メンブランズ社（　Ｌｉｐｅｘ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，　Ｉｎｃ，χカナ ダ国、プリテッシェ＝コロンビア州、バンク−バー〕で懸濁液に強制的に平方イ ンチ当たり２００−７００　ボンドの圧力をかけた．この押出工程を常に約４５ ℃（脂質の転移温度以上）で１０回行った．リン酸緩衝液をｄｄｃＴＰ溶液の代 わりとしたことを除いて同僚に°空の″リポソームを製造した，ｄｄｃＴＰ−リ ポソームの場合には、２回交換するリン酸緩衝液に対して一晩透析することによ シ遊離薬剤を除去した．その他の同様の実験において、遊離ｄｄＣＴＰはサイズ 排除カラムクロマトグラフィーにより除去された。 その他の好ましい連鎖停止剤ホスホリル化ヌクレオシドを含有するリポソームを 同様の方法で製造した。 リポソームの特徴づけ 調製物中の脂質の童を、標準ベータ計測シンチレーシヲン液体内の１４０計数（ 　１４Ｃ−コレステリルオレエート）から決定した，　ｄｄＣＴＰの量を２８０ ｎｍでの光学濃度から決めた．光学濃度を読むための試料を、試料α５ｄに６５ ：２５クロロホルムエタノール溶液［１９ｍを添加することにより調製した．こ のことは、そうしなければ脂質粒子の存在から生じたであろう光散乱を除去した ．ネガティブ染色電子顕微鏡検量は，グロー放電フォームバ−−カーボン被覆グ リッドおよびリンタングステン酸ナトリウムを用すて行われた。リポソームから ｄｄＣＴＰ　の放出は、リン酸緩衝液に対する試料の透析によシ評価された。　 ｄｄｅＴＰの完全さは高性能グラジェント溶離アニオン交換クロマトグラフィー によシ評価された。 試験管内での毒性および抗ウイルス作用慢性的にＨＩＶを産生ずる２つのタイプ の細胞に関するリポソームの毒性作用を試験した。１つのクローン（ＪＥ６）を リンパ細胞系Ａ、３（Ｎから誘導し；その他のクローン（Ｕ、　１　）を前単球 系Ｕ９３７から誘導した。１０チクシ胎児血清を有するＲＰＭＩ培地中のｊｌａ 　ｍ　（１ｘ　１ｏａ７クエル）を平底９６ウ工ル微量滴定グレート内ニピペッ トで入れた。　ｄｄｃＴＰ−リポソーム、　をリポソーム、遊離ｄｄｃＴＰまた はりン款緩衝液を含有する溶液５０μｊを各ウェルに添加した。ホルボールミリ スチルアセテート（ＰＭＡ）５０μｌを次に各ウェルに開数のために１０″Ｍ。 の最終濃度まで添加するか、さもなければ非刺激形態には塩溶液５０μｌを添加 した。　プレートを７　％　ＣＯ，中３７℃で約４８時間培養した。上１１００ μｌを各ウェルから取シ、ポリアデニレートおよびオリゴデオキシチミジンを用 いて逆転写酵素（ＲＴ　）活性を分析した。　ＲＴアッセイを行なうために、Ｒ Ｔを含有する上清１０μｔをポリＡ、オリゴｄＴ（ファルマシア社、アメリカ合 衆国、二凰−ジャージー州、ビスカタウエイ）　Ｍｇｃ／！、および”Ｐ−ｄＴ ＴＰ　（ア−ｖ　Ａ／　シａｙ　Ａ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）　）を含有するカ クテルに添加し、３７℃で２時間培養した。このカクテル１０μｌを次いでＤＥ １３１紙上にスポットし、乾燥させ、セして１×クエン酸ナトリウム緩衝液中で 洗浄した。 この紙を次に乾燥させ、切り、そしてペックマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ　）　ＬＳ 　７０００シンチレーシｌンカウンターで計測した。 各ウェル中の残りの１００μｌ内の細胞を激しく慇濁し、そして試料５０μｌを 次に新しいプレートの相当するウェルに移した。新しいプレート内の各ウェルに 新鮮培地５０μｌおよびＩＨ−チミジン２０μｌを添加した。プレートを７　％ 　ＣＯ，中３７℃で約４時間培養し、集め、洗浄し、そして３Ｈ−チミジンの取 込みを計測した。 リポソームの特徴づけ 上記操作は全ｄｄＣＴＰの９チをトラップし、そして計算された捕捉は２．６μ ｌ／μＭ＠質だった。４℃での流出のＴ１／２は〉６０時間だった。ネガティブ 染色電子顕微鏡検量は、最大値約ｃＬ４ミクロンの範囲に及んで変化する大きさ のリポソームを示した（第１図）、ａａｃ’ｒｐはは使用前のＨＰＬＣによシワ ９チの純度だった。 毒　性ニ トリチウムを入れたチミジンの取込みは、リンパ球（８，Ｅ６　）および前単球 （Ｕ、１）クローンに関するｄｄｃＴＰリボンームの毒性作用を評価するために 用いられた。結果を第１表に示す、遊＠　ｄｄＣＴＰ　、空すボンームまたはｄ ｄＣＴＰ−リポソームを有するいずれの細胞タイプにも、該細胞をＰＭＡで刺激 したか否かにかかわらず、顕著な毒性作用は認められなかった。トリパンブルー 排除試験により判断すると、細胞は全ての投与量で９０−以上生き残っていた。 第　１　表 薬剤なし：　α０齢　１００　８０　１００　８５ｄｄＣＴＰ−１α０　１００ 　８０　８０　８５α０１　１１８　７７　１１２　８７ ｄｄＣＴＰ：　１［ｌＬｏ　９６　７５　１６２１０７１．０　１０１　１０５ 　１００　９６α１　７９　９９　１１２　９７ α０１　９０　９９　１１５　７８ α１　８２　１１５　９９１１５ α０１　１１５　８７　８４１１７ −ＰＭＡ：ホルボールミリスチルアセテート・・マイクログラム／ｄでのｄｄＣ ＴＰ投与量（または空のリポソーム脂質中の当り。