JPH02503146A - ヌクレオチドプローブ用非ヌクレオチド連結試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヌクレオチドプローブ用 非ヌクレオチド連結試薬 ［発明の分野］ この発明は、標識または挿入剤のような単一または多数の部分を、任意の特定選 択位置においてヌクレオチドプローブに好便に連結できる非ヌクレオチド試薬に 関するものである。

［技術の概説コ 臨床研究および診断において、ＲＮＡまたはＤＮＡ中の特定のヌクレオチド配列 （「標的ヌクレオチド配列」または単に「標的配列」と称する）の存在を測定す る既知技術は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイの実施である。このアッセ イでは、標的配列の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を宵するヌクレ オチド多量体プローブ（代表的にはオリゴヌクレオチド）が選択される。代表的 な場合、プローブは標識され、すなわち、存在が容易に検出できるような原子ま たは基が結合している。標識したプローブをハイブリダイゼーション条件下に標 的ヌクレオチド配列を含む疑のある試料にばく露すると、標的はこのような標識 プローブとハイブリッド形成する。試料中の標的配列の存在は、通常ハイブリッ ド形成および非ハイブリッド形成プローブを分離し、ついでプローブハイブリッ ド中の標識の存在を測定するか、または非ハイブリッド形成プローブ中の標識量 を測定することにより、定性的または定量的に測定することができる。

歴史的には放射性標識が用いられた。しかし、取扱い上の難点から、後になって 非放射性標識が開発された。このような標識には、存在の測定が直接になされる ものも間接になされるものも含まれる。

直接標識の例としては、化学発光、燐光、蛍光または分光的測定が可能な標識が 含まれる。間接標識の例としては、ビオチンのような化合物および適当な検出可 能標識とコンジユゲートした蛋白により検出できる抗原が含まれる。

ヌクレオチドプローブに標識を結合する従来法のあるものは、代表的な場合、ヌ クレオチドに１個の！１１［！＊を連結し、ついで１個またはそれ以上の上記ヌ クレオチドをプローブにとり込ませることに基づくものである。例えば、ピリミ ジン環の０５位に結合したビオチン部分を含むｄＬｉＴＰおよびＵＴＰ類似体が 化学的に合成され、酵素的にポリヌクレオチドにとり込まれた［Ｐ、Ｒ，ランガ ー等、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン スＵＳＡ１７８巻６６３３頁（１９８１年）コ。このビオチン標識ヌクレオチド は、酵素法により、生物または合成核酸プローブにとり込ませることができる。

さらに、前述の類似体の５′　−アリルアミン前駆体の使用が、同様に使用して 、一般的方法により標識に連結できる求核性アミン部分のプローブへのとり込み をもたらすものとして提案された。そのほかのデオキシヌクレオチドトリ燐酸類 似体も、酵素的にプローブにとり込まれている。詳述すると、ブロモｄＵＴＰお よびヨードｄＵＴＰがとり込まれ免疫化学的に検出された［ポリトラッド等、ジ ャーナル・オブ・バソロジー、１４８巻６１頁（１９８６年）］。さらに、］４ −チオＵＴＰＨ，エシャフポア等、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、７巻１ ４８５頁（１９７９年）コがＤ　Ｎ　Ａフラグメントの３′末端に結合され、つ いで求核性スルフヒドリル部分が標識された。ディンの国際出願（国際公開番号 Ｗ０８６１０００７４、公開日１９８６年１月３日）は、−見ランダムなピリミ ジン塩基ヌクレオチドを脱ピリミジン化し、生成する輪環を開いて、そこにアミ ン担持部分を結合させる技術を記載している。

標識の化学法も提案されｔ４が、これはヌクレオチド多量体中の若干のヌクレオ チドにランダムに標識を結合させるものである。例えば、Ｎ−アセトキシ−Ｎ− アセチルアミノフルオレンが核酸のグアニン残基に結合され、ついで免疫化学的 方法により検出された［Ｐ。

ディン等、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンスＵＳＡ、８１巻３４６Ｇ頁（１９８４年）コ。

標識を結合できる求核性アミン基を提供する別の方法としては、核酸プローブの シトシン残基の０６位における重亜硫酸触媒アミノ基転移がある［Ｒ，Ｐ、ビシ ジ等、ジャーナル・オブ・クリニカル・バイオロジー、２３巻３１１頁（１９８ ６年）］。上記化学法および酵素法の何れも、単一のヌクレオチドを特異的に標 識することが不可能であるか、またはその方法がヌクレオチド塩基の環外アミン を修飾し、そのためハイブリッド形成が妨害されるとの難点を存する。

ヌクレオチド多量体、代表的にはオリゴヌクレオチドの５′または３′末端に１ 個の標識のみを結合する他の方法も報告されている。

例えば、このような方法はＣ，Ｆ、チュー等、ヌクレイツク・アシツズ・リサー チ１．１１巻６５１３頁（１９８３年）およびＡ、コレラ９８５年）に記載があ る。固相オリゴヌクレオチド合成の最終工程として標識付着により好便な別の末 端標識法が報告されている。例えば、Ｂ、Ａ、コノシー、ヌクレイツク・アシツ ズ・リサーチ、１３巻４４８５頁（１９８５年）、Ｓ、アグラワル等、ヌクレイ ツク・アシツズ・リサーチ、１４巻６２２７頁（１９８６年）およびコノシー、 ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、１５巻３１３１頁（１９８７年）参照。し かし、これらの末端標識法は、１個の標識をヌクレオチド多量体の末端に付着し 得るのみであるとの点で制限されたものである。

標準的自動合成法の実施中に合成オリゴヌクレオチドの選択した位置に１級アミ ン修飾ヌクレオチド残基の挿入に用い得る化合物が提案された。このような化合 物としては、デオキシチミジン、デオキシアデニン、デオキシグアニンおよびデ オキシチジンの類似体が含まれる［Ｇ、Ｂ、　　ドライヤー等、プロシーディン ゲス・オブ・ザ・ナシロナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、８２巻９ ６８頁（１９８５年）、Ｊ、Ｌ、ラス、国際出願公開番号ＷＯ３４１０３２８５ 、公開日１９８４年８月３０日］。理論的には、このような化合物は、配列に沿 った若干数の位置に標識ヌクレオチドを置き、多数標識の使用により検出感度の 増加を可能とし得る筈である。しかし、プローブに対してこのような標識ヌクレ オチドを使用すると、特に多数標識が存在する場合、標的配列との間に形成され たハイブリッドの安定性を減少させることが証明された。このようなハイブリッ ド安定性の減少は、ウリジン、シチジン、またはアデニン塩基に結合した多数の ビオチン部分をもつ生物起源の核酸プローブについて示された（Ｒ，Ｐ、ビシジ 等、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー、２３巻３１１頁（ １９８６年）、Ｇ、ゲベイエフ等、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、１５巻 ４５１３頁（１９８７年）コ。ハイブリッド安定性の減少はまた、修飾ウリジン 、残基に結合した多数のフルオレスセイン標識をもつ合成オリゴヌクレオチドに ついても報告された［Ｊ、ハラランビジス等、ヌクレイツク・アシツズ・リサー チ、１５巻４８５７頁（１９８７年）コ。このような不安定性はまた、シチジン 塩基のＮ−４位に結合したビオチンおよびフルオレスセイン標識をもつ合成オリ ゴヌクレオチドについても証明された。さらに、合成ヌクレオチド内の任意の目 的位置に１個または複数の標識を置くためには、全部すなわち８種の異なる化合 物（４種はデオキシリボ核酸多量体、４種はリボ核酸多量体）をもつことが必要 になる。

