JPH02502122A

JPH02502122A - 液体中のリガンドを検出及び定量する方法

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Publication number: JPH02502122A
Application number: JP63501878A
Authority: JP
Inventors: ヘベイ，リチヤード・シー
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-01-15
Filing date: 1988-01-14
Publication date: 1990-07-12
Also published as: WO1988005538A1; AU1342488A; CA1297406C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】液体中のリガンドを検出及び定量する方法技術背景非放射性イムノアッセイはタンパク質、ヌクレオチド配列、薬剤、ステロイド等のようなアナライト（ａｎａｌｙｔｅｓ）の存在及び量を決定するために臨床及び研究関係に広く使用される。非放射性イムノアッセイは２つのタイプ、即ち不均質アッセイ及び均質アッセイに分けることができる。

不均質アッセイにおいては、固体支持体（例えば、ビーズ、カラム）が使用され、標識した試薬のいくらかは支持体に結合しているが、残りは結合していない。

結合した標識しＩ：試薬及び遊離の標識した試薬を分離するための方法が必要である。

均質アッセイにおいては、分離は必要ではなく、従って追加の工程は必要ではない。普通に使用される均質イムノアッセイには少なくとも５種類の主なタイプがある。これらの１つである蛍光偏光イムノア７セイ（Ｆ　Ｐ　Ｉ　Ａ）は少量の物質（例えば、ナノグラム／ｍＱで）を測定するのに使用することができる。それらは、分子が基底状態又は（最低エネルギー状態）存在することができそして入射する放射にさらした後、励起状態又はより高いエネルギー状態で存在することができることを利用する。

このソースからのエネルギーの吸収は、分子の１個又はそれより多くの電子をより高いエネルギレベルに昇位させる。このジャンプが起こるとき、電子は吸収したエネルギーの少部分を失うことがある（例えば、他の分子との衝突によるなどして）。その電子がより高いエネルギレベルから基底状態に戻るときに、励起しｔ；分子はエネルギーを放射することができる。しカルながら、このようにして発生したエネルギーは、最初に分子を励起するのに必要としたエネルギーよりも少ない。結果として、放出した光の波長（ここでは、蛍光）は、分子を励起するのに使用した光の波長より長い。放出される光エネルギーは、入射光ビームに対して直角に位置した検出器のような標準装置を使用して検出することができる。

ニス・ベーカーマン（編集）、化学手引き：蛍光偏光イムノアッセイ、２ボラトリー・マネージとと上、１６−１８（１９８３年７月）（Ｓ、Ｂａｋａｒｍａｎ（ｅｄ、）、ＣｈｅＩＩＣｕｅｓ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｐｏ１ａｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、　ＬａｂｏｒａｔB ｒｙ　Ｍａｎａｇｅ＋＋＋ｅｎｔ、１６−１８（Ｊｕ１７１９８３））、デー・フライ７エルダー、蛍光分光法＝フィジカル・バイオケミストリｍ：バイオケミストリー及びモレキュラー・バイオロジーへの応用（第２ｇ）：５３７−５７２（１９８２ＸＤ、Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、　＋ｎ　：Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：　` ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｄ　ｅｄ）、５３７−５７Q （１９８２））。

ＦＰＩＡの理解には、偏光の理解も必要である。常光線は、各々が１つの面内にある多数の電磁波と見なすことができ、各波ぽ光ビームの中心軸又は路を通過する。しかしながら、偏光は、１つのみの波面が生じる（他は排除されるか又は遮断される）光である。蛍光分子がその双極子が光波と同じ面内にあるように配向されると、それは偏光を吸収する。

それが基底状態に戻ると、分子は同じ面内で光を放出する。

ＦＰＩＡにおける重要な２つの追加のファクターは、時間に関係している。第」に、使用される分子の蛍光寿命を考慮しなければならない。

寿命とは、偏光バースト（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ　ｌｉｇｈｔ　ｂｕｒｓｔ）による分子の励起と分子による同様なバーストの放出との間隔である。第２に、分子の回転緩和時間、即ち、放出される偏光が分子の励起とは異なる方向に放出されるように励起分子が整合から外れるのに必要な時間を考慮に入れなければならない。小さな分子（例えばハプテン）は、溶液中で迅速に回転し、それらの回転緩和時間は分子蛍光寿命より短い。結果として、偏光を吸収した後、このような小さな分子は偏光した放出光が得られる時間までにランダムに配向される。より大きい分子（例えば免疫グロブリン）は比較的ゆっくりと回転し、典型的な蛍光寿命より長い回転時間を有する。

蛍光偏光測定は、発蛍光団の分子回転が起こらなければ偏光した励起放射は偏光した放出放射を生じるという事実に基づいている。発蛍光団は蛍光分子又は１つの波長で光を吸収しそしてより長い波長でそれを放出する性質を持った化合物である。上述のように、小さな分子ハプテンに結合した発蛍光団は放出の前に励起状態の寿命に比較して速い速度で分子回転を行う。故に、光は小さな分子に結合されている場合には偏光解消される。抗体は発蛍光団−抗原に結合すると、回転は抗体の大きい寸法（分子量−１５０，０００）の故に劇的に減少して、放出された光を偏光させたままである。

イムノアッセイはこの現象を下記のように利用する。抗体及び発蛍光団で標識したハプテン又は発蛍光団で標識した抗原を存在させて、抗体と発蛍光団及びハプテンとの間に又は抗体と発蛍光団−抗原との間に結合が生じそして蛍光偏光解消は殆ど起こらない。分析されるべき抗原が加えられるにつれて、それは抗体に競合的に結合し、発蛍光団−抗原は結合せずそして偏光解消が観察される。偏光解消は抗原濃度の関数でありそして定量的アッセイを構成する。

ＦＰＩＡの原理は１９７０年以来知られており、７０−セル及びディジタルビみ出しを備えたこのアッセイのｔ；めの実用可能な機器が１９７３年以来入手可能であるけれども、ＦＰＩＡの用とは臨床用に比較的限定されている。その理由は、それがアナライト検出のためにそれを使用できるアナライトの寸法において限定されているからである。ＦＰＩＡ法は簡単で、迅速で、正確であるが、その感度は限定されている。比較的小さい偏光の変化しか起こらないので、この方法は分子質量が約２０゜０００ダルトンを越える抗原には適用できない。

発明の開示本発明は、蛍光偏光を使用して液体中のリガンドを測定する方法に関する。本発明は、ビオチン−アビジンコンプレックス系を使用する、リガンドを検出及び定量する方法に関する。本発明は、液体中のアビジン及びビオチンの量を特定的に決定する方法にも関する。

ビオチン−アビジンコンプレックス系は、不均質方式及び均質方式の両方においてイムノアッセイを行うのに使用することができる。それは特に均質方式において液体中の大きい分子（例えば約２０，０００ダルトン又はそれ以上の分子量を持った分子）の存在及び量を決定するのに良く適している。故に、それは２０．０００ダルトン以上の分子量の物質（例えばリガンド）の検出及び定量に蛍光偏光イムノアッセイの使用を広げることが可能である。

本発明の方法に従えば、物質をビオチンに共有結合により結合させてビオチンで標識しｔ；物質を形成し、この物質はリガンド又はリガンドに対する特異的結合パートナ−であつり、これはそれぞれビオチンで標識したリガンド及びリガンドに対するビオチンで標識した特異的結合パートナ−の生産をもたらす。ビオチンは蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　＋ｎａｔｅｒｉａｌｓ）（ビオチンで標識した発蛍光団）にも共有結合により結合せしめられる。

更に、発蛍光団へのビオチンのこの結合は、未知量のビオチン又はアビジンを含有する溶液の蛍光偏光を測定するための下記する本発明の方法の使用の基礎にもなっている。

液体中のリガンドを定量するだめの本発明の方法に使用される基礎的成分は、ｌ）ビオチンで標識した物質、２）ビオチンで標識した発蛍光団、３）液体又は試料（存在及び／又は量を決定すべきりガンドーー問題のりガント、を含有する）、４）問題のりガントに対する特異的結合パートナ−及び５）アビジンである。

本発明の方法の１つの態様においては、イムノアッセイは均質７オーマツトで行なわれる。即ち、本発明に従う液体中のりガントの存在及び量を決定する際にビオチン−アビジンコンプレックスを使用する１つの方法は、下記のとおりである。問題のリガンドについて分析されるべき既知容量の液体を、ビオチンで標識されている既知量の問題のリガンド、成る量の問題のりガントに対する特異的結合パートナ−、ビオチンで標識した発蛍光団及びアビジンとインキュベーションする（−緒にする）。

得られる組み合わせを特異的結合反応（リガンドとその特異的結合パートナ−との反応）が起こるのに適当な条件下に保つ。蛍光偏光はアビジンの添加の前及び後に既知の方法を使用して測定される。蛍光偏光の差（例えばアビジンが存在している場合と存在していない場合）は逐次に又は同時になされる。即ち、既知量のアビジンを、他の成分と共に又は他の成分が一緒にされそして特異的結合反応が起こつＩ；後に加えられる。

第１の場合には、蛍光偏光は同時に測定され、後者の場合には、蛍光偏光は逐次に測定される。この変化は液体中のリガンドの存在及び量を示すものとして役立つ。前記−緒にしたものの蛍光偏光をアビジンを含まない対照の蛍光偏光と比較することも可能である。バックグラウンド蛍光偏光（成分自身により引き起こされる）は、アッセイの感度を増加させるために下記の如く決定しそして差し引くことも可能である。

均質方式でも使用することができる本発明の方法は、ビオチンで標識した発蛍光団、問題のリガンドについて分析されるべき液体、リガンドに対する特異的結合パートナ−、ビオチン−アビジンコンプレックスに結合したリガンド及びアビジンを使用する。液体中のリガンドの存在及び量を決定するこの方法においては、ビオチンが結合しｔ；リガンドはその特異的結合パートナ−又はアビジンと削具て反応させる。第１の場合には、得られるコンプレックス（ビオチンが結合したリガンド／特異的結合パートナ−）、ビオチンで標識した発蛍光団及びアビジンを問題のりガントについて分析されるべき既知容量の液体に加える。第２の場合には、得られるコンプレックス（ビオチンが結合したリガンド・アビジン）、ビオチンで標識した発蛍光団及び特異的結合パートナ−を問題のリガンドについて分析されるべき既知容量の液体に加える。蛍光偏光の変化（アビジン又はリガンドの添加の前及び後）を測定し、この変化は問題のリガンドの存在及び量のインディケータ−として働く。別法として、インキュページ冒ンした組み合わせ物の蛍光偏光をアビジンを含まない対照の蛍光偏光と比較することができる。

この方法の他の態様においては、問題のりガントについての特異的結合パートナ −を含む不溶性相を使用する。この態様はそれらの特異的結合パートナ−に対する１つ又はそれより多くの結合点又は部位を持ったりガントの測定に有用である。この系の成分は、特異的結合反応（例えばりガントとその特異的結合パートナ −との間で）が起こるのに適当な条件下にインキュベーションされる（−緒にされる）。特異的結合反応に続いて、可溶性相の蛍光偏光を測定する。

特に、液体中のリガンドの存在及び量は下記の如くして決定される。

リガンドに対する特異的結合パートナ−を含む不溶性相を、問題のリガンドについて分析されるべき既知容量の液体及びビオチンで標識しｔ；リガンドと共にインキュベーションする。未反応の試薬（可溶性相内ににある）をインキュページ磨ンの後に不溶性相から分離しそして可溶性相の蛍光偏光を測定する。ビオチンで標識した発蛍光団及び既知量のアビジンを次いで可溶性相に加える。再び公知の方法を使用して蛍光偏光を測定する。蛍光偏光の変化を決定し、これは液体中のりガントの存在及び量をを示すものとして働く。別法としてインキュベージ１ンされた組み合わせ物の蛍光偏光をアビジンを含まない対照の蛍光偏光と比較することができる。

他の態様においては、問題のリガンドに対する特異的結合パートナ−を含む不溶性相をその特異的結合パートナ−に対する少なくとも２つの結合点又は部位を有するリガンドと反応させる。ビオチンで標識した結合物質及びアビジンを加える。成分を、特異的結合反応（例えぼりガントとその特異的結合パートナ−間の）が起こるのに及びビオチンとアビジンが結合するのに適当な条件下に一緒にする。可溶性相を不溶性相から分離しそして未結合アビジン（例えば可溶性相の）のアリクナートを取り出しモしてビオチンで標識した発蛍光団と反応させる。特異的結合反応が起こった後、可溶性相の蛍光偏光を測定する。