各数値は、薬剤も刺激も有し ない対照に対する、２重の測定の平均値を表わす。 抗ウィルス作用 第２表はＰＭＡ刺激の不在下８．Ｅ６およびＵ、１細胞に関するＢＴアッセイの 結果を示す、　ｄｄｃＴＰ−リポソームは実質的に試験された全ての投与量で凡 Ｔ活性を阻害し、一方ｄｄＣＴＰおよび空のリポソームは非常に低い作用を示し た。 第　２　表 ジデオキシシチジントリポスフエートを含有するリポソームによるｔＪ、１細胞 中のＨＩＶ逆転写酵素活性の阻害投与量−ｄｄｅ’ｌ”Ｐ−リポソーム　空のリ ポソーム　遊離ｄｄＣＴＰ１α０２９−）−／−８％ｔｈ自　８７−）−／べ一 ６チ　６９＋／−２１チ１．０　１９＋／−２８２＋／−１７６１＋／−４（Ｌ ｌ　２７＋／−１０８０＋／−１５８０＋／−１２１０１２６＋μｃＬ２　６Ｂ ＋７−５８　６７＋／−１９・マイクログラム／ｄでのｄｄＣＴＰ投与量（また は空のリボリーム脂質中の当量） ・・薬剤のない対照に対する百分率（２重の測定値の平均、士標準偏差）　、　 ｄｄＣＴＰ−ＩＪボンームに対する集合平均は、２−テール（ｔｗｏ−１ａｉｌ 　）　ステー−プントのｔ検定および比例誤差モデル（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａ ｌ　ｅｒｒｏｒｍｏｄｅｌ　）を用いて、空のリポソーム（ｐく、α１）のもの および遊離ｄｄｅＴＰ　（ｐ＜、０１　）のものと著しく異なる。 ｔ４３表は１ｏ−Ｉ　Ｍ　ＰＭＡによシ刺激されたＵ、１　細胞に関するＲＴア ッセイの結果を示す。ｄｄｅＴＰを含有するリポソームの全てのレベルで実質的 な阻害が見られる。 第　３　表 ジデオキシシチジントリホスフェートを含有するリポソームによるＰＭＡ刺激Ｕ 、ＩＭＥ胞中のＨＩＭ逆転写酵素活性の阻害 投与量−ｄｄｃＴＰ−リポソーム　空のリポソーム　遊ｆＥｄｄＣＴＰ１［Ｌｏ 　５３％”　ＮＤ　７５％ １．０　５５　９６　７５ α１　５８　９５　９６ αＯｆ　５１　１１０　８４ °０空のリポソーム対照の平均により正規化された百分率。各数値は二重の測定 値の平均値である。この実験において細胞を１　ｎＭ　ＰＭＡで刺激した。ｄｄ ｅＴＰ−リポソームに対する集合平均は、２−テールスチェーデントのｔ検定お よび比例誤差モデルを用いて、空のリポソーム（ｐ＜α０１）のものおよび遊離 ｄ　ｄｃＴＰ（ｐ＜α０１）のものと著しく異なる。 ＮＤ＝試験しなかった。 大きい多重膜リポソームを上記のように製造するが、しかし以下の変更をした： 組成は　ＤＰＰＣ（１５０〜）、ＤＰＰＧ　（ａ　ｏ■）およびコレステロール （６０Ｗｉ）だった。 ｄｄＣＴＰ　（４０マイクロモル）を滅菌蒸留水中で水和し、脂質に添加した。 Ｉｌ！！！Ｓ液にアルゴンガスを流し、５０ｍ：まで周熱し、そして２時間の間 断萩的に渦巻状に混合した。次いで懸濁液をカップ−ホーン　ノニケーター（Ｃ ｕｐ−ｈｏｒｎ　５ｏｎｉｃａｔｏｒ　）　［ヒート　システムズ　ウルトラソ エックス社（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ、　Ｉｎｃ、 ）、　アメリカ合衆国、ニューヨーク州、プレインビュー）１１いて５−８分間 超音波処理した。この操作は、サイズ排除カラムでの溶出によシ決定されるよう に、ｄｄｃＴＰ約５５チをトラップした。をのリポソームはｄｄｃＴＰ溶液をリ ン酸緩衝液に代えることによシ同様に製造された。庄体内での実験のために、遊 離薬剤を除去しなかった。 毒性試験のために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのメスの（１Ｂ−１９ｇｍ）マウスを用い た。第０８目に始めて、マウス（１群当たシ５匹）にベンドパルビタールで麻酔 をして２−５日毎に５週間ｄｄｃＴＰ　Ｉｊメタノール静脈注射した。その注射 液は注射１本当たシｄｄｃＴＰ　（約３５％　トラップされた）７１８μ９およ び脂質１２−５ｗＩを含有していた。その他の群の５匹のマウスはリン酸緩衝液 を与えられた。 幾皿かのマウスをＬＰ　−ＢＭ　５マウス白血病ウイルスの腹腔的注射により第 ０８目に感染させた〔モジアー（Ｍｏｓｉｅｒ）等、Ｊ、ＥＸｐｏＭｅｄ、１６ １ニア６６−７８４（１９８５））、Ｌかしながら、これには実験の期間の体重 また＃ｉ庄き残シに関する独立した影響がなかった。第４表に示す結果は、体重 数値または死亡率に関してｄ　ｄ　ＣＴＰリボノームに原因を帰し得る顕著な毒 性を示していない、　ｄｄｅＴＰ　Ｏ投与量１１５および１／２５で注射された その他の群の５匹のマウス（表示せず）も同様に毒性の欠如を示した。 第　４　表 マウスに注射されたｄ　ｄ　ＣＴＰリポソームの毒性の欠如０　１ａ７＋／−α ９　１７．９　＋／−Ｌ３　１１１ＬＯ＋／−１，６２１＆？＋／−Ｉ１６　１ ９．２＋／−Ｌ５　１９．１−）−／−１，６４１９，３＋／〜α８　１９．３ ＋／−ｔ４　１９．２＋／−１，４６１９６＋／−α８　１９．