JPH02502191A - 免疫グロブリンｅ競合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫グロブリンＥ競合体 この発明はヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する競合体または類似体に関す るものである。より具体的には、この発明は低親和性受容体部位に対してＩｇＥ と競合するポリペプチドに関するものである。

本発明者らに係る同時係属国際特許出願Ｐ　ＣＴ／ＧＢ　８７１００４６６号（ 国際特許出願公開公報Ｗ０８８１００２０４号（１９８８年１月１４日公開）） では、ベンニッチによって報告された完全なＩｇＥ重鎮配列［プロプレス・イン ・イムノロジー■、第１巻（１９７４年７月）、４９〜５８頁およびインターナ ショナル・アーカイブズ・オブ・アレルギー・アンド・アプライド・イムノロジ ー、５３巻、４５９頁コのアミノ酸残基３０１〜３７６に対応するヒトＩｇＥ配 列の第２ドメインおよび第３ドメインの７６個のアミノ酸からなるモノマー鎖を 有する、ＩｇＥに対するポリペプチド競合体を報告し権利範囲とした。このポリ ペプチドは、特に肥満細胞および好塩基球上に存在するＩｇＥ高親和性Ｆｃ受容 体（Ｆ　ｃＥ　Ｒ、）と結合することによって、抗原特異的１ｇＥが、抗原の存 在でそのような受容体部位と結合して架橋するときに生じるエキソソサイトーシ スおよび脱顆粒のような生体反応を抑制する。

ヒト免疫系におけるＩｇＨの主な役割は寄生虫に対する免疫を提供することにあ ると考えられる。然しまたＩｇＥは枯草熱および喘息のような症状を発現させる アレルギー反応であるＩ型過敏症を仲介する。このアレルギー反応の機構を簡単 に述べると、花粉のような通常無害な抗原の進入によってＢ細胞による抗原特異 的１８Ｅの合成が開始される。ついで抗原特異的ＩｇＥはそのＦｃ領域を介して 肥満細胞受容体と結合し、その後、さらに任意の抗原の進入を引き金として肥満 細胞の脱顆粒を起こし、主としてヒスタミンのようなメディエータ−を遊離し、 その結果、Ｉ型過敏症の典型的な急性炎症症状を惹起する。

ＩｇＥは、構造的に他の免疫グロブリン類と共通した２本の重鎮と２本の軽鎖を 含んでおり、イプシロン重Ｊ［！ｔ５つのドメイン、即ち可変ドメインＶＨおよ び不変ドメインＣＨ１−ＣＨ４を有する。

ＩｇＨの分子量はおよそ１８８０００であるカセ、そのうち重鎮は約７２５００ を占め、これは約５５０個のアミノ酸残基配列に相当する。

ＩｇＥのイプシロン重鎮のアミノ酸残基２１８〜５４７［ベンニッチの示した配 列番号に基づく（プログレス・イン・イムノロジー■第１＠（１９７４年７月） 、４９〜５８頁コに対応する３３０個ノアミノ酸からなるペプチド配列は、ヒト 肥満細胞からのメディエータ−遊離に対して抑制効果を有することが報告された ［ネーチャー、３１５巻、（１９８５年）、６０２０号、５７７〜５７８頁コ。

この３３０個のアミノ酸配列は、それぞれ３３０個のアミノ酸鎖長を有しジスル フィッド結合によって連結された２本のアミノ酸鎖からなる二鳳体として存在す る。

米国特許第４１７１２９９号および同第４１６１５２２号では、ヒトＩｇＥのＰ ｃ領域のベンニッチ命名法（前記参考文献参照）によるアミノ酸２６５〜５３７ 部分から選ばれた配列中、３〜１０個のアミノ酸を含んだオリゴペプチドが肥満 細胞のＰｃ受容体を遮断し・したがって脱顆粒およびヒスタミンのようなメディ エータ−の遊離が抑制されることを報告している。これらのオリゴペプチド中、 最も強力なのはＩｇＥ重鎮のアミノ酸配列３３０〜３３４から誘導されるペンタ ペプチドＡｓｐ−Ｓｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＨＥＰＰ：ヒユーマン・イムノグロ ブリンＥ・ポリペプチド）と同定された。天然１８Ｅのアミノ酸３３２はアスパ ラギンであるが、これらの特許では、アスパラギンをアスパラギン酸と置換する と遮断活性が実質上増強されることを示唆している。

上記の特許ではベンニッチが示した完全な配列［プログレス・イン・イムノロジ ー■、第１巻（１９７４年７月）、４９〜５８頁］を引用し、３３２の位置にア スパラギン酸を示している。然しベンニッチ自身、その後、その位置がアスパラ ギン残基であることを主張した〔インターナショナル・アーカイブズ・オブ・ア レルギー・アンド・アプライド・イムノロジー、５３巻、４５９頁〕。またベン ニッチはペプチドＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＡｒｇもＡｓｐ−５ｅｒ− Ａｓｎ　−Ｐｒｏ−Ａｒｇも何ら遮断活性を示さないことを報告した。遺伝子配 列の決定によってアミノ酸３３２はアスパラギンであって、アスパラギン酸でな いことが判明した。ヨーロッパ特許出願第１０２６３４号では、対応する位置に アスパラギン酸ではなくアスパラギンを正しく引用している。

さらにまたＨＥＰＰの比活性は低く、何らかの有意な生理的効果を発揮するには 極めて大量の投与を必要とすることも報告された。

ＩｇＥ鎖の好適なドメインを暗号化したＤＮＡ配列をクローニングし、エシェリ キア・コリで発現することにより、ＩｇＥイプシロン鎖断片を合成し得ることが 知られている〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（１９８５年） 、１５巻、９６６〜９６９頁およびプロシーディンゲス・オブ・ナショナル・ア カデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ＵＳＡ、８１巻（１９８４年）、２９５ ５〜２９５９頁〕。

また天然１ｇＥは、リンパ球、好酸球、単球および血小板のような細胞の低親和 性受容体（ＦｃＥＲｔ）と結合して、これらの細胞の作動体＠能、例えば好酸球 によるＩｇＥに依存した殺寄生虫作用を活性化させる。またＢリンパ球のＦｃＥ Ｒｔ受容体は、増殖信号の導入およびＢ細胞活性化に関与している。ＦｃＥＲ， およびＦｅＥＲｔは構造的に無関連なタンパク質であるので、ＩｇＥのＦｃ領域 の異なった部位を認識することが期待できる。

この発明の目的は第２型低親和性Ｆｃ受容体（Ｆ　ｃＥ　Ｒ＊）と結合するポリ ペプチドを提供することにある。

この発明では、下記第１表に示したベンニッチ配列表のアミノ酸残基３４０〜４ ３９の配列を有するポリペプチドを含んだ免疫グロブリンＥの低親和性受容体に 対する競合体を提供する。

第１表 ３４０　　　　Ａ−Ｌ＠ｕ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−５ａｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ −Ａｓｐ−Ｌｅｕ−３４９Ｐｈｅ−工１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｐｒｏ− Ｔｈｒ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−３５９Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌ ＠ｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−３６９Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓ ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−５ｅｒ−酸配列の一部 に対応するアミノ酸配列であり得る。それはこの３０３７９　　　　　　Ｇｌｙ −Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｅ　ｉｓ−５ｅｒ−Ｔｈ１５−５ｅｒ−Ｔ ｈｒ−Ａｒ　　　　　　Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌ！１−Ａｒｇ−Ａｓｎ− Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−３９９Ｖａｌ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌ ｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ　−Ａ　ｒｇ−４０９Ａｓｐ−Ｔｒｐ −工１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｉｎ　−Ｃｙｓ　−４ １９Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ　−１１ｉ　ｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉ　ｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒ ｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−４２９Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−５ｅｒ−τｈｒ−Ｔｈｒ −Ｌｙｓ−’！’ｈｒ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−４３９Ｐｒｏ−Ｂ。

