JPH02501954A - 血液滴または任意の生物媒質に由来する液からの物質の免疫酵素的検出装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血液滴または任意の生物媒質に由来する液からの物質の免疫酵素的検出装置 本発明は、その存在量がｍ１当りナノグラムのオーダーの微少量であっても、生 物学的媒体中における化学物質または生物学的物質の存在を検出する装置に関す る。本発明は、より詳しくは、抗原−抗体反応を利用して、基質の着色により、 検出すべき物質の存在を明らかにする急速生物学的装置に関する。

尿における検出試験を行なうための診断ストリップは、すでに長期にわたり知ら れている。また、セルロースの正方面上に置かれた一滴の血液を１分間保持し、 次いで洗浄して、着色反応を読み取ることにより、グルコースの世を測定するた めのセルロース片も知られている。

抗原または抗体を使用する免疫−酵素的検出装置も知られている。しかしながら 、これは、一方では、血液サンプルを採取し且つ取り扱うための人員を必要とし 、他方、複雑で、高価で、特に長時間を要するシステムを必要とする（すなわち 、各段階間の３０分間のインキュベイジョン期間に引き続いて繰り返される洗浄 のために、３時間を要する）。

本発明の装置は、これらの欠点を解消して、患者、医師、小さな処置センター、 輸血センター、救急サービスなどが広い領域にわたる高速テストを行なうことを 可能とするもとするものである。何故ならば、分析すべき液体の一滴を必要とす るだけの本発明装置は、採取後の数分間内に、人手を煩わすことなく、装置の下 部におかれた基質ペレットの着色を判定するだけで、診断を可能とするものであ り、コストを低下させ、取扱いを容易とする。

その存在量がｍ１当りナノグラムのオーダーの微少量であっても、液体または固 体の生物学的媒体中における化学物質または生物学的物質の存在を検出するため の本発明装置は、下記の組合わせにより特徴付けられるニー分析されるべき少量 の生物学的媒体を受入れる上部貯留部を形成するように切り込まれた透明または 不透明のプラスチック材料フィルム、 一上記の上部貯留部の基部に位置し、且つその上面が分析されるべき少量の生物 学的媒体と反応するための試薬（Ａ）の薄膜を支持する第一の濾過膜、−上記第 一の濾過膜を通る少量の生物学的媒体の通路からの液体を受入れる中間貯留部を 形成するように切り込まれた第二の透明または不透明のプラスチック材料フィル ム：該中間貯留部は、該液体と反応し得る試薬（Ｂ）を含んでいる、 一上記の中間貯留部の基部に位置し、上記の中間貯留部中の試薬（Ｂ）との接触 後に上記の液体が通過する第二の濾過膜、 一試薬（Ｃ）用の適当なキャリアーを含む下方貯留部を形成するように切り込ま れた第三の透明または不透明のプラスチック材料フィルム；該試薬（Ｃ）は、上 記第二の濾過膜を通過して下方貯留部に到達した液体との接触により、分析され るべき生物学的媒体中でのめる物質の存在または不存在を示すようになされた着 色を呈する。

本発明装置の好ましい実施態様においては、試薬（Ａ）は、適当なマーカーによ りマークされ、好ましくは凍結乾燥された抗体または抗原である。試薬（Ｂ）は 、適当な材料から製造され、抗原または抗体により被覆された微小球（マイクロ スフェア−）である。試薬（Ｃ）は、試薬（Ａ）のマーカーと反応して、試薬（ Ａ）との接触で着色乃至変色し得る基質である。

本発明装置の他の好ましい実施態様においては、試薬（Ａ）は、所定量で存在す るマークされていない抗体により形成されており、装置は、上部貯留部に引き続 いて、リポソーム中に含まれているマークされた抗体により構成される試薬（Ｄ ）を備えている。

本発明装置の他の好ましい実施態様においては、試薬（Ｃ）は、適当なキャリア ー、より具体的にはセルロースベレット或いはその類似物により、支持されてい る。

本発明装置の他の好ましい実施態様においては、数種の異なる物質を同時に検出 し得るように、それぞれのフィルムから切り出された複数個の貯留部が設けられ ている。

本発明装置のさらに他の好ましい実施態様においては、付加的なフィルムが設け られている。

本発明装置のさらに他の好ましい実施態様においては、試薬（Ａ）は、特定の病 気に特異的な複数の異なる抗体または抗体により構成されており、また試薬（Ｃ ）は、試薬（Ａ）を構成する一または二辺上のマーカーと反応し得る複数の基質 からなっていて、一または二辺上の着色を与えるようになされている。