その上に、オリゴヌクレオチドへのとり込み後に求核性部分を標識できる燐酸基 連結ヌクレオチド誘導体が報告された［Ｒ，Ｌ、レトシンガーおよびＭ、Ｅ、シ ョット、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテイ（１９８１年 ）１０３巻７３９４頁、桟木、特開昭６１−４４３５３号、６１−５７５９５号 、６１−４４３５２号、何れも１９８６年３月］りしかし、ヌクレオチド誘導体 に基づく上記化合物は、前述したヌクレオチドに基づく誘導体に関する欠点の少 なくとも一部をしめず筈である。さらに、上記連結剤の例は、現在の標準固相合 成法では方法自体の変更なしには使用できない。

［定義コ 本明細書および請求の範囲において、下記のように用語を定義する。

ヌクレオチド・・・燐酸基、５炭糖および窒素含有塩基からなる核酸サブユニッ ト。ＲＮＡでは、５炭糖はリボースである。ＤＮＡでは、２−デオキシリボース である。このＳ酎よまた、これらサブユニットの類似体をも含む。

ヌクレオチド多量体・・・燐酸ジエステル結合で連結されたヌクレオチド鎖また はその類似体。

オリゴヌクレオチド・・・一般的に長さ約ｌθ〜約１００ヌクレオチドのヌクレ オチド多量体であるが、長さ１００ヌクレオチドより大きなこともあり得る。こ れらは通常ヌクレオチドモノマーから合成されると考えられるが、酵素法により 得ることもできる。

デオキシリボオリゴヌクレオチド・・・デオキシリボヌクレオチドモノマーから なるオリゴヌクレオチド。

ポリヌクレオチド・・・一般に約１００ヌクレオチドまたはそれ以上の長さのヌ クレオチド多量体。これらは通常生物起源であるかまたは酵素法により得られる 。

ヌクレオチド多量体プローブ・・・第２のヌクレオチド多量体、通常ポリヌクレ オチド内に含まれる標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する ヌクレオチド多量体。通常、プローブは標的配列中の対応塩基に完全相補的なよ うに選択される。しかし、場合によっては、プローブ中の１個以上のヌクレオチ ドが標的配列中の対応塩基に相補的でないことが適切であり、望ましいこともあ り得る。代表的な場合、プローブは標識されている、非ヌクレオチドモノマ一単 位・・・これはポリマーのハイブリッド形成に有意に関与しないモノマ一単位で ある。このようなモノマ一単位は、例えば、ヌクレオチドの有意の水素結合に関 与してはならず、成分として５ヌクレオチド塩基の１種またはその類似体を有す るモノマ一単位を除外する。

ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー・・・ヌクレオチドおよび非ヌクレオチ ド性のモノマ一単位を含むポリマー。プローブとして使用する場合、代表的なも のは標識されている。

オリゴヌクレオチド／非ヌクレオチド多量体・・・一般に合成物で１００未満の ヌクレオチドを有するが２００ヌクレオチドを上回ってもよく、１種以上の非ヌ クレオチドモノマ一単位を含む多量体。

モノマ一単位・・・試薬がポリマーに提供する、ヌクレオチド試薬またはこの発 明の非ヌクレオチド試薬の単位。

ハイブリッド・・・相補的塩基間のワトソン・クリック塩基対形成により２のヌ クレオチド多量体間に形成された複合体。

［発明の要約］ この発明は、ヌクレオチド試薬の特定のヌクレオチドモノマ一単位と合成的に結 合して、ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドモノマ一単位を含む骨格をもつ明確 な配列のポリマーを生成する非ヌクレオチドモノマ一単位をもった非ヌクレオチ ド試薬を提供するものである。上記非ヌクレオチド試薬はまた、リンカ−アーム が脱保護されたときコンジュゲート化反応に関与し得るリンカ−アーム部分であ るか、またはポリマーの合成開始前に有用な目的化学部分が結合しているサイド アームであり得る、リガンドを有し得る。一般に、リンカ−アームに部分を結合 する技術は蛋白上の基に標識を結合する技術に類似する。しかし、この方法の修 正が必要である。有用な化学手段の例には、活性エステル、活性イミン、アリー ルフルオリドまたはイソチオシアナートとアルキルアミンの反応、およびマレイ ミド、ハロアセチル等とチオールの反応が含まれる［その他の可能な方法につい てはＧ、Ｍ、ミーンズおよびＲ，Ｅ、フイーネイ、「ケミカル・モディフィケー シヨン・オブ・プロテインズ」、ホルデンーデイ・インコーホレイテッド（１９ ７１年）、Ｒ，Ｅ、フイーネイ、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプ タイド・プロティン・リサーチ、２９巻（１９８７年）１４５−１６１頁参照コ 。ポリマーの形成中リンカ−アームの官能基を保護するのに用い得る適当なは保 護基は、蛋白質化学で用いるものに類似する［例えば、「ザ・ペプタイド・アナ リシス・シンセシス・バイオロジー」３巻、Ｅ。

グロスおよびＪ、マインホラファー編、アカデミツク・プレス（１９７１年）コ 。非ヌクレオチド試薬の化学的性質に基づき、これを骨格中の任意の目的位置に 置くことができる。このことは、ヌクレオチドモノマーを含むポリマーに広範囲 の性質を設計することを可能にする。その中には、（１）ポリマー内の任意の目 的位置への特定の化学的部分の結合。このような部分としては、（限定されるも のではないカリ検出可能な標識、挿入剤、キレート剤、薬物、ホルモン、蛋白、 ペプチド、ハプテン、ラジカル発生剤、液分解剤、蛋白分解剤、触媒、レセプタ ー結合物質およびその他の生物学的関心の対象である結合物質、並びに生物学的 障壁（例えば膜）の通るＤＮＡ輸送を修飾する剤、およびヌクレオチド多量体の 溶解度を変改する物質が含まれ得る。このことは、このような標識および挿入剤 を任意の目的ヌクレオチドに隣接して位置させることが可能なことを意味する。

