JPH02501732A - ブタ赤痢ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ブタ赤痢ワクチン この発明は、ブタ赤痢に対するブタの免疫化に関するものであり、特に、この病 気の制御用ワクチンに関するものである。

嫌気性スピロヘータのトレポネーマ・ヒョジセンテリエは、ブタ赤痢、すなわち 世界中に広°く分布するブタのムコイド出血性下痢の主たる病原体として単離お よび同定されている。この微生物は、それが他の嫌気性細菌の存在下で増殖する 場合ブタの大腸（結腸）において好発し、ムコイド出血により大腸の大部分に壊 そ性変性を生じさせる。組織の上皮および粘膜固有層に広く侵入するため、スピ ロヘータは光学または電子顕微鏡下で壊死組織に沿って明白に観察される。

ブタ赤痢から回復したブタはそれ以上の攻撃に対して免疫を有することが立証さ れたが、トレポネーマ・ヒョノセンテリエ感染に対するブタの免疫応答に関して 利用可能な情報は事実上存在しない。

有効なブタ赤痢ワクチンの開発に関する幾つかの試みが行なわれた。アメリカ合 衆国特許第４１００２７２号は、トレポネーマ・ヒョジセンテリエのヴイルレン ト（病原性）分離株の化学的不活化細胞を含む非経口投与用ワクチンを記載して おり、アメリカ合衆国特許第４１５２４１３号は、ヴイルレント分離株の不活化 細胞を含む経口投与用の似たワクチンを記載している。アメリカ合衆国特許第４ １５２４１５号および同第４４６９６７２号は、経口投与前のワクチンの非経口 投与段階を含む、経口接種方法の修正法を記載している。

国際出願公開第ＷＯ３５１０３８７５号は、初回免疫投与量の不活化ワクチンの 非経口投与およびほぼ同時またはその後におけるトレポネーマ・ヒョジセンテリ エの生の非ヴイルレントまたは非病原性株の経口投与を含む修正接種法を開示し ている。

これらの先行技術の接種試験では、トレポネーマ・ヒョジセンテリエの不活化ヴ イルレント株を使用し、細胞を定着性化学物質、例えばホルムアルデヒドで処理 したことは明らかである。全ての場合において、不活化ワクチンは、注射または 経口法により単独で投与されたか、または不活化ヴイルレント株または生の非ヴ イルレント株の経口投与と組み合わせて注射により投与された。非ヴイルレント 株の経口投与の原理は、大腸の局所免疫を刺激し、恐らくはＩｇＡ応答を刺激す ることである。

スピロヘータの生株の筋肉的投与によりトレポネーマ・ヒョジセンテリエに対す るブタの有効な免疫化が達成され得ることが見出された。また、トレポネーマ・ ヒョジセンテリエの酸素処理した生育不能株の筋肉的投与によりトレポネーマ・ ヒョジセンテリエに対するブタの有効な免疫化が達成され得ることが見出された 。さらに、この発明に従い使用され得る株はヴイルレントおよび弱毒化法の両方 を含む。

この発明の一態様によると、トレポネーマ・ヒョジセンテリエの生株または酸素 処理した生育不能株のブタへの非経口、好ましくは筋肉的投与を特徴とする、ト レポネーマ・ヒョジセンテリエ感染により誘発されるブタ赤痢に対するブタの接 種方法が提供される。既に述べた通り、トレポネーマ・ヒョジセンテリエのヴイ ルレントまたは弱毒化法がこの方法において使用され得、下記の通り、この発。

明に従い使用され得る代表的株には、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク シタンにＡＴＣＣ３１２’８７および３３２１２の番号下で寄託されたヴイルレ ント参考株並びに同じ＜ＡＴＣＣ２７＋　６４の番号下で寄託された非ヴイルレ ント参考株が含まれる（アメリカ合衆国特許明細書第４１００２７２号参照）。

この発明に従い非経口、特に筋肉内投与に使用され得る株には、ヴイルレント株 ５３８０または弱毒化法７０Ａ、例えば前述の参考株ＡＴＣＣ３１２８７，３１ ２＋２および２７１６４のプロフィールと似た蛋白質プロフィールを有するトレ ポネーマ・ヒョジセンテリエの分離株が全て含まれる。以下、詳細に記載する通 り、蛋白質プロフィールにおける僅かの差異は、様々なヴイルレントまたは弱毒 化法の免疫原性に大きな影響を与えたとは思われず、ヴイルレント株５３８０お よび弱毒化７０Ａの使用は、この発明に従い使用され得るヴイルレントおよび弱 毒化法の分離株の代表例としてこの明細書に詳述されているものである。外膜蛋 白質プロフィールは、全トレポネーマ・ヒョノセンテリエ分離株の顕著な類似性 を示し、免疫原蛋白質のウェスタン・プロット分析は、ヴイルレント・トレポネ ーマ・ヒョジセンテリエ分離株５３８０に対して産生さとｆ二抗血清が、全トレ ポネーマ・ヒョジセンテリエ分離株における同じ分子量領域の免疫原蛋白質を認 識することを示している。