０＋／−１，３ １９，０＋／−１，１８２［Ｌ２＋／−（１８，１＆９＋／−１，４１９，１− １−／−１，４１Ｓ　２［Ｌ２　＋／−α９　１９．２＋／−１，４１９，５＋ ／−１，３１９２ＣＬ８＋／−１１８１９，１＋／−ｔ７　１９．９＋／−１， ５１注射および感染後の日数（ｎ＝５．群当たシ）°°各注射液は５０μｌ中に 総脂質１２．５ｗＩｇ、カプセル化ｄｄｅ’ＴＰ　２５１μｉおよび遊離ｄｄＣ ＴＰ　４６７μｇを含有してｂた。動物は２−３日毎に注射された。体重曲線に 顕著な差異は見られなかった。実験の条件下で、感染は体重に著しく影響を及ぼ すと考えられなかった。 卵黄ホスファチジルコリン（ＲＰＣ）およびウシ脳ホスフ丁チジルセリン（ｐｓ ）はアバンチ　バイオケミカルズ（Ａｖａｎｔｉ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　 ）　（アメリカ合衆国、アラバマ州、バーミンガム）から得られた。薄層クロマ トグラフィー（クロロホルム：メタノール：水６５：２５；４で溶出）では２０ ０μｉの童ではつきシした不純物が現われなかっり、コレステロール　１４Ｃ− コレステリルオレエートおよびｄｄｃＴＰは実施例１と同じ供給源から得られた 。 ＶＹＤＡＣｓｏｓ　ＮＴ４ｏｓ　ヌクレオチドカラム〔じバレーシｌンズ　グル ープ（５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ　）、アメリカ合衆国、カリフォル ニア、ヘスペリア〕での溶出によシｄｄＣＴＰは９８チ以上の純度（０，Ｄ、２ ６８に関して）であることが解った０部分的に精製した５、６一ジｍＨ−２’。 ３′−ジデオキシシチジンーダートリホスフェート（３）１−ｄｄＣＴＰ）はモ ラベック　バイオケミｆ２ルズ（ＭｏｒａｖｅｃｋＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　 ）　（アメリカ合衆国、カリ７１　ｋ　ニア州、プレア）から得られた。トリチ ウムを入れたストックの一部を使用前にヌクレオチドカラムで精製した。 ＥＰＣ（５＆５ｙ）、ＰＳ（２ａｓｑ）、コＶ　Ｘ　テロ−５ｒ（３五４■）お よび１４ｃｍコレステリルオレエート（（１１２５μＣｉ）を、窒素ガス流下ガ ラスビンの壁土クロロホルムで乾燥させた。　＄Ｈ−ｄｄｃＴＰ　（通常２μＣ ｉ）を放射活性トレーツーとして作用するｄｄｅＴＰストックに添加した以外は 実施例１に記載したように、水利、渦巻状混合、凍結−融解フイクルおよびポリ カーボネートフィルターを通す押出によシ、４または４０　ｍＭ　ｄｄｃＴＰを 含有するリポソームを製造した。ゲル濾過カラムクロマトグラフィーまたはセフ 丁デツクス０２５Ｍ（ファルマシア）ヲ含む小カラムの遠心分離、そして引き続 きフライ（Ｆｒｙ）等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、９０　：８０９−８１５　 、１９７８に記載されたような標準法によシカプセル化されていないｄｄｅ’） Ｐを除去した。 工程の特徴づけ 調製物中の脂質およびｄｄｃＴＰＯ童を夫々１４ＣおよびｓＨ計測から計算した 。カプセル化は一般にｔ５−２マイクロリットル／−イクロモルＥＰＣの範囲内 だった。　リポソームの大きさの分布は、ＮａＭＤマルチブルーアングル　サブ ミクロン　パーティクル　サイズ　アナライザー（アメリカ合衆国、フロリダ州 、Ｉ・イアレーア）を用いる準弾性元散乱（ＱＥＬＳ　）によシ決定された。第 ２図は、約２週間リン酸緩衝液中４℃で貯蔵した典型的な調製物の大きさ分布を 示す、プロフィールは新鮮な調製物のものと実質的に同一だった０重量平均直径 は、約１１００ｎの変動係数で約２１５ｎｍだった。 時間の関数としてのリポソーム内容物の放出は、セントリフリー　フィルターズ （Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ−４：Ｉ↑ｅｒ３−人）〔アミコン（Ａｍ１ｃｏｎ　） 、アメリカ台木１、マサチューセッツ州、ダンバース〕を通す遊＠　ｄｄＣＴＰ の遠心溶離によシ評価された。典型的には、懸濁液１００μ／　１５００Ｇで約 １０分間遠心分離し、更にリン酸緩衝液１００μｌを添カロし、フィルターを再 び１０分間回転させた。プールされたＦ液の３Ｈ−ｄ　ｄＣＴＰを計測し、遊離 された薬剤を決定し、そしてフィルターそれ自体も同様に計測し、質量平衡を確 立した。極〈少量の１４Ｃ−コレステリルオレエートがＰ液にいつも見い出され たが、これはリポソーム脂質がフィルターを通過しなかったことを示す。これら の研究、並びに実施例１に記載したような透析実験は、普通のリポソーム貯蔵（ リン酸緩′＠液中４℃）の条件下での極〈少量の漏れを示す、以下のウィルスの 実験のそれらをまねた条件下、ＲＤち９６平底ウエルを有する組織培養プレート 〔コスタ−（Ｃｏ５ｔａｒ　）、アメリカ台木１、マサチューセッツ州、ケンブ リッジ〕内のゲンタマイシン、グルタミンおよび１０チクシ胎児血清で補足した ダルベツコの最小イーグル培地（ＤＭＥＭ−ＧＣ−Ｆｅ２）　中でＣＯ，インキ エベーター内３７℃でも漏れ試験を行った。 