第１表において、基Ａは水素原子、または連鎖開始アミノ酸配列を含み得る、多 くとも単に免疫グロブリンＥ重鎖のアミノ酸残基の天然配列の一部だけを含むア ミノ酸配列であり、その天然配列部分はベンニッチ配列表のアミノ酸残基３０１ 〜３３９の配列の全部または一部を形成し、Ｂは水素原子または同様のアミノ酸 配列Ｂと二量体を作り得るアミノ酸配列である。

Ａは、Ａ基のＣ末端残基３３９から遡って伸長し、ベンニッチ配列表による残基 ３０１を含んだ免疫グロブリンＥ重鎖の天然アミツノ酸配列Ｘ（これに対応する ヌクレオチド配列はＡＴＧ　　ＧＡＴｌ〜３３９配列の単に一部だけを含むもの であり得る。Ａは不活性なポリペプチド配列であって免疫グロブリンＥの低親和 性受容体部位に対するポリペプチドの競合能を妨げない、好ましくは不活性なオ リゴペプチドであり、またはそれを含むことができる。

Ｂは同様のＢ基と二量体構造を形成でき、免疫グロブリンＥ低親和性受容体部位 に対するポリペプチド競合体の競合能を妨げない任意のアミノ酸配列であり得る 。それは残基４４０で、例えばベンニッチ配列表による残基５４７まで伸長を開 始するＴＨＥ重鎮配列の一部に対応することもできる。別法として地のタンパク 質、例えばマウス・ガンマ−２ｂ鎖の断片であることもできる。Ａが連鎖開始ア ミノ酸配列を表し、もしくはこれを含む場合、そのような配列は通常約２０個を 超えないアミノ酸残基を含み、普通約１０個を超えず、例えば４または５個のア ミノ酸残基を含んでいることが好ましい。

この発明によるポリペプチド競合体の好ましい一形態では、Ａは水素原子、また はＭｅｔ　−Ａｓｐ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａｒｇ−のような連鎖開始アミＣＣＧ　　 ＣＧＣ）、Ｂは下記の第ｎ表に示したベンニッチ配列表のアミノ酸残基４４０〜 ５４７の配列を表す。

第■表 （第■表つづき） さらにこの発明は、第１表に示したポリペプチド競合体（ここでＡは下記の第ｍ 表に示したベンニッチ配列表のアミノ酸残基３０１〜３３９の配列を表す）を包 含する。

第■表 ３０１　　　　Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｅｉｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ａ ｒｇ−τｈｒ−Ｔｙｒ−３１１　　　　Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈ ｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｂｉｓ−Ｔｈｒ−３２１Ｐｈａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ −５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｚ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−３３１５ｅｒ− Ａｓｎ−’Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−８ｅｒ−人１ａ−Ｔ７ｒ−。

特に好ましいこの型のポリペプチドは、その構造およびヌクレオチド配列が下記 の第■表に示したものであるマウス・ガンマ−２ｂ鎖で作成されたアミノ酸配列 を表す残基Ｂを有するものである。

第■表 Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ− 人１ａ−ＣＣＡ　ＣＡＡ　ＧＴＡ　ＴＡＣＡＴＣＴＴＧ　ＣＣＧ　ＣＣＡ　ＣＣ Ａ　ＧＣＡＧｌｕ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ −５ｅｒ−Ｌｅｕ−ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＴＴＧ　ＴＣＣＡＧＧ　ＡＪ！Ｊｋ　ＧＡ Ｔ’　ＧＴＣＡＧＴ　ＣＴＣＴｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ −Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＡＣＴ　　ＴＧＣＣＴＧ　　Ｇ’Ｅ　　Ｇ ＴＧ　　ＧＧＣＴＴＣＡＡＣＣＣＴ　　ＧＧ八へｓｐ−Ｘ　ｌｅ−５ｅｒ−Ｖａ ｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−ＧＡＣＡＴＣＡＧＴ　 ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＡＣＣＡＧＣＭ’ｒ　ＧＧＧＨｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ −Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−？’ｈｒ−Ａｌａ−ＣＡＴ　ＡＣ Ａ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＡＣＴＡＣＡＡＧ　ＧＡＣＡＣＣＧＣＡＰｒｏ−Ｖａｌ −Ｌｅｕ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＣＣＡ 　ＧＴＣＣＴＡ　ＧＡＣ丁ＣＴ　ＧＡＣＧＧＴ　’ｒＣＴ　ＴＡＣＴＴＣ工１ｅ −Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−１ｉｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−５ｅｒ −ＡＴＡ　ＴＡＣＡＧＣＡＡＧ　Ｃ！’ＣＧＡ’ｒ　ＡＴＡ　ＡＭ　ＡＣＡ　Ａ ＧＣＡＡＧ　ＴＧＧ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＴＣＣＴＴｃＴＣＡ　 ＴＧＣＡｓｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａ ｓｎ−Ｔｙｒ−ＡＡＣＧＴＧ　ＡＧＡ　ＣＡＣＧＡＧ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＡＡＡ 　ＡＡＴ　ＴＡＧＴｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙａ−Ｔｈｒ−Ｘ　ｌｅ−５ｅｒ −Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−ＴＡＣＣＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＣＣＡＴＣＴＣ ＣＣＧＧ　’Ｉ’ＣＴ　ＣＣＧＧｌｙ−Ｌｙｓ　Ｃ停止】 ＧＧＴ　ＡＡＡ　ＴＧＡ。

二の発明は、特にベンエッチ配列表のアミノ酸残基３４０〜５４７の配列を有す るポリペプチドを含んだ下記の第７表に示した免疫グロブリンＥの低親和性受容 体部位に対する競合体を提供する。