酸素添加トレポネーマ・ヒョジセンテリエの蛋白質プロフィールを生きた非酸素 添加トレポネーマ・ヒョジセンテリエと比較しても、検出可能な差異は観察され 得ない。同様に免疫原蛋白質のウェスタン・プロット分析は、細胞が酸素処理さ れたか生きているかという点とは関係無く、ヴイルレント・トレポネーマ・ヒョ ジセンテリエ分離株５３８０に対して産生された抗血清が、同じ免疫原蛋白質を 認識することを示している。先の化学的不活化ワクチン（例えばホルマリン不活 化ワクチン）では、化学処理がトレポネーマ・ヒョジセンテリエの幾つかの表面 抗原を含めである種の抗原を破壊すると考えられることから、酸素処理が蛋白質 プロフィール、従って抗原性に同等変化をもたらさないという事実は意義深いと 思われる。

この発明の別の態様では、非経口、好ましくは筋肉内投与による、トレポネーマ ・ヒョジセンテリエ感染に対するブタの免疫化において有効なワクチン組成物で あって、トレポネーマ・ヒョジセンテリエの生株または酸素処理した生育不能株 を含むワクチン組成物が提供される。

この発明のワクチンの製造に使用されるトレポネーマ・ヒョジセンテリエ分離株 は、３７−３８°で嫌気性雰囲気下、例えば５０％Ｈ，１５０％ＣＯｔまたはＮ 、中１０％ＣＯ，でインキュベーションしたトリブチカーゼ大豆ブロスを用いて 生育され得る。システィンまたは他の還元化合物を培地に加えることにより、嫌 気生活を維持する。最初？こ培養物を液体培地中で生育させる場合、胎児うし血 清（１０％以下）、グルコース、シトレート、ピルベートおよび鉄分（培地１ｍ Ｑ当たり２μ？の厳密な濃度で）により培地を補足することが必要であり得る。

液体培地を４００μ９７ＲＱのスペクチノマイシンで補足することにより、分離 細胞の蛋白質組成を変えることなく混入し得る汚染物質を抑止することができる 。所望ならば、次に後述の酸素処理を行うことにより細胞を不活化させ得る。

別法として、トレポネーマ・ヒョジセンテリエ細胞は、嫌気性条件下血液寒天プ レートにおいて生育され得る。この方法で細胞を調製する場合、使用前に細胞を 燐酸緩衝食塩水または他の等張性溶液中で洗浄することにより寒天中の不純物を 除去しなければならず、次いで所望ならば、酸素飽和溶液中に入れて細胞を不活 化する。

トレポネーマ・ヒョジセンテリエの培養物は３５９〜４２°の温度範囲で生育さ れ得るが、これを越える温度範囲で生育された株の蛋白質組成に差異は無い。

トレポネーマ・ヒョジセンテリエ細胞を発酵槽で培養後、それらを遠心分離によ り採取し、燐酸緩衝食塩水（０、１Ｍ）または規定食塩水（０，１Ｍ５ｐＨ７， ０−７，４）に懸濁し、−７０℃または一２０℃で濃縮形態として貯蔵すること ができる。別法として、細胞を小容量のアリコートに分け、凍結乾燥することも できる。

発酵槽中で培養し几トレポネーマ・ヒョジセンテリエ細胞を不活化するためには 、好ましくは０．ガスを培地に吹き込んで培地を０！で飽和させることにより、 細胞に酸素添加を行う。この酸素添加処。

理を好ましくは少なくとも３−４時間、さらに好ましくは６時間以下の間維持す ることにより、培地中のトレポネーマ・ヒョジセンテリエを全て生育不能にする 。これらの細胞は、アジュバントと合わせることにより酸素化した後直接使用さ れ得るか、または別法とし形態として貯蔵し得る。別法として、細胞を小容量の アリコートに分け、凍結乾燥することができる。ワクチン用の細胞密度は、約１ ０１生物／！Ｑであるべきである。ワクチンは、好ましくはｌＸｌ０＠生物１ｓ （ｌを適当なアジュバント、例えばフロインド不完全アジュバント（ＣＳＬ）１ ｘＣと混合した形で含有する。またワクチンは、保存剤、例えばチメロサールを 含有し得る。ワクチンは、最大の免疫学的応答が得られることから深筋肉内注射 方法による投与が推奨されている。しかしながら、ワクチンの非経口投与に関し て許容されている他の方法、例えば皮下注射も使用され得るが、好ましくはない 。

トレポネーマ・ヒョジセンテリエ感染に対するブタの抵抗力を高めるためには、 ワクチンの送達は、７−１４日あけて約１ＸｌＯｓのトレポネーマ・ヒョジセン テリエを２回用量として投与するの力く好ましい。２回目の投与後ＥＬ　Ｉ　Ｓ Ａ検定または同等の血清学的検定で測定した結果、免疫応答の程度が１／８００ の血清希釈率で１゜０　０Ｄ単位より大きいレベルに達しない場合、３回目のワ クチン用量が投与され得る。

飼養場では年１回のブースター用量で動物を再接種することにより、ｌ／８００ の血清希釈率で１．００　０Ｄ単位を越えるＩｇＧレベルを維持するのが望まし い。

添付図面１〜５は、トレポネーマ・ヒョジセンテリエの幾つかの臨床分離株並び に参考味ＡＴＣＣ３１２８７，３１２１２および２７１６４の全細胞および外膜 （ＯＭ）濃化フラクシヨンの５ＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールの試験結果を示す。