結果を第５表に示す、付着性単球の存在下または不在下７２時間の間に極〈少量 のｄｄｃＴＰ漏れが観察された。 対照的に、５０チのｄｄｅが１時間以内に放出され、そして９５チが４時間以内 に放出された。これらの結果は、ヌクレオシドそれ自体（ｄｄｅ　）がホスホリ ル化された形のもの程すボンーム内へのカプセル化に適しているものではないこ とを明らかに示す。 第　５　表 付着性のヒト半球の存在下および不在下でのリポソームかＩ、　ｄｄＣＴＰおよ びｄｄＣの５７℃での漏れ０　８４．４　８ａ６　５’Ｌ７　５ＥＬ５α１６Ｅ １８　７４．５　６１４　５ａ７α５２　８４．４　７ａ５　５α９４ａ７１　 ７ａＯ７７，２３１２５０，５ ２８五３　８２．１　１９．２　２五〇４　１１９　７ａ５　１歳４＆６ ２４　７五９　８１．７　９．５　７．５４８　６ａ０　７５．７　４．８　４ ４７２　７ａ４　８７．４　ａＱ ヒト末梢血液単核細胞を、ウオール（Ｗａｈｌ）等、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、　８５　：　３７３−３８３　（１９８４）　に記載さされたような 連続フロー細胞分離（白血球搬出）を用いる標準法によシ得た。調製物をリン酸 緩衝液中に希釈し、そしてフィコール−パーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ　） 　［７丁Ａ／　マシアーピーエル　バイオケミカルズ（ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｐ ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）、アメリカ合衆国、二瓢−ジャージー州、ピス カタウエイ〕のグラジェント上に載せた。遠心分離後、単核細胞を界面からピペ ットで吸い取り、洗浄し、セしてＤＭＥＭ−ＧＧ−Ｆｅ２中に懸濁した。それら を次に向ｒ！Ｌ遠心分離エルトリエージ！１　ン（ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎ ｔ　ｃａｎｔｒｉｆｕ−ｇａｌ　ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ　）により分画した。 操作はＪ−２１ペックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ　）遠心分離機、ＪＥ−６エルトリ エータ−、ストロボスコープ、並びにマスターフレックス（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅ ｘ　）　ポンプおよびポンプヘッドを含むペックマンエルトリエージ冒ンシステ ムかラナル、ａｌｌ’４ｔ−ｔ’−タ内に入れ、そして流れ速度を増加させて溶 出により分画した。高度に単球に冨む画分７と８を使用のためにプールした。 空のリポソーム、ｄｄＣＴＰ−リポソーム、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＣＴＰ＋空の リポソームは５つの異なる単球機能＝（１）　カンジダ　フルビカ：／　ス（Ｃ ａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　）　の溶菌百分率； （１）　グロスタグランジンＥ、の生成；および（叫　スーツく一オ＊　シ）’ ノ生ｇ　（ｔ　：ｔ　−ル（Ｗａｈｌ　）等Ｃｅｌ　１ｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ　。 ＢＳ：５Ｂ４−５９５　（１９８４））　に関するそれらの作用に対し全て試験 された。空のリポソーム、ｄｄｃＴＰ−リボン−ム、遊離ｄｄｃＴＰまたはｄｄ 　ＣＴＰ＋空のリポソームに対し一致した作用は見られなかった。第６表はスー ツ（−オキシド生成に関する作用の欠如を示す、ホルボールミリスチルアセテ− ）（ＰＭＡ）は陽性の対照として用いた。 培養の結果としてのトリバンプルー侵入または細胞数に関する明白な作用は無か った。 第　６　表 ｄｄＣＴＰリボンーム、空のリポソーム・遊離ｄｄｃＴＰおよびｄｄｃＴＰ＋空 のリポソームと処理した単球によるスーパーオキシド生成 対照　α６２（，０８）　ｃＬ７１（，１２）　（１８９（，１２）　ＣＬ８９ （，１３）０　１．１１（，０６）　１．０８（、Ｏ５）　１．１９（，０６） 　１．４６（，０３）、０１８　α９９（，０４）　１．２４（，０４）　１． ３３（，０５）　１．２７（，０８）、０９　ｔ１９（，１１）　Ｌ１７（，１ ０）　１．４２（，１０）　１．２７（，０８）、４５　ｔ０２（，０５）　ｔ ２７（，１３）　１．３３（，０８）　ｔ２３（，０６）１２　ＣＬ８３（，０ ７）　ｔ２７（，０５）　１．２１（，０２）　ｔ８１（，１３）１１　１．２ １（，０８）　α９９（，０２）　α８５（，０４）　１．３５（，０６）５６ 　ｔ３４（，０４）　１．１４（，０４）　α７７（，０４）　ｔ６０（，１０ ）ＰＭＡ　ｘ２ｓ（、ａ９）　五３０（，１２）　ム２６（，０５）　五４６（ ，１２）ＰＭＡ　：ホルボールミリスチルアセテート処理（陽性対照）、　カッ コ内は平均値の標準誤差。 