（２）例えばヌクレオチド親和性支持体を構成するために、支持体の化学部分に 対する結合にリンカ−アームを用いて固体支持体上に明確に定義された配列を固 定する能力。（３）ポリマーに多数の非ヌクレオチドモノマ一単位をとり込ませ ることによりポリマーに多数の化学部分をリンカ−アームにより結合する能力。

（４）ポリヌクレオチドに作用する酵素および蛋白により活性が変化している点 で天然ポリヌクレオチドと異なるポリマーを構築する能力。例えば、純ポリヌク レオチドの３°末端上に非ヌクレオチドモノマ一単位を位置させると、へび毒ホ スホジェステラーゼによる分解に抵抗を生ずる。このような非ヌクレオチドモノ マ一単位は他のヌクレアーゼに対する特異的開裂部位を創出し得る。（５）ハイ ブリッド形成可能なヌクレオチドモノマ一単位と非ヌクレオチドモノマ一単位を 点在させることによりハイブリダイゼーションプローブを構築する能力。

例えば、ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドモノマーの混合ブロック合成を行う ことができ、その際ヌクレオチドモノマーの明確な配列を合成し、その後１個以 上の非ヌクレオチドモノマ一単位を伸ばし第２の明確な配列のヌクレオチドモノ マーのブロックを続は得る。

（６）１個以上の塩基対が異なる標的ヌクレオチド多量体を同時に検出できる合 成プローブを構築する能力。これは、種々の標的ヌクレオチド多量体のヌクレオ チド配列で差異が生じる部位において本書に記載の非ヌクレオチド試薬を用いて プローブ中のヌクレオチドを非ヌクレオチドモノマ一単位に置き換えることによ り達成される。

好ましい発明の形態では、標識したハイブリダイゼーションプローブは、ヌクレ オチドおよび非ヌクレオチドモノマーを含む定義された配列から構築される。別 の好ましい発明の形態では、非ヌクレオチドモノマ一単位が２個またはそれ以上 の定義された配列のヌクレオチド多量体を結合するのに用いられ、非ヌクレオチ ドモノマ一単位はハイブリダイゼーシーン反応に使用するため化学的に標識され る。

さらに別の好ましい実施態様では、非ヌクレオチドは、現行のＤＮＡ合成法の１ つを用いて混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーを生成すべく段階的に付 加することが可能なように構築される。

このようなヌクレオチドおよび非ヌクレオチド試薬は、通常、固体担体に共有的 に固定された生成中のオリゴヌクレオチド鎖に対応するモノマ一単位を結合する ように段階的に加えられる。代表的な場合、最初のヌクレオチドは合成開始前に 開裂可能なエステル結合を用いて担体に結合される。オリゴヌクレオチド鎖の段 階的延長は、通常、３°から５゛の方向に実施される。標準的ＤＮＡおよびＲＮ Ａ合成法については、例えば「シンセシス・アンド・アプリケーション・オブ・ ＤＮＡ・アンド・ＲＮＡＪ、Ｓ、Ａ、ナラング編、アカデミツク・プレス（１９ ８７年）、およびＭ、Ｊ、ゲト、「オリゴヌクレオチド・シンセシスＪ、ＩＲＬ プレス、ワシントン、Ｌ！５Ａ（１９８４年）参照。合成完了後、上記エステル 結合の加水分解によりポリマーを担体から解裂し、最初に担体に結合したヌクレ オチドは生成したオリゴマーの３°末端になる。類似の方法として、非ヌクレオ チドモノマ一単位を導入する別法にはＤＮＡ合成の開始前にＤＮＡ合成担体に同 様に結合させる方法がある。好ましい実施態様では、非ヌクレオチドモノマ一単 位は非ヌクレオチドモノマーの遊離アルコール形を用いて形成したエステル結合 によりＤＮＡ合成担体に結合される。

したがって、この発明はヌクレオチドおよび非ヌクレオチドモノマ一単位の混合 物を含むポリマーを製造するための試薬を提供する。

上記非ヌクレオチドモノマーは、さらに１つ以上の保護されたリンカ−アームま たは標識または挿入剤のような目的とする化学部分にコンジュゲートした１つ以 上のリンカ−アームを含む。

このような非ヌクレオチドモノマーは、さらにヌクレオチドおよび非ヌクレオチ ドモノマ一単位のポリマーに段階的に含有させ得るように２つ以上のカップリン グ基を有する。上記カップリング基のうち第１のものは、生長しつつあるモノマ 一単位鎖の末端に効果的に結合し得る性質を有する。上記カップリング基のうち 第２のものは、生長しつつある混合ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドモノマー 鎖を段階的に延長する能力を有する。これは、最初のカップリング基が結合中に は、第２のカップリング基が実質的に結合しないように不活性化され、その後非 ヌクレオチドモノマ一単位を結合し得るように活性化され得ることを必要とする 。「不活性化」は、好ましくは第２のカップリング基への保護基を用い、これを 除去したとき第２のカップリング基を活性化し得るようにする。しかし、このよ うな「不活性化」および「活性化」が、単に反応条件（例えばｐＨ１温度、反応 系の他の成分の濃度変更）の変更によって達成され、この際第２のカップリング 基は適当な化学構造戸し、このような技術による不活性化および活性化に役立つ ようにすることも、この発明の範囲に含まれる。上記カップリング基は、ヌクレ オチドまたは非ヌクレオチドモノマ一単位を隣接して結合させることを可能にす る。好ましい実施態様では、上記カップリング基は標準的ＤＮＡ合成法の１種と 相客性があるカップリングおよび脱保護反応により操作される。

このような方法は、合成が無方向的に行うこと、および全てのカップリング開裂 および脱保護工程が「不適切でない」条件下で行なわれること、すなわちこれら がポリマー骨格並びにその糖、塩基、リンカ−アームおよび標識成分にもモノマ ー試薬にも実質的な悪影響を与えないことを必要とする。当業者は、これらの条 件を充足する官能基、カップリング法、脱保護法および開裂条件を容５に定める ことができる（例えばゲトの前掲文献参照）。

非ヌクレオチドモノマーは、好ましくは末端にカップリング基が連結された骨格 を有する。骨格は！−２０原子鎖の非環式鎖であるのが好ましく、１−２０炭素 原子の非環式炭化水素鎖が好ましい。