図面の説明： 第１図は、トレポネーマ・ヒョジセンテリエの分離株および参考味の全細胞リゼ イトの５ＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを示す。レーンｌおよび１７、分離株７０ Ａ；レーン２、分離株５３８０；レーン３、分離株５５４１：レーン４、分離株 ３２３８６．レーン５、分離株３２４８６Ａ；レーン６、分離株３２４８６Ｂ； レーン７、参考味ＡＴＣＣ３１２１２；レーン８、参考法ＡＴＣＣ２７１６４； レーン９、参考味ＡＴＣＣ３１２８７；レーンｌＯ１分離株１５４５；レーンＩ Ｌ分離株９６９０；レーン１２、分離株８８４１；レーン１３．８４４１、レー ン１４、分離株５０８；レーン１５、分離株１０５９；レーン１６、分離株２５ ４９゜ 第２図は、サルコシル不溶性０Ｍｎ製物の５ＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを示す 。パネルＡ、１０マイクログラムのトレポネーマ・ヒョジセンテリエ分離株から 得られた０Ｍ蛋白質。レーン１．７０Ａルーン２、ＡＴＣＣ３１２８フルーン３ 、ＡＴＣＣ２７１６４ルーン４．２５４９ルーン５．１５４５ルーン６．５３８ ０：レーン７．９６９０ルーン８．８８４１ルーン９．８４４１ルーン１０、ト レポネーマ・イノセンス９５０９ルーン１１、トレポネーマ・イノセンス９５１ Ｏルーン１２．１０３９ルーン１３、ＡＴＣＣ３１２１２ルーン１４．３２４８ ６Ｂルーン１５．５０８；レーン１６、反復７０Ａ：レーン１７．５３８０全細 胞リゼイト。

パネルＢ、）レボネーマ・ヒョジセンテリエ、エシェリヒア・コ１ノ、ニス・テ ィフィムリウム、ワイ・エンテロコリティ力、シー・ジェジュニおよびシー・フ ェラスから得られたｌＯマイクログラムの０Ｍ蛋白質。レーン１，２および３は それぞれトレポネーマ・ヒョジセンテリエ分離株７０Ａ、ＡＴＣＣ３１２８７， ５３８０；レーン４、エシェリヒア・コリＪＰ７７７、レーン５、ニス・ティフ ィムリウムＶ２７９：Ｌ／−ン６、ワイ・エンテロコリティ力４３０−１゜レー ン７、シー・ジェジュニＦｌルーン８、シー・ジェジュニＦ１４、レーン９、シ ー・フェラス、亜種フェラスニレ−２１０１反復５３８０゜ 第３図は、特異ブタ血清を用いたトレポネーマ・ヒョジセンテ１ノ工全紬胞可溶 化蛋白質のウェスタン・イムノプロット分析を示す。

細胞リゼイトを５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタン・プロツト分析用ゼ ータプローブに移した。免疫前対照血清（パネル、へ）および多価ブタ抗トレポ ネーマ・ヒョジセンテリエ（分離株５３８０）血清（パネルＢＸ希釈率１：１０ ０）を用いて抗原を検出した。レーンｌおよび５．７０Ａ、レーン２および６． ５３８０；レーン３および７ＡＴＣＣ３１２８７，レーン４および８．３２３８ ．６　、レーン９．１５４５；レーン１Ｏ１ＡＴＣＣ３１，２１２：レーン１１ ．１０５９；レーン１２、反復５３８０；レーン１３．５５４１；レーン１４． ３２４８６Ｂ、レーン１５、反復ＡＴＣＣ３１２８７，レーン１６、ＡＴＣＣ２ ７１６４；レーン１７．９６９０．レーン１８．８８４１；レーン１９、トレポ ネーマ・イノセンス９５］０；レーン２０、トレポネーマ・イノセンス９５０９ ゜（３５Ｓ）プロティンａおよび後続のオートラジオグラフィーを用いて結合抗 体を検出した。

第４図は、ブタ抗トレポネーマ・ヒョジセンテリエ血清を用いたトレポネーマ・ ヒョジセンテリエ分離株の０Ｍ蛋白質のウェスタン・プロット・プロフィールを 示す。パネルＡ、免疫前対照血清による免疫プロット；パネルＢ、過免疫血清に よる免疫プロット。血清を１：１００に希釈し几。レーン１および５、トレポネ ーマ・ヒョジセンテリエ５３８０細胞抽出物：レーン２および６．５３８００Ｍ Ｐ；レーン３および７、ＡＴＣＣ３１２８７０ＭＰ：レーン４および８．７０Ａ 　ＯＭＰ：レーン９．２５４９０ＭＰ：レーンｌＯ１１０１ｌ５４５０レーン１ １、ＡＴＣＣ２７１６４０ＭＰ、レーン１２．８８４１　ＯＭＰ　、レーン１３ 、トレポネーマ・イノセンス９５１００ＭＰ、（”Ｓ）プロティンＡとのインキ ュベーションおよび後続のオートラジオグラフィーにより抗体結合を検出した。