単球による脂質およびｄｄｅＴＰＯ取込み細胞による小泡内容物の取込みの指標 として３Ｈ−デオキシシチジントリホスフェート（３Ｈ−ｄｃＴＰ　）の取込み を用いた。６−ウェル微量滴定プレート（コスタ−）の各ウェルに５ｘ１ｏｓ個 の単球をブレーティングし、そして１もしくは２日後に試薬を添加することによ シ取込み実験を行った。培養をＤＭＥＮｉ−ＧＧ−ＦＣ８中３７℃で行った。 細胞内のｄｃＴＰ含量の増加速度は９時間の間（第７表）、４　ｍＭ　ＲＰＣを 含有するリボン−ムチ平均Ｉ１２９ｐｍｏｌ／ミリオン細胞／時間だった。１４ ｃ脂質マーカーの取込みを第８表に示す、その他の実験はｄｄＣＴＰおよびｄ　 ｄ　ｅＭＰは容易に？−８胞によシ取込まれないことを確立した（第９表）。 第７表 付着性ヒト単球によるリポソーム−カプセル化ｄＣＴＰα１ｍＭ　ＥＰＣ，２４ ，５ｕＭｄＣＴＰ、４　ｍＭｄｃＴＰ内部リポソーム、１４３　ｍｍｏｌ　ｄｃ ＴＰ／ｍｏｌ　ＥＰＣ第　８　表 ３７℃での付着性ヒト単球によるリポソームの取込みＲＰＣ濃度 時間（ｈ）　ｐｍｏｌ脂質／１００万個細胞６　１α（１２９，９ 抗ウイルス活性に関する研究のものをまねた条件下１０チＦＣ８中で試験を行っ た。 第　９　表 ３７℃での付着性ヒト単球によるジデオキシヌクレオチドの取込み （Ｌ　（Ｌ１５　ｃＬ２１　ＣＬ１５　（ＬＯ７ＣｌＯ２（ＬＯｌ　１０５　Ｃ ｌＯ２ＣＬＯ３邸３　α０９　α０７　α０５　α１８　α００　αＯＯα０１ 　α０１　α０１ｔｏｏ　ｒ：Ｌ０９　ａｌｏ　（ＬＯ６凹２　（１１６（ＬＯ ９（１１９ＣｌＯ２１１１０３（１１１五〇〇　α１１　（Ｌｌｌ　α０６　α ０８　α０４　α０２　α４３　１Ｌ１７　α１０　α１３＆００　ω３　α０ ８　α０５　（Ｌ２０　［１０１α０１　１．５０　α０６　α０３　凹６９０ ０　α４３１・９０　（Ｌ５１ ２１１ｏＯα６６　（Ｌ８１　凹７ 薬剤の濃度は１　ｕＭだった。 ＤＰＭ　＝　１００　ｕＭジビリタモル平均、ＳＤおよび８Ｅは３回の繰返しか ら計算された。 取込みの形態学は、顕微鏡スライドチャンバー内で細胞を成長させ、そして上記 のように作られたが、しかし約１モルチ螢光脂質を添加したリポソームと共に培 養することにより評価された。螢光脂質は、Ｎ−（リスサミンローダミンＢスル ホニル）−ホスファチジルエタノールアミンまたはＮ−フルオロセインーホスフ 了チジルーエタノールアミンのいずれかだった。３７℃でリポソームとの培養後 、細胞は表面染色を示し、そしてまたエンドサイト−シスされた物質を示唆する 内部螢光果合体を遊離ｄｄＣＴＰを抗ウイルス試験をまねた条件下ＤＭＥＭ−Ｇ Ｇ−ＦＣ８中に置いた時、それは２時間以内でｄ　ｄ　ｅＭＰに大部分変換し、 そして６時間で２３チｄｄＣだった（第１０表）、培地中に置いたｄｄｅＭＰは ７２時間以内に９３チ変換された（第１１表）、同じ培養が単球の不在下で行わ れた時、結果は実質的に同一だった。これらの発見は、薬剤が遊離の形態で培地 に添加されるならば避けられないであろう代謝変換からリポソームは薬剤を保護 することを示す。 第１０表 １０％ウシ胎児血清中３７℃でのｄｄＣＴＰの代謝・・・ｍ胞なし・・・　・・ ・細胞あり・・・呟（ｈ）　ｄｄＣＴＰ　ｄｄｃＭＰ　ｄｄＣｄｄＣＴＰ　ｄｄ ｃＭＰ　ｄｄＣα５　３９．６　３ａ８　１五６　６７．８　３２．２　０［１ ７５２α３７＆４　五８′５α２　６４．５　１．７ｔ５　１９．５　７５．４ 　１６　１４．４　７五２＆５４　２．７　Ｂ４．５　１ｔ５　１．４　Ｅ１６ 　１２６　α６　７ａ５　２ａ７　１．４　；”Ｌ３　２五１抗ウイルス試験の ものをまねた条件下で研究を行った。 ｄｄｅＭＰ　＋ジデオキシシチジンモノホスフェート、データの数値はＶＹＤＡ Ｃヌクレオチドカラムでのグラジェント溶出からのＨＰＬＣピークの総和を表わ す。 第１１表 １０チウシ胎児血清中３７℃でのｄｄｅＴＰの代謝・・・細胞なし・・・　・・ ・細胞あり・・・喋（ｈ）　ｄｄｃＴＰ　ｄｄＣＭＰ　ｄｄＣｄｄｃＴＰ　ｄｄ Ｃ八正へｄＣＩ１５　０　９９．２　α８　０　９９．７　（Ｌ３（１７５０９ ９，７Ｉ１３　五１　９９．９　０１．５　０　９＆５　１．５　１．３　９ａ １　α６４　０　８９．９　１α１　０　９１０　α０６　０　６＆３　２４． ８　０　７α２２９８７２　０　７．７　９２．！１　０　７．３　９２．７抗 ウイルス試験のものをまねた条件下で研究を行った。 ｄｄｅＭＰ　ニジデオキシシチジンモノホスフェート・データの数値はＶＹＤＡ Ｃヌクレオチドカラムでのグラジェント溶出からのＨＰＬＣビークの総和を表わ す。 単球内でのＨＩＶ増殖の阻害 洗浄した単球を単球／ＨＩＶ−１のマクロファージ誘導株（Ｂａ−Ｌ）　で感染 させ、洗浄し、そしてプラスチック製組織培養ウェル中に設置した。それらを次 に１．３．５および７日目にｄｄｃＴＰ−リポソーム、空のリポソーム、遊離ｄ ｄｃＴＰ　、または空のリボンーム＋遊除ｄｄＣＴＰで処理した。上澄の試料を ３．５，７，１０，１４．１７および２１日目に果め、そしてトライトン×１０ ０界面活性剤で不活性化した。