本発明装置のさらに他の好ましい実施態様においては、濾過膜は、ゼラチンとガ ラス繊維とからなっている。

上記の構成に加えて、本発明は、以下の記載から明らかになる様な構成を備えて いる。

本発明は、添付した図面を参照しつつ行う以下の記載らより一層明らかとなろう 。図面において：第１図は、本発明装置の長さ方向の断面図である；第２図は、 本発明装置の斜面図である；第３図は、本発明装置の平面図である：第４図は、 本発明装置の底面図である。

しかしながら、これらの図面及び以下の説明は、単に本発明の目的を明らかにす るために示すものであって、本発明は、これらによって限定されるものではない ことは、言うまでもない。

図面に示す装置は、同長（例えば、１００ｍｎ＋）で且つ同幅（例えば、２０！ ０１１１）の積層されたエレメント（１）〜（５）により構成されている。これ らのエレメントは、全て同位置に一または二辺上の切込み部（貯留部Ｒ１、Ｒ２ 及びＲ３）を備え、これらの切込み部は、円形で、厚さは異なるが、要求される 診断に応じて５〜２０１１Ｉ１１の一定の直径を有している。それぞれの詳細は 、以下の通りである： １）分析されるべき液体滴をＲ１において受取るための０．５〜５關厚の透明ま たは不透明のプラスチックフィルム。

２）分析されるべき液体滴と直ちに反応するための薄い試薬層（Ａ）をその上面 に支持する０、５〜１．５ｍｍ厚のゼラチンとガラス繊維との膜。

３）膜（２）を通過する滴の濾過により得られる液をＲ２において受取るための １〜５ｍｍ厚の透明または不透明のプラスチックフィルム；この液は、貯留部（ Ｒ２）で試薬（Ｂ）と接触する。

４）試薬（Ｂ）との接触後に液を濾過するための上記３）と同様の膜。

５）０．５〜２關厚の透明または不透明のプラスチックフィルム；その切込み部 は、試薬（Ｃ）を含むことができるセルロースペレットまたは他のキャリアーを 含む貯留部（Ｒ３）を形成する。濾過膜（４）を通過する液と接触する試薬（Ｃ ）は、分析されるべき液中にめる物質が存在するか否かによって、異なる着色を 呈する。この反応は、分析の種類によっても異なるが、６）Ｒ１の上面およびＲ ３の底面を覆う不透明な保護接着フィルム。

試薬（Ａ）は、必要ならば任意のマーカー（例えば、酵素、蛍光体、放射性物質 など）によりマークされた凍結乾燥抗体または抗原により構成される。

膜（２）は、ガラス繊維上にゼラチンを置いて製造され、所望の診断に応じて定 められる０、２〜５０ミクロンの孔を有し、その上面に試薬（Ａ）を支持してい る。

膜（４）は、同様にガラス繊維上にゼラチンを置いて製造され、０．２〜５０ミ クロンの孔を有している。

試薬（Ｂ）は、鉄、その他の金属、金属合金、ポリサッカライドその他の材料か ら製造され、攪拌後に抗原または抗体を確実に固定するためにヒドロキシアパタ イトおよび蛋白質Ａにより被覆された１０〜２５０ミクロンの微小球（マイクロ スフェア−）により構成されている。

これらは、次いで、全てのアミン部位をブロックし、抗原−抗体反応以外の化学 反応を防止するために、１〜６時間エタノールアミンと接触せしめられる。

例えば、抗原または抗体が酵素によりマークされており、その酵素がペルオキシ ダーゼである場合には、基質は、青色着色のためには、３，３°、５．　５’− テトラメチルベンチジンであり、オレンジ色着色のためには、オキシフェニルジ アミンである。

本発明装置の一変形例では、複数個の異なる物質を検知するために、複数の貯留 部を設けても良い。例えば、肝炎の診断テストのためには、トランスアミナーゼ 類の急速評価を組合わせることが有利である。同様に、心臓発作の場合には、心 臓酵素率（ｃａｒｄｉａｃ　ｅｎｚｙａ＋ｅ　ｒａｔｅ　）の評価が、経過予測 と症状の重大さの非常に貴重な表示となる。同様に、さらに、エイズの血清陽性 が明確でない場合に、リンパ球の性質と数とを示すことができる免疫的テストに より、同一の試験片上でこれを行い、かくして血清陽性のフォローアツプを行う ことが可能となる。

貯留部の変形例としては、正方形、長方形、卵形、その他のものがある。

本発明の他の変形例においては、フィルムの数は、上記の３より大きくても良（ 、或いは３よりも小さくても良い。

本発明による装置を使用することにより、作因（抗原）と抗原に対する生体の反 応が関わる多数の病気を確認することが可能となる。すなわち、人体に由来する 各種液体（血液、血清、プラズマ、尿、唾液、涙、脳−を髄液、尿管及び膣液、 母乳、手術中に吹き取られた液体、或いは、エイズを検出するために移植される べき臓器からの液体）からのこの作因に対する抗体の検出及びその量的測定が可 能となる。