またこの発明は同じく下記の第７表に示したヌクレオチド配列を有するＤＮＡを 提供する。

第Ｖ表 ３４０　　　　　　Ｘ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−５ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐ ｂｅ−Ａｇｐ−Ｌｅｕ−Ｃ’！’Ａ　ＡＧＣＣＧＧ　ＣＣＣＡＧＣＣＣＧ　’！ ’ｒＣＧＡＣＣＴＧ３４９　　　　　Ｐｈｅ−工１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−５ｅｒ −Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−工１ｅ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−ＴＴＣＡ’ｒＣＣＧＣＡＡＧ　Ｔ ＣＧ　ＣＣＣＡＣＧ　ＡＴＣＡＣＣＴＧＴ３５９　　　　　　　　　　　Ｌｅｕ −Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ −ＣＴＧ　ＧＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＣＣＡＧＣＡＡＧ　ＧＧＧ３ ６９　　　　　Ｔｈｒ−Ｖａｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔ　ｒｐ−５ｅｒ− Ａｒｇ−Ａｌａ−５ｅｒ−ＡＣＣＧＴＧ　ＡＡＣＣＴＧ　ＡＣＣＴＧＧ　ＴＣＣ ＣＧＣＧＣＣＡＧＴ３７９　　　　　　　　　Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ −Ａｓｎ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−τｈｒ−人ｒｇ−Ｌｙｓ−’ＧＣＧ　ＡＡＧ　ＣＴ Ｔ　ＧＴＧ　ＡＡＣＣＡＣ’！’ＣＣＡＣＣＡＧＡ　ＡＡＧ３１１９　　　　　 Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−’！’ｈｒ−Ｌｅ ｕ−Ｔｈ　ｒ−ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＣＧＣＡＡ’ｒ　ＧＧＣＡＣ Ｇ　’！”ｌ’Ａ　ＡＣＣ３９９Ｖａｌ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐ ｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＧＴＣＡＣＧ　’ｌ’ｃｃ　ＡＣＣＣ ＴＧ　ＣＣＧ　ＧＴＧ　ＧＧＣＡＣＣ’　ＣＧＡＡｒａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｈｉ ｓ−Ｐｒｏ−Ｅｉｇ−Ｌｅｕ−Ｐｒｙ−ｒ−λｔ”６−λ１烏−（第Ｖ表つづき ） ４３９　　　　　Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌｍ−λ１ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ− Ｔｙｒ−＾１ａ−Ｐｈｅ−ＧＣＧ　ＡＣＧ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＣＣＧ　 ＧＧＧ　ＡＧＣＣＧＧ　ＣＡＣ４５９Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ −Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−工１ｒ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−ＡＧＧ　ＣＧＣＡＣＣＣＴＣＧＣ Ｃ’ｒＧｃ　ＣＴＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＡＡＣ４６９Ｐｈｅ−Ｎｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌｕ−Ａｓｐ−工１ｅ−８ｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｔｒｐ−ＴＴＣＡＴＧ　ＣＣ Ｔ　ＧＡＧ　ＧＡＣＡＴＣＴＣＧ　ＧＴＣＣＡＧ　ＴＧＧＣＴＧ　ＣＡＣＡＡＣ ＧＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣＣＣＣＧＡＣＣＣＣ４８９Ａｒｇ−Ｈｉｓ−５ ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｂｒ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−’！’ｈｒ−αＺ　 ＣＡＣＡＧＣＡＣＧ　ＡＣＧ　ＣＡＧ　ＣＣＣＣＧＣＭＧ　ＡＣＣ（第７表つづ き） ５０９　　　　　Ｌ４Ｉｕ−Ｇｉｎ−Ｖａ　ｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａ　１ａ−Ｇ ｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−ＣＩ’Ｇ　ＧＡＧ　ＧＴＣＡＣＣＡＧＧ　ＧＣ ＣＧＡＡ　ＴＧＧ　ＧＡＧ　ＣＡＧ５１９　　　　　Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ− Ｐｈｅ−Ｘ　ｌｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−１！ｉ　５−ＪＬＡＡ　 ｃＡＴ　ＧＡＧ　ＴＴＣＡＴＣＴＧＣＣＧＴ　ＧＣＡ　ＧＴＧ　ＣＡ’！’５２ ９　　　　　Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｔｈ ｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＧＣＧ　ＡＧＣＣＣＣＴＣＡ　ＣＡＧ　 ＡＣＣＧ？’ＣＣＡＧ５３９　　　　　Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｖａ ｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｅ停止】ＣＧＡ　ＧＣＧ　ＧＴＧ　ＴＣ Ｔ　ＧＴＡ　ＡＡＴ　ＣＣＣＧＣＴ　ＡＡＡ　　ＴＧＡ第Ｖ表において、基Ｘは 水素原子、または連鎖開始アミノ酸配列であり、以下に説明する具体的な製造方 法では、Ｘ基はＭｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−であり、それに対応するヌク レオチド配列はＡＴＧＧＡＴ　　ＣＣＧ　　ＣＧＣである。

この発明は、さらに前記第１表および第７表で示した型のポリペプチド配列（お よび連鎖を開始し、モして／または停止する対応する不活性なオリゴペプチドに より、Ｎ末端またはＣ末端の一方または双方で停止した第■表、第ｍ表または第 ■表で修飾された第１表に示した型のポリペプチド配列）に拡張する。

この発明のポリペプチド競合体の二量体形態は特に重要である。

また前記第１表および第７表で定義した配列断片、または第■表または第■表の 何れか一つにより修飾された第１表で定義した配列断片と同一または類似の競合 性を有するこの発明のポリペプチド断片は、その二量体形態を含みこの発明の範 囲に包含される。

またこの発明は、配列３４０〜５４７のポリペプチドを暗号化したヌクレオチド 配列を含んでいる宿主／ベクター系を提供する。

発現ベクターはエシェリキア・コリＮ４８３０が都合よく、配列３４０〜５４７ のペプチドを暗号化したプラスミド（ｐＥ　３−４と命名）を含んだこの歯の培 養をナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャーズ・イン・ロンドン へ受入れ番号ＮＣＴＣ１２１６２のちとに寄託した（寄託口、１９８７年１１月 １８日）。

またこの発明は、その宿主微生物を培養し、培養物からペプチドを単離すること を含むポリペプチド３４０〜５４７の製造方法を提供する。

またこの発明は、有効成分が前記の型の免疫グロブリンＥ低親和性受容体部位に 対するポリペプチド競合体である医薬製剤を包含する。

またこの製剤は、このポリペプチド競合体を好適なき様により、例えば経鼻的に 投与し得る医薬用担体を含有し得る。

またこの発明のポリペプチド競合体は、その他の治療薬または診断薬、またはＩ ｇＥ低親和性受容体保有細胞を標的として治療薬または診断薬を走行させるよう ポリペプチドが作用する効果をもたらし得る他の分子と共有結合的に結合し、ま たは会合させ得る。

さらにこの発明は、結合測定および診断用キットに包含させるこの発明のポリペ プチド競合体、その二量体およびその生物学的に有効な断片の用途を目的とする 。

このようにこの発明のポリペプチド３４０〜５４７は、細胞の低親和性１８Ｅ受 容体との結合能を有することが判明した。この発明から生じる利点は、ＩｇＨの 高親和性結合部位と低親和性結合部位とを鑑別し得る能力によって、医学的な適 応に応じてこれらの作動体分子の投与を分けることを可能とした点である。Ｉｇ Ｅは■型即時型過敏症として知られるアレルギー反応に関与しており、その拮抗 物質としての価値は先に挙げた発明者らの同時係属特許出願で説明した。

ＩｇＥの肥満細胞との反応は即時型過敏症を誘発するばかりでな。

く、遅発型過敏症状態を発現するのに直接関与しており、この状態は最初の免疫 反応の際、肥満細胞からの化学化合物の放出によって開始される。連発型過敏症 には、血小板、マクロファージ、好酸球のようなその他の細胞型が動員され、こ れらは異物または最初の組織損傷部位に誘引され、そこで炎症反応を起こす。

これらの細胞が低親和性受容体を介してＩｇＥおよび抗原と結合すると、細胞障 害性酸素ラジカルが遊離され、これらはもし異種細胞が存在するとその細胞をも 含めて局所付近の細胞を破壊する。したがってポリペプチド３４０〜５４７は天 然ＩｇＥ結合に随伴する連発型過敏反応を遮断し、もしくは消滅させるＩｇＥ拮 抗物質としての用途が考えられる。

以下、実施例によってこの発明を説明する。

第１図はヒトＩｇＥのイプシロン鎖の共有結合構造を示したもので、鎖内ジスル フィッド（Ｓ−Ｓ）結合および値開ジスルフィッド（Ｓ−Ｓ、５−Ｌ）、および ５つの構造ドメイ：／（ＶＨ，ＣＨ−１〜４）の境界をＮ−末端（左側）とＣ− 末端（右側）との間のゲノムＤＮＡ内のエキジンに対応させて示している。組換 え体ペプチドを説明すると、ｒＥ　２−４はＡｓｐ２１８−Ｌｙｓ５４７を含み （ＣＨＩからの７個のアミノ酸を含むＣｅ２−４）、ｒＥ　２−３はＡｓｐ２１ ８−Ｐｒｏ４３９を含み（ＣＨＩからの７個のアミノ酸およびＣＨ４からの１個 のアミノ酸を含むＣＨ２およびＣＨ３）、ｒＥ４はＡｒｇ４４０−Ｌｙｓ５４７ を含み、ｒＥ２°−４はＧ１ｎ３０１−Ｌｙｓ５４７を含み（値開ジスルフィッ ド結吾を形成する２個のシスティン間の示された位置からのＣＨ２のＣ末端、Ｃ Ｈ３およびＣＨ４）、ｒＥ　３−４はＬｅｕ３４０−Ｌｙｓ５４７を含み（Ｎ末 端の９個の残基を除＜ＣＨ３のすべておよびＣＨ４）、ｒＥ２はＡｓｐ２１８− Ｖａ１３３６を含み（ＣＨＩからの７個のアミノ酸を含むＣＨ２およびＣＨ３か らの６個のアミノ酸）、Ｒｅ２°−３°はＧ１ｎ３０１−Ａｒｇ３７６を含んで いる（ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの鎖内ジスルフィッド結合を形成するシステ ィン間の示された位置からのＣＨ２のＣ末端部分およびＣＨ３のＮ末端部分）。