この発明の一実施態様においては、試薬は下記化合物（１）または（ＩＩ）の一 方から選択される。

■ 化合物（１）と（Ｉりの何れが選択されるにせよ、記載されている基は下記のも のである。

（ｉ）　　Ｒ＊＝非ヌクレオチド骨格 は第１カツプリング基であり、ここで Ｘｓ”ハロゲンまたは置換アミノ Ｘ４＝ハロゲン、アミノまたは０ Ｒ８＝アルキル、アルコキシ、またはフェノキシＲ５＝アルキル、アルコキシ、 またはアリールオキシまたはＸ４＝０の場合に限りＨであり得る。

（ｉｉｉ）　Ｒ＋−Ｘｓは保護された第２のカップリング基であり、ここでＸ、 ＝０、Ｓ、ＮＨ，またはＨＮ＝Ｎ−Ｒ１＝カップリング基脱保護条件下で開裂し て第２のカップリング基Ｈ−Ｘ、−を再生し得る保護基（ｉｖ）　　ｎは整数 （ｖ）　　Ｒａ　　Ｘｓ−はリガンド。これを好ましくは官能部分力）ら、また は不適切でない条件下で脱保護して官能部分に連結し得るようζ二（この場合も 不適切でない条件下で）なり得る保護されたリンキングアームから選択される。

後者の場合、ＸｓはリンキングアームでＲ４は保護基である。

さらに、好ましくは、上記基のあるものは下記の通りである。

Ｘ、＝ＣＩまたは第２級アミノ（好ましくはジアルキルアミノおよび複素環式Ｎ −アミンから選ばれる）Ｒｓ　＝メトキシ、エトキシ、クロロフェノキシ、また はベータシアノエトキシ ｘ３−０、Ｓ、ＮＨ，またハＨＮ　＝　Ｎ　−テ終結し好ましくはＲ２から延長 して１−２５原子鎖を有するＸ４＝Ｃ１，第２級アミノまたはＯ Ｘ、はさらに好ましくはジイソプロピルアミノ、ジメチルアミノまたはモルホリ ノである。Ｒ１はさらに好ましくはトリフェニルメチル（これはその誘導体、代 表的にはジメトキシトリフェニルメチルを含む）およびｘＩは０である。

Ｒ，は好ましくは一〇−に結合した第２級炭素を有する。これは、合成中に第２ 級アルコールを使用することを可能にし、このことはアルコールから保護された 試薬をより高い収率で生成するという利点を有する。

ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーの製造法も記載する。この方法は、非ヌ クレオチドモノマ一単位とそれに結合した（上述）のリキッドの使用、並びに第 １のモノマ一単位に対する、および第２の別のモノマ一単位の１つまたは固体担 体に対する不利でない条件下における非ヌクレオチドモノマ一単位のカップリン グを含む。上述した別のモノマ一単位の少なくとも１つはヌクレオチドモノマ一 単位である。非ヌクレオチド試薬からの別のモノマ一単位を選ぶ場合、勿論さら にモノマ一単位を他の非ヌクレオチドモノマ一単位にカップルさせ、さらに続け ること等も可能である。代表的な場合、上述したカップリングは、共に非ヌクレ オチドモノマ一単位に結合している第１のカップリング基と保護された第２のカ ップリング基によって行なわれる。すなわち、非ヌクレオチドモノマ一単位をま ず第１のカップリング基により第１のヌクレオチドモノマ一単位に結合し、つい で第２のカップリング基を脱保護して、非ヌクレオチドモノマ一単位を第２のヌ クレオチドまたは別の試薬非ヌクレオチ法で使用し得る好ましい試薬の化学的組 成物は、前述したものである。

上記試薬から得られる生成物およびその製法についても記載する。

複数個のヌクレオチドおよび非ヌクレオチドモノマ一単位、並びに代表的な場合 標識の役をし、プローブの対応モノマ一単位に連結された、少なくとも１つのア クリジニウムエステル標識部分を含むポリマープローブについても記載する。

好ましくは、アクリジニウムエステル部分は化学発光アクリジニウムエステル標 識である。また、複数個のヌクレオチドモノマ一単位をもつポリマーの対応モノ マ一単位に上記のようなアクリジニウムエステル部分の少なくとも１種を連結す ることを含む上記プローブの製造法をも記載する。

本発明の具体例を反応式により説明する。

図中、 第１図は本発明の試薬の製造を説明し、第２図は本発明の別の試薬の製造を説明 し、第３図は本発明のまた別の試薬の製造を説明する。

第４−８図は本発明のさらに他の試薬の製造を解説するものである。

本発明の実施例の詳細な説明 本発明の３種の異なる「リンカ−」試薬の合成を下記の実施例１−３において詳 細に説明する。下記の実施例４は本発明の置換ヌクレオチドの製造方法（特に、 オリゴヌクレチド）を説明するものであり、これはオリゴヌクレチド上の種々の 特定の予め選択された部位に結合する試薬の骨核を有する。実施例５は本発明の 置換ヌクレオチド中の連結基への標識の連結を示すものであり、一方、実施例６ は、本発明の置換ヌクレオチドにより得られる利点、すなわち、ホスホジェステ ラーゼ触媒による加水分解に対し抵抗する利点を示すもの２−（３−アミノプロ ピル）−１，３−ジヒドロキシプロパン・リンカ−試薬 この合成の反応式は第一図に示し、下記に概要を説明する。

（ａ）　　２−にトリルプロピル）−ジエチルマロネート（１）：使用する方法 はアダム、ら、オーガニック・シンセシス第１巻第２５０−２５１頁の方法を用 いた。

試薬：マロン酸ジエチル、３〜ブロモプロピオニトリルおよびナトリウム・エト キシド（２１％エタノール溶液）はアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（ミル ウォーキー、ウイスコンシン）から入手した。無水アルコール（２００プルーフ ）はＵ、Ｓ、インダストリアル・ケミカルズから入手した。

方法：ナトリウム・エトキシド（０，１モル）を無水エタノールで稀釈し、最終 審！１１００ｍｌにする。無水エタノール５０ｍ１中マロン酸ジエチル（０，１ モル）溶液を攪拌しつつ滴下する。反応装置はＣａＣ１ｇ乾燥管で湿気を遮断す る。攪拌は室温にて１時間継続する。