予め凍結乾燥された或いは単に少量の水と混ぜ合わされた固体の断片についても 、検出を行うことが出来る。

めに獣医学或いはホルモン量の特定にも適用し得る。

本発明の装置は、植物栄養学分野にも適用できる。すなわち、全ての化学物質類 （例えばトキシン類）または生物学的物質（例えば、微生物、ビタミン含有量な ど）の特定或いは量的測定に応用できる。

本発明装置は、微量測定のために農業にも適用可能である。

本発明装置は、より一般的な観点で、捜査、研究、水処理、生態学（例えば、絶 滅しつつある種の病気の診断など）などのために必要とされる微量測定に関する 全てに応用可能である。

本発明装置は、ある種の癌の抗原率（ａｎｔｉｇｅｎ　ｒａｔｅ）の定量をも行 ない得る。即ち、再発、転移などが起こり得るか否かを十分に早期に知ることが 実際上困難である手術を受けた癌患者における病状急変という問題を解決するこ とが可能となる。本発明装置は、抗原率が一定限度を越えたら直ちに着色反応に より、再発、転移などの事実を明らかにする。

本発明装置は、さらに多数の病気（梅毒、エイズ、肝炎など）の早期且つ急速な 検出、および血液型特定、循環酵素類の評価などの生物学的指標の急速な入手、 ならびに同定困難な病気（狂犬病、マラリアなど）の診断をも目的とする。

以下に本発明装置により診断され得る病気乃至症状などの例を挙げるが、本発明 はこれらに限定されるものではない。

■−ウィルス性疾患の診断。

■−徹生物性疾患の診断。

■−酵素的定量。

■−自己免疫症およびアルツハイマー硬化症。

Ｖ−血液型の急速特定。

■−癌の検知。

■−循環する医薬の定量。

■−アレルゲンの検出。アレルギーの診断。

■−膜レセプターの定量。

Ｘ−ホルモンの定量。

ＸＩ−その他の定量（電気泳動図によるアニオン類およびカチオン類、金属類、 ならびに一般的にメンデレーエフによる分類の全ての元素）。

本発明による検出装置は、以下のようにして操作される： １）液体滴が貯留部Ｒ１に付与される。

２）１分後、血清を試薬（Ａ）と反応させ、膜（２）のゼラチンが溶解して、ガ ラス繊維を通って、血清を通過させる。

３）血清は、試薬（Ｂ）で被覆されたマイクロスフェア−とＲ２で接触する。１ 分後、第二のゼラチン膜（４）が溶解する。再び、ガラス繊維を通過する濾過が 起こる。

４）血清が貯留部Ｒ３中の試薬（Ｃ）に到達して、結果に基いて定まる着色を直 ちに示す。

抗原の追跡の場合には： 陽性反応：抗原は、Ｒ１で抗体（Ａ）に結合され、マイクロスフェア−により捕 捉されることなく、Ｒ２を通過し、Ｒ３に到達して、基質を着色させる。

陰性反応：抗原なしニマークされた抗体（Ａ）が、マイクロスフェア−の抗原に より捕捉されるので、基質は、着色されない。

抗体の追跡の場合には： （Ａ）がマークされた抗原であり、血清中に抗体が不存在の状態でこのマークさ れた抗原を捕捉するために、抗体がマイクロスフェア−上に固定されていること 以外の点では、上記と同様の原則である。

半定量的測定： （Ａ）において、例えば、１０　ｎｇ／　ｍｌ・抗原の割合でマークされていな い抗体が固定される。もし、血清がそれ以上の量を含んでいる場合には、１分後 に開くであろうリポソウム中に封入されたマークされた抗体上に後で固定される 。抗体の半定量的測定にも同様の原則が適用される。

本発明装置によれば、以下の効果が達成されるニーその構造の故に、免疫学にお いて一般的である複数回の洗浄ステップが不要となり、他のテスト法に比して、 多大の時間的省略が可能となるニ ー指先から採取した血液滴からの非常に重要な生物学的情報が得られるので、特 別な看護スタッフがいなくとも、また実験室がなくとも、使用可能である；−同 じ試験により尿温、母乳或いは予め凍結乾燥した固体中の物質を検出できるので 、装置使用に大きな柔軟性が得られるニ ー上述の複数個の貯留部において、それぞれの物質に対応する試薬を組合わせる だけで、同−滴の血液から、複数種の異なる物質を検出することが可能となる。