特異的結合パートナ−に対する１つより多くの結合点又は部位を持ったリガンドの存在及び量を決定するのに使用することができる本発明の別の態様は、問題のりガントに対する特異的結合パートナ−を含む不溶性相の使用を伴う。この態様においては、不溶性相を、問題のリガンドについて分析されるべき既知量の液体及びリガンド（固相特異的結合パートナ−に結合されている）に対する特異的結合パートナ−とインキュベーションさせる。インキュベージ１ンは特異的結合反応が起こるのに適当な条件下に行なわれる。未反応試薬を不溶性相から分離しそして既知量のアビジンを不溶性相に加える。不溶性相の蛍光偏光を公知の方法を使用して決定する。未反応試薬を再び不溶性相から分離しモしてビオチンで標識した発蛍光団を不溶性相又は分離した液体相に加える。不溶性相上のアビジン又は液体相の未反応アビジンへのビオチンで標識した蛍光物質の結合による蛍光偏光を決定する。蛍光偏光の変化は液体中のりガンどの存在及び量の指示として働く。

本発明の方法は、問題のヌクレオチド配列（即ち、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の決定に使用することができる。液体中のＤＮＡの存在及び量を決定する際のその使用は下記の如くである。

問題のＤＮＡを含む既知容量の液体をニトロセルロース固体相（例えばニトロセルロースフィルター）上に置く。問題のＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列を持ったビオチンで標識したＤＮＡを、ニトロセルロース固体相に加える。結合したビオチンで標識したＤＮＡ及び遊離のビオチンで標識したＤＮＡを分離しそしてアビジン及びビオチンで標識した発蛍光団と反応させる。アビジンに対するビオチン−発蛍光団の結合により引き起こされる蛍光偏光の変化は、公知の方法を使用して測定される。

本発明の方法に従って行なわれるリガンド決定は、非競合的結合反応又は競合的結合反応の使用により達成することができる。

本発明の方法は、放射性試薬を使用しないで、液体中の問題のリガンドの存在及び量を迅速に決定することを可能とする。

同様な方法において、ビオチン又はアビジンについての特異的アッセイに関する本発明の方法は、迅速に（即ち約５分間で）アッセイを行うことを可能とする。

発蛍光団へのビオチンの結合は、ビオチン又はアビジンを決定するための現在利用できる最善の方法に対して５−１０倍の感度の増加を達成する。

発蛍光団又はビオチンのみを定量するだめの本発明の方法は、現在利用可能な方法で検出することができるよりもはるかに少量の試料中のアビジン及びビオチンを検出することを可能とする。この方法は、コンプレックスを形成しｔ；蛍光分子及びコンプレックスを形成していなし〜蛍光分子（即ち、高分子量分子に結合した蛍光分子及び小さな分子に結合した蛍光分子）は、それらが放出する光の偏光の程度の測定により区別されうる。かくして、小さな分子は溶液中で迅速にタンブルし、偏光による励起の後に放出される光の偏光解消が続くという結果になる。しかしながら、大きい分子は、よりゆっくりとタンブルし、その結果、放出される光のいくらかは偏光し！こままである。コンプレックスを形成した分子及びコンプレックスを形成していない分子はそれらの偏光の程度に基づいて区別することができる。

本発明の方法を使用して、アビジン／ビオチン分析の現存の方法で検出することができるよりも少ない量の試料中のアビジン（例えば、約５ｎｇ／ｒｎＱ）及びビオチン（例えば約４０ｐｇ／ｍのを検出することか可能である。

図面の簡単な説明８１図は、ビオチンで標識した発蛍光団、ビオチンで標識したりガント及びアビジンを一緒にしｔ；ときに起こる反応及び蛍光偏光に対する効果の略図である。

第２図は、アビジンのアッセイのための標準曲線である。ビオチン−フルオレセインコンプレックスの偏光の変化はアビジン濃度の関数として示されている。ビオチン−フルオレセイン濃度はＯ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ−７，４）中の１× １０−９Ｍである。

第３図は、本発明の方法に従う均質方式において行なわれるイムノアッセイの略図である。

第４図は、本発明の方法に従う不均質方式で行なわれるイムノアッセイの略図である。

第５図は、ビオチン−フルオレセインの偏光に対する。８０ｎｇ／ｍＱアビジンの存在下にビオチン−抗原の効果の略図である。データ点は単一測定である。

第６図は、ビオチン−フルオレセインの偏光に対する、逐次に加えられた６０ｎｇ／ｍＩ２ビオチンーウサギＩｇＧ及び８ｏｎｇ／ｍＱアビジンの存在下の抗− ウサギＩｇＧの効果の略図である。誤差バーは抗体なしの対照と同じ初期偏光に規格化された２つの異なる日の実験の高、低及び平均である。

第７図は、ビオチン−フルオレセインの偏光に対するアビジン：ビオチン−抗ウサギＩｇＧの存在下のウサギＩｇＧの効果を示す。

本発明の詳細な説明本発明の主題である蛍光偏光の測定によって液体中の問題のリガンドを定量する方法は、ビオチンとアビジンの高い結合効果を利用する。本方法は均質的な結合方法及び不均質的な結合方法の両者で使用することができる：しかし競合的な均質結合又は非競合的な均質結合方法が好適である。

液体中における問題のりガントの存在及び量の測定はビオチン蛍光偏光検出系の使用によって行われる。この系の使用はビオチン又はビオチンに結合したリガンドの検出及び定量手段として、ビオチンに対するアビジンの高度な結合親和性を利用する。又アビジンの代わりに抗ビオチン抗体を使用することも可能であり、例えば単クローン性抗体が使用できる。

本発明の方法において使用される基本的な成分は＝１）一般にビオチンで標識したリガンドであるが、ビオチンで標識した特異的結合パートナ−であることもできる、ビオチンで標識した試薬；２）ビオチンで標識した発蛍光団：問題のりガントについて分析されるべき試料：４）問題のりガントに対する特異的な結合パートナ−；及び５）アビジンである。

一般にこれらの成分は一時に又は選択された順序で一緒にされる；末法が使用される測定上の要件は、ビオチンへのアビジンの結合が得られる選択された方法の能力（例えば、蛍光偏光の測定、及び液体中の問題のリガンドの存在及び／又は量の指示体としてそれを利用することを可能とする能力）である。

本発明の方法は均質的結合方法又はインムノアツセイ（即ち、標識されｔ；試薬の結合しｔ；又は遊離の７ラクシ」ンの分離を必要としない方式）及び不均質的結合方法又はインムノアツセイ（即ち、二つの試薬フラクシコンに分離する明確な段階を必要とする方式）の両者で使用できる。

第１図はビオチンで標識したりガント又はアナライト、ビオチンで標識しに発蛍光団及びアビジンを一緒にした時に、それらの間で起こる反応の略図的な表現である。発蛍光団は蛍光性の物質であり、或波長における光を吸収して他の（長い）波長の光を発する性質を有する。図示のようにアビジンはビオチンで標識したリガンドに結合し、ビオチンで標識した発蛍光団への結合に利用できるアビジンの結合座席をブロックする。アビジンは又ビオチンで標識した発蛍光団とも結合し、蛍光性コンプレックスを与える。最後に相当量のビオチンで標識した発蛍光団は未結合（遊離）のままであり、迅速な回転にさらされる。

小分子からの蛍光の放射は、小分子が大きい分子とコンプレックスを形成した時に偏光するという事実は又、本発明の方法を使用して試料中のアビジン及びビオチン濃度の定量の基礎である。

本発明のアッセイは、蛍光性物質（発蛍光団）及びビオチンを結合することにより小さい蛍光性ビオチン・コンジュゲートが形成されるという点でこの事実を利用している。発蛍光団は蛍光性物質であり、一つの波長で光を吸収する性質を有している。二種の間の結合は共有結合であることが好ましい。本文中に記載されるように、本アッセイはフルオレセインを利用するが、偏光を示す他の発蛍光団（例えばローダミン、ピリジン誘導体、ウンベリフェロン、ポルフィリン）を使用することができる。

本発明の方法により行われるアビジンのアッセイは、フルオレセイン−ビオチン・フンシュゲート及びアビジンが結合する溶液の蛍光偏光の測定を基礎としている。未知の量のアビジンを含む溶液の蛍光を、第２図に示されるような標準曲線と比較し、こうして試料中のアビジンの濃度を定量する。この方法を使用すれば、約５ｎｇｌＴＤＱもの低濃度のアビジンが検出される：アッセイ範囲は約２０倍である。

本発明の方法によって行われるビオチンのアッセイは未知の量のビオチンが含まれる溶液の蛍光偏光の測定を基礎としている。本方法によれば、アビジンが未知のビオチン濃度を有する溶液に添加され：溶液は室温で短時間（例えば約２−３分間）インキュベートされる。次いで蛍光性のビオチン・コンジュゲート（例えばビオチン−フルオレセイン）を最終濃度がｌＸｌ０−”Ｍとなるように充分量添加し；−緒にして得られた物を再度短時間（例えば約２−３分間）インキュベートする。次いで蛍光偏光を測定し、標準曲線と比較する。本発明の方法を用いて、ビオチン濃度が約４Ｏ−４００ｐｙ／ｒｎＱである試料の分析を行うことができる。

第１表において、現在使用できるアビジン−ビオチンアッセイの感度と本発明の感度との比較を示す。

第　１　表　利用し得るアビジン：ビオチン　アッセイの感度力　法　　　　　　　感　　　度　　　　　　典　　拠［アビジン］　　Ｃビオチン］ｎｇ／ｗ（ｌ　　　ｎｇ　／ｎＱ蛍光測定　　　１７０．０００　　２５０　　　モック（Ｍｏｃｋ）等比色　　　　　　５０，０００　　１００　　　グリーン（Ｇｒｅｅｎ）比色　　　　　　　　　　　３　１０〇　　ニードバラ（Ｎｉｅｄｂａｌａ）等放射性同位体法　　５．０００　　　５０　　　グリーン放射性同位体法　　　　１００　　　−　　オマリー（０’Ｍａｌｌｅｙ）電位差測定法　　　５．０００　　　２０　　　ゲボース（Ｇｅｂａｕｓｅ）＆レチナイト（Ｒｅｃｈｎｉｔｅ）分光光度法　　　　３．０００　　　５　　　カリコ（Ｃａｒｒ　１ｃｏ）放射性同位体法　１０．０００　　　　０．６　　レフテンマイヤー（Ｒｅｔｔｅｎｍｅｉｅｒ）蛍光測定法　　　　　　４０　　　　０．５　アル−ハキエム（Ａ　Ｉ　−Ｈａｋ　ｉｅｍ）蛍光測定法　　　　　　　５　　　０．１　本発明アッセイの条件はビオチン、アビジン及びビオチン−フルオレセインの逐次的添加、及びビオチンの添加後及びビオチン−フルオレセインの添加後に短時間のインキュベージ３ン期間を置いての室温状態である。

偏光値は少なくとも数時間安定で、最高１％までの血清は妨害しなかった。

本発明のビオチン−アビジン　コンプレックス法は第３図に示されたように均質インムノアッセイにおいて使用できる。図示のように次ぎの成分が使用される：１）ビオチンで標識したリガンド（本文ではビオチンで標識した抗り；２）ビオチンで標識した発蛍光団；３）既知の量の液体試料中に存在する問題の未知の量のリガンド（本文では抗ｗ）；４）問題のりガントのための特異的結合パートナ −（本文では抗原に特異的な抗体）；及び５）アビジン。

この場合には、特異的な結合反応（即ち、リガンド［抗原］及びその特異的なパートナ−［抗体１の間の反応）が起こるのに適当な条件下で下記のもの：１）問題のりガント（抗原）を分析すべき既知量の液体；２）既知量のビオチンで標識したリガンド（抗原）；３）既知量の特異的に結合するパートナ−（抗体）；４）ビオチンで標識しＩ；発蛍光団；及び５）一定量のビオチン；がインキュベート（−緒に）される。成分ｌ−４は同時に又は逐次的に一緒にすることができる。感度をより大きくするためには、成分を逐次的に一緒にし、そして成分を配合する順序を変えることも可能である。例えば、ビオチンで標識しｔ；リガンド、未知の量の問題のリガンド（既知な容積の液体中の）及び特異的な結合パートナ −を−緒にし、それらをインキュベートすることも可能である。

アビジンを添加し、次いでビオチンで標識した発蛍光団を添加する。各成分は又下記の：ビオチンで標識したリガンド；未知の量のリガンド（既知容積の液体中の）；問題のりガントと特異的に結合するパードナー：及びアビジン：の順序で逐次的に一緒にすることもできる。