ついで無水エタノール５０＋ａｌ中３−ブロモニトリル溶液を攪拌しつつ滴下し 、混合物を室温にて一夜攪拌する。得られた溶液を濾過し、沈澱した臭化ナトリ ウムを除去し、濃縮し、ジエチルエーテル（５０ｍｌ）で抽出する。ついで溶液 を水（５０ｍｌ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、油状物質に濃縮する 。移動層としてクロロホルムを用い、シリカ板上薄層クロマトグラフィーにかけ 、ヨード蒸気で発色させると３個のスポットが現れる：Ｒｆ　　ｏ、ｓｓ、０． ５１および０．３８であり、これらは各々、マロン酸ジエチル、２−にトリルプ ロピル）−ジエチル・マロネートおよび２，２−ジーにトリルプロピル）マロネ ートであるとして同定した。数日間冷蔵後、粗油から結晶を濾取し分離し、トル エン（１０＋＊１）に溶解し、ヘキサンを添加して再結晶させ、白色固体３．２ ８９（収率：１２％）を得る；薄層クロマトグラフィー（上記と同じ）、Ｒｆ　 　Ｏ，３Ｂ。この化合物の構造は、’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｍ）により、２．２− ジーにトリルプロピル）マロネート（６）と確認された：δ１．３０（ｔ、６１ １）、２．２６（ｔ、４）１）、２．４７（ｔ、４）１）、４．２７（Ｑ、４Ｂ ）。濾過油状物質を真空上蒸留し、目的化合物（１）を得ル、（ｂ、り、９９− １０３℃、ＯＪ＋ｎｍＨｇ）、収率２０　％；　’　ＨＮ　Ｍ　Ｒ（ＣＤＣ１３ ）分析：６１，２４（ｔ、６Ｈ）、２．１９（Ｑ、２Ｈ）、２．４７（ｔ、２１ １）、３，４ａ（ｔ、ＩＨ）、１ｔｓ（ｑ、＋Ｈ）。

（ｂ）　　２−（３−アミノプロピル）−１，３−ジヒドロキシプロパン（２） の合成： 試薬：　（１）記載のものに加えて、水素化リチウムアルミニウム（ジエチルエ ーテル０．１Ｍ溶液）をアルドリッチ社から入手した。

方法：　無水ジエチルエーテル（５０＋ａｌ）中２−（３−ニトリルプロピル） −ジエチルマロネート（１，３，２１９，１５，１ミリモル）を、窒素気流中、 水素化リチウムアルミニウム（ジエチルエーテル１００ｗ１中０．１モル）の攪 拌溶液中に滴下しつつ添加する。得られた混合物を２時間還流し、ついで室温に て一夜攪拌する。次に、水（１００ｍｌ）中水酸化ナトリウム２．５ｍＭ溶液を ゆっくりと添加し、未反応ヒドリドを失活させる。この混合物を２時間攪拌し、 エーテル層をデカントし捨てる。（生成物は水層に残留している）。白色ゼラチ ン状固体を遠心分離により水層から除去し、水洗し、水性上清液と水洗液を合し 、真空下蒸発させ、シロップ状物質を得る。薄層クロマトグラフィー（アナルテ ク逆層板、水移動相、ニンヒドリン発色試薬）により、主要スポットとして同定 された目的化合物（２）を得る；Ｒｒ　　Ｏ，４８、および副スポットは縮合副 生成物であると考えられる。Ｒｆ、０．２９゜目的化合物（２）はカチオン交換 クロマトグラフィー（ダウエックス５０×８．０．５ＭＨＣｌ移動相）により精 製し、最終収率５０％であった。’ＨＮＭＲ分析（Ｄ、Ｏ）：δ１．３６（明ら かなカルチット、２Ｈ）、１．６８（ｍ、３８）、２．９７（ｔ、２Ｂ）、３． ５７（ｄ、４Ｈ）。

（ｃ）　　２−（３−Ｎ　−）リフルオロアセチルアミノプロピル）−１゜３− ジヒドロキシプロパン（３）： 方法は引用して本明細書中に含ませているメソッド・イン・エンチモロジイ第１ １巻第３１７頁中のゴールドフィンガーの方法を採用する。

試薬：（上掲に加えて）Ｓ−エチル−トリフルオロチオアセテートをアルドリッ チ社から入手した。

方法：２−（３−アミノプロピル）−１，３−ジヒドロキシプロパン（２Ｘ３ミ リモル）を水（２５ｍｌ）に溶解する。溶液のｐ）（を６ＮＨＣ１を滴下しつつ 添加して９．５より下にする。下記の反応はフード中で行う：Ｓ−二チルトリフ ルオ口アセテート（２ｍｌ）を激しく攪拌した溶液中に滴下する。６ＮＫＯＨを 滴下しつつ加え、ｐＨ９，５−１０，０に維持する。３０分後、ｐＨを上記と同 様に保ちつつ、Ｓ−エチルトリフルオロアセテートの同量ｍｌを添加する。混合 物をさらに４５分間攪拌する。ついで、ｐＨを６ＮＫＯＨを用いて７に調整し、 混合物を真空下、ロータリー・エバポレーターで濃縮乾固する。残渣をアセトン （２０ｍｌ）とかきまぜ、濾過して酢酸カリウム沈澱物を除去する。濾液を濃縮 し、シロップ状物質とし、再びアセトン（２−ｌ）に溶解し、シリカゲル（ベー カー・ケミカル・カンパニー（フィルスバーブ、二ニージャーシイ、ＵＳＡ）製 ：平均粒直径４０μｍ）４０９含有フラツシユクロマトグラフイーにかける。カ ラムをメチレンクロリド／アセトン（５００ＩＩｌｌ）の５０　：　５０　（ｖ ／ｖ）溶液で溶出し、２５１１ずつ分画する。各両分を、シリカゲル板上に２μ ｍ分づつスポットし、１０％ピペリジン水溶液をスプレーし、１５分間放置し、 ヒート・ガンで乾燥し、ついでニンヒドリン試薬で処理して、含有生成物を分析 する。

ピペリジンスプレー処理を怠ると、ニンヒドリンとの発色反応による第１級アミ ンのトリフルオロアセトンの確認を妨げる。この方法では、生成物は両分１３− １８に確認され、これらの両分を集め、ロータリー・エバポレーターで濃縮し無 色油状物質を得る。ＲｆＯ０４（同じ溶媒系および上記と同様の発色方法を用い たシリカゲル薄層クロマトグラフィー）。

（ｄ）１−０−（ジメトキシトリチル）　−２−（３−Ｎ−）リフルオロアセチ ルアミノプロピル−１，３−ジヒドロキシプロパン（４）の合成： 試薬：（上掲に加えて）、ジメトキシトリチル・クロリドをアルドリッチ社（Ｕ ＳＡ）から入手した。塩化メチレンを還流し、ＣａＨ，を加えて蒸溜し、４オン グストローム（４Ａ）モルキュラー・シーブに充てんする。ピリジンを水酸化カ リウム粒とパラトルエンスホン酸塩を加えて蒸溜し、乾燥窒素ガス中で貯蔵する 。