もし、テストが陽性であれば、それは、試験した酒中にめる物質の少なくとも一 種が存在するからである。

かくして、例えば、同じ試験に異なる癌マーカーを用いることができる（例えば 、消化薬として、結腸用にＡＣＥ、膵臓用にＣ１９−９など）。被験者が数種の 異なる癌を有していることは、通常有り得ないので、もし試験が陽性であれば、 このことは、医者の注意を消化器官に向けて、各癌および器官についての個々の 試験を行なわせ、出発となった腫瘍の位置確定を可能とする。

同様に、手術台上での外科手術に先立って、外科医または麻酔医は、試薬（Ｂ） のマイクロスフェア−が異なる抗原（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、肝炎など）で被覆され たテスト、或いはマイクロスフェア−の一部がＨＩＶにより被覆され、他の部分 がＨＴＬＶなどで被覆されたテストを行なうことにより、同じ装置を使用する一 回のテストにより、−滴の血液から極めて重要な指標を得ることができる。

以上の記載から明らかな様に、本発明は、上記の実施例および応用例に限定され るものではない。本発明が、本発明の精神を逸脱しないかぎり、当業者にとって 明゛白な全ての変形例をも包含することはいうまでもない。

国際調査報告 −１−一〜−一−ＰＣＴ／ＴＲＲ８１００４９３国際調査報告 ＦＲ８８００４９３ ＳＡ　２４９８５ 国際調査報告 ＳＡ　２４９８５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．その存在量がｍ１当りナノグラムのオーダーの微少量であっても、液体また は固体の生物学的媒体中における物質の存在を検出するため装置であって、下記 の組合わせにより特徴付けられる装置： −分析されるべき少量の生物学的媒体を受入れる上部貯留部（Ｒ１）を形成する ように切込まれた透明または不透明のプラスチック材料フィルム（１）、−上記 の上部貯留部の基部に位置し、且つその上面が分析されるべき少量の生物学的媒 体と反応するための試薬（Ａ）の薄膜を支持する第一の濾過膜（２）、−上記第 一の濾過膜（２）を通る少量の生物学的媒体の通路からの液体を受入れる中間貯 留部（Ｒ２）を形成するように切込まれた第二の透明または不透明のプラスチッ ク材料フィルム（３）；該中間貯留部（Ｒ２）は、該液体と反応し得る試薬（Ｂ ）を含んでいる、 −上記の中間貯留部（Ｒ２）の基部に位置し、上記の中間貯留部（Ｒ２）中の試 薬（Ｂ）との接触後に上記の液体が通過する第二の濾過膜（４）、−試薬（Ｃ） 用の適当なキャリアーを含む下方貯留部（Ｒ３）を形成するように切込まれた第 三の透明または不透明のプラスチック材料フィルム（５）；該試薬（Ｃ）は、上 記第二の濾過膜（４）を通過した後下方貯留部（Ｒ３）に到達した液体との接触 により、分析されるべき生物学的媒体中での求める物質の存在または不存在を示 すようになされた着色を呈する。 ２．試薬（Ａ）が、適当なマーカーによりマークされ、好ましくは凍結乾燥され た抗体または抗原であり；試薬（Ｂ）が、適当な材料から製造され、抗原または 抗体により被覆された微小球（マイクロスクェアー）であり；試薬（Ｃ）が、試 薬（Ａ）のマーカーと反応して、試薬（Ａ）との接触で着色乃至変色し得る基質 である請求の範囲１に記載の装置。 ３．試薬（Ａ）が、所定量で存在するマークされていない抗体により形成されて おり、装置が、貯留部（Ｒ１）に引き続いて、リボソーム中に含まれているマー クされた抗体により構成される試薬（Ｄ）を備えている請求の範囲１または２に 記載の装置。 ４．試薬（Ｃ）が、適当なキャリアー、より具体的にはセルロースペレット或い はその類似物により支持されている請求の範囲１乃至３のいずれかに記載の装置 。 ６．数種の異なる物質を同時に検出し得るように、それぞれのフィルムから切り 出された複数個の貯留部が設けられている請求の範囲１乃至５のいずれかに記載 の装置。 ７．付加的な複数のフィルムが設けられている請求の範囲１乃至６のいずれかに 記載の装置。 ８．試薬（Ａ）が、特定の病気に特異的な複数の異なる抗体または抗体により構 成されており、また試薬（Ｃ）が、試薬（Ａ）を構成する一または二以上のマー カーと反応し得る複数の基質からなっていて、一または二以上の着色を与えるよ うになされている請求の範囲１乃至７のいずれかに記載の装置。 ９．濾過膜が、ゼラチンとガラス繊維とからなっている請求の範囲１乃至７のい ずれかに記載の装置。