蛍光偏光はアビジンの添加の前及び後に、既知の技術を用いて測定することができる。別法として、蛍光偏光は総ての５種の成分を一緒にしｔ：後に測定され、得られる測定値をアビジンを含まない対照（即ち、上記に挙げｆ：　ｌ　−４の成分を含む）の測定値と比較することもできる。アビジンが存在する場合の偏光の増加はビオチンで標識した発蛍光団への結合を表示するものである。偏光の増加の範囲は分析される液体中に存在する問題のりガントの量に逆比例的な関係にある。例えば、分析される液体中に存在する抗原の量が減少するにつれて、ビオチン−抗原の抗体との結合は増大する。ビオチン−抗原−抗体コンプレックス中のビオチンは添加されたアビジンとの反応に利用されない。従って、大量の抗原が液体中に存在する場合よりも、ビオチン−発蛍光団のアビジンとの結合が一層多く起こる。その結果、多量のビオチンで標識しｔ：　ｑ　蛍光団がアビジンに結合する；アビジン−ビオチン発蛍光団は蛍光性であり、偏光は多量の抗原が存在する場合よりも大きい。液体中の問題のりガントの量は液体の蛍光偏光を既知濃度の標準物の蛍光偏光と比較することにより定量することができる。例えば、アビジンの種々の既知の濃度の液体の蛍光偏光を測定することにより作成されＩ；標準曲線と比較することができる。別法として、液体の蛍光偏光と、その蛍光偏光が読み取られている標準液体の蛍光偏光とを比較することにより定量することができる。

バックグラウンドの蛍光を差し引いて、アッセイの感度を増大させることも可能である。成分それ自身の存在によるバックグラウンド蛍光を差し引くには、下記の手順、即ち；ｌ）問題のりガントを分析すべき既知量の液体、既知量のビオチンで標識しＩ；リガンド、既知量の特異的に結合するパートナ−及びアビジンを一緒にすること：２）−緒にした物の蛍光偏光を測定すること；により行われる。これは試料自体の蛍光偏光の測定に帰着する。上記のようなアビジンを含まない対照との比較の結果、試料中に存在する問題のりガントの量の定量的測定が得られる。

アビジンを含まない対照のバックグラウンド蛍光は又、上記の成分１１２及び３を一緒にし、蛍光を測定し、成分４を加え、再度蛍光を測定し、そして二つの測定値の間の差を測定することによって差し引き又は除去することができる。次いでアビジンを含まない一緒にした物の蛍光偏光を測定する：これは対照の蛍光偏光の測定値を提供する。

抗体である問題のリガンドについて均質インムノアッセイが行われるのであれば、その手順は抗原の定量についての上記のものと同様である。

かようなアッセイは抗−風疹（ｒｕｂｅｌｌａ）抗体、抗−ＤＮＡ抗体及び抗− インスリン抗体のような問題の抗体を定量するために有用である。しかしここで、問題の抗体について分析すべき既知量の液体は、既知量のビオチンで標識した特異的な結合パートナ−（この場合にはビオチンで標識したウィルス又はインスリンのようなビオチンで標識した抗原であル）、ビオチンで標識した発蛍光団及びアビジンと共にインキュベートされる。成分は同時に又は逐次的に一緒にしてもよく、その−緒にする順序は（例えば感度を増大させるｔ；めに）変えることができる。

抗原のアッセイの説明の際上記に述べたように、蛍光偏光における変化の測定を行うｔ；めに、アビジンの添加の前と後に蛍光偏光を測定することができる。別法として、アビジンを添加した後で測定し、アビジンを含まない対照の蛍光偏光と比較することができる。この場合も又試料のバックグラウンド蛍光を差し引いて、アッセイの感度を増大させることができる。

均質結合方法における本発明の方法の使用は、ビオチンで標識したリガンド（例えばビオチンで標識した抗原）をその特異的に結合するパートナ−（抗体）と予め反応させて、ビオチンで標識しＩ：リガンド／特異的に結合するパートナ−（ビオチンで標識した抗原／抗体）コンプレックスを形成するように変えてもよい。得られるコンプレックスをビオチンで標識した発蛍光団、問題のりガントの未知量を含む既知容積のりガント試料及びアビジンと共にインキュベートする。上記のように、蛍光偏光はアビジンの添加の前と後に測定され、その変化が定量される。蛍光偏光の範囲は試料中に存在する抗原の量と反対に変化する；即ち、抗原が増加すれば、偏光が減少する。

他の具体化においては、ビオチンで標識した特異的な結合パートナ−をアビジンと事前に反応させて、ビオチンで標識した特異的な結合パートナ−／アビジンを生成させる。得られるコンプレックスを未知量のりガントを含む既知容積の液体試料と共にインキュベートする。ビオチンで標識した発蛍光団を添加して蛍光偏光を測定する。偏光の量をアビジンを含まない対照と比較する。

不均質性インムノアッセイに８ける本発明の方法の使用の実例は、第４図に示されている。図示のように使用される成分は＝１）ビオチンで標識した試薬（この場合はビオチンで標識した抗り；２）ビオチンで標識しｔ；発蛍光団：３）リガンドの既知の容積中の問題の未知量のりガント（この場合は抗り；４）固体相に結合する特異的な結合パートナ−（この場合は抗原に特異的な抗体）；及び５）アビジン：である。この場合は、問題のりガント（抗原）について分析されるべき既知量のリガンド、ビオチンで標識しｔ；リガンド及びリガンドに対する特異的な結合パートナ−（抗体）を含む不溶性相が、特異的な結合反応が起こるのに適当な条件下でインキュベートされる（−緒にされる）。インキュベージタン後、反応混合物の不溶性相及び可溶性相を分離する。既知容積の可溶性相を、第４図の下部に示すように、ビオチンで標識した発蛍光団及び既知量のアビジンと共にインキュベートする。アビジンの添加の前及び後に、既知の技術を用いて蛍光偏光を測定する。別法として、最終的に一緒にしｌ；物の蛍光偏光を測定しくインキュベージタン後）、アビジンを含まない対照の蛍光偏光と比較することもできる。アビジンが存在する時の偏光の増加は、ビオチンで標識した発蛍光団への結合を示すものである。偏光の増加の範囲は、分析される液体中に存在するリガンドの量と間接的に関係している。蛍光偏光測定値を標準（例えば既知濃度の溶液の蛍光偏光を表している）と比較して、存在する問題のリガンドの量が定量される。ここで又バックグラウンド蛍光を差し引いてアッセイの感度を上げることができる。これは下記のようにしてなされる：問題のりガント（抗Ｗ）について分析される可き既知量のりガント、ビオチンで標識したリガンド及びリガンドに対する特異的な結合パートナ−（抗体）を含む不溶性相を、特異的な結合反応が起こるのに適当な条件下でインキュベートする（−緒にする）。不溶性相及び可溶性相を分離する。既知容積の可溶性相をアビジンと一緒にし、蛍光を測定する。

引き続きビオチンで標識した発蛍光団を添加して再度蛍光を測定する。

こうしてバックグラウンドを差し引いた蛍光偏光の定量値を得ることができる。

液体中の検出されるべきリガンドが、特異的な結合パートナ−に結合できる一つ以上の点又は座席を有していれば、不均質結合方法において本発明の方法を使用する別な手段も可能である。この場合には検出すべきリガンド（例えば抗原）に対し特異的な結合パートナ−（例えば抗体）を含む不溶性相を、分析すべき既知量のりガント及び固体相の特異的結合パートナ−に結合しｔ；リガンドに対するビオチンで標識した特異的結合パートナ−と共に、逐次的か又は同時的にインキュベートする。可溶（液体）相（未反応試薬）及び不溶性相を分離し、不溶性相と共に既知量のアビジンをインキュベートする。可溶性相（未反応のアビジン）と不溶性！Ｂ（結合し！；アビジン）を分離し、可溶性相中の未反応のアビジン又は不溶性相上のアビジンのいずれがと共にビオチンで標識した発蛍光団をインキュベートする。最後のインキュページ覆ン（ビオチンでｊｌＩ識した発蛍光団と一緒の）の前及び後に、既知の技術を用いて蛍光偏光を測定する。偏光の増大は不溶性相に結合したアビジン又は可溶性相中の未反応のアビジンのいずれかにビオチンで標識しｔ；発蛍光団が結合したことによる。第一の場合には、可溶性相に結合したアビジンが測定され、蛍光偏光は試料中に存在している問題のりガント（例えば抗原）に直接関係しており；リガンドが増加すると蛍光偏光が増大する。

遊離のアビジンが測定される第二の場合には、蛍光偏光は存在するリガンドの量に逆比例的な関係にあり：リガンド濃度が増加すると蛍光偏光が減少する。更に、第一のインキュベージｇンの可溶性相はアビジン及びビオチン−発蛍光団と逐次的に反応できる。

競合結合ズ応の場合に、ビオチンｊ二結合したリガンドとビオチンで標識した蛍光化合物（発蛍光団）はアビジンへの結合で競合する。ビオチンに結合したりガントの濃度が増大すると、ビオチンで標識した蛍光化合物の結合は減少する；即ち、ビオチンに結合したりガントの濃度が高いと、ビオチン−発蛍光団のアビジンとの結合は、ビオチンに結合したリガンドの濃度が低い場合よりも少なくなる。蛍光偏光の理論によれば、ビオチン−発蛍光団のアビジンとの結合により偏光の増加を招き：偏光の強度はアビジンに結合しｔ；ビオチン−発蛍光団の濃度に関係している。

非−競合的結合反応の場合には、競合的な手段と同様に鋭敏なアッセイを行うために、物質（例えばビオチン、リガンド、アビジン）の逐次的添加が使用できる。

本発明Ｉこより測定できるリガンドは一つ又は多数の特異的結合パートナ−が提供できる化合物である。こうした特異的結合パートナ−は、他の物質を除外してリガンドに特異的な親和性を有する任意の物質又は物質群である。本発明の方法により定量できるリガンドが例えば、抗原、抗体、ハプテン（薬品又は他の有機性小分子）、核酸系列（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）天然に産する受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を有する他の物質を含んでリガンドが抗原であるときには、抗原を検出するために使用される特異的に結合するパートナ−は、通常抗原がを推動物の血流中に導入される時に生じる対応する抗体である。本発明により測定できる抗原の例は、例えばポリペプチド及び蛋白質ホルモン類、ヒトＴｇＥ、及びアルファ７エトプロテイン、肝癌及び胎芽性腺癌を持った患者の血清中に生じる胎児性（ｆｅｔａｌ）抗原を含んでいる。リガンドが抗体である時には、誘発性抗原を特異的結合パートナ−として使用することができる。抗体力価のアッセイは例えば梅毒、風疹及び溶血性の連鎖球菌により起こる感染のような感染症の診断において特に有用である。

リガンドがハプテン（即ち、それ自身では抗体の生成を誘発しない蛋白を含まない物質）である時には、ハプテンを検出するために用いられる特異的結合パートナ−は、ハプテンが抗原担体に結合してを推動物の血流中に導入される時に生産される抗体である。本発明により測定できるハプテンの例は、エストロン、エストラジオール、テストステロン、プレグナンジオール及びプロゲステロンのようなステロイド；Ｂ１１及び葉酸のようなビタミン：トリオドチロニン、チロキシン、ヒスタミン、セロトニン、ジゴキシン、プロスタグランジン、アドレナリン、ノルアドレナリン、モルフイン、ホルモン、及びペニシリンのような抗生物質を含んでいる。

リガンドが天然に生じる受容体を有する物質である時には、受容体がリガンドに対して特異的な形態で分離できれば、リガンドを検出する特異的結合パートナ− として受容体を利用することができる。天然Ｉ；生じる受容体を有するリガンドは、例えばチロキシン、多数のステロイド、インスリン及びアンギオテンシン及び多数の他者のようなポリペプチドを含んでいる。この部類のリガンドに対する受容体は通常蛋白質又は核酸である。

非−競合的結合方法（即ち、“サンドイッチ“技術）を補助的に用いて本発明により測定されるリガンドは、特異的結合パートナ−を含む固体相及びビオチンでｌｌｌ！識した特異的結合パートナ−の両者と結合するｔ；めに、それらの特異的結合パートナ−に結合する点又は座席を少なくとも二つ持たなければならい。

競合結合方法が使用される場合はこのことは不必要である。

ビオチンで標識した物質の製造（即ち、ビオチンで標識した特異的結合パートナ −又はビオチンで標識したりガント）は、ジメチルホルムアミドのような適当な溶剤中で、ビオチンＮ−ヒトミキシスクシンイミドエステル（ＢＮＨ３）で標識されるように全体を単に混合することによって実行することができる。ＢＮＨ３の使用が好適であるが、他の適当な試薬及び／又は方法を使用してもよい。

ビオチンで標識した蛍光化合物（発蛍光団）は偏光を呈する、ビオチンで標識された任意の蛍光化合物であることができる。例えばフルオレセイン、ローダミン、ビリン誘導体、ウンベリフェロン及びポルフィリンを使用することができる。