〔方法〕

上記のペプチドを生産するエシェリキア・コリでの発現に使用する遺伝子組立て 物を説明する。ｒＥ　２−４を暗号化しているプラスミドｐＥ２−４およびｒＥ ４を暗号化しているプラスミドｐＥ４はＨｉｎｄＩ［［部位によって結合させた イプシロン遺伝子断片を含んでおり、ＴｒｐＥ配列の最初の７個のアミノ酸を含 んだ短いＮ末端融合物の合成を指定する。８量体ＨｉｎｄｌＩＩリンカー（二ニ ー・イングランド・バイオラボズ）をコドン４３９のペプチド（Ｆ　ｎｕＤ　ｎ 部位の位置）へ付加した後、ｐＥ４のイプシロン配列を挿入する。プラスミドｐ Ｅ２は１２量体ＮｈｅＩリンカー（二ニー・イングランド・バイオラボズ）で修 飾されたｐＨ２−４の誘導体であって、このリンカ−は翻訳停止信号を提供する 。クローニングしたｃＤＮＡをＨａｅＩ［で切断し、３゜突出部をＴ４ポリメラ ーゼで除去した後、このリンカ−をイプシロン配列のコドン３３７だけヘライゲ ニションした。プラスミドＩ）Ｈ２−３はｐｔａｅ　−８５へサブクローニング したイプシロンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を含んでおり、非融合ポリペプチドの発現を 指定する。Ｆ　ｎｕｄ　Ｕでイプシロン配列をコドン４３９の位置で切断した後 、合成オリゴヌクレオチドをその位置ヘライゲーションすることによりＣＨ３配 列のすぐ下流に翻訳停止信号（Ｐ、Ｌ、バイオケミカルズ）を配置した。

ｒＥ２’−４°を暗号化しているプラスミドｐＥ２’−４はイプシロン遺伝子断 片を含んでいるので、これを５ａｃｌで切断しくコドン２９７の位置で切断）、 Ｂａ１３１で緩和なエキソヌクレアーゼ処理した後、発現ベクターＰＡＳＩへ挿 入した。コドン３７６の位置にあるＳｍａｌ制限酵素部位でｐＨ２°−４へ翻訳 ターミネータ−を挿入することにより、ｒＥ２’−３°を暗号化しているプラス ミドｐＥ２’−３゜を作成した。

ｐＡＳＩＣローゼンバーグら、１９８３年、メソッズ・イン・エンザイモロジー 、１０１巻、１２３〜１３８頁）の組換え誘導体であるｐＥ　３−４のラムダ・ ＰＬプロモーターの制御下に、エシェリキア・コリでｒＥ　３−４配列を合成し た。ｐＡｓＩのＢａｍＨ１部位へ挿入するため、イプシロンＤＮＡをＨａｅＩＩ で切断し、緩和なエキソヌクレアーゼ処理をし、１２量体ＢａｍＨＩリンカーを 付加することによってｐＥ　３−４内の遺伝子断片を調製した。Ｂａｍ８１部位 の周りのＤＮＡ配列を測定した。これによって、推論されたアミノ酸配列では発 現されたイプシロン配列がコドン３４０で始まることが判明した。操作中、付加 的に挿入した残基はＡＴＧ　ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＣＧＣ・・・ＣＴＡＭｅｔ　Ａｓ ｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　　−Ｌｅｕ　−（イプシロン配列の残基３４０） である。

ｐＥ３−４のイプシロン遺伝子断片は熱誘導によりエシェリキア・コリＮ４８３ ０で発現できる。これを達成するには、３０℃でＡ６００＝０．８まで株の増殖 を行い（非誘導）、ついで４２℃でインキュベートを行う（誘導）。

イプシロン（ＮＤ）の重鎖のＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインを暗号化した 遺伝子の欠失変異体からエシェリキア・コリで生成したヒトＩｇＥのクローニン グ断片を使用して、ＦｃＥＲｔ−陽性ヒトＢ細胞系ＲＰＭＩ８８６６の低親和性 （Ｆ　ｃＥ　Ｒｔ）部位への結合に関与するヒトＩｇＥ上の部位をプローブした 。種々の断片について予備的な間接および直接免疫蛍光結合測定を実施し、その 成績を下記の第■表に示す。この表は各ペプチドの高親和性受容体への結合能を 示している。

第■表 ヒトの高親和性（Ｆ　ｃＥ　Ｒ□）および低親和性（ＦｃＥＲｔ）受容体への組 換えＩｇＥペプチドの結合のまとめ ペプチド　　アミノ酸　　　　重鎮ドメイン　　　　結合ＶＨＩ　ＣＨＩ　ＣＨ ２ＣＨ３ＣＨ４ＦｃＥＲｔ　ＦｃＥＲｔＴｇＥ　　　　１−５４７ ｒＥ２−４　　２１８−５４７　　　　−ｒＥ２’−４３０１−５４７−−−ｇ ＋　　＋ｒＥ２−３　　２１８−４３９　　　　−　−ｒＥ２゛−３’　　：（ ０１−３７６−−一部一部−ｒＥ４　　　４４０−５４７ ｒＥ２　　　２１８−３３６ ｒＥ３−４　　３４０−５４７　　　　−これらの成績から、ヒトＩｇＥのＦ　 ｅＥ　Ｒ！への結合にはこの発明によって得られた重鎮の第３および第４ドメイ ンの存在が必要であり、また試験したこの発明のペプチド中でペプチドｒＥ　３ −４だけが高親和性結合には陰性で低親和性受容体へ結合することが判明した。

さらに間接蛍光免疫測定による研究から、骨髄腫タンパク質ＩｇＥ（ＰＳ）、ｒ Ｅ　２−４、ｒＥ２’−４およびｒＥ　３−４はｐ　ｃＥ　Ｒｖ陽性ＲＰＭＩ８ ８６６Ｂ細胞の９０％以上と結合することが確かめられた。然しさらに研究によ って、これとは対照的にｒＥ　２−３、ｒＥ２゛−３°、ｒＥ４およびｒＥ２で は検出し得る結合がないことが判明した。ｒＥペプチドの結合は２つの抗ＦｃＥ Ｒｔモノクローナル抗体（ｍＡｂｌ　３５および抗ＢＬＡＳＴ−２）と細胞とを 予じめインキュベートすることによって抑制されるが、特異性に関連のない対照 １ｇＧ１では抑制されないことから、この結合は特異的である。しかもＦｃ　Ｅ 　Ｒ＊陰性細胞系ジャーカットおよびラジでは結合が起こらないことが判明した 。