この試料をエリザアッセイ〔デュポン（Ｄｕｐｏ ｎｔ　）、アメリカ合衆国、プラクエア州、９イルミントン〕を用いてＨＩＶｐ ２４抗原に対して測定した。抗体被覆プレートを室温（約２２−２５℃）で試料 と共に培養し、そして第２層検出工程を５７℃で１時間行った。このアッセイの 非直線範囲の濃度を読みとるために、基質添加の後並びに硫酸での反応停止の後 に、ＯＤＡ９０ｎｍの読みを時間の関数として取った。対照実験は、ｐ２４の上 清濃度の増加を伴って、細胞の感染を示した（第５図）。 ｇ　４　図ハｄｄＣＴＰ　ｌｊポソームの結果を示す、　ｄｄＣＴＰ　ｌｊボン ームは、６２．５０Ｍ薬剤薬剤で）９０％　ｐ２４　発現を阻害した。空のリポ ソームは、６４倍高い脂質濃度でさえも効果がほとんどまたは全くなかった。従 って脂質それ自体は観察された活性に関与し得な−、遊離ｄｄＣＴＰおよびｄｄ ＣＴＰ＋リボンームは同様の濃度で活性だった。 用いられた実験条件下、６時間でそれらの含量のく１０チのリポソームを放出し 、そして２４時間でく２０チ　を放出するという観察は、薬剤がリポソームから 漏れ出、数日かかってｄｄｅに変換し、そして細胞により遊離体で取込まれると いう可能性に相対するものである。もしそれが活性の機構であったなら、リポソ ームｄｄｃＴＰの有効性の著しい遅延が予測されたであろう、そのような遅延は 観察されなかった。 従って、ここに示されたデータは、明らかな副作用または毒性なしにＨＩＶに対 して本発明のリポソーム製剤の有効性を明らかに示す０本発明のリポソーム製剤 の選択性をさらに高めるために、リポソームと結合されている、ＣＤ４またはウ ィルス（それらのエピトープはウィルス複製サイクルの間少なくとも同じ点で宿 主細胞の表面に暴露されている）のコートポリタンパク質のいずれかに対する抗 体または抗体断片を含む特異的リガンドもまたもちろん使用し得る。さらにウィ ルスコートタンパク質またはそれらの断片、例えばＴペプチドまたはその類似物 の１つがリガンドとして使用され得る。 そのような結合体を製造する技術は、決まシきっており、この分野で十分公知で ある。そのように製造された場合、本発明の製剤は、レトロウィルスの伍き残シ を形成する細胞内分裂細胞および食菌細胞または適当なリガンドと結合されてい るならばＣＤａ陽性リンパ球およびその類似物のいずれかに自然に方向づけられ 、そして有効投与量で供給され得る。 冥　施　例　３ 抗体産生ｄｄＣＴＰ−リボンーム 上記のように、抗体は特定の細胞タイプとの相互作用に対するリポソームを標的 とするだめに用いられ得る。 〔ヴアインシュタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ　）等Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｏｐｈ ｙｓ。 Ａｃｔａ　５０９：２７２−２８８（１９７Ｂ））、ｘイズに関連して、それは ＣＤ４およびクラスｌ抗原（ＨＩＶ結合部位の部分として）、ｇｐ１２０　（ウ ィルスの外部のコートタンパク質”）、　ｙｐ４１　（ウィルスの内部のコート タンパク質）、およびウィルスまたは宿主細胞のいずれかに特徴的なその他の抗 原決定基を標的とするために有用であろう、それはまたＦｃレセプターおよびオ プンニ〉化粒子の取込みのための単球およびマクロファージに関連するその他の レセプターを標的とするために有用であろう、これは、これらの細胞においてウ ィルスの成長を阻害する連鎖停止剤を含有するりボンームの効果を高め得る。従 って、マウスＩｇＧ（Ｆｃタンパク質を含有する）をリポソームに付着させるこ とによシＦＣレセプターは標的とされた。 もちろん、同一目的を達成するために、Ｆｃドメインまたはそれらの部分だけを 付着することも可能であろう。 抗体産生リポソームを製造するために、レーザーマン（Ｌｅｓｅｒｍａｎ　）等 〔ネーｆヤ−（Ｎａｔｕｒｅ）２８８　：６０２−ｂａａ　（１９８０））によ る記載の方法の変法を用いた・研究のために選ばれた抗体は３６−７−５．）（ −２にと反応性のマウスエｇＧ２ａだった。その目的は、単球系統およびその他 の細胞タイプに関するｐｃレセプターによる取込みのためにリポソームを°オプ ンニン化９することである。 アメリカ合衆国、アラバマ州、バ、−ミンガムのアノ（ンチ（、Ａｖａｎｔｉ　 ）から得られるへ−（４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル〕ホスファチジ ルエタノールアミン（ＭＰＢ−ＰＥ：　マットヘイ（Ｍａｔｔｈａｙ　）等、Ｃ ａ　Ｒｅｓ、４４　：１８８０−１８８６　（１９８４））５モルチを添加した 他は実施例２と実質的に同じ方法でリポソームを裏道した。最終的す組成は、Ｅ ＰＣ（４ａ５Ｈり、ｔ　’７　Ｐａ（２ＥＬ８！　）、　コレステｏ　−ル（５ １４ｗｉ　）、ＭＰＢ−ＰＥ（９，５ｑ）、１４ｃ　−コレステリルオレエー） 　（２００μＣ１）７’ｒ：つた。１ｄシリ？ジ内に充填されたセファデックス Ｇ２５のカラム上でのゲル濾過により遊離ｄｄＣＴＰを分離した。