ビオチン−フルオレセインは本発明の方法において特に有用であり、下記のようｊこして製造することができる：フルオレセインインチオシアネート１０１１１０１ｌμモル）を２１１１ｇのジメチルホルムアミドに溶解し；室温で８μｇのエチレンジアミン（１２０μモノリを添加する。生じる沈澱をジメチルホルムアミド中で再結晶し、濾過して乾燥する。（沈澱は直ちに生じるが；しかし反応は４０時時間性させる。）フルオレセイン−エチレンジアミン付加物６．５ｍｇ（１４μモル）を２−のジメチルスルホキシドに溶解し；９１１９（２６μモル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンを添加し、得られる混合物を室温に数時間放置する。上記の反応混合物１００μａを予め平衡処理されたシリカゲルカラム（２Ｘ１．５ｃ肩、２３０−４００メツシユ、孔径６０人）上でクロマトグラフにかけ、メタノールで溶離することにより生成したコンジュゲートを精製する。

測定されるリガンドに対する特異的結合パートナ−を含む不溶性相の製造は、既知の方法によって実施することができる。例えば、特異的結合パートナ−を架橋結合により、共有結合又は物理的結合によって固体担体に付着させることができる。本発明において使用される固体担体の例は、ポリプロピレン菅、ポリスチレン微小滴定板（ｍｉｃｒｏｔｉｉｅｒ）及びナイロン・ビーズを含む。ナイロン・ビーズが使用される時には、適当な抗体を、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、４８：２２６　（１９７４）に記載されたフォールスチッチ（Ｆａｕ　１ｓｔ　１ｃｈ）’！！’の方法によりビーズに共有結合的に連結することができる。

問題のりガンどの存在及び量が測定できる液体は、天然に生じたもの又は合成のものであってもよい。多くの場合、液体は血清、血漿、全血、尿、羊膜液及び脳を髄液のような生物学的液体である。リガンドを適当な非水性液体中に溶解又は分散させることにより又リガンドを測定することもできる。

蛍光偏光の測定は既知の技術及び標準的な装置を用いて寅行される。

例えばＰｈｙｓｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（第２版）、５３５−５７２、Ｗ、Ｈ，フリーマント（Ｆｒｅｅｍａｎｔ）社（１９８２）所載のり、７ライフエルグー（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ）著〜フルオレセンス・スペクトロスコピー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を参照されたい。

次いで本発明を下記の実施例によって説明するが、これらの実施例はいずれの意味でも本発明を限定するものと考えるべきではない。

ｍ−１＝蛍光ビオチン・コンジュゲートの合成アビジン、ビオチン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン、及びフルオレセインインチオシアネートはシグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋ａｉｃａｌ）社から購入した。総ての溶剤及び緩衝液は試薬級の品質のものであっｔ；。

偏光値はキセノン・アーク灯、４９１ｎｍに設定された励起ビームのモノクロメータ−５及びバンド幅１０ｎｍの発光ビーム中の５２０ｎｍのフィルターを備えたＳＬＭ蛍光計を用いて測定された。偏光フィルターは、発光フィルターが励起フィル−ターに対し平行又は垂直に配列できるように励起及び発光ビーム中に置かれた。偏光値を測定するために、ＳＬＭ　５ＰＣ−８２２データ処理モジュールを光量子計数モードとして使用した。

ビオチン−フルオレセインの合成７ルオレセインイソチオシアネ一ト１０ＴＢｇ（２５μモル）を２ＩＩＩｇのジメチルホルムアミドに溶解し：室温で８μｇのエチレンジアミン（１２０μモル）を添加した。直ちに沈澱が生じた。反応は室温で４０時間続行させｔ：。沈澱をジメチルホルムアミド中で再結晶し、濾過して乾燥した。フルオレセイン−エチレンジアミン付加物６．５ｍｇ（１４μモル）を２＋ａｆｆのジメチルスルホキシドに溶解し；９ｍｇ（２６μモル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンを添加し、得られる混合物を室温で数時間放置した。上記の反応混合物１００ μｇを予め平衡処理されたシリカゲルカラム（２Ｘ１．５０票、２３０−４００メツシユ、孔径６０人）上でクロマトグラフにかけ、メタノールで溶離することによりコンジュゲートを精製した。アビジンとのコンプレックス生成の際に最大の蛍光偏光変化を示す先行フラクシヨンを存する三つの蛍光性ピークが分離されｔ；。

ガラス又はプラスチックチューブ又は使捨て可能なキュベツトに、０゜１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７−４中のｌＸ１０−’Ｍビオチンーフルオレセイン１．３ｍｆｆを加えた。ビオチン−フルオレセインコンジュゲートの濃度は本質的にアッセイの感度を決定する。その理由は、アビジンに対するビオチンの高い結合定数は、両者の実質的に完全なコンプレックス杉皮等モル濃度で起こることを可能とするからである。コンプレックスの濃度は、２０：１試料：緩衝液蛍光比を与えるように選ばれた。緩衝液蛍光を減少させるために特別の注意は払わなかった。この溶液に、第２図に示された濃度を生じるのに十分なアビジンをルーチンに加えた。ビオチン−フルオレセインコンジュゲートはｌμａという小さな容量でアッセイに加えることができる。アッセイ容量（このアッセイ構成では総計１−３５ｍＱ）の残りは、アッセイ試料であることができ、かくして試料は実質的に希釈を行なわれない。アッセイ混合物は室温で少なくとも３分間ンキュベーシｌンさせた。次いで混合物の蛍光偏光を測定した。これらの結果はアビジンの未知の濃度を持った試料中のアビジンを測定するのに使用するための標準曲線（ｎｇ／ｍｃでのアビジン濃度対偏光）を構成するのに使用された。代表的な標準曲線が第２図に示されている。

（既知の）異なる濃度のビオチンを含む試料にアビジン番加えた。アビジンは上記緩衝液に４０ｎｇ／ｍ１２（５Ｘ　１０″″１９Ｍ）の濃度で加えられた。

この混合物を３分間室温でインキュベージジンし、ビオチン−フルオレセインを加えてｌＸｌ０″″”Ｍの最終濃度を得た。混合物を追加の３分間室温でインキユベーシヨンしそして蛍光偏光を決定しｔ；。この実施例で使用したアビジンの濃度（４０ｎｇ／ｍＱ）は、最大偏光変化の約５０％下記の物質がシグマ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ）から得られた：アビジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン、フルオレセインインチオシアネート及びヤギ抗つサギＩｇＧＩｇＧ、ＩｇＧ７ラクシヨン。ウサギＩｇＧフラクシジンはペルーフリーズ・バイオロジカル（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）から得られた。すべての溶媒及び緩衝液は試薬銘柄の品質であっｊ；。ビオチン−フルオレセインは上記の如くして合成された。

ビオチン化されたウサギＩｇＧの合成は下記の如くして行なわれた：ウサギＩｇＧ（２ｍｇ、］　２．５ナノモル）をｐＨ−７，４リン酸緩衝液２ｍ１２に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンをＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解しそして０．３＋ｎｇ（８８０ナノモル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンを加えそして室温で２時間インキュベーションした。ビオチン化混合物は、遊離ビオチンからビオチン化抗体を分離させる溶離剤と同じ緩衝液を使用して、セフ７デツクスＧ−２５（ｌｘ２５ｃｍ）でのクロマトグラフィーにより精製された。ビオチン：抗体比は１６であった。これは、２８０ｎＩ１１での吸収により抗体濃度を測定しそしてグリーン・エフ・エム、メソッズ・イン・ユンザイモロジー、マクコルマック・デー・ビー及びエル・ビー・ライト（編）１８Ａ：４１８（１９７０ＸＧｒｅｅｎ、　Ｎ、Ｍ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ＭｃＣｏｒｍａｃｋ　Ｄ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｌ。

Ｂ、　Ｗｒｉｇｈｔ（ｅｄ、）１８Ａ：４１８（１９７０））の方法によりビオチン濃度を測定することにより決定されたものである。

偏光値はキセノンアークランプを備えたＳＬＭ蛍光計、４９１止にセットされた励起ビームにおけるモノクロメータ及び放出ビームにおけるｌＱｎｗバンド幡５２０膓フィルタを使用して測定され！；。偏光フィルタは励起フィルタと平行又は垂直に放出フィルタを整列させることを可能とするために、両励起ビーム内に置いｔ；。ＳＬＭ　　５ＰＣ−８２２データプロセツシングモジユールを光子計数モードにおいて使用して偏光値を決定しＩ；。

抗体アッセイガラス又はプラスチックチューブ又は使捨て可能なキュベツトに、種々の量のヤギ抗ウサギＩｇＧを加えた。ビオチン−抗Ｗ（ウサギＩｇＧ）を加えて６０％ｇ／ｍＱの最終アッセイ濃度を得そして溶液を室温で１時間インキュページ腸ンした。次いでアビジンを加えて８０％ｇ／ｍｆｆの濃度とし、続いて３分の後Ｉ　Ｘ　ｌ　Ｏ−”Ｍの濃度が得られるのに十分なビオチン−フルオレセインを加えた。次いで偏光を測定した。すべての物質はＯ，１Ｍリン酸緩衝液中に構成された。抗体試料は、すべての他の成分を非常に小さい容量で加えることができるのでアッセイの全容量に近付くことができる。他の成分の濃度は下記の如くして決定された。

ビオチン−抗原濃度は、８０％ｇ／ｍＱの最終濃度が得られるのに十分なアビジンに種々の濃度のビオチン−抗原を加えることにより決定された。この組み合わせを３分間インキュベーションしＩ；。ビオチン−フルオレセイン（最終濃度ｌＸｌ０″″１Ｍ）を加えそして偏光を測定した。２０％の最大偏光変化を生じるビオチン−抗原のレベルが抗体及び抗原アッセイに対して選ばれた。

アビジン濃度は、ビオチン−フルオレセインの偏光に対する種々の濃度のアビジンの効果が決定されるとき８０％の最大偏光変化を生じるレベルを選ぶことにより選ばれた（第２図）。

ビオチン−フルオレセイン濃度は、緩衝液蛍光を減少させるのに特別の注意を払わないで２０；ｌ試料−緩衝液蛍光比を生じるように選ばれｔ；。

抗原アッセイ第５図に示された濃度を与える種々の量の抗原、ウサギＩｇＧをヤギ抗ウサギＩｇＧＩｇＧ（４，４μｇ／ｍＱ最終濃度）と１時間インキュベーションしｔ；。

上記の濃度を使用して、ビオチン−抗原を加えそして１時間インキュベージテンした。アビジンを加えそして３分間の後ビオチン−フルオレセインを加えそして偏光を測定した。

１時間のインキュベーシッン時間（抗体と抗［）を数分に減少させることができる。

このアッセイは適当な固相に結合した免疫学的成分により行うこともできる。これは表面に拡散させるためのより長い反応時間を必要とするが、改良されｔ；感度又は試料物質の妨害を取り除く手段を与えることができる。

提示されたアッセイは、分子量にかかわりなく分子に適用できる均質蛍光偏光イムノてツセイである。このアッセイの仕方を第１表に概略を述べる。このアッセイは抗原及び抗体の検出及び定量に有用である。それはいかなる結合タンパク質及びその受容体並びに小さな分子及びそれらの（大きい又は小さい）結合剤にも適用できる。

表　　１反応　　　　　　可変　　一定　　　　生成物　　　偏光発蛍光団のみ　　　　 −Ｂ−Ｆ　　　　　−低１、（第１図）　　　　アビジン　Ｂ−Ｆ　　　　Ｂ− Ｆ−アビジン高２、（第２図）　　　　　Ｂ−Ａｇ　　＋　アビジン　Ｂ−Ｆ　　　　　　低Ｂ−Ｆ　　　　アビジン−Ｂ−Ａ３、（第５図）　　　　　Ａｂ　　　＋Ｂ−ＡｇＢ−Ｆ−アビジン高アビジン　Ｂ−Ａｇ−Ａｂ −Ｆ４、（第６図）　　　　　Ａｇ　　　＋Ａｂ　　　　　Ｂ−Ｆ　　　　　　低Ｂ −Ａｇ　　　　Ａｇ−−Ａｂアビジン　アビジン−Ｂ−Ａｇ −Ｆ略号：　Ｂ−Ｆ−ビオチン−発蛍光団Ｂ−Ａｇ鱈ビオチン−ウサギ　ＩｇＧＡｂ　　麿ヤギ抗ウサギＩｇＧ　ＩｇＧＡｇ　　−ウサギ　夏ＫＧアッセイプローブ（Ｂ−Ｆ）は発蛍光団に共有結合により結合したビオチンであり、発蛍光団はこの場合にはフルオレセインである。偏光により励起されると、Ｂ−Ｆは光を放出し、これはこの小さな分子の迅速なタンプリングの故に偏光解消される（偏光が低い）、よりゆっくりとタンプリングする巨大分子アビジンとコンプレックス形成すると、偏光は高い（反応ｌ）。ビオチンとフルオレセインのコンプレックス形成は他の成分により調節される。ビオチンはりガント（例えば抗原）及びこの抗原ｔ：対して特異的結合パートナ−（例えば抗体）から成るコンプレックス形成対の１つの成分（例えば抗Ｗ、）に共有結合により結合される。ビオチン−抗原をアビジンとコンプレックス形成するのに十分な濃度で加えてＢ−Ｆをコンプレックス形成させないままとする（反応２）。抗体を最初に加えるならば、抗体はビオチン−抗原とコンプレックスを形成しそして立体ブロッキングによりアビジンがビオチン−抗原に結合するのを妨げる。