第５図は、トレポネーマ・ヒョジセンテリエ分離抹５３８０全細胞に対するプロ テアーゼ消化作用を示す。無傷細胞を５０μｙ／ｘρのトリプシン（レーンＡ） まにはＰＢＳ緩衝液（レーンＢ）とインキュベーションした。３０分後、Ｐ　Ｍ 　−Ｓ　Ｆ・を加えることにより反応を止め、５ＤＳ−ＰＡＧＥの前に細胞をＳ ＤＳ試料緩衝液により可溶化した。矢印は、蛋白質加水分解に感受性のあるクー マシー・ブルー−染色蛋白質の位置を示す。

結果 トレポネーマ・ヒョジセンテリエの臨床分離株および基準株から得られた全細胞 リゼイトのポリペプチドの５ＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールは、３０ｋＤａ〜４０ ｋＤａの分子質！（Ｍｒ）範囲における４〜７の主な富裕蛋白質を示し、さらに 少なくとも３０の強さの劣るクーマシー・ブルー染色蛋白質が５ＤＳ−ＰＡＧＥ において菌株につき分離された。電気泳動プロフィールにおいて高分子質量ポリ ペプチド（＞　２００　ｋＤａ）は観察されなかった。殆どの分離株において緊 密移動している二重線として３６ｋＤａおよび３９ｋＤａの蛋白質が検出された 。さらに、分子質量領域２２−２５ｋＤａの株全てに存在する拡散バンドは、銀 染色およびニトロセルロース結合特徴分析（データは示さず）に基づき、リボ− ポリ多糖類（ＬＰＳ）として同定された。

トレポネーマ・ヒョジセンテリエ全細胞すゼイトのクーマシー・ブルー染色蛋白 質プロフィールの比較は、３０ｋＤａないし４０ｋＤａ間のＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　 、Ａ　Ｇ　Ｅゲル分子質量領域において移動している主富裕蛋白質の見かけ上の 電気泳動移動度の差異を立証した。バンド・パターンにおけるこの株−抹変異性 を用いることにより、被験分離株間の２つの電気泳動パターンを区別することが できる。試験したトレポネーマ株の大多数は、ＡＴＣＣ３１２＋　２およびＡＴ ＣＣ３１２８７基準株（第１図、各々レーン７および９）の場合と類似した蛋白 質バンド・プロフィールを示し、３９ｋＤａ、３７ｋＤａおよび３６ｋＤａ蛋白 質の分子質量を有する特徴的な主富裕蛋白質と共にグループＡと定めた。基準株 ＡＴＣ０２７１６４（第１図、レーン８）は、ＡＴＣＣ３１２８７株と同一のポ リペプチド・プロフィールを示したが、３９ｋＤａ蛋白質二重線を表さなかった （これもまたグループＡと定め１コ）。明確な４０ｋＤａ蛋白質は分離株９６９ ０．８８４１および８４４１（第１図、各々レーン１１，１２および１３）にお いて示され、これらの分離株についてはグループＢと定めた。

生長培地における多数の継代後、同じトレポネーマ・ヒョジセンテリエ株から得 られに全細胞リゼイトの４種の異なる調製物（９５０Ａ、７０Ａ、３１２８７． ３１２１２）を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより試験した。株は全て、分離株の蛋白組成 が継代時に変化しなかったこと（データは示さず）を立証する同一ポリペプチド ・プロフィールを示した。さらに、インビボ攻撃およびその後の数頭のブタから の再分離後、５３８０株の蛋白質プロフィール（グループＡ１第１図、レーン２ ）は依然として安定状態であった（データは示さず）。

トレポネーマ・ヒョジセンテリエの臨床分離株および基準味並びにトレポネーマ ・イノセンスの２種の分離株から得られた細胞エンベロープ・フラクションを、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したサルコシルおよびサルコシル不溶性ＯＭＰ−濃 化調製物により抽出した（第２　Ａ図）。トレポネーマ・ヒョジセンテリエ株に 存在する主富裕蛋白質は、細胞蛋白質調製物の分子質量範囲３０　ｋＤ　ａ＝ｋ Ｄ　ａにおいて移動する主富裕蛋白質に対応する（第１図参照）。ＯＭＰプロフ ィールは、グループＡの全部およびグループＢの大部分の分離株が、共通の３６ ｋＤａ、３４ｋＤａ、３３ｋＤａ、３１．５ｋＤａおよび３０ｋＤａ　０Ｍ蛋白 質を発現することを示した。試験したグループＡ株１０種のうち、６種は主３７ ｋＤａ　ＯＭＰを発現し、４種は主３７゜５ｋＤａ　ＯＭＦを発現した。これら の分離株を各々サブグループＡ１およびＡ２と命名した。グループＢのＯＭＰに おいては、株変異性３７ｋＤａ蛋白質の発現は無かった。トレポネーマ・ヒョジ センテリエ分離株のＯＭＰ蛋白質を、他のグラム陰性菌から得られたサルコシル 不溶性ＯＭＰ−濃化調製物と比較した（第２Ｂ図）。トレポネーマ・ヒョジセン テリエ分離株の０Ｍパターンは、エシェリヒア・コリ、ニス・ティフィムリウム 、ワイ・エンテロコリティ力、シー・ジェジュニおよびシー・フェラス　亜種フ ェラスの場合と容易に区別された。