方法：２−（３−ニトロフルオルアセチルアミノプロピル）−１，３−ジヒドロ キシプロパン（３Ｘ３６２ｍｇ、　　１　、　５８ミリモル）を減圧下乾燥ピリ ジンと数回蒸発乾燥し、ついでさらに完全真空下数時間乾燥する。ついで残渣を 、乾燥窒素気流中、乾燥ピリジン１０ｍ１中に溶解する。乾燥塩化メチレン（１ ，５ｍ１）中ジメトキシトリチルクロリド（４０１ｍｇ、１．１８ミリモル）を 攪拌しつつ添加し、得られた溶液を室温にて１時間攪拌する。溶媒を減圧上除去 し、残渣をクロロホルム（５０ｍｌ）中に溶解する。この溶液を５％炭酸水素ナ トリウム水溶液で３回抽出し、ついで無水硫酸マグネシウムで乾燥する。

得られた溶液を濃縮し、油状物質を得る。クロロホルム２＋ａｌ中に再溶解し、 移動相としてクロロホルム／酢酸エチル／ピリジン（９５：５　：　０　、２　 ｖ／ｖ／ｖ）を用いて上掲と同様にフラッシュ・クロマトグラフィーにより分画 する。各両分は同じ溶媒系を用いてシリカゲル板上薄層クロマトグラフィーによ り分析する。スポットを発煙ＨＣＩにより発色させ、Ｒｆ値０．２７．０．８７ ．０．９３は各々、１−（ジメトキシトリチル生成物（４）、ジメトメキシトリ タノールおよび１．３−ジー（ジメトキシトリチル）副生成物であることを確認 した。後者の物質は、塩化メチレン飽和水溶液中４％ジクロロ酢酸混合液と振盪 し、加水分解して目的物質（４）を得ることができる。

生成物（４）を該当する両分から溶媒を蒸発させて分離し、完全真空下乾燥し泡 状物質（３７０ｍｇ、　４４％）を得る。

（ｅ）１−０−（ジメトキシトリチル）−２−（３−Ｎ−）リフルオロアセチル アミノプロピル）−，３−０−（メチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミ ド）−１，３−ジヒドロキシプロパン（５）の合成：試薬＝（上掲のものに加え て）Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびＮ、Ｎ−ジイソプロピルメチル ホスホルアミディック・クロリドはアルドリッチ社（ＵＳＡ）から入手した。ジ メチルホルムアミドは還流させ、ＣａＨ上を加えて蒸留し、４Ａモルキュラー・ シーブに充填した。

方法：１−０−（ジメトキシトリチル）−２−（３−）リフルオロアセチルアミ ノプロピル）−１，３−ジヒドロキシプロパン（４，３００ｍｇ、０．５６ミリ モル）を乾燥ピリジンと数回蒸発乾燥し、乾燥ジメチルホルムアミド１０ｍ１中 に溶解する。以下の反応は乾燥窒素気流中で行−）：Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエ チルアミン（２４５μｍ、１．３ミリモル）を攪拌しつつ加え、ついでＮ、Ｎ− ジイソプロピルメチルホスホルアミディック・クロリド（１４０μｍ、０．７ミ リモル）を添加する。反応混合物を２時間攪拌する。ついで混合物を減圧下濃縮 し、塩化メチレン（５０ｍｌ）に溶解する。この溶液を５％炭酸水素ナトリウム 水溶液にて３回抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下濃縮し油状物質 を得る。出発物質（４）の相当するホスホルアミド体への転換が、”Ｐ　　ＮＭ Ｒ（ＣＤＣＩｓ、）リメチルホスフエート、高純度）により確認された：６１４ ７．９゜純度は７０％より高いと推定される。

実施例２：２．２−ジー（３−アミノプロピル）１．３−ジヒドロキシプロパン ・リンカ−試薬の合成 この実施例は、複数標識結合のための２個のアミノプロピル・リンカ−を有する 合成オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格への結合のためのモノマーを含 む。理論反応式を第２図に示す。

試薬：特に断わらなければ実施例１で挙げたものと同じである。

（ａ）　２　、２−ジー（３−アミノプロピル）−１，３−ジヒドロキシプロパ ン（７）の合成： 以下の工程は、上掲の実施例１　（ｂ）記載の方法の要約である。

２．２−ジーにトロプロピル）−ジエチルマロネート（６０２，００ｇ、７．５ １ミリモル）（この合成は実施例（ＩＸａ）に記載）を無水ジエチルエーテル（ ８０ｍｌ）中に溶解する。得られた溶液をジエチルエーテル（１００Ｉｌｌ）中 水素化リチウムアルミニウムの攪拌溶液に滴下しつつ添加し、１５分後、混合物 を還流下２時間加熱し、ついで室温にて一夜攪拌する。処理および粗生成物の回 収は１掲実施例１（ｂ）と同様に行う。実施例１　（ｂ）に記載と同様の薄層ク ロマトグラフィーにより、主要スポット（Ｒｆ：約０．２）を得る。

（ｂ）　２　、２−ジー（３−トリフルオロアセチルアミノプロピル）−１。

３−ジヒドロキシプロパン（８）の合成：２．２−ジー（３−アミノプロピル） −１，３−ジヒドロキシプロパン（７）（３，７ミリモル）を水２５ｍ１に溶解 し、ｐｉ（を６ＮＨＣＩにてｍｌを激しく攪拌しながら添加し：ｐＨを６ＮＫＯ Ｈを滴下しつつ添加しながら９．５−１０．０間に保つ。さらにエチルトリフル オロチオアセテ−）１．０ｍｌを、３０分間間隔で２回同様に添加する。混合物 を減圧下濃縮し油状物質を得、ついでアセトン（３０ｍｌ）に溶解する。沈澱物 である酢酸カリウムを濾過して除去する。生成物（８）を、移動層塩化メチレン ／アセトン（５０：５０ｖ／ｖ）を用いて、実施例１　（Ｃ）記載と同様にシリ カゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。精製物質は、同じの溶媒 系を用いてシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより、実施例１　（ｃ）記載と 同様のピペリジンの次にニンヒドリン処理による発色により、単一のスポット（ Ｒｆ０．７）を与える。収率５１０ｍｇ（１，４８ミリモル）。

（ｃ）１−０−（ジメトキシトリチル）−２，２−ジー（トリフルオロアセチル アミノプロピル）−１，３−ジヒドロキシプロパン（９）の合成： ２．２−ジー（３−トリフルオロアセチルアミノプロピル）−１，３−ジヒドロ キシプロパン（８０５１０ｍｇ、　　１　、４８ミリモル）を乾燥ピリジンを、 減圧下蒸発乾燥させ、ついで窒素気流中乾燥ピリジン５ａ＋１に溶解する。乾燥 塩化メチレン（１，５ｍ１）中ジメチルオキシトリチルクロリド（３７６ｍｇ、 １．１１ミリモル）を窒素気流中攪拌しつつ添加し、混合物を１時間攪拌する。