［ｒＥペプチドの結合能〕 ＲＰＭ１８８６６細胞を各種濃度のｒＥペプチドとインキュベートし、間接免疫 蛍光測定を実施した。

第１表にその成績をまとめた間接免疫蛍光測定のため、染色緩衝液（ＲＰＭｌ　 １６４０−０．０１％アジドを含有する２、５％ウシ胎児血清）中、０．５ｘ１ ０＠ＲＰＭＩ８８６６細胞（〉９９％ＦｃＥＲｔ陽性）を各種濃度（０，１〜２ ００μｇ／ｍＱ）の精製ｒＥ断片または天然ＩｇＥ（ＰＳ）と４℃で４０分間イ ンキュベートした。これを洗浄後、細胞を好適なフルオレスセインイソチオシア ナート（ＦＩＴＣ）結合−抗Ｆ　ｃｍＡ　Ｂまたはアフィニティー精製を行った ヤギー抗ヒトＩｇＥ抗体（１０μｇ／ｍ１２）と４℃で３０分間インキュベート した。十分に洗浄した後、ＩｇＥまたはｒＥ断片と結合した細胞の百分率をＦＡ Ｃスキャン（ベクトン・ディキンジン、マウンテンビュー、ＣＡ）により測定し た。第１表に陽性細胞の絶対百分率を示す（９回の実験から得られた結果の平均 値±Ｓ、Ｄ、）。

第１表 間接蛍光免疫測定による組換え体ＩｇＥペプチドのＲＰＭＩ８Ｂ６６Ｂ細胞への 結合 リガドン　　　　　　　アミノ酸配列　　　　　　陽性細胞％ＩｇＥ（ＰＳ）　 　　Ｇｌｐｌ−Ｌｙｓ５４７　　　　　　９１±２％ｒＥ２−４　　　　Ａｓｐ 　２１８−Ｌｙｓ　５４７　　　　９２±２％ｒＥ２’−４Ｇｌｎ　３０１−Ｌ ｙｓ　５４７　　　　９１±２％ｒＥ３−４　　　　Ｌｅｕ　３４０−Ｌｙｓ　 ５４７　　　　９０±３％ｒＥ２−３　　　　Ａｓｐ　２１８−Ｐｒｏ　４３９ 　　　　　３：１％ｒＥ２°−３′　　Ｇｌｎ　３０１−Ａｒｇ　３７６　　　 　　２±１％ｒＥ２　　　　　　Ａｓｐ　２１８−Ｖａｌ　３３６　　　　　２ ±１％ｒＥ４　　　　　　Ａｒｇ　４４０−Ｌｙｓ　５４７　　　　　３±２％ 第■表の成績からＦｃＥＲｔ結合部位はｒＥ　３−４のペプチド＜Ｌｅｕ３４０ −Ｌｙｓ　５４７）に含まれており、ＣＨ２ドメインは必要でないことが分かる 。

抗ｐｃＥＲｔモノクローナル抗体を用いる試験のため、０．５ｘ１０”ＲＰＭｌ 　８８６６細胞の染色緩衝溶液を予じめ培地、抗ＦｃＥＲｔｍＡｂ（ｍＡｂｌ　 ３５または抗ＢＬＡＳＴ−２ｍＡｂ）ＩＪ１ｇ／ｍＱまたは対照１ｇＧ１ネズミ ｍＡｂ（抗ＨＬＡ−ＤＰ、２．５μｇ／ｍＱ）と４℃で６０分間インキュベート した。洗浄した後、細胞をＩｇＥ（ＦＳＸＩμｇ／ｍ１２）またはｒＥ　３−４ 　（２００μｇ／ｍ１２）と４℃で４０分間インキュベートし、ついでｍＡｂ　 ＲＰ　Ｉ　−Ｆ　Ｉ　ＴＣで処理した。第Ｘ１表は陽性細胞の絶対百分率を示す （３回の実験から得られた結果の平均値±Ｓ、Ｄ、）。　　。

第Ｎ１表 抗Ｆ　ｃＥ　Ｒｔ／　ＣＤ　２３　ｍＡ　ｂによるｒＥ　３−４のＲＰＭＩ８８ ６６細胞への結合抑制 抑制物質　　　　　　　　　　　　　リガドンＩ　ｇＥ　　　　　　　ｒＥ　３ −４ 無添加　　　　　　　　　８８±２　　　　　８９±３ａＡｂｌ　３５　　　　 　　　　２±１　　　　　　５±２抗ＢＬＡＳＴ−２３±１　　　　　４±２対 照マウスＩｇＧ１　　　　７４±２　　　　　７６±５これらの実験で使用した ｍＡｂ１３５は、Ｅ、レフターら〔イムノロジー、５５巻、４８１〜４８７頁（ １９８５年）〕の報告によるものであり、抗ＢＬＡＳＴ−２＋ｎＡｂはＣ，キン トナーら〔ネーチャー、２９４巻、４５８〜４６０頁（１９８１年）〕の報告に よるものである。

種々のイプシロン鎖断片および突然変異体配列の相対活性を比較すると、結合は ペプチド濃度の関数として測定される。結合の変化を第２図に示し、その結果を 第■表にまとめた。ｒＥ２°−３／Ｇ３はｐＨＧ２０１に由来するマウス・ガン マ−２ｂｃＤＮＡを使用して組立てたキメラ組換え体である［Ｓ、ロバーツら、 プロティン・エンジニアリング、１巻、５９〜６５頁（１９８６年）コ。マウス ＣＨ３配列は、ｐＨＧ２０１を５ａｃｌで部分消化し、アミノ酸３４６〜４４７ （ＥＵインデックス）を暗号化しているＤＮＡ断片を得ることにより誘導した。

この断片をＰＥ２’−４でコドン４３９の下流へ挿入することにより、Ｃイプシ ロン−４配列をＣガンマ−２ｂ　ＣＨ３ドメインで書き換え乙。組換え体ペプチ ドはイプシロンおよびガンマ−２ｂの何れの抗血清とも反応した。

第■表 ｒＥペプチド類の結合能 リガドン　　　　Ｂ細胞と５０％結合するのに必要なモル濃度ＩｇＥ　　　　　 　　　　　　９，０ｘｌＯ”脱グリコジル化　　　　　４．８ｘｌＯ”したＩｇ Ｅ ｒＥ２−４　　　　　　　　７．２ｘ　１０−”ｒＥ２°−４２，６Ｘ１０−” ｒＥ３−４　　　　　　　　５．８Ｘ１０−’ｒＥ２−４　　Ａｒｇ　　　　　 　ｔ、ｅｘｔ　Ｑ−１゜５０６（二量体） ｒＥ２’−３／Ｇ３　　　　４．７Ｘ１０−”脱グリコジル化のために、ｒｇＥ （ＦＳＸ２００μｓ／ｍ１２）の０．５５Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ８、６ ）をＮ−グリコシダーゼＦ（Ｎ−グリカナーゼ、ジェンザイム・コーポレーショ ン、ボストン、ＭＡ）　１５　Ｕ／＠（！と３７℃で一夜インキユベートし、つ いで回転板上で４℃で過剰のレンチル・レクチン・セファロース４Ｂ（シグマ・ ケミカル・カンパニー・セントルイス、ＭＯ）に吸着させた。調製品の５ＤＳ− ＰＡＧＥ分析および過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）による明した。脱グリコジル化 試料のＩｇＥ濃度は放射免疫測定によってチェックした。

ｒＥ　２−４における点位置は、Ｙ、モリナガら〔バイオテクノロジー、７月、 ６３６〜６３９頁（１９８４年）〕が報告した方法に従い、二本鎖プラスミドＤ ＮＡを使用するオリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異によって実施した。

組換え体Ｆｃ（ｒＥ２−４）は極めて活性が高く、事実、骨髄腫ＩｇＥ（ＰＳ） より明らかに強い、この発明で得られたＩｇＥ（ＰＳ）の酵素０脱グリコジル化 によりその活性が増大する結果から、親和性の向上は炭水化物が存在しないこと によるものと推定される。ＣＨ２およびＣＨ３からの９個のアミノ酸を欠いてい るｒＥ　３−４はｒＥ２＝４より遥かに低い活性を示す。これに反して、先端を 切り取ったペプチド、ｒＥ２°−４はＣＨ２のＣ末端の３０個のアミノ酸を保有 しているが、完全なＦｃ配列とほとんど同等の活性を示した。従って生理的な結 合親和性のためには、３個のＦｃドメインがすべて必要であるようである。