これはアビジンがＢ−Ｆとコンプレックスを形成して高い偏光をもたらすことを可能とする（反応３）。遊離抗原を最初に加えるらなば、抗原は抗体とコンプレックスを形成し、これはビオチン−抗原がアビジンとコンプレックスを形成することを可能とする。これは遊離Ｂ−Ｆ及び低い偏光をもたらす。

かくして抗体のアッセイは、反応３から成り、抗原のアッセイは反応４である。

各逐次の反応において起こる偏光の変化は図に示されたように種々の試薬の濃度に依存して起こる。

Ｂ−Ｆの偏光に対するアビジンを変えることの効果（反応ｌ）は第２図に示される。偏光はこの例では０．０６から０．２３まで変わり、ビオチン−フルオレセインのより高度に精製された試料は、０．０２−０−３１の偏光の変化を示す。

１　ｘ　１０−’Ｍアビジンの濃度が下記の反応に使用するために選ばれた。

抗体のアッセイ（反応３）のための標準曲線は第５図に示されてしする。

種々の濃度の抗体を上記ビオチン−抗原に加えそして１時間インキュベージテンした。アビジン及びＢ−Ｆを加えそして偏光を測定した。典型的な競合結合曲線をデータから作ることができる。より短いインキュベ−シコン時間を使用することができる。これはＩｇＧフラクションポリクローナル抗体でありそしてビオチン−抗原を中和するためにビオチン−抗原より高い濃度の抗体を必要とする。これは少なくとも一部は純度の欠如によるものであるが、アビジンによるビオチンへの接近を防止する！こめに１対１より多くのコンプレックスが必要であることも示す。アッセイの範囲はこの不純なフラクションについては約０．２−２０μ ｇ／ｍＱである。下記の抗原アッセイに使用するために３　ｘ　Ｉ　Ｐ　’Ｍ（４，４μｇ／ｍＯ）の濃度が選ばれた。

抗原のアッセイ（反応４）のための標準曲線が第６図に示されている。

アッセイ範囲は約４０−４００ｎｇ／ｍＱ（２Ｘ　ｌ　Ｏ″″”−２Ｘ　１０− 　’Ｍ）である。抗体を中和するのに必要な低い量の抗原は必要な抗体についての両説明（上記の原理参照）と合致している。必要なアビジン及び抗原レベルの当量に近いことは注目すべきであり、この方法の種々の工程を通じて感度の有意な損失がないことを示す。

％：不均質蛍光偏光イムノアッセイポリスチレン試験管を２０μｇ／ｍ１２０．００５Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳＸｐＨ７，４）のアフィニティー精製ヤギ状ウサギＩｇＧの溶液１ｍ１２で３日間コーティングした。この管’Ｈ）、０５ＭＰＢＳ（ｐＨ７，４）で２回洗浄しそして９００ｐ（ｌの０．０５ＭＰＢＳ（ｐＨ７−４）を充てんした。抗原の逐次希釈物を０．１２％トリトンＸ−１００中に調製し、１００μｇのアリフォートを抗体コーテイング管中で３７℃にて２．５時間インキュページ励ンしＩ；。

抗原−ビオチンを５０μ＜＋０．１２％トリトン　　Ｘ−１００ＰＢｓ中に加えて、最終濃度８４又は４２ｎｇ／ｍ１２を得た。この管を３７℃で一部インキユベーションした。次いでアビジンを５０ｐ１２ＰＢＳに加えて６９ｎｇ／ｍＱの最終濃度を得、この後均質アッセイ（実施例４参照）での最終濃度に匹敵する最終濃度でのフルオレセイン−ビオチンが統いた。

次いで蛍光偏光を測定した。

実施例６：同時アッセイこの方法に対する別法も又有効でありそして抗原アッセイにおける成分の数及び必要な添加の数の点でアッセイの筒素化をもたらすことも示された。これは、成分を逐次に一緒にするのではなくて先に成分を一緒にしそしてビオチン化抗原の排除を伴う。プロトコルの変動は明らかに少しの程度であるけれども、これはアッセイの基本を変える。上述の逐次のアッセイはビオチン−発蛍光団及びビオチン−抗原のアビジンに対する競合に基づいている。これは、大きい分子であるアビジンがビオチン−抗原に結合するのを立体的に妨げる抗体により調節される（ｍｏｄｕｌａｔａｄ）。同時アッセイにおいては、アビジン：ビオチン化抗体コンプレックスを前以て形成させる。アナライト（抗原）の添加は、小さなビオチン−発蛍光団がアビジンに接近するのを立体的に妨げるより大きいコンプレックスの形成をもｔ：らす。故に、ビオチン−発蛍光団とアビジンは結合しない。前以て形成されたアビジン：ビオチン化抗原コンプレックスヲ使用した抗体の同様な同時アッセイを行うことができる。

この方法においては、アビジンを１０：ｌアビジン：ビオチン−抗体比（これは変えてもよい）でビオチン化抗体と混合する。これは試薬として働く。このコンプレックスは、アビジンがこのアッセイに使用されるべきビオチン化−発蛍光団濃度と部位モル当量であるような濃度で使用される。種々の濃度のアナライト抗原をアビジン：ビオチン−抗体コンプレックスと短時間インキュベーションし、ビオチン−発蛍光団を加え、レセインの偏光に対するアビジン：ビオチン−抗ウサギＩｇＧの存在下でのウサギＩｇＧの効果を示す。

均等な方法当業者は、ルーチンな寅験を使用して、前記した本発明に対する多くの均等な方法を認め又は確かめることができるであろう。このような均等な方法は本発明の範囲内に包含されることを意図する。

拭楽雪　　架試俵ス＠＜（ｒ：　　　　　　　　　　　　　ブＯ”、ｔ）、”ｈ　ｒ：ｒｅ；７補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、特許出願の表示ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０　Ｏ０６７２、発明の名称液体中のりガントを検出及び定量する方法３、特許出願人住　所　アメリカ合衆国ペンシルベニア州１９３５５マルバーン・キングロード８８１氏　名　へペイ、　リチャード・シー４、代理人　〒１０７電話　５８５−２２５６５、補正書の提出年月日１９８８年１２月２２日６、添付書類の目録（１）　　補正書の写しく翻訳文）　　　　　　　　　　１通［明細書（英文）第２５頁及び特許請求の範囲］第一の場合には、可溶性相に結合したアビジンが測定され、蛍光偏光は試料中に存在している問題のりガント（例えば抗原）に直接関係しており；リガンドが増加すると蛍光偏光が増大する。遊離のアビジンが測定される第二の場合には、蛍光偏光は存在するりガントの量に逆比例的な関係にあり；リガンド濃度が増加すると蛍光偏光が減少する。更に、第一のインキ二ベーシ履ンの可溶性相はアビジン及びビオチン−発蛍光団と逐次的に反応できる。

競合結合反応の場合に、ビオチンに結合したリガンドとビオチンで標識した蛍光化合物（発蛍光団）はアビジンへの結合で競合する。ビオチンに結合しｔ；リガンドの濃度が増大すると、ビオチンで標識した蛍光化合物の結合は減少する：即ち、ビオチンに結合したリガンドの濃度が高いと、ビオチン−発蛍光団のアビジンとの結合は、ビオチンに結合しＩ；リガンドの濃度が低い場合よりも少なくなる。蛍光偏光の理論によれば、ビオチン−発蛍光団のアビジンとの結合により偏光の増加を招き；偏光の強度はアビジンに結合したビオチン−発蛍光団の濃度に関係している。

非−競合的結合反応の場合には、競合的な手段と同様に鋭敏なアッセイを行うために、物質（例えばビオチンで標識したりガント又は発蛍光団、リガンド、アビジン）の逐次的添加が使用できる。

本発明により測定できるリガンドは一つ又は多数の特異的結合パートナ−が提供できる化合物である。

請求の範囲１゜ａ、液体、ビオチンで標識した問題のリガンド、ビオチンで標識した発蛍光団、問題のりガントに特異的に結合するパートナ−及びアビジンを、問題のりガントとその特異的に結合するパートナ−の結合が起こるのに適当な条件下でインキュベートすること：及びす、アビジンの添加の後に生じる蛍光偏光の変化を測定すること；ここでアビジンが存在する時の偏光の変化は問題の該リガンドの存在の指標であること；を含んで成る液体中の問題のリガンドの測定方法。

２、ビオチンで標識した発蛍光団がビオチンで標識したフルオレセインである請求の範囲１項に記載の方法。

３、問題のリガンドが抗原又はハブテンであり、特異的な結合パートナ−が該抗原に特異的な抗体又は該ハブテンに特異的な抗体である請求の範囲１項に記載の方法。

４、問題のリガンドが抗体であり、特異的な結合パートナ−が抗原に対し抗体が特異的である抗原である請求の範囲１項に記載の方法。

５゜ａ、液体、ビオチンで標識した問題のリガンド、ビオチンで標識した発蛍光団、問題のりガントに特異的に結合するパートナ−及びアビジンを、問題のリガンドとその特異的に結合するパートナ−の結合が起こるのに適当な条件下でインキュベートすること；及びす、インキュベーション後、蛍光偏光を、アビジンを含まない対照の蛍光偏光と比較すること；ここで該対照は液体、ビオチンで標識した問題のりガント及びビオチンで標識した発蛍光団から成り；インキュベージコン後の液体の蛍光偏光とアビジンを含まない対照の蛍光偏光との間の差は液体中の問題の該リガンドの存在の指標であること；を含んで成る液体中の問題のりガントの測定方法。

６゜ａ３問題のりガントを分析すべき既知容積の液体；ビオチンで標識した問題のリガンド；ビオチンで標識した発蛍光団：及び問題のりガントに特異的に結合するパートナ−を、問題のりガントとその特異的に結合するパートナ−の間に特異的な結合反応が起こるのに適当な条件下で一緒にすること；ｂ、得られる組み合わせ物の蛍光偏光を測定すること；Ｃ０得られる組み合わせ物にアビジンとビオチンの結合に適当な条件下でアビジンを添加すること；及びｄ、液体の蛍光偏光を測定すること；及びｅ１段階（ｂ）で測定された蛍光偏光と段階（ｄ）で測定された蛍光偏光の間の差を定量すること薯ここで蛍光の該差は問題のりガントの存在の指標であること；の段階を含んで成る液体中の問題のりガントの測定方法。

７、問題のりガントが抗原又はハブテンであり、特異的な結合パートナ−が該抗原に特異的な抗体又は該ハブテンに特異的な抗体である請求の範囲６項に記載の方法。

８゜ａ、１）既知容積の液体；２）問題のりガントに特異的に結合するパートナ−に結合したビオチンで標識した問題のリガンドから成るコンプレックス；及び３）アビジンを、問題のリガンドとその特異的に結合するパートナ−の結合が起こるのに適当な条件下でインキュベートすること；ｂ、ビオチンで標識した発蛍光団を添加すること；及びＣ３液体の蛍光偏光を測定すること；ここでインキュベーション後の液体の蛍光偏光とアビジンを含まない対照の蛍光偏光との間の差は液体中の問題の該リガンドの存在の指標であること；を含んで成る液体中の問題のリガンドの測定方法。

９゜ａ、既知容積の液体；アビジンに結合したビオチンで標識した問題のりガントから成るコンプレックス；問題の該リガンドに対し特異的に結合するパートナ−を −緒にすること；ｂ、ビオチンで標識した発蛍光団と一緒にしｔ；ものを問題のリガンドとその特異的に結合するパートナ−との結合が起こるのに適当な条件下でインキュベートすること；及びＣ，インキュベーション後の液体、コンプレックス及び特異的に結合するパートナ−の蛍光偏光を、インキュベーション後の液体、コンプレックス、特異的に結合するパートナ−及びビオチンで標識しｔ；発蛍光団の蛍光偏光と比較すること：ここで偏光の変化は問題の該リガンドの存在の指標であること；を含んで成る液体中の問題のりガントの測定方法。

１０゜ａ１問題のりガントに特異的に結合するパートナ−を含む不溶性相、液体、及びビオチンで標識したりガントをインキュベートすること；ｂ、インキュベーション後可溶性相から不溶性相を分離すること；Ｃ０可溶性相をビオチンで標識した発蛍光団とインキュベートすること；ｄ、可溶性相の蛍光偏光を測定すること；ｅ、可溶性相を既知量のアビジンとインキュベートすること；及びｆ、インキュベーション後可溶性相の蛍光偏光における変化を測定すること：ここでインキュベーション後の液体の蛍光偏光とアビジンを含まない対照の蛍光偏光の間の差は液体中の問題のりガントの存在の指標であること：を含んで成る液体中の問題のりガントの測定方法。