混合物を減圧下濃縮し、クロロホルム（５０ｍｌ）中に溶解する。溶液を飽和炭 酸水素ナトリウム水溶液にて３回、飽和食塩水にて１回抽出する。ついで溶液を 無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、真空下濃縮し油状物質を得る。次に、油状物 質をクロロホルム２ｍｌに溶解し、クロロホルム／酢酸エチル／ピリジン（８０ ：　２０　：　０　、２　（ｖ／ｖ／ｖ）を用いて、上記と同様にシリカゲルフ ラッシュクロマトグラフィーにより分画する。生成物（９）はンリカゲル薄層ク ロマトグラフィーにより同じ溶媒系を用い、発煙ＨＣＩにより発色させ同定する （Ｒｆ：０．３）：減圧下濃縮し、完全真空上乾燥し、黄色の泡状物質を得る（ ５１７ｍｇ、　５２％）。

（ｄ）　１−０−　（ジメトキシトリチル）−２，２−ジー（３−トリフルオロ アセチルアミノプロピル）−３−０−（メチル−Ｎ　、　Ｎ−ジイソプロピルエ チルアミン）−１，３−ジヒドロキシプロパン（ｌＯ）の合成： 方法：１−０−（ジメトキシトリチル）−２，２−ジー（トリフルオロアチルア ミノプロピル）−１，３−ジヒドロキシプロパン（９Ｘ１３６＋ｇ、０．２ミリ モル）を乾燥ピリジン（３ｍｌ）と３回共蒸留し乾燥する。得られた残渣をアル ゴン気流中乾燥塩化メチレン（１，５ｍ１）中に溶解し、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピ ルエチルアミン（１７５μｌ、１゜０ミリモル）を攪拌しつつ添加する。次に、 Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホルアミディック・クロリド（８０μｍ、０ ．４ミリモル）を添加し、反応物を１時間攪拌する。得られた混合物を酢酸エチ ル／トリエチルアミン（９８，２８５０ｍ１）で稀釈し、飽和炭酸水素ナトリウ ム水溶液（２５ＩＩｌｌ）で２回抽出する。有機層を無水Ｍｇ５Ｏ，で乾燥し、 油状物質を得る（２４０ｍｇ）。ホスホルアミド体（１０）への転換ハ、”　’ 　Ｐ　　Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　Ｃ１ｓ、トリメトキシ・ホスフェート、高純度）に よって確認する：δ１４５．５、純度は６０％より高いと推定される。

実施例３：３−アミノ−１，２−プロパンジオール基準リンカ−試薬の合成 合成法は第３図に図示し、下記に記載する。

（ａ）３−（）リフルオロアセチルアミノ）−１，２−プロパンジオール（１１ ）の合成： 試薬＝３−アミノー１．２−プロパンジオールおよびＳ−エチルトリフルオロア セテートをアルドリッチ社（ＵＳＡ）から購入した。

方法：Ｓ−エチルトリフルオロアセテート（５，１３ｍｌ、　４５ミリモル）を ３−アミノ−１，２−プロパンジオール（２，３２＋ａｌ）および酢酸エチル（ ５，Ｏｓ＋１）の混合物に急速に攪拌しつつ添加する。数分後、混合物は均一に なる。１時間後反応溶液を石油エーテル（１００ｍ１）と振盪し、分離し、真空 下濃縮し油状物質を得る。この物質は、移動相として酢酸エチル／塩化メチレン （２，１）を用いてシリカ板上薄層クロマトグラフィーで分析する。薄層板は最 初ニンヒドリンで発色させると起点に未反応出発物の変色を表わす。つぎに板を １０％ピペリジン水溶液でスプレーして発色させ、１５分間ヒートガンで乾燥し 、ニンヒドリン試薬で処理する。後者の場合は、全物質の９５％より多く含むと 推定される主要スポットを明らかにする（Ｒｆｏ、２８）。主要スポットと思わ れる物質（１１）の精製は予備的規模の薄層クロマトグラフィーによって行う。

（ｂ）３−（）リフルオロアセチルアミノ）−１−０−（ジメトキシトリチル） １．２−プロパンジオール（１２）の合成：試薬および方法は１掲実施例１　（ ｄ）に記載した。

３−（トリフルオロアセチルアミノ）−１，２−ジヒドロキシプロパン（ＩＩＸ ｌ、８７ｇ、１０ミリモル）を減圧下乾燥ピリジン（ｌＯｍｌ）と３回共蒸発さ せて乾燥する。ついでこの物質を乾燥ピリジン（ｌＯｍｌ）中に溶解する。つぎ に乾燥ピリジン（１０＋１）中ジメトキシトリチルクロリド＜３．７３ｇ、ｔ　 ｌミリモル）溶液を窒素気流中攪拌しつつ滴下して添加する。約１時間後、メタ ノール（０，２ａ＋１）を添加する。得られた溶液を酢酸エチル（８０ｍｌ）で 稀釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍｌ）で２回、水（２０ｍｌ）で ２回抽出する。

有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下濃縮し、粗油６ｇを得る。組物 質１．１ｇを、塩化メチレン／酢酸エチル／ピリジン（ｌＯ：１：０．０１Ｖ／ Ｖ／Ｖ）を用いて上記と同様のシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより 分画する。各画分を同じ溶媒系でシリカゲル板上薄層クロマトグラフィーにより 分析する。スポットを発煙ＨＣＩで発色させると、Ｒｆ値が０．９４および０． ８７の２個の少量成分とＲｆｏ、５３の主成分を示し、これは各々、１．２−ジ ー（ジメトキシトリチル）副生成物、ジメトキシトリチルールおよび予想生成物 （１２）であると固定された。上記と同じ薄層クロマトグラフィーによるＲｆＯ １５３を有する両分を集め、蒸発させて０．７２ｇの（１２）を得、この構造を ’ＨＮＭＲにより確認した。（１２）の最終収率はフラッシュカラムから収率に 基づくと８０％であった。

（ｃ）３−（）リフルオロアセチルアミノ）−１−０−（ジメトキシトリチル） −２−０−（メチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミド）−１，２−プロ パンジオール（１３）の合成：合成試薬は玉揚実施例１と同様である。