トレポネーマ全細胞すゼイトの試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、次いで免 疫検出用ゼータプローブに移した。全トレポネーマ・ヒョジセンテリエ株５３８ ０細胞（グループＡ）に対するブタ過免疫血清は、ある程度の株変異性を有する 、見かけ上の分子質量が２４ｋＤａを越える少なくとも２０の蛋白質を認識した （第３図）。免疫前対照血清により認識された蛋白質は無かった。過免疫ブタ血 清は、殆ど全ての分離株（グループＡおよびＢ）に共通しているが、トレポネー マ・イノセンス分離株において認識される免疫反応性蛋白質とは異なる、３０ｋ Ｄａ〜４７ｋＤａの分子質量範囲における若干の蛋白質と強く反応した。

７種のトレポネーマ・ヒョジセンテリエ（グループＡ６種およびグループＢ１種 ）分離株およびトレポネーマ・イノセンス分離株から得られたサルコシル不溶性 ０Ｍ調製物を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ゼータプローブに免疫ブロッティ ングし、ブタ抗トレポネーマ・ヒョジセンテリエ株５３８０過免疫血清によりプ ローブすると、反応性のパターンは、３８ｋＤａ〜４０ｋＤａ（ダルトン）分子 質量範囲の蛋白質における僅かな程度の株変異性を除き、殆ど全ての分離株にお いて類似していた（第４図）。分離株５３８０全細胞リゼイトとの反応性パター ンは、比較目的に含まれた（第４図、レーンｌおよび５）。グループＡおよびＢ 並びにトレポネーマ・イノセンス分離株から得られた０Ｍ蛋白質は、過免疫血清 に存在する抗体とは反応性を示したが、攻撃前対照血清とは反応性を示さなかっ た（第４図、レーン１〜４）。全てのトレポネーマ・ヒョジセンテリエ分離株に おいて、免疫反応性の強い共通の０Ｍ蛋白質が３４ｋＤａおよび３０ｋＤａで観 察された。また、３４ｋＤａバンドはトレポネーマ・イノセンス分離株において 反応性を示した（第４図、レーン１３）。

グループＡ分離株に存在する３９ｋＤａバンド（第４図、レーン６〜１１）、グ ループＢ分離株８８４１に存在する主４０ｋＤａ（第４図、レーン１２）並びに トレポネーマ・イノセンス分離株９５１Ｏの３８ｋＤａおよび３８．５に、Ｄａ 蛋白質バンド（第４図、レーン１３）もまた免疫反応性を示した。０Ｍ蛋白質を うさぎ抗トレポネーマ・ヒョジセンテリエ過免疫血清によりプローブすると、似 た抗体応答が観察された（データは示さず）。他のグラム陰性菌由来の０Ｍ蛋白 質を同じブタ抗トレポネーマ・ヒョジセンテリエ過免疫血清により免疫プローブ した場合、検出可能な抗体交差反応性は存在しなかった（データは示さず）。

さらに免疫学的応答において重要なトレポネーマ・ヒョジセンテリエ抗原の特徴 分析を行うために、ウェスタン・プロットで認識された０Ｍ蛋白質をトレポネー マ・ヒョジセンテリエの表面に位置する蛋白質と相関させた。無傷のトレポネー マ・ヒョジセンテリエ株５３８０全細胞をトリプシンにより処理し、蛋白質加水 分解をＰＭＳＦにより止めた。プロテアーゼ処理および対照トレポネーマ・ヒョ ジセンテリエ５３８０細胞の両方をＳＤＳ試料緩衝液に可溶化し、５ＤＳ−ＰＡ ＧＥに付した（第５図）。トリプシン加水分解は、分子質量値３９ｋＤａ１３６ ｋＤａ、３４ｋＤａ（二重線）および３０ｋＤａの蛋白質バンドの選択的喪失を 誘発したが、これは、これらの蛋白質がＯＭを通ってトレポネーマ細胞表面に伸 びたことを示している。トリプシンではなく、トレポネーマ・ヒョジセンテリエ ５３８０細胞のプロテアーゼに処理を用いた場合、蛋白質加水分解の同じパター ンが観察された（データは示さず）。

以下、実施例によりこの発明の特徴をさらに詳しく説明する。

実施例１ Ａ、実験動物 ブタ赤痢の発生層をもたない農場のブタを４週令の時点で独立ユニットに入れ、 抗生物質を含まない生育飼料を与えた。綿棒で直腸試料を採取し、暗視野顕微鏡 により試験し、スペクチノマイシン含有および不含有のウシおよびウマ血液寒天 並びにセレナイト・ブロス中に接種した。トレポネーマ・ヒョジセンテリエ様生 物は顕微鏡下では観察されず、分離培地上でも分離されなかった。糞は、サルモ ネラ・エスピーピーおよびコンピロバクター・エスピーピーについて陰性であっ た。動物は全て、同時出願中のオーストラリア国特許出願第ＰＨ０９６３１／８ ６号で開示されたトレポネーマ・ヒョジセンテリエＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定において 陰性であった。