１１、問題のりガントが抗体であり、特異的な結合パートナ−が該抗原に対し特異的である抗体であり、及びビオチンで標識した発蛍光団がビオチンで標識したフルオレセインである請求の範囲１０項に記載の方法。

１２゜ａ１問題のリガンドに特異的に結合するパートナ−を含む不溶性相、液体、及びビオチンで標識した結合パートナ−を、問題のりガントとその特異的に結合するパートナ−の結合が起こるのに適当な条件下でインキュベートすること；ｂ、不溶性相を可溶性相から分離すること；Ｃ１可溶性相にビオチンで標識しｔ；発蛍光団を添加すること；ｄ、ビオチンで標識した発蛍光団を含有する可溶性相の一部試料をアビジンと共にインキュベートすること；ｅ、インキュベーション後の一部試料の蛍光偏光を測定すること；ここでインキュベーション後の液体の蛍光偏光とアビジンを含まない対照の蛍光偏光の間の差は液体中における問題の該リガンドの存在の指標であること：を含んで成る、問題のりガントが特異的結合パートナ−に対し少なくとも二つの結合座席を有する、液体中の問題のリガンドの測定方法。

１３゜ａ１問題のりガントに特異的に結合するパートナ−を含む不溶性相、リガンド及び問題のりガントに特異的に結合するビオチンで標識したパートナ−を、問題のリガンドとその特異的に結合するパートナ−の結合が起こるのに適当な条件下でインキュベートすること；ｂ、不溶性相を可溶性相から分離すること；Ｃ９不溶性相と共にアビジンをインキュベートすること：ｄ、不溶性相を可溶性相から分離すること；ｅ、不溶性相をビオチンで標識した発蛍光団と共にインキュベートすること又は可溶性相をビオチンで標識した発蛍光団と共にインキュベートすること；及びｆ、インキュベーション後に蛍光偏光を測定すること；ここでインキュベーション後の液体の蛍光偏光と、アビジンを含まない対照の蛍光偏光の間の差は液体中の問題の該リガンドの存在の指標であること：を含んで成る液体中の問題のりガントの測定方法。

１４、問題のリガンドが抗原であり、特異的な結合パートナ−が該抗原に対し特異的である抗体であり、及びビオチンで標識した発蛍光団がビオチンで標識しｔ；フルオレセインである請求の範囲１３項に記載の方法。

１５゜ａ、既知量の液体；ビオチンで標識した問題の抗原又はビオチンで標識した問題のハプテン；問題の抗原に特異的な抗体又は問題のハゲテンに特異的な抗体；ビオチンで標識した発蛍光団及びアビジンを、゛問題の抗原が問題の抗原に特異的な抗体又は問題のハプテンが問題のハプテンｊ：特異的な抗体ｊこ結合するのに適当な条件下でインキュベートすること；及びす、アビジンの添加後に起こる蛍光偏光の変化を定量すること；ここで偏光の変化は問題の該リガンドの存在の指標であること：を含んで成る液体中の問題の抗原又は問題のハプテンの測定方法。

１６゜ａ、既知容積の液体を１）アビジン及び問題のリガンドと特異的に結合するビオチンで標識したパートナ−から成るコンプレックス；２）ビオチンで標識した発蛍光団と共に１問題のりガントとその特異的Ｉ；結合するパートナ−との間に結合反応が起こるのに適当な条件下でインキュベートする二と：ｂ、インキュベージ９ン後蛍光偏光を測定すること；及びＣ０測定した蛍光偏光を対照の蛍光偏光と比較すること；ここで該対照は液体、問題のリガンド及びビオチンで標識した発蛍光団から成ること：インキュベーション後の液体の蛍光偏光と既知濃度の問題のリガンドを有する液体の蛍光偏光との間の差は液体中の問題の該リガンドの存在の指標であること；を含んで成る液体中の問題のりガントの測定方法。

１７゜ａ、既知容積の液体；抗体が特異的であるビオチンで標識した抗原：アビジン及びビオチンで標識した発蛍光団をインキュベートすること：ｂ、インキュページ聰ン後に蛍光偏光を測定すること；及びＣ，インキュページ腸ン後になされた測定値をアビジンを含まない対照の蛍光偏光と比較すること；ここでインキュベージ腑ン後の液体ノ蛍光偏光とアビジンを含まない対照の蛍光偏光の間の差は液体中の問題の該リガンドの存在の指標であること：を含んで成る液体中の問題の抗体の測定方法。

１８゜ａ、試料をアビジンと共に、ビオチンとアビジンの結合に適当した条件下でインキュベートすること；ｂ、インキュベーション後に蛍光体−ビオチン・コンジュゲートを添加し、そしてビオチンとアビジンの結合に適当した条件下でインキュベートすること；Ｃ８段階（ｂ）のインキュページ厘ン後に蛍光偏光を測定すること；及びｄ、測定された蛍光偏光をビオチン濃度既知の試料の蛍光偏光測定値と比較すること；を含んで成る、ビオチン濃度未知の試料中のビオチンの濃度の測定方法。

１９、蛍光体−ビオチン・コンジュゲートがフルオレセイン−ビオチンである請求の範囲１８項に記載の方法。

２０゜ａ、試料を蛍光体−ビオチン・コンジュゲートと共に、ビオチンとアビジンの結合に適当した条件下でインキュベートすること；ｂ、インキュベージ３ン後の試料の蛍光偏光を測定すること；及びＣ８濃度既知のアビジンを有する試料の測定された蛍光偏光値と比較すること；を含んで成るアビジン濃度未知の試料中のビオチンの濃度を測定する方法。

２１、蛍光体−ビオチン・コンジュゲートがフルオレセイン−ビオチンである請求の範囲２０項に記載の方法。

２２、試料に添加されるフルオレセイン−ビオチンの濃度が約１×ｌＯ−＠Ｍである請求の範囲２１項に記載の方法。

２３、ビオチンで標識した発蛍光団がビオチンで標識したフルオレセインである請求の範囲第１５項記載の方法。

２４、特異的結合パートナ−に対する少なくとも２つの結合部位を持った液体中の問題のりガントを測定する方法であって、ａ０問題のリガンドに対する特異的結合パートナ−を含む不溶性相と、前記液体と、ビオチンで標識しｔ；特異的結合パートナ−を、問題のリガンドとその特異的結合パートナ−が結合するのに適しｔ；条件下にインキュベーションすることと、ｂ、不溶性相を可溶性相から分離することと、Ｃ１不溶性相にアビジンを加えることと、ｄ、　（ｃ）の生成物の蛍光偏光を測定することと、ｅ、不溶性相を可溶性相から分離することと、ｆ、不溶性相をビオチンで標識した発蛍光団と共（ごインキュベージ１ンすることと、ｇ、　（ｆ）の不溶性相の蛍光偏光を測定し、工程（ｆ）のインキュベーション後の蛍光偏光と（ｄ）で測定した蛍光偏光の差が液体中の前記問題のりガントの存在を示すこと、を含んで成る方法。

２５、液体中の問題のリガンドを測定する方法であって、前記液体と、ビオチンで標識した問題のリガンドと、ビオチンで標識した発蛍光団と、問題のりガントに対する特異的結合パートナ−と、抗ビオチン抗体を、問題のりガントとその特異的結合パートナ−の結合が起こるの適した条件下にインキュベーションし、そして抗ビオチン抗体の添加後に起こる前記問題のりガントの存在を示す蛍光偏光の変化を測定することを含んで成る方法。

２６、ビオチンで標識した発蛍光団がビオチンで標識したフルオレセインである請求の範囲第２５項記載の方法。

２７、問題のリガンドが抗原又はハプテンであり、特異的結合パートナ−が前記抗原に対する特異的抗体又は前記ハプテンに対する特異的抗体である請求の範囲第２５項記載の方法。

２８、問題のリガンドが抗体であり、特異的結合パートナ−がこの抗体に対して特異的な抗原である請求の範囲第２５項記載の方法。

２９、液体中の問題のリガンドを測定する方法であって、前記液体と、ビオチンで標識した問題のリガンドと、ビオチンで標識した発蛍光団と、問題のりガントに対する特異的結合パートナ−と、抗ビオチン抗体を、問題のりガントとその特異的結合パートナ−の結合が起こるの適した条件下にインキュベーションし、そしてインキュベージ１ン後の蛍光偏光を抗ビオチン抗体を含まない対照の蛍光偏光と比較し、該対照が、前記液体と、ビオチンで標識した問題のりガントと、ビオチンで標識した発蛍光団と、問題のりガントに対する特異的結合パートナ−より成り、インキュベーション後の前記液体の蛍光偏光と抗ビオチン抗体を含まない対照の蛍光偏光の差が液体中の前記問題のリガンドの存在を示すこと、を含んで成る方法。

３０、液体中の問題のリガンドを測定する方法であって、問題のリガンドについて分析されるべき成る容量の液体と、ビオチンで標識した問題のリガンドと、ビオチンで標識した発蛍光団と、問題のりガントに対する特異的結合パートナ−を、問題のりガントとその特異的結合パートナ−との特異的結合反応が起こるのに適した条件下に一緒にする（ｃｏｍｂｉｎｅ）ことと、ｂ、前記−緒にしたものの蛍光偏光を測定することと、Ｃ３前記−緒にしたものに抗ビオチン抗体とビオチンが結合するのに適した条件下に抗ビオチン抗体を加えることと、ｄ、この液体の蛍光偏光を測定することと、ｅ、　（ｂ）で測定した蛍光偏光と（ｄ）で測定した蛍光偏光の差を決定し、蛍光の差が問題のりガントの存在を示すこと、を含んで成る方法。

３１、問題のリガンドが抗原又はハプテンであり、特異的結合パートナ−が前記抗原に対する特異的抗体又は前記ハプテンに対する特異的抗体である請求の範囲第３０項記載の方法。

３２、液体中の問題のリガンドを測定する方法であって、１）成る容量の前記液体と、２）前記問題のりガントに対する特異的結合パートナ−に結合したビオチンで＃Ｓ識した問題のりガントから成るコンプレックスと、３）抗ビオチン抗体を、問題のリガンドとその特異的結合パートナ−の結合が起こるのに適した条件下にインキュページ冒ンし、ビオチンで標識した発蛍光団を加え、この液体の蛍光偏光を測定し、インキュベーション後の液体の蛍光偏光と抗ビオチン抗体を含まない対照の蛍光偏光との差が液体中の前記問題のりガントの存在を示すものであること、を含んで成る方法。

３３、液体中の問題のりガントを測定する方法であって、ａ、成る容量の前記液体と、抗ビオチン抗体に結合したビオチンで標識しｔ；問題のリガンドから成るコンプレックスと、前記問題のリガンドに対する特異的結合パートナ−と、ビオチンで標識した発蛍光団を、問題のりガントがその特異的結合パートナ−に結合するのに適した条件下にインキュベーションし、ｂ、インキュベージコン後のこの液体の蛍光偏光を対照の蛍光偏光と比較し、該対照は、既知の濃度の問題のりガントを有する液体より成り、偏光の変化が前記問題のりガントの存在を示すものである、工程を含んで成る方法。

３４、液体中の問題のりガントを測定する方法であって、ａ、前記液体と、ビオチンで標識したリガンドと、問題のリガンドに対する特異的結合パートナ−を有する不溶性相を、問題のりガントに対する特異的結合パートナ−と問題のリガンドの結合が起こるのに適した条件下にインキュベーションすることと、ｂ、不溶性相を液体から分離することと、Ｃ０この液体をビオチンで標識した発蛍光団とインキュベーションして、対照液を生成させ、ｄ、この対照液の蛍光偏光を測定することと、ｅ、前記液体を既知量の抗ビオチン抗体とインキュベーションして試験液を生成させることと、ｆ、試験液の蛍光偏光を測定しそして対照液の蛍光偏光と試験液の蛍光偏光の差を決定し、対照液の蛍光偏光と試験液の蛍光偏光の差が前記液体中の問題のりガントの存在を示すものであること、を含んで成る方法。

３５、問題のりガントが抗原又はハプテンであり、特異的結合パートナ−が前記抗原に対する特異的抗体又は前記ハプテンに対する特異的抗体であり、ビオチンで標識した発蛍光団がビオチンで標識しｔ；フルオレセインであるる請求の範囲第３４項記載の方法。