結合に必要なＦｃの構造要素を明らかにした。すべての抗体クラスのＰｃ領域は 多くの共通な特徴を有すると考えられる。特にそれらはＣ末端ドメイン（例えば ＣＨ４またはＣ−ガンマ−３）で非共有結合的に連結し、中間ドメイン（ＣＨ３ またはＣ−ガンマ−２）で炭水化物によって分離され、Ｎ末端ドメイン（ＩｇＧ の連結領域に対応するＩｇＥのＣＨ２）で共有結合的に１またはそれ以上のジス ルフィッド結合により連結されている２本の重鎖を含んでいる。従ってＣＨ２お よびＣＨ４にある値開結合は第３級構造を生じ、この構造が受容体認識に必要な のかもしれない。これが活性状態を決定するのかどうかを調べるため、単量体鎖 の活性を測定した。

Ｃ）（４ドメインを含んでいるｒＥ鎖断片はすべて溶液中で二量体を作ることが できる。然し３つのＦｃドメインは何れもジスルフィッドで連結された二量体の 生成が必要であることが判明し、このことはＣ）（４における非共有結合的な会 合の場合、ジスルフィッド結合の生成が起こり得るようＣＨ２に予じめチオール を配置しておく必要があることを示唆している。もし２つのＣＨ４ドメインの会 合が二量体形成を核とするのであれば、この会合を防止することによって二量体 の生成を抑制できるはずである。ＩｇＥモデルではＣＨ４の２つのＰｈｅ５０６ 残基がファン・デル・ワールスの接触にあることを示唆する。従ってＰｈｅ５０ ６を荷電された残基で置き換えると二量体の生成が阻止されるはずである。突然 変異体遺伝子の発現生産物、ｒＥ　２−４　（Ａｒｇ５０６）はゲル電気泳動法 による判定で単量体性を保有していることが判明した。ＨＰＬＣにより痕跡の二 量体（く１％）を除去すると、生産物は、Ｂ細胞に対する結合が完全に不活性で あることが分かった。分離した画分から回収した二量体は非突然変異体Ｆｃより 著しく強い活性を示した。Ｐｈｅ５０６はＣＨ４ドメインに含まれているので認 識配列を関与しているようには考えられない。以上のことから鎖の二量体化がＦ ＣＥＲＩ結合に不可欠であると結論した。

第２図はアフィニティー精製を行ったｒＥペプチドのポリアクリルアミドゲル電 気泳動による結果を示したものである。第３Ａ図は２０％５ＤＳ＝尿素ゲルで非 還元条件下にペプチドを分析して得られた結果を示したものであり、第３Ｂ図は １５％５ＤＳ−尿素ゲルで還元条件下にペプチドを分析した結果を示している。

適用した試料は、バンド（１）が標準タンパク質、バンド（２）がｒＥ　２−４ 、バンド（３）がｒＥ　２−４　（Ａｒｇ５０６）、バンド（４）がｒＥ２’− ３／Ｇ３である。これらのペプチドはエシェリキア・コリから単離し、アフィニ ティー精製を行った。

ＣＨ４は二量体化に必要であり、二量体化は活性に必要であるから結合部位の部 分はＣＨ４に存在している可能性があるので、このドメインを簡単に欠失によっ て除（ことはできない。例えばｒＥ２−３が単量体状態にあることは先の第■表 にまとめた結合検定における不活性から十分に説明できる。ＦｃＥＲ，結合にお けるＣＨ４配列の役割を明らかにするため、ｒＥ２°−４のＣ末端ドメインをマ ウス・ガンマ−２ｂ鎖に置き換えたキメラ免疫グロブリン断片ｒＥ２’−３７Ｇ ３の挙動について検討を行った。ＩｇＥとＩｇＧとの相同性から予想されるよう に、このキメラ鎖は第３図に見られるような高収量でジスルフィッドで結合され た二量体を生成する。第２図の検査成績から理解されるように、これらの二量体 はその非キメラ対応物の強度と同程度の活性水準を示す。またマウスＩｇＧ２ｂ はＢ細胞と結合しないことが分かったので、ＦｃＥＲｔ特異的結合部位はＣＨ３ に局在していると結論した。

ＣＨ３ドメインのＦＣＥＲ２の結合部位をさらに正確にマツピングするためＦｃ 領域における抗原決定基に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用して、″ ５■−標識ＩｇＥのＢ細胞結合に対するそれらの抑制効率を測定した。抗体によ って認識される各種の抗原決定基をウェスタンブロッティング法によりｒＥペプ チドへマツピングし、配列内のペプチドの位置をモデルにおけるそれらの位置と 関連付けた。その結果を第Ｘ表にまとめた。

第Ｘ表 抗ヒトＦｃｍＡｂ：特異性および ＋ｔｓ　Ｉ　　Ｉ　ｇＥのＦ　ｃ　Ｅ　Ｒｔの結合の抑制ｍＡｂ　　　　　　　 抗原決定基の位置　　　　　　　”！−１ｇＥ（アミノ酸）　　　　　　　　結 合の抑制％ＤＣＣＨ２（Ａｓｎ　２１８−Ｇｉｎ　３０１）　　　　　ナシＡＳ ７．ｔ２　　ＣＨ２（Ａｓｎ　２１８−Ｇｌｎ　３０１）　　　　ナシＢ５１７ 　　　ＣＨ２（Ｇｌｎ３０１−Ｔｈｒ３１５）　　　　７８ＲＰ３　　　　ＣＨ ２（Ａｓｐ　３０７−Ｔｈｒ　３１５）　　　　７７ＩＣ２７２ＣＨ２（Ｔｈｒ 　３１５−Ｖａｌ　３３６）　　　　２２Ｌｅ２７　　　　ＣＨ３（Ｌｅｕ　３ ４０−Ｖａｌ　３６１）　　　　　ナシＲＰ　Ｉ　　　　ＣＨ３（Ｌｅｕ　３４ ０−Ｖａｌ　３−６１）　　　　　ナシＩＣ２７ＣＨ３（Ｌｙｓ　３６７−Ｖａ ｌ　３７０）　　　　８８ＩＣ１７３ＣＨ４（Ａｒｇ　４４０−Ｌｙｓ　５４７ ）　　　　　ナシ抗Ｆｅ　　ｉ＋Ａｂの特異性は、酵素結合抗体免疫吸着アッセ イ、ウェスタンプロット法およびドツト免疫測定によりｒＥ断片、アミノ酸残基 Ａｓｎ２１８−Ｔｈｒ３１５を含んだｒＥ断片およびアミノ酸残基Ａｓｐ３０７ −Ｖａｌ３７０を含んだ合成ペプチドとの反応パターンにより推定した。精製ヒ ト骨髄腫ＩｇＥ（ＰＳ）をクロラミン−Ｔ法によってヨード化した（比活性：　 ８０００　ｃｐｓ／　ｎｇ）。ＩｇＥのＦ　ｃＥ　Ｒｘ結合を抑制する抗）”ｃ 　　ｍＡＢの抑制能を試験するには、＋１！１１　　ＩｇＥのＰＢＳ−０，５％ ＢＳＡ溶液（１５ｎｇ／　５０　ｕＱ）を１Ｏ１１００，１０００Ｍ過剰の抗Ｆ ｃ　　ｍＡｂと３７℃で１時間混合し、ついで１ｘｌＯ＠ＲＰＭＩ８８６６細胞 ０　、　Ｉ　ｍＱへ添加した。４℃で２時間インキュベートした後、細胞を血清 内で撹拌し、細胞に結合した放射能活性を計測した。最大の結合は培地だけの存 在で細胞を１１５１−ＩｇＥとインキュベートすることにより測定した。第Ｘ表 にはｍＡｂの１０Ｍ過剰で得られた抑制を示した。