Ｂ、ワクチン調製 トレポネーマ・ヒョジセンテリエ株５３８０または７０Ａの培養物を、システィ ン、グルコース、くえん酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウムおよび鉄を補い、 ｐＨを６．８に調節し、滅菌した嫌気調製トリブチカーゼ大豆ブロス培地中で４ ８時間培養し、Ｎ、中ｌＯ％ＣＯ１の混合気体を吹き込んだ。１０％以下、好ま しくは１％の胎児うし血清を加えることにより、成長を促進させ得る。培養物を 採取し、燐酸緩衝食塩水に再懸濁した。使用前、微生物を約ｌＸｌ０＠／１１Ｉ ２の濃度に希釈した。

Ｃ１攻撃接種物 攻撃接種物は、液体培養（前記）または３７℃で４８時間インキュベーションし た微生物の単一血液寒天プレート中で培養された同じトレポネーマ・ヒョジセン テリエ微生物を成分とした。

２００＊（！の再構成ミルク粉末のホモジネート中、攻撃接種物を接種前の２４ 時間食物に接近させなかったブタに与えた。

Ｄ、ヴイルレンス試験 試験ｌ トレポネーマ・ヒョジセンテリエ株５３８０の１血液寒天培養から得られｆコ培 養物を４頭のブタに経口接種した。ブタを抗生物質不含有飼料を与えて維持し、 赤痢の徴候および症状を毎日モニターした。

トレポネーマ・ヒョジセンテリエ５３８０を接種されたこれらのブタの臨床応答 は以下の通りであった。

下痢　４／４ 赤痢　４／４ 発病までの平均日数　１０日 平均継続期間　３日 死亡　４／４ この試験は、株５３８０がブタに対して毒性を有することを示した。トレポネー マ・ヒョジセンテリエは、赤痢にかかったブタ全部から分離採取されｆこ。

試験２および３ これらは、３週令のブタ６頭を用いた試験１の反復であった。ブ夕は全て接種の １１０後に下痢および赤痢の症状を示しに。試験２では、１２１ｐ目に２頭のブ タが赤痢で死亡し、ブタ赤痢の古典的徴候を呈する残りのブタについては、抗生 物質処理により赤痢を制御した。試験３の結果は同様であった。

又、これらの試験は、株５３８ｏがトレポネーマ・ヒョジセンテリエのヴイルレ ント株であることを示した。

試験４ 試験１，２および３の場合と同じ接種プロトコルを用いて、５３８０ではなく７ ０Ａの培養物により８頭のブタを攻撃し几。ブタ赤痢で死亡したブタは無かった 。

試験５ トレポネーマ・ヒョジセンテリエ株の濃縮接種物（ＩＸＩＯ”）の経口接種およ び１寒天プレートから新たに採取しｆ二表面培養物の直腸内接種により、４週令 のブタ６頭に５３８０株（４頭のブタ）または７０Ａ株（２頭のブタ）を接種し た。ブタを同じ小屋の別々の木枠中に入れ、同じ飼料を与えた。５３８０グルー プの４頭のブタは全て、攻撃０１０日以内に臨床ブタ赤痢の証拠を示し、１／４ は１２日目に死亡しｆ二。５３８０グループの残りを抗生物質で処理することに より赤痢を制御した。株７０Ａにより攻撃されんブタの中に、実験終了時である 攻撃の３０日後までに赤痢の徴候を示し１ニブタは無かった。

試験６ 急成長トレポネーマ・ヒョジセンテリエ７０Ａ（ミルク中）の１寒天プレートの 経口接種および１ｘＱのトレポネーマ・ヒョジセンテリ工培養ブロスに＠濁しん 急成長トレポネーマ・ヒョジセンテリエ７０Ａの表面培養物の直腸内接種により 、８頭のブタを７０Ａの培養物で攻撃した。ブタ赤痢の何らかの徴候を示し１こ ブタは無かった。

しかし、それらは、トレポネーマ・ヒョジセンテリエに対する抗体力価の増加を 示さなかった。トレポネーマ・ヒョジセンテリエは接種の２４時間後にブタの糞 から単離され得た。しかしながら、トレポネーマ・ヒョノセンテリエは攻撃５日 後の糞からは単離され得な　、かった。

Ｅ、接種試験 試験７ ０日目に６頭のブタに２Ｘ１０’）レボネーマ・ヒョジセンテリエ５３８０（ア ジュバント中）を筋肉内接種し、１１日目に再接種した。６頭のブタから成る対 照グループは別々に保たれ、処理は行わなかった。２２日目に、試験ｌと同様に 、全部のブタをミルク中に入れた株５３８０攻撃飼料により攻撃し１こ。対照ブ タは全て、古典的ブタ赤痢にかかり１７日以内にブタ赤痢により死亡した。接種 されｆこブタは全て、攻撃に対する抵抗力を有し、トレポネーマ・ヒョジセンテ リエ感染の証拠を示さなかった。

試験８ 試験７と同様に５頭のブタに接種を行ったが、初回接種の僅か１０日後に第２接 種を行い、次いで２６日目（第２接種の１６日後）にトレポネーマ・ヒョジセン テリエ５３８０により攻撃しに０非接種ブタは、攻撃の９日以内にブタ赤痢の徴 候を示し始め、攻撃の１０日以内に急性ブタ赤痢により死亡し始めた。接種し１ ニブタの中に、攻撃の４５日以内にブタ赤痢感染の証拠を示したブタは無かった 。