５６−７−５ 抗体の試料をｌｕ工で標準ヨードーゲン（Ｉｏｄｏ−ｇｅｎ　）技術によりＳ　 ２６　ｘ　１０”　ｃｐｍ／ｍｍｏｌの特異的活性まで標識した。抗体を次に３ −（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（８ＰＤＰ：ファルマシア、アメリカ 会衆ｉ、ニエージャージー州、ピスカタウエイ）を用いて修飾した。１ＪＩｊ中 の抗体（（ＬＯ１ｓｖ　ｕｌＩ−Ｉ９Ｇおよび１９９■非修飾ＩｊｌＧ）に２０ 　ｍＭ　５ＰＤＰ　Ｌ６　ｔｔｌを添加した。溶液を室温で３０分の培養の開時 々渦巻状に混合し、そしてｐＨ４，５の２００ｍＭ酢酸塩緩衝液で平衡化したＰ Ｄ１０カラム（ファルマシア）で溶出させた。集める適当な画分けｌｌ５Ｉを計 測することにより示された。抗体内に導入されたジチオピリジル基を次に還元し 、最終濃度５０　ｍＭでジチオトレイトールの添加によジチオールを得た。室温 で約２０分間の培養後、１０　ｍＷヘペス緩衝液、ｐＨ＆ｏで予め平衡化したＰ Ｄ１０カラムを通過させて、タンパク質をＤＴＴから分離した。抗体をリポソー ムに結合するために、リポソー　ム＠１ｉ（ＥＰＣ２，６？イタ０モル）　５０ 　μｔ　ｆ　”５Ｉ　１ｇ識チオレート化抗体１００μｌおよびり、ン酸緩衝液 ３５０μｌに添加した。溶液を室温で攪拌しながら約１７時間培養した。仄いで 、標準セファロース４Ｂカラム（ファルマシア）を用いてリポソームを遊離抗体 （第５図）から分離した。 リポソーム（平均直径約２５０ｎｍと推定して）当たりの抗体分子の計算された 平均数は１１だった０回収された抗体の約７５チがリポソームに結合した。 単球による取込みの研究のために、６ウエルプレート（コスタ−）内にフェル当 たり５　ｘ　１０’個で細胞をブレーティングした。１日後、溶液を除去し、そ して細胞をＤＭＥＭ−ＧＧ−Ｆｅ２で２度、リン酸緩衝液で１度洗浄した。 リポソーム含有ＤＭＥＭ−ＧＧ−ＦＣ８１ｄを次に添加し、そして細胞を３７℃ で０．ＬＳ、５，６．２４または４０時間培養した。　ｒＬ４チドデシル硫酸ナ トリウム溶液α６ｄを各ウェルに添加し、そしてプラスチックから細胞を除云す るためにプレートを振とうした。溶解細胞を次に１２５ｉ。 １４ｃ、および５Ｈの計測をした。 第１２表は結果を示す、１４Ｃ計測によシ示されるように、細胞は抗体を産生じ ないリポソームよシ抗体産生すボンームをよシ多く取込んだ。 第　１２　表 １０チウシ胎児血清中５７℃でのヒト単球による抗体産生リポソームの取込み 時間（ｈ）　平面リポソーム　ＭＰＢ−ＰＥリポソーム抗体−リポソーム０　２ ［１１４１，６５五２ １．５　２＆１　５９．６　１８１．３五〇　２７．９　７７．６　１２５．８ ＆０　３五２　９Ｌ１　１９４．３ ２４．０　６ａ２　２２五〇　３６α６４α０　１５α６　３１６．８　５０５ ．１抗クイルス研究のものをまねた条件下で試験を行った。 リポソーム内へのカプセル化に関するジデオキシシチジンとジデオキシシチジン トリホスフェートの比率は実施例２に記載した。その他の多くのホスホリル化お よび非ホスホリル化ヌクレオシドがリポソーム内へのカプセル化に対するそれら の安定性を決定するために研究された。 ２′、３′−ジデオキシグアノシン５′−トリホスフェート（ｄｄＧＴＰ　）、 ２′、３′−ジデオキシアデノシン５′−トリホスフェ−）　（ｄｄＡＴＰ　） 、２．３７−シデオキシチミジン５′−トリホスフェート（ｄｄＴＴＰ　）、２ ′、３′−ジデオキシクチシン５′−ジホスフエート（ｄｄＣＤＰ）、および２ ｔ、ｓＩ−ジデオキシシチジン５′−モノホスフェ−）　（ｄｄＣＭＰ　）はフ ァルマシア（アメリカ合衆国、ニエージャージー州、ピスカタウエイ）から得ら れた。これらの試薬の各々を含有するリポソームは、５６■ＥＰＣ，２９■ＰＳ 、３３ηコレステロールおよびα１２５μＣｉ”Ｃ−コレステリルオレエートを 用いて調製された。カプセル化のための溶液はリン酸緩衝液ｐＨ７中の８ｍＭヌ クレオシドまたはヌクレオチドだった。ガラスビンの壁土で脂質を乾燥させ、カ プセル化する溶液の一部で脂質を水和し、そして液体窒素で凍結−融解を５回行 うことにより、実施例２に記載したものと実質的に同一にリポソームを製造した 。しかしながら、脂質を１．αｄよりも（１８ａｊに水和し、そして排除工程を 省略した。従って、製造した主成物は凍結融解多重膜リポソームであると予想さ れた。調製物を遠心分離により洗浄し、カプセル化されていない溶質を除云した 。当量のクロロホルム：メタノール（６５：２５）とリン酸緩衝液を用いて、抽 出によシカプセル化された容量を決定した。ヌクレオシドおよびヌ・クレオチド 溶質はほとんど水相に分配され、一方脂質は有機相および遠心分離後の界面近傍 に見い出された。カプセル化された溶質の量は標準的な紫外線分光分析法によシ 決定され、そして脂質はシンチレーシッン液中の１４ｃラベルを計測することに よシ計量された。得られたカプセル化の容量は第１５表に記載しである。 リポソーム２５μｌにリン酸緩衝液１４５μｌを添加し、そしてエアーフェージ （Ａｉｒｆｕｇｅ　）　（ベックマン）巾約１０（ＬＯＯＯＧで１０分間遠心分 離することによシ溶質解離の速度を決定した。