９個のモノクローナル抗体のうち３個がＩｇＥ受容体との相互作用を強く抑制し た。５ＡｂＢｓ１７およびＲＰ３に対する抗原決定基はＣＨ２のＣ末端領域（Ｇ １ｎ３０１〜Ｔｈｒ３１５の間）にあり、３番目の抗原決定基ＩＣ２７はＣＨ３ のＮ末端（Ｌｙｓ３６７−Ｖａ１３７０を含む）にある。これら３つの部位はＰ ｃモデルのＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の裂は目の内側またはそれに 近接して位置している。４番目のｇ＋Ａｂ　　ＩＣ２７２は介在配列（Ｔｈｒ３ １５−Ｖａｌ３３６）で結合しているが弱い抑制を示すだけである。このｍＡｂ は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の裂は目のＣＨ２側に並んでいる２ 本のベータ鎖を分けるループと結合していることが想定される。そのやや弱い抑 制効果はこれによって説明し得よう。

他の２つのａＡｂ、ＲＰＩおよびＬｅ２７は第２の介在配列（Ｌｅｕ３４０−Ｖ ａｌ３６１　）内で結合するが何ら抑制効果を示さない。このペプチド断片全体 が裂は目から離れて結合している。その他の３つのｍＡｂ％ＤＣＳＡ９７．１２ およびＩＣ１７３はＣＨ２−ＣＨ３結合領域の外側、ＣＨ２およびＣＨ４の抗原 決定基と結合しているが、受容体結合を抑制しない、断片結合測定の結果を考え 合わせると、これらの成績からＦ　ｃ　Ｅ　ＲｔはＡｓｐ３６２−Ｖａｌ３７０ の付近で結合していることが示唆される。ＣＨ２は配列の結合部位に関与しない から、抗ＣＨ２＋ａＡｂによる抑制は単に立体障害の結果に過ぎないと言えよう 。

以上考察した成績は、ヒ）ＩｇＥのＦ　ｃ　Ｅ　Ｒを結合部位がＦｃの３Ｄ構造 にあるＣＨ２に近接したＣＨ３のＮ末端領域にあることを示している。ただしＣ Ｈ４およびＣＨ２ドメインはＣＨ３構造に対するそれらの効果を介して活性水準 を決める。特に２つのＣＨ３ドメインは何れも活性を必要とし、ＣＨ２およびＣ Ｈ４は単に二量体を生じるだけに作用することが判明した。ｒＥ２°−４で先端 を切り取ったＣＨ２ドメインがほぼ完全な活性を十分示し、ｒＥ　３−４もまた 活性を有するから、ＣＨ２の天然構造はそれ自体重要なものであるようには思わ れない。またＣＨ４の天然構造もＰｈｅ５０６をアルギニンで置換しても二量体 の活性を損なわないから、いったん共有結合が生成されるとなくてもよいのかも しれない。

Ｂ細胞ＦｃＥＲ＊への結合で、キメラペプチドｒＥ２’−３／Ｇ３が完全な活性 よりも著しく劣った活性を示した観察については説明を要する。天然ＩｇＥでＣ 末端ドメインはＩ　ｇＥ　ｃＤＦ　ｃＥ　Ｒｔへの結合を妨害することがあり、 またＣＨ４はＣ−ガンマ−３より小さい結合妨害を生じることが示唆される。ｒ Ｅ２−４（Ａｒｇ５０６）はｒＥ　２−４より二量体として一層有効であること が分かった。これは対にならないＣＨ４ドメインが存在し、そのために対になっ たドメインよりもセグメントの可動性および回転の自由度が損なわれる程度が少 ないことによるのかもしれない。二量体化の基準に上り天然構造を有すると思わ れるｒＥ４はＢ細胞でＦ　ｃ　Ｅ　Ｒ＊　ｈの結合ができない。

従ってＣＨ４ドメインカ月ｇＥのＦ　ｃ　Ｅ　Ｒｔとの相互作用にプラスに働く ことはありそうにない。

これらの成績からＣイプシロン・ドメインが両方とも単一の受容体と結合するの か、あるいは１つまたは恐らく２つのＦｃＥＲｔ分子が二量体で別々のＣＨ３ド メインと結合するのかは明らかにならなかった。２つのＣＨ３ドメインがタンパ ク質および炭水化物によって分離されて遠く離れていることから結合の第一モデ ル（２：１）はありそうにない。存在する証拠は決定的ではない。ｍＡＢ　　Ｉ Ｃ２７がＩｇＥと結合でき、Ｂ細胞でその受容体に固定されることは判明した。

このことはＦｃＥＲｔ分子がＩｇＥのＣＨ３ドメインの一つだけと結合し、第２ のドメインがｍＡｂと相互作用し得るように自由に放置されていることを意味す ると言い得よう（もしｍＡｂと受容体が同一部位で競合すると推論するのなら） 。然し他の成績では、ネズミの）’ｃＥＲｔに対する２価のモノクローナル抗体 がＩｇＥの場合と同様に同数の部位と結合するが、そのＦ　ａｂ’断片はその数 の２倍と結合するので、２つの受容体が単一のＩｇＥ分子の複数のＣＨ３ドメイ ンと結合することを示唆している。理論上、２：２の結合様式として名付けられ た「モノガマス（単婚性）−２価」ではＫａ二量体≧（Ｋａ単量体）′であるこ とが親和性にとって有利となるのかもしれない。もし１０’Ｍ−’のＫａの観測 値が双方の部位のほぼ匹敵する値から生じたのであれば、単一部位の相互作用に よって生じた結合自由エネルギーはここに記載した測定に用いた検出の限界値以 下になるであろう。特異性の問題とも言い換えられる相互作用の化学量論に関し てはまだ不確定であり、即ち受容体が二量体化によって起こされた立体構造で単 一のＣＨ３ドメインを認識するのかしないのか、あるいは二量体が単に２つの部 位での相互作用によって一履高い親和性を生じるように働くのかそうでないのか は確定していない。

ヒトＩｇＥでは）’ｅＥＲｔ結合部位はＦ　ｃ　Ｅ　Ｒ＋結合部位と区別される 。Ｆ　ｃ　Ｅ　Ｒ＋はｒＥ　２−３およびｒＥ２°−３°と結合するが、ＦｃＥ Ｒ２は結合しない。一方、ＦｃＥＲｚはｒＥ　３−４と結合するが、ＦｃＥＲ， は結合しない。これはＧ１ｎ３０１とＬｅｕ３４０の間の配列がＦｃＥＲ□を必 要とするが、）’ｃＥＲ＊結合を必要としないことを示している。これらの部位 はＣＨ３でＶａ１３６２とＬｙｓ３６７の間の領域で重複しており、この領域は ＦｃＥＲ，部位のＣ末端境界を形成しているが、Ｆ　ｃＥ　Ｒを部位はさらにＣ 末端側へ伸長し、あるいは実際は、これらの部位は完全に分かれているのかもし れない。）’ｃＥＲｔ結合部位のＮ末端境界部位を確定しそれによって何れにし ても共通した配列の範囲を決定するにはさらに解像度の高いマツピングを必要と する。またＦ　ｃＥ　Ｒｌは単量体および二量体と結合し、他方、Ｆｃ　Ｅ　Ｒ ｔは単量体と結合できないので、２つの受容体は異なった結合様式を示す。Ｉｇ Ｇ１の単球受容体結合部位およびＩｇＭのＴ細胞およびＢ細胞受容体結合部位を Ｃ−ガンマ−２およびＣ−ｍｕ−３ドメインへそれぞれマツピングしたところ、 ＣＨ３と相同であった。Ｆｃ−ｍｕ−Ｒがｐ　ｃ　Ｅ　Ｒｔと同様に単量体鎖と 結合できないことは興味深い。