３−（トリフルオロアセチルアミノ）−１−０−（ジメトキシトリチル）−１， ２−プロパンジオール（１２）（１９６Ｂ、０．４ミリモル）をジイソプロピル エチルアミン（３４８μｌ、　２ミリモル）を含有する乾燥塩化メチレン（１， ５ｍ１）中に溶解する。Ｎ　、　Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホルアミディッ ククロリド（２００μｌ、　　１ミリモル）をアルゴン気流中攪拌、滴下しつつ 添加する。１時間後、１％トリエチルアミン含有酢酸エチルを添加しく５０ｍ１ ）、得られた溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて３回抽出する。有機層を 無水液酸マグネシウムで乾燥し、減圧下濃縮し、油状物質を得る。この物質の純 度は”Ｐ　　ＮＭＲ（ＣＤＩＣＮ、）リメトトキシホスホスリックアシッド、高 純度）により９５％より高いと推定される：６．１４７．５゜この物質をトルエ ン／ヘキサン混合溶媒中−７８℃で再結晶を試みたが成功しなかった。従って、 粗試料を直接リンカ−付加に使用する。

実施例３（ａ）：　　−アミノ−１，２−ヘキサンジオール基準リンカ−試薬の 合成 反応式は第４図に示し、下記に記載する。

（ａ）１．２−（イソプロピリジン）−１，２，６−）リヒドロキシヘキサン（ １４）の合成： 試薬：　　１，２．６−ドリヒドロキシヘキサンおよび２．２−ジメトキシプロ パンはアルドリッチ社（Ｕ　Ｓ　Ａ）から購入した。

方法：　　１，２．６−）リヒドロキシヘキサン（１，００ｇ１７．４５ミリモ ル）、乾燥アセトン（１０ｍｌ）および濃硫酸（μｌ）をマグネチック・スター ジーを備えた５０＋ａｌ丸底フラスコ中に添加する。フラスコに窒素を充てんし 、ゴム栓をし、湿気を遮断する。次に、２．２−ジメトキシプロパン（３，００ ｍ１，２４．４ミリモル）を攪拌溶液中に３０分かけて、シリンジからゆっくり と添加する。攪拌を２時間継続する。無水炭酸ナトリウム（１５０ｎｇ）を添加 し、反応を終了させ、ついで、内容物を一夜攪拌する。最後に、溶液を濾過し、 減圧下濃縮し、薄黄色シロップ状物質を得る（１．６ｇ）。この物質を精製せず につぎの工程に用いる。

（ｂ）１．２−（イソプロピリジン）−６−（ｐ−トルエンスルホニル）−１， ２，６−）リヒドロキシヘキサン（１５）の合成試薬：　　ｐ−）ルエンスルホ ニルクロリドはアルドリッチ社（ＵＳＡ）から購入した。

方法：　前の工程で得た粗のイソプロピリジン化物質（１４、約７゜４５ミリモ ル）を乾燥アセトン（１５ｍｌ）中溶解した。次に、ｐ−）ルエンスルホニルク ロリド（２，８８％　１４．９ミリモル）および乾燥ピリジン（５ｍｌ）を添加 し、内容物を湿気を遮断しつつ、室温にて、３時間攪拌する。ついで、溶媒を、 減圧下除去し、残渣を塩化メチレン（２５ｍｌ）中に入れ、無水硫酸マグネシウ ムにて乾燥し、濾過、ついで減圧下濃縮し、固体結晶を得る（１５．２．８ｇ） 。粗生成物を移動相としてクロロホルムを用いて上記と同様にシリカゲルフラッ シュクロマトグラフィーにより精製する。各両分を同じ溶媒系を用いて蛍光シリ カゲル板上薄層クロマトグラフィーにより分析する。

スポットを蛍光ランプにより発光させる。生成物を含有する画分（Ｒ１０，５０ ）を集め、減圧下濃縮し、最終収率９６．９％の油状物質（１５，２，３７ｇ） を得る。

（ｃ）１．２−（イソプロピリジン）−６−アジド−１，２−ジヒドロヘキサン （１６）の合成： 方法：　前の工程のトシル体（１５，２，３７ｇ、７．２２ミリモル）を乾燥ジ メチルホルムアミド（３０ｍｌ）中に溶解する。ナトリウム・アジド（１，６４ ｇ、　、２５．２ミリモル）をマグネチック・スターラー棒を伝って添加し、還 流冷却器およびＣａＣ１を乾燥管を付ける。ついで、混合物を３時間水浴中６０ −６５℃にて攪拌する。

攪拌を室温にて一夜継続する。ついで、沈でん物を遠心分離によって除去し、得 られた溶液を減圧下濃縮し、最終容量的５ｍｌを得る。

濃縮液をクロロホルム（５０＋ｎｌ）および水（１５ｍｌ）中に入れる。さらに 、有機層を水（１５＋ｌ１ｌ）にて洗浄し、無水Ｍｇ５Ｏ，で乾燥し、濾過、減 圧下濃縮し、こはく色油状物質（１６）を得る。ついで、粗生成物をさらに精製 することなく次の工程に用いる。

（ｄ）６−アミノ−１，２−ジヒドロキシヘキサン（１７）の合成：試薬：　ジ エチルエーテル中水素化リチウムアルミニウム（１，０Ｍ）はアルドリッチ社（ ＵＳＡ）から購入した。

方法：　無水ジエチルエーテル（１０ｍｌ）およびジエチルエーテル中水素化リ チウムアルミニウム（１，０Ｍ）をアルゴン気流中、２５０ｍ１丸底フラスコ中 に添加する。無水ジエチルエーテル中前の工程の粗アジド（１６、約７ミリモル ）溶液をアルゴン気流中攪拌しつつ、滴下ロートから添加する。全部添加した後 、アルゴン中攪拌する。

全部添加した後、混合物を還流下、９０分攪拌する。得られたスラリーをジエチ ルエーテル（２５ｍｌ）で希釈し、下記の溶液を、攪拌上記載の順序に添加する ：　水（１ｍｌ）、５Ｎ　　ＮａＯＨ（１ｍｌ）および水（１ｍｌ）。ついで混 合物をガラス・フィルターで濾過する。濾液を室温にて高真空上蒸留して濃縮し 、薄黄色油状物質を得る。次に、水（１０，８ｍ１）および８８％蟻酸（１４， ２ｍ１）を添加する。得られた混合物を室温にて一夜放置し、ついで２時間７０ −７５℃に加熱する。溶液を減圧下濃縮し、シロップ状物質を得、ついでこれを 、水（５０ｍｌ）に溶解し、ＡＧ　　５０Ｗ−Ｘ８樹脂を含むカチオン交換カラ ム（Ｈ型、５０ｍ１吸着床容量、ビオ−ラプス、リッチモンド、カリフォルニア 、ＵＳＡ）にかける