リポソームベレットを次に１４０ 脂質の計測を行い、そして各上清１００μｌを紫外線分光分析のためにリン酸緩 衝液で５倍に希釈した。第１３表は、４℃で約２８後観察された解離を示す、各 々の場合において、トリホスフェートはよシ少なく解離され、そしてより少ない ホスホリル化体がより広い範囲まで解離される。最大の解離は非ホスホリル化体 ｄｄＴに観察された。 これらの化合物の抗ウィルス作用は、上記のように決定される。 第１３表 リポソーム内の権々の連鎖停止剤ヌクレオシドおよびヌクレオチドに対する４℃ で２日間におけるカプセル化容量およびＳ離百分率 りに素雰隼（〜イクロ１５−ｙ　）”ｘ／−ｒＦ、ｊ’！モルＥＰＣ）　解離百 分率ｄｄＧＴＰ　２．７４　α３　チ ｄｄＡＴＰ　Ｌ！Ｓｏ　（Ｌ９ ｄｄＴＴＰ　１．６１　α０４ ｄｄＴ　１．２９　４に１ ｄｄＣＤＰ　ｔ２６　４２ ｄｄｅＭＰ　（Ｌ７６　’＆９ ＲＰＣ：卵＊スファチジルコリン：　ｄｄＧＴＰ　ニジデオキシグアノシントリ ホスフェ−）　：　ｄｄＡＴＰ　ニジデオキシアデノシントリホスフェ−）　； 　ｄｄＴＴＰ　ニジデオキシチミジントリホスフェ−）　；　ｄｄＴ　ニジデオ キシチミジン：ｄｄｃＤＰ　ニジデオキシシチジンジホスフェート：　ｄｄＣＭ Ｐニジデオキシシチジンモノホスフェート製剤組成物の調製のために、あらゆる 非毒性担体、助剤、滅菌剤および類似物が使用され得る。そのような添加剤の好 ましい例は、生理的食塩水、非毒性酸酢緩衝液、抗バクテリア剤および類似物で おる。もちろん本発明の製剤は感染もしくは感受性宿主を、適当な経路により例 えば静脈、皮下、筋肉その他を経て処置するために投与され得る。 しかしながら、本明細書に示された証拠に基づいて、ある種の重要な要素が本発 明への到達において確立されなければならなかったことは銘記される：即ち、第 一に、ホスホリル化された連鎖停止剤ヌクレオシド類似体が、抗レトロウィルス 剤として、もし存在するならば細胞内で非ホスホリル化体よシもより有効である こと；第二に、そのようなホスホリル化された連鎖停止剤類似体がリポソーム内 にそれから漏れることなくカプセル化され得ること；そしてそのリポソームがＨ ＩＶ感染の主な生き残りである細胞内分裂細胞を標的とし得ることである。安定 なリポソーム製剤の実現可能性が一旦確立されたら、次の重要な要素は、種々の 有害な副作用を引き起こすことな（ＨＩＶに対するリポソーム製剤の有効性を決 定することだった０本明細書に示された結果は、効果のある抗ＨＩＶ組成物およ びそのための効果的な供給系をはじめて提供する。 本明細書に記載された実施例および実施態様は説明のためだけのものであり、そ してそれらを考慮した種々の変更および変化は当業者に提案されるであろうし、 そして本出願の精神および範囲並びに添付された請求の範囲の範囲に包含される べきであることは理解される。 ｄｄＣＴＰすボゾームのＱＥＬＳサイス′分操ＨＩＶＴ７）厚味の６廷稜のｐ２ ４亮規、の呵間終式Ｊ！５ｒ東翫の９狡 ＦＩＧ、４ 国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．レトロウイルスの逆転写酵素活性を阻害するためのリボソーム内にカプセル 化さ九た連鎖停止剤ホスホリル化ヌクレオシドの有効量、および薬学的に許容性 の担体を含むことを特徴とする抗レトロウイルス組成物。
2. ２．前記連鎖停止剤ホスホリル化ヌクレオシドが、モノー、ジ−、またはトリ− ホスフェートであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
3. ３．連鎖停止剤ホスホリル化ヌクレオシドが、アジドチミジントリホスフェート 、ジデオキシシチジントリホスフェート、ジデオキシアデノシントリホスフェー ト、ジデオキシチミジントリホスフェート、ジデオキシグアノシントリホスフェ ートおよびそれらの混合物からなる群がら選択されることを特徴とする請求項２ 記載の組成物。
4. ４．前記連鎖停止剤がジデオキシシチジントリホスフェートであることを特徴と する請求項３記載の組成物。
5. ５．前記リボソームが、該リバソームを選択的に標的とするリガンドと結合して いることを特徴とする請求項４記載の組成物。
6. ６．前記リガンドが、レトロウイルスのＣＤ−４またはコートポリタンパク質に 対して特異的結合親和力を有する抗体またはそれらの断片であることを特徴とす る請求項５記載の組成物。
7. ７．前記リガンドが、レトロウイルスのエンベロープタンバク質またはそれらの 部分であることを特徴とする請求項５記載の組成物。
8. ８．前記レトロウイルスがヒト免疫不全症ウイルスであることを特徴とする請求 項７記載の組成物。
9. ９．レトロウイルス感染症に感染したもしくは感受性のヒトもしくはヒト以外の 動物宿主に、レトロウイルスの逆転写酵素活性を阻害するための請求項１記載の 組成物を有効量投与することを特徴とするレトロウイルスの疾病を治療する方法 。
10. １０．前記レトロウイルスがヒト免疫不全症ウイルスであることを特徴とする請 求項９記載の方法。