Ｆ　ｃ　Ｅ　Ｒ＋およびＦｃＥＲｔは無関連なタンパク質である。ＦｃＥＲ。

は、報告されている限りの他のすべての免疫グロブリン受容体と共通して免疫グ ロブリンの１課に属する。ＦｃＥＲｔは独特でアシアログリコプロティン受容体 と相同である。従って驚くべきことにＦｃＥＲ，はｒＥ　２−４と結合し、また 酵素０脱グリコジル化を行ったＩｇＥと天然のＩｇＢよりさらに強力に結合する 。これに反してＩｇＧのＰｃ−ガンマ−Ｒ１に対する高親和性結合は、炭水化物 の存在によって左右されることが報告されている。Ｆ　ｃＥ　Ｒを結合部位の推 定領域に近いイプシロン鎖のＡｓｎ３７１にグリコジル化部位のあることは注目 すべきである。この炭水化物置換基は明らかに結合部位の一部ではなく、イプシ ロン重鎮だけに見出され、ＦｅＥＲｙ結合活性を調節するために都合よく配置さ れているのかもしれない。

〔微生物〕

・記載箇所：原文１１頁４行目（訳文１５頁９行目）寄託機関の名称 ・ナショナル・コレクシジン・才ブ・タイプ・カルチャー寄託機関の住所 ・セントジル・パブリック・ヘルス・ラボラトリ−、コリンゾール・アベニュー 、 ロンドンＮＷ９　５ＨＴ 寄託の日付 ・１９８７年１１月１８日（１Ｂ、１１．８７）・ヨーロッパ特許を求めている それらの表示に関して、寄託された微生物サンプルの入手はヨーロッパ特許の許 可発令の公示、または出願の拒絶または取り下げ、または取り下げたとみなされ る日は、サンプル要求者によって指名された専門家へのサンプル発行によっての み行うことができる（ＥＰＣ規則２８（４））−ｒＥ２　　　／２７１９−３３ ６） −ｒＥ２’−３’　（３）１−、う５七≦ノ−ｏ−１ｇｆ 十Ｄｅｇ１．ＩｇＥ −＋　Ａｒｇ　５０６　、１５本 ・７　　　　７　　　　７０１００　　　７αη　　１００００ソｐ”＞７−　 　濃Ｌ　　（諸） Ｅａ、２ ＾ 国際調査報告 ＋内＋＊Ｍｍ１□−−１１＾・−”’−”Ｉ・ＰＣＴ／ＧＢ８８１０１０１８２ 国際調査報告

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．第１表に示したベンニッチの配列表（ここで基Ａは水素原子、または連鎖開 始アミノ酸配列を含み得る、多くとも単に免疫グロブリンＥ重鎖のアミノ酸残基 の天然配列の一部だけを含むアミノ酸配列であり、その天然配列部分はベンニッ チ配列表のアミノ酸残基３０１〜３３９の配列の全部または一部を形成し、Ｂは 水素原子または同様のアミノ酸配列Ｂと二量体を作り得るアミノ酸配列である） のアミノ酸残基３４０〜４３９の配列を有するポリペプチドを含んでいる免疫グ ロブリンＥ低親和性受容体に対するポリペプチド競合体。
2. ２．Ａは水素原子または速鎖開始アミノ酸配列を表し、Ｂは第ＩＩ表に示したベ ンニッチの配列表のアミノ酸残基４４０〜５４７の配列を表す請求項１記載のポ リペプチド競合体。
3. ３．Ａがアミノ酸配列Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−である請求項２記載の ポリペプチド競合体。
4. ４．Ａが第ＩＩＩ表に示したベンニッチの配列表のアミノ酸残基３０１〜３３９ の配列を表す請求項１記載のポリペプチド競合体。
5. ５．Ｂが第ＩＶ表に示したアミノ酸配列を有するマウス・ガンマー２ｂ鎖を表す 請求項４記載のポリペプチド競合体。
6. ６．第Ｖ表（ここでＸは水素原子または連鎖開始アミノ酸配列である）で示した アミノ酸残基３４０〜５４７の配列を有するポリペプチドを含んでいる免疫グロ ブリンＥ低親和性受容体に対するポリペプチド競合体。
7. ７．ＸがＭｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−である請求項６記載のポリペプチド 競合体。
8. ８．特定のポリペプチド配列が少なくともその一つの末端を連鎖を開始しまたは 停止する不活性なポリペプチド配列によって停止される請求項１〜７の何れか１ 項記載のポリペプチド競合体。
9. ９．特定のポリペプチド配列がそのＮ末端およびＣ末端をともにそれぞれ対応す る連鎖を開始しまたは停止する不活性なオリゴペプチド配列にようて停止される 請求項１〜８の何れか１項記載のポリペプチド競合体。
10. １０．第Ｖ表に示したアミノ酸残基３４０〜５４７の配列を有するポリペプチド を含み、Ｘ基を欠いている免疫グロブリンＥの低親和性受容体に対するポリペプ チド競合体。
11. １１．請求項１〜１０の何れか１項記載のポリペプチド競合体の二量体形態。
12. １２．特定のポリペプチド配列の競合性と同一または類似の競合性を有する請求 項１〜１０の何れか１項記載のポリペプチド競合体または請求項１１記載のその 二量体形態の断片。
13. １３．主成分として請求項１〜１０の何れか１項記載のポリペプチド競合体また は１１項記載の二量体形態または請求項１２記載の生物学的に活性なそれらの断 片を医薬用担体または賦形薬と組合わせて含有する医薬製剤。
14. １４．第Ｖ表に示したヌクレオチド配列を有するＤＮＡ。
15. １５．請求項１２記載の少なくとも１断片を宿主／ベクター系で発現した請求項 １４記載のＤＮＡ断片。
16. １６．ＤＮＡが請求項１４または請求項１５記載のヌクレオチド配列を含んでい る形質転換体。
17. １７．請求項１４または請求項１５記載のＤＮＡ断片がその断片を宿主で発現し てポリペプチドを生産するようベクター内に配向されているＤＮＡ断片を含んで いるベクター。
18. １８．受入れ番号ＮＣＴＣ１２１６２のもとに１９８７年１１月１８日、ナショ ナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー、ロンドンへエシェリキア・コ リＮ４８３０によって寄託したプラスミドｐＥ３−４を含んでいる請求項１７記 載のベクター。
19. １９．請求項１８記載のベクターによって形質転換された宿主。
20. ２０．プラスミドｐＥ３−４を含んでいるエシェリキア・コリＮ４８３０（ナシ ョナル・コレクション・タイプ・カルチャー、ロンドンヘ１９８７年１１月１８ 日、受入れ番号ＮＣＴＣ１２１６２のもとに寄託）を含んだ宿主／ベクター。
21. ２１．請求項１９記載の宿主微生物を培養し、培養からポリペプチドを単離する ことからなる請求項６記載のポリペプチドの製造方法。
22. ２２．請求項２０記載の宿主／ベクターを培養し、培養からポリペプチドを単離 して請求項６記載のポリペプチドを入手し、これを処理して連鎖開始基Ｘを除去 することからなる請求項１０記載のポリペプチドの製造方法。
23. ２３．使用する試薬が請求項１〜１０の何れか１項記載のポリペプチド競合体ま たは請求項１１記載の二量体または請求項１２記載のそれらの断片である結合検 定。
24. ２４．検定を実施する手段を含み、その検定に試薬として使用するために請求項 １〜１０の何れか１項記載のポリペプチド競合体または請求項１１記載の二量体 または請求項１２記載の生物学的に活性なその断片を含んでなる診断用キット。