死亡した感染ブタ全部からトレポネーマ・ヒョジセンテリエが単離されたが、攻 撃の１２日後に接種ブタからは単離されなかった。

試験８におけるブタの臨床応答は下記の通りであった。

非接種　接種 下痢　５１５　０／６ 赤痢　５１５　０／６ 死亡　５１５　１／６＊ （＊　１頭のブタはエンエリヒア・コリ腹膜炎で死亡しｆこ。腸にトレポネーマ ・ヒョジセンテリエ感染の証拠は無く、腸組織からトレポネーマ・ヒョジセンテ リエは単離されなかった。）試験におけるブタ全部から血液を採取した。血清学 的力価（ＩｇＧレベル）を添付図面（第４図）に示す。

試験９ トレポネーマ・ヒョジセンテリエ分離株５３８０および７０Ａの可溶性細胞蛋白 質および外膜蛋白質のポリアクリルアミド・ゲル電気泳動分析は、ウェスタン・ プロット分析を用い几測定によると、それらの蛋白質組成または抗原性における 顕著な差異を全く示さなかったため（第１，２および３図参照）、７頭のブタに 対し、０８目に２ＸＩＯ’トレポネーマ・ヒョジセンテリエ７０Ａを接種し、１ ７日目に２Ｘ１０’）レボネーマ・ヒョジセンテリエ７０Ａを再接種した。６頭 のブタを対照として別々に維持した。全部のブタに対し、２４日目（第２接種の ９日後）にトレポネーマ・ヒョジセンテリエ５３８０を攻撃した。対照ブタは全 て、下痢および赤痢の症状を示し、全てのブタが攻撃後２８日以内に急性ブタ赤 痢により死亡した。接種したブタの中に、ブタ赤痢の徴候を示し１ニブタは無か っ１こ。

この試験中３６日目、１頭の接種ブタが攻撃の１２日後急性腹膜炎のため死亡し た。腸管の試験はブタ赤痢の証拠を全く示さず、トレポネーマ・ヒョジセンテリ エは大腸から単離されなかった。非接種ブタの微細組織学的電子顕微鏡分析は、 急性ブタ赤痢の特徴を有するブタ全てにおける変化を示し、試験終了時における 接種ブタに関する同様の分析は、トレポネーマ・ヒョジセンテリエ感染による顕 微鏡的または組織学的変化の証拠を示さなかった。

接種および非接種ブタの血清学的応答は、感染および非感染ブタにおけるトレポ ネーマ・ヒョジセンテリエに対するＩｇＧ力価における著しい差異を示した。全 接種ブタにおいて、トレポネーマ・ヒョジセンテリエに対する血清学的力価（Ｉ ｇＧ）は、血清希釈率ｌ／８００で１．０　００単位より大きかった。これらの 接種試験は、トレポネーマ・ヒョジセンテリエのヴイルレント（５３８０）また は非ヴイルレント（７０Ａ）株を接種したブタにおいて、トレポネーマ・ヒョジ センテリエのヴイルレント株（５３８０）による攻撃から保護する抗体力価（１ ／８００で１．０を越える）が得られることを立証している。

実施例２ Ａ、実験動物 ブタ赤痢の発生層をもたない農場のブタを４週令の時点で独立ユニットに入れ、 抗生物質を含まない生育飼料を与えた。綿棒で直腸試料を採取し、暗視野顕微鏡 により試験し、スペクチノマイシン含有および不含宵のウシおよびウマ血液寒天 並びにセレナイト・ブロス中に接種した。トレポネーマ・ヒョジセンテリエ様生 物は顕微鏡下では観察されず、分離培地上でも分離されなかった。糞は、サルモ ネラ・エスピーピーおよびコンピロバクター・エスピービーについて陰性であっ た。動物は全て、同時出願中のオーストラリア国特許出願第ＰＨ０９６３１／８ ６号で開示されたトレポネーマ・ヒョジセンテリエＥＬＩＳＡ検定において陰性 であった。

Ｂ、酸素処理ワクチン調製 トレポネーマ・ヒョジセンテリエ株７０Ａの培養物を、システィン、グルコース 、くえん酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウムおよび鉄を補い、ｐＨを６．８に 調節し、滅菌した嫌気調製トリブチカーゼ大豆ブロス培地中で４８時間培養し、 Ｎ、中ｌＯ％ＣＯｔの混合気体を吹き込んだ。１０％以下、好ましくは１％の胎 児うし血清を加えることにより、成長を促進させ得る。培養物を６時間酸素化し 、約ｌＸｌ０”／ｘρの濃度に希釈し、使用前にアジュバントを添加しＣ９接種 試験 １１０頭のブタに対し、０８目および１０日目に酸素処理しん生育不能アジュバ ント添加トレポネーマ・ヒョジセンテリエ・ワクチンによる接種を行い、１１０ 頭のブタを対照ブタとして維持した。

地方病的ブタ赤痢のブタを全て市販の豚舎に入れた。非接種ブタは、接種試験開 始後７日以内に急性赤痢の徴候を示し始めた。この接種試験におけるブタの臨床 応答は下記の通りであった。