３６、特異的結合パートナ−に対する少なくとも２つの結合部位を持った液体中の問題のりガントを測定する方法であって、ａ、前記液体と、ビオチンで標識した特異的結合パー）・ナーと、問題のりガントに対する特異的結合パートナ−を有する不溶性相を、問題のりガントとその特異的結合パートナ−が結合するのに適した条件下にインキュベーションすることと、ｂ、不溶性相を液体から分離することと、ｃ、　（ｂ）で分離した液体に抗ビオチン抗体を加えることと、ｄ、　（ｃ）の生成物の蛍光偏光を測定することと、ｅ、　（ｃ）で形成しｔ；抗ビオチン抗体を含む液体のアリフォートをビオチンで標識した発蛍光団とインキュベージ３ンすることと、ｆ、（ｅ）の生成物の蛍光偏光を測定することと、ｇ、　（ｄ）で測定した蛍光偏光と（ｆ）で測定しｔ；蛍光偏光の差を決定し、抗ビオチン抗体の添加後の蛍光偏光の増加が液体中の前記問題のりガントの存在を示すものである、工程を含んで成る方法。

３７、特異的結合パートナ−に対する少なくとも２つの結合部位を持っｔ；液体中の問題のリガンドを測定する方法であって、ａ、前記液体と、ビオチンで標識しｔ；特異的結合パートナ−と、問題のリガンドに対する特異的結合パートナ− を有する不溶性相を、問題のリガンドとその特異的結合パートナ−が結合するのに適しｔ；条件下にインキュベージコンすることと、ｂ、不溶性相を液体から分離することき、ｃ、　（ｂ）で分離した不溶性相に抗ビオチン抗体を加えることと、ｄ、不溶性相を液体から分離することと、ｅ、　（ｄ）で分離した不溶性相の蛍光偏光を測定することと、ｆ、　（ｄ）で分離した抗ビオチン抗体を含む不溶性相をビオチンで標識しＩ；発蛍光団とインキュページ崖ンすることと、ｇ、　（ｆ）の不溶性相の蛍光偏光を測定することと、ｈ −（ｅ）で測定した蛍光偏光と（ｇ）で測定した蛍光偏光の差を決定し、抗ビオチン抗体の添加後の蛍光偏光の増加が液体中の前記問題のりガントの存在を示すものである、工程を含んで成る方法。

３８、液体中の問題のリガンドを測定する方法であって、ａ、前記液体と、ビオチンで標識しＩ；問題のりガントに対する特異的結合パートナ−と、問題のリガンドに対する特異的結合パートナ−を有する不溶性相を、問題のりガントとその特異的結合パートナ−が結合するのに適した条件下ｊニインキュベーシ遍ンするこトド、ｂ、可溶性相を不溶性相から分離することと、Ｃ８抗ビオチン抗体を不溶性相とインキュベーションすることと、ｄ、　（ｃ）の生成物の蛍光偏光を測定することと、ｅ、　（ｃ）の生成物ををビオチンで標識した発蛍光団とインキュページ司ンすることと、ｆ、　（ｅ）の生成物の蛍光偏光を測定することと、ｇ−（ｄ）で測定した蛍光偏光と（ｆ）で測定した蛍光偏光の差を決定し、偏光の変化が液体中の前記問題のリガンドの存在を示すものである、工程を含んで成る方法。

３９、問題のりガントが抗原であり、特異的結合パートナ−が前記抗原に対する特異的抗体であり、ビオチンで標識した発蛍光団がビオチンで標識したフルオレセインである請求の範囲第３８項記載の方法。

４０、液体中の問題の抗原又は問題のハプテンを測定する方法であって、ａ、前記液体と、ビオチンで標識した問題のリガンド又はビオチンで標識した問題のハプテンと、問題の抗原に対する特異的抗体又は問題のハプテンに対する特異的抗体と、ビオチンで標識した発蛍光団を、問題の抗原が問題のりガントに対する特異的抗体と結合するのに適した又は問題のハプテンが問題のハプテンに対する特異的抗体と結合するのに適した条件下にインキュベージコンすることと、ｂ、インキュベーション後に蛍光偏光を測定することと、ｃ、　（ａ）の生成物に抗ビオチン抗体を加えることと、ｄ、　（ｃ）の生成物の蛍光偏光を測定することと、ｅ−（ｂ）で測定した蛍光偏光と（ｄ）で測定した蛍光偏光の差を決定し、抗ビオチン抗体の添加後の蛍光偏光の増加が液体中の前記問題のりガントの存在を示すものである、工程を含んで成る方法。

４１、液体中の問題のりガントを測定する方法であって、ａ、成る容量の前記液体を、抗ビオチン抗体とビオチンで標識した問題のりガントに対する特異的結合パートナ−から成るコンプレックスをインキュページ磨ンすることと、ｂ、インキュベーション後に蛍光偏光を測定することと、Ｃ１問題のりガントとその特異的結合パートナ−が結合するのに適しｔ；条件下に、（ｂ）の生成物とビオチンで標識した発蛍光団をインキュベージ２ンすることと、ｄ、　（ｃ）の生成物の蛍光偏光を測定することと、ｅ、　（ｂ）で測定した蛍光偏光と（ｄ）で測定した蛍光偏光を比較し、偏光の変化が前記液体中の問題のりガントの存在を示すものであること、を含んで成る方法。

４２、液体中の問題の抗体を測定する方法であって、ａ、成る容量の前記液体と、オチンで標識した前記抗体に対する特異的抗原と、抗ビオチン抗体と、ビオチンで標識した発蛍光団をインキュページ層ンすることと、ｂ、蛍光偏光を測定することと、ｃ、　（ｂ）で測定した蛍光偏光を対照の蛍光偏光と比較し、該対照は、既知量の問題の抗体を含有しており、インキュベージフン後の液体の蛍光偏光と前記対照の蛍光偏光の差が前記液体中の問題のリガンドの存在を示すものである、ことを含んで成る方法。

４３、液体中の問題のりガントを決定する方法であって、前記液体と、ハプテンで標識した問題のりガントと、ハプテンで標識した発蛍光団と、問題のリガンドに対する特異的結合パートナ−と、抗ハプテン抗体を、問題のリガンドとその特異的結合パートナ−の結合が起こるのに適した条件下にインキュページ烈ンし、抗ハプテン抗体の添加後に起こる蛍光偏光の変化を測定し、偏光の変化が問題のりガントの存在を示すものであること、を含んで成る方法。

４４、ハプテンでｌ１ｉｉｉした発蛍光団がハプテンで標識したフルオレセインである請求の範囲第４３項記載の方法。

４５、問題のりガントが抗原又はハプテンであり、特異的結合パートナ−が前記抗原に対する特異的抗体又は前記ハプテンに対する特異的抗体である請求の範囲だ４３項記載の方法。

４６、問題のりガントが抗体であり、特異的結合パートナ−がその抗体に対して特異的な抗原である請求の範囲第４３項記載の方法。

４７、液体中の問題のりガントを決定する方法であって、前記液体と、ハプテンで標識した問題のリガンドと、ハプテンで標識した発蛍光団と、問題のりガントに対する特異的結合パートナ−と、抗ハプテン抗体を、問題のリガンドとその特異的結合パートナ−の結合が起こるのｌ；適した条件下にインキュベーションし、インキュベーション後の蛍光偏光を、抗ハプテン抗体を含まない対照の蛍光偏光と比較し、該対照は、前記液体と、ハプテンで標識した問題のりガントと、／％ブテンで標識した発蛍光団と、問題のりガントに対する特異的結合パートナ− より成り、インキュページオン後の液体の蛍光偏光と抗ハプテン抗体を含まない対照の蛍光偏光の差が前記液体中の問題のリガンドの存在を示すものであること、を含んで成る方法。

４８、液体中の問題のりガントを決定する方法であって、ａ１問題のりガントについて分析されるべき成る容量の液体と、ノ＼ブテンで標識した問題のリガンドと、ハプテンで標識した発蛍光団と、問題のリガンドに対する特異的結合パートナ−を、問題のりガントとその特異的結合パートナ−の特異的結合反応が起こるのに適した条件下に一緒にすることと、ｂ、得られる一緒にしたものの蛍光偏光を測定することと、Ｃ１得られる一緒にしたものに、抗ハプテン抗体とハプテンが結合するのに適した条件下に、抗ハプテン抗体を加えることと、ｄ、この液体の蛍光偏光を測定することと、ｅ、　（ｂ）で測定した蛍光偏光と（ｄ）で測定した蛍光偏光の差を決定し、蛍光の差が問題のリガンドの存在を示すものである、工程を含んで成る方法。

４９、問題のりガントが抗原又はハプテンであり、特異的結合パートナ−が前記抗原に対して特異的抗体又は前記ハプテンに対して特異的抗体である、請求の範囲第４８項記載の方法。

５０、液体中の問題のりガントを測定する方法であって、ｌ）成る容量の前記液体と、２）前記問題のりガントに対する特異的結合パートナ−に結合しｔ；ハプテンで標識した問題のりガントから成るコンプレックスと、３）抗ハプテン抗体を、問題のリガンドとその特異的結合パートナ−の結合が起こるのに適しＩ；条件下にインキュベーションし、ハプテンで標識した発蛍光団を加え、この液体の蛍光偏光を測定し、インキュベーション後の液体の蛍光偏光と抗ハプテン抗体を含まない対照の蛍光偏光との差が前記液体中の問題のリガンドの存在を示すものであること、を含んで成る方法。

５１、液体中の問題のりガントを決定する方法であって、ａ、成る容量の前記液体と、抗ハプテン抗体に結合したハプテンで標識した問題のリガンドから成るコンプレックスと、前記問題のリガンドに対する特異的結合パートナ−と、ハプテンで標識した発蛍光団を、問題のりガントとその特異的結合パートナ−の結合が起こるのに適した条件下にインキュベーションし、ｂ、インキュベージコン後の液体の蛍光偏光を対照の蛍光偏光と比較し、該対照は、既知の濃度の問題のりガントを有する液体より成り、偏光の変化が前記問題のりガン１゛の存在を示すものである、工程を含んで成る方法。

５２、液体中の問題のりガントを決定する方法であって、ａ、前記液体と、ハプテンで標識しｔ；リガンドと、問題のりガントに対する特異的結合パートナ−を有する不溶性相を、問題のリガンドに対する特異的結合パートナ−と問題のリガンドの結合が起こるのに適した条件下にインキュベーションすることと、ｂ、不溶性相を液体から分離することと、Ｃ１この液体をハプテンで標識した発蛍光団とインキュベージコンして、対照液を生成させることと、ｄ、この対照液の蛍光偏光を測定することと、ｅ、前記液体を既知量の抗ハブテン抗体とインキュページ鱈ンして試験液を生成させることと、ｆ、試験液の蛍光偏光を測定しそして対照液の蛍光偏光と試験液の蛍光偏光の差を決定し、対照液の蛍光偏光と試験液の蛍光偏光の差が前記液体中の問題のリガンドの存在を示すものであること、を含んで成る方法。

５３、問題のりガントが抗原又はハプテンであり、特異的結合パートナ−が前記抗原に対する特異的抗体又は前記ハプテンに対する特異的抗体であり、ハプテンで標識した発蛍光団がハプテンで標識したフルオレセインであるる請求の範囲第５２項記載の方法。

５４、特異的結合パートナ−に対する少なくとも２つの結合部位を持った液体中の問題のリガンドを測定する方法であって、ａ、前記液体と、ハプテンで標識した特異的結合パートナ−と、問題のリガンドに対する特異的結合パートナ−を存する不溶性相を、問題のリガンドとその特異的結合パートナ−が結合するのに適し！二条性下にインキュベージランすることと、ｂ、不溶性相を液体から分離することと、ｃ、　（ｂ）で分離した液体に抗ハプテン抗体を加えることと、ｄ、　（ｃ）の生成物の蛍光偏光を測定することと、ｅ、　（ｃ）で形成しｔ；抗ハゲテン抗体を含む液体のアリフォートをハプテンで標識した発蛍光団とインキュベーションすることと、ｆ、（ｅ）の生成物の蛍光偏光を測定することと、ｇ、　（ｄ）で測定しｔ；蛍光偏光と（ｆ）で測定した蛍光偏光の差を決定し、抗ハプテン抗体の添加後の蛍光偏光の増加が液体中の前記問題のリガンドの存在を示すものである、工程を含んで成る方法。

５５、特異的結合パートナ−に対する少なくとも２つの結合部位を持った液体中の問題のリガンドを測定する方法であって、ａ、前記液体と、ハプテンで標識した特異的結合パートナ−と、問題のリガンドに対する特異的結合パートナ−を有する不溶性相を、問題のリガンドとその特異的結合パートナ−が結合するのに適した条件下にインキュベーションすることと、ｂ、不溶性相を液体から分離することと、ｃ、　（ｂ）で分離した不溶性相に抗ハプテン抗体を加えることと、ｄ、　（ｃ）の生成物の蛍光偏光を測定することと、ｅ、液体から不溶性相を分離することと、ｆ、（ｃ）で形成Ｉ；抗ハブテン抗体を含む不溶性相をノーブテンで標識した発蛍光団とインキュベーションすることと、ｇ−（ｆ）の不溶性相の蛍光偏光を測定することと、Ｌ　（ｄ）で測定しｔ；蛍光偏光と（ｇ）で測定した蛍光偏光の差を決定し、抗ハプテン抗体の添加後の蛍光偏光の増加が液体中の前記問題のリガンドの存在を示すものである、工程を含んで成る方法。