非接種　坦 下痢　１１０／１１０　２／１１０ 赤痢　＊９６／１１０　１／１１０ 死亡　＊　６／１１０　１／１１０＋ ＊　一旦ブタ赤痢が検出および確認されると、急性赤痢の証拠を示すブタを全て 、１０ｘｇ／ｋｇチアムリン塩酸塩で処理することにより、処理を行わなければ 必ずや発生するブタの死亡を減少させに０＋　接種グループの１頭のブタは、接 種の僅か３日後に急性赤痢の証拠を示し、このブタは発病後数時間以内に死亡し た。接種後３日という期間は、充分な免疫反応を発現させるには不充分である考 えられた。

接種および非接種ブタの血清学的応答は、感染および非感染ブタにおけるトレポ ネーマ・ヒョジセンテリエに対するＩｇＧ力価における著しい差異を示した。全 接種ブタにおいて、トレポネーマ・ヒョジセンテリエに対する血清学的力価（Ｉ ｇＧ）は、血清希釈率Ｉ／８００で１．０　０Ｄ単位より大きかった。これらの 接種試験は、トレポネーマ・ヒョジセンテリエ（７０Ａ）の酸素処理生育不能株 を接種したブタにおいて、トレポネーマ・ヒョジセンテリエのヴイルレント株に よる攻撃から保護する抗体力価（１／８ｏｏで１０を越える）が得られることを 立証している。

Ｄ、免疫原性の比較 ブタにおけるトレポネーマ・ヒョジセンテリエに対するＩｇＧ抗。

体の刺激能について、アジュバント添加トレポネーマ・ヒョジセンテリエ？ＯＡ 生株およびアジュバント添加酸素処理生育不能トレポネーマ・ヒョジセンテリエ ７０Ａ間の比較を行った。アジニバント中１，５ＸＩＯ”）レボネーマ・ヒョジ センテリエを含む各ワクチン２用員を、１０日あけて４頭のブタから成る２グル ープに筋肉内注射した。４頭のブタから成る第３グループを対照として定めた。

全ブタから得られた血清を３週間毎週集め、トレポネーマ・ヒョジセンテリエに 対するＩｇＧ抗体力価の発現（吸光度により測定）を記録した。結果を第６図に 示す。第６図から、生ワクチンまたは酸素処理ワクチンにより誘導されｆこ吸光 度数に顕著な差異の無いことがわかる。

９４に− ７１ｃ′／６．２Ｂ。

八　８゜ ７１ｃ′／Ｇ、４゜ Ｂ ＦｔＧ、５ ンーーーーーり０２７ｒ−／シし　ワ７ヂントーーー艷　廿東・ Ｆｔｃ；、６゜ 国際調査報告 一嗜−１＋１慢り一為・−帽１１−１−−＠、ＰＣＴ／Ａｌ１８７１００４４０ に堂佃ｘＴｏフ伍フ庁口へχ：αＯＬ王λにΣだフゴσグ＝ＭｒＥＲＮＮｒ１コ ＮＡＬ　λＰＰＬ工ＯＬＴ？ＧＪ　Ｎｏ、ＰＣｒ　ＡＵ　８７　００４４０ＥＰ 　１３５７９０　０に５０３１７８５　ＧＢ　８４０５５３０　１０８５０３８ ７５

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）トレポネーマ・ヒヨジセンテリエの生株または酸素処理生育不能株のブタ に対する非経口投与を特徴とする、トレポネーマ・ヒヨジセンテリエ感染により 誘発されるブタ赤痢に対するブタのワクチン接種方法。
2. （２）投与法が筋肉内投与法である、請求項１記載の方法。
3. （３）トレポネーマ・ヒヨジセンテリエの株がヴィルレント株である、請求項１ 記載の方法。
4. （４）トレポネーマ・ヒヨジセンテリエの株が弱毒化株である、請求項１記載の 方法。
5. （５）投与前にトレポネーマ・ヒョジセンテリエを酵素飽和溶液に入れることに より、それらを生育不能にする、請求項３または請求項４記載の方法。
6. （６）トレポネーマ・ヒヨジセンテリエの株がこの明細書記載のグループＡ株で ある、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. （７）投与前にアジュバントをトレポネーマ・ヒヨジセンテリエと合わせる、請 求項１記載の方法。
8. （８）非経口投与によるトレポネーマ・ヒヨジセンテリエに対するブタの免疫化 に有効なワクチン組成物であって、トレポネーマ・ヒヨジセンテリエの生株また は酸素処理生育不能株を、所望により許容し得る担体中アジュバントと共に含む 組成物。
9. （９）トレポネーマ・ヒヨジセンテリエの株がヴィルレント株である、請求項８ 記載の組成物。
10. （１０）トレポネーマ・ヒヨジセンテリエの株が弱毒化株である、請求項８記載 の組成物。
11. （１１）トレポネーマ・ヒヨジセンテリエを酸素飽和溶液に入れることにより、 それらを生育不能にした、請求項８または請求項９記載の組成物。
12. （１２）トレポネーマ・ヒヨジセンテリエの株が、この明細書記載のグループＡ 株である、請求項８および１１のいずれか１項記載の組成物。
13. （１３）さらに、フロインド不完全アジュバントを含む、請求項８〜１２のいず れか１項記載の組成物。