５６、液体中の問題のりガントを測定する方法であって、ａ、前記液体と、ハプテンで標識した問題のりガントに対する特異的結合パートナ−と、問題のリガンドに対する特異的結合パートナ−を有する不溶性相を、問題のりガントとその特異的結合パートナ−が結合するのに適した条件下にインキュベーションすることと、ｂ、不溶性相を液体から分離することと、Ｃ０不溶性相と抗ハプテン抗体をインキュベージ１ンすることと、ｄ、可溶性相から不溶性相を分離することと、ｅ、不溶性相をハプテンで標識した発蛍光団とインキュベーションするか又は可溶性相をハプテンで標識した発蛍光団とインキュベージコンすることと、ｆ、インキュベージ２ン後に蛍光偏光を測定し、インキュベーション後の蛍光偏光と抗ハプテン抗体を含まない対照の蛍光偏光の差が前記問題のりガントの存在を示すものである、工程を含んで成る方法。

５７゜問題のリガンドが抗原であり、特異的結合パートナ−が前記抗原に対して特異的抗体であり、ハプテンで標識した発蛍光団がハプテンで標識したフルオレセインである請求の範囲第５６項記載の方法。

５８、液体中の問題の抗原又は問題のハプテンを測定する方法であって、ａ、前記液体と、！１ハプテンで標識された問題の抗原又は第１のハプテンで標識されたｗｃ２ハプテン、この第２ハプテンが問題のハプテンである、と、問題の抗原に対して特異的抗体又は第２ハプテンに対して特異的抗体と、第１ハプテンでｌ！識された発蛍光団を、問題の抗原が問題の抗原に対する特異的抗体と結合するのに適しｌ；又は第２ハプテンが第２ハプテンに対する特異的抗体と結合するのに適した条件下にインキュベージコンすることと、ｂ、インキュベージ２ン後に蛍光偏光を測定することと、Ｃ８得られる組み合わせ物に第１ハプテンの抗ハプテン抗体を加えることと、ｄ、　（ｃ）の生成物の蛍光偏光を測定することと、ｅ−（ｄ）で測定した蛍光偏光と（ｆ）で測定した蛍光偏光の差を決定し、抗ハプテン抗体の添加後の蛍光偏光の増加が液体中の前記問題のりガントの存在を示すものである、工程を含んで成る方法。

５９、液体中の問題のリガンドを測定する方法であって、ａ、成る容量の前記液体を、ｌ）抗ハプテン抗体とハプテンで標識した問題のリガンドに対する特異的結合パートナ−から成るコンプレックス、及び２）ハプテンでｉ識した発蛍光団と共に、問題のリガンドとその特異的結合パートナ−の結合が起こるのに適した条件下にインキュベーションすることと、ｂ、インキュベーションの後蛍光偏光を測定することと、ｃ、＠定した蛍光偏光を対照の蛍光偏光と比較し、該対照は、前記液体と、問題のリガンドと、ハプテンで標識した発蛍光団より成り、インキュベーション後の液体の蛍光偏光と既知濃度の問題のりガントを含む対照の蛍光偏光の差が液体中の前記問題のリガンドの存在を示すものであること、を含んで成る方法。

６０、液体中の抗体を測定する方法であって、ａ、成る容量の前記液体と、ハプテンで標識した前記抗体に特異的な抗原と、抗ハプテン抗体と、ハプテンで標識した発蛍光団をインキュベーションすることと、ｂ、蛍光偏光を測定することと、Ｃ０この測定値を抗ハプテン抗体を含まない対照の蛍光偏光と比較し、インキュベージ１ン後の液体の蛍光偏光と抗ハプテン抗体を含まない対照の蛍光偏光の差が液体中の前記問題のリガンドの存在を示すものであること、を含んで成る方法。

国際調査報告国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ａ．液体、ビオチンで標識した問題のリガンド、ビオチンで標識した発蛍光団、問題のリガンドに特異的に結合するパートナー及びアビジンを、問題のリガンドとその特異的に結合するパートナーの結合が起こるのに適当な条件下でインキュベートすること；及びｂ．アビジンの添加の後に生じる蛍光偏光の変化を測定すること；を含んで成る液体中の問題のリガンドの測定方法。
２．ビオチンで標識した発蛍光団がビオチンで標識したフルオレセインである請求の範囲１項に記載の方法。
３．問題のリガンドが抗原又はハプテンであり、特異的な結合パートナーが該抗原に特異的な抗体又は該ハプテンに特異的な抗体である請求の範囲１項に記載の方法。
４．問題のリガンドが抗体であり、特異的な結合パートナーが抗原に対し抗体が特異的である抗原である請求の範囲１項に記載の方法。
５．ａ．液体、ビオチンで標識した間題のリガンド、ビオチンで標識した発蛍光団、問題のリガンドに特異的に結合するパートナー及びアビジンを、問題のリガンドとその特異的に結合するパートナーの結合が起こるのに適当な条件下でインキュベートすること；及びｂ．インキュベーション後、蛍光偏光を、アビジンを含まない対照の蛍光偏光と比較し、該対照は液体、ビオチンで標識した問題のリガンド及びビオチンで標識した発蛍光団から成ること；を含んで成る液体中の問題のリガンドの測定方法。
６．ａ．問題のリガンドを分析すべき既知容積の液体；ビオチンで標識した問題のリガンド；ビオチンで標識した発蛍光団；及び問題のリガンドに特異的に結合するパートナーを、問題のリガンドとその特異的に結合するパートナーの間に特異的な結合反応が起こるのに適当な条件下で一緒にすること；ｂ．得られる組み合わせ物の蛍光偏光を測定すること；ｃ．得られる組み合わせ物にアビジンとビオチンの結合に適当な条件下でアビジンを添加すること；及びｄ．液体の蛍光偏光を測定すること；の段階を含んで成る液体中の問題のリガンドの測定方法。
７．問題のリガンドが抗原又はハプテンであり、特異的な待合パートナーが該抗原に特異的な抗体又は該ハプテンに特異的な抗体である請求の範囲６項に記載の方法。
８．ａ．１）既知容積の液体；２）問題のリガンドに特異的に結合するパートナーに結合したビオチンで標識した問題のリガンドから成るコンプレックス；及び３）アビジンを、問題のリガンドとその特異的に結合するパートナーの結合が起こるのに適当な条件下でインキュベートすること；ｂ．ビオチンで標識した発蛍光団を添加すること；及びｃ．液体の蛍光偏光を測定すること；を含んで成る液体中の問題のリガンドの測定方法。
９．ａ．既知容積の液体；アビジンに結合したビオチンで標識した問題のリガンドから成るコンプレックス；ビオチンで標識した発蛍光団；及び問題の該リガンドに対し特異的に結合するパートナーを、問題のリガンドとその特異的に結合するパートナーとの結合が起こるのに適当な条件下でインキュベートすること；及びｂ．インキュベーション後、蛍光偏光を、アビジンを含まない対照の蛍光偏光と比較し、該対照は液体、ビオチンで標識した発蛍光団及び問題のリガンドの特異的に結合するパートナーから成ること；を含んで成る液体中の問題のリガンドの測定方法。
１０．ａ．問題のりかンドに特異的に結合するパートナーを含む不溶性相、液体、及びビオチンで標識したリガンドをインキュベートすること；ｂ．インキュベーション後可溶性相から不溶性相を分離すること；ｃ．可溶性相をビオチンで標識した発蛍光団とインキュベートすること；ｄ．可溶性相の蛍光偏光を測定すること；ｅ．可溶性相を既知量のアビジンとインキュベートすること；及びｆ．インキュベーション後可溶性相における蛍光偏光の変化を測定すること；を含んで成る液体中の問題のリガンドの測定方法。
１１．問題のリガンドが抗原であり、特異的な結合パートナーが抗原に対し特異的である抗体であり、及びビオチンで標識した発蛍光団がビオチンで標識したフルオレセインである請求の範囲１０項に記載の方法。
１２．ａ．問題のリガンドに特異的に結合するパートナーを含む不溶性相、液体、及びビオチンで標識した待合パートナーを、問題のリガンドとその特異的に結合するパートナーの結合が起こるのに適当な条件下でインキュベートすること；ｂ．不溶性相を可溶性相から分離すること；ｃ．可溶性相にアビジンを添加すること；ｄ．アビジン含有可溶性相の一部試料をビオチンで標識した発蛍光団と共にインキュベートすること；ｅ．インキュベーション後の一部試料の蛍光偏光を測定すること；を含んで成る、問題のリガンドが特異的結合パートナーに対し少なくとも二つの結合座席を有する、液体中の問題のリガンドの測定方法。
１３．ａ．問題のリガンドに特異的に結合するパートナーを含む不溶性相、リガンド及び問題のリガンドに特異的に結合するビオチンで標識したパートナーを、問題のリガンドとその特異的に結合するパートナーの結合が起こるのに適当な条件下でインキュベートすること；ｂ．不溶性相を可溶性相から分離すること；ｃ．不溶性相と共にアビジンをインキュベートすること；ｄ．不溶性相を可溶性相から分離すること；ｅ．不溶性相をビオチンで標識した発蛍光団と共にインキュベートすること又は可溶性相をビオチンで標識した発蛍光団と共にインキュベートすること；及びｆ．インキュベーション後に蛍光偏光を測定すること；を含んで成る液体中の問題のリガンドの測定方法。
１４．問題のリガンドが抗原であり、特異的な結合パートナーが該抗原に対し特異的である抗体であり、及びビオチンで標識した発蛍光団がビオチンで標厳したフルオレセインである請求の範囲１３項に記載の方法。
１５．ａ．既知量の液体；ビオチンで標識した問題の抗原又はビオチンで標識した問題のハプテン；問題の抗原に特異的な抗体又は問題のハプテンに特異的な抗体；ビオチンで標識したフルオレセイン及びアビジンをインキュベートすること；及びｂ．蛍光偏光の変化を測定すること；を含んで成る液体中の問題の抗原又は問題のハプテンの測定方法。
１６．ａ．既知容積の液体を１）アビジン、ビオチン及び問題のリガンドと特異的に結合するビオチンで標識したパートナーから成るコンプレックス；２）問題のリガンド；及び３）ビオチンで標識した発蛍光団を、問題のリガンドとその特異的に結合するパートナーとの間に結合反応が起こるのに適当な条件下でインキュベートすること；ｂ．インキュベーション後蛍光偏光を測定すること；及びｃ．測定した蛍光偏光を対照の蛍光偏光と比較し、該対照は液体、問題のリガンド及びビオチンて標識した発蛍光団から成ること；を含んで成る液体中の問題のリガンドの測定方法。
１７．ａ．既知容積の液体；抗体が特異的であるビオチンで標識した抗原；アビジン及びビオチンで標識したフルオレセインをインキュベートすること；ｂ．インキュベーション後蛍光偏光を測定すること；及びｃ．測定値をアビジンを含まない対照の蛍光偏光と比較すること；を含んで成る液体中の問題の抗体の測定方法。
１８．ａ．試料をアビジンと共に、ビオチンとアビジンの結合に適当した条件下でインキュベートすること；ｂ．インキュベーション後に蛍光体一ビオチン・コンジュゲートを添加し、そしてビオチンとアビジンの結合に適当した条件下でインキュベートすること；ｃ．インキュベーション後に蛍光偏光を測定すること；及びｄ．測定された蛍光偏光を既知のビオチン濃度の蛍光偏光測定値と比較すること；を含んで成るビオチン濃度未知の試料中のビオチンの濃度を測定する方法。
１９．蛍光体−ビオチン・コンジュゲートがフルオレセイン−ビオチンである請求の範囲１８項に記載の方法。
２０．ａ．試料を蛍光体−ビオチン・コンジュゲートと共にビオチンとアビジンの結合に適当した条件下でインキュベートすること；ｂ．インキュベーション後に蛍光偏光を測定すること；及びｃ．既知濃度のアビジンを有する試料の蛍光偏光値と比較すること；を含んで成るアビジン濃度未知の試料中のビオチンの濃度を測定する方法。
２１．蛍光体−ビオチン・コンジュゲートがフルオレセイン−ビオチンである請求の範囲２０項に記載の方法。
２２．フルオレセイン−ビオチンの最終濃度が約１×１０−９Ｍである請求の範囲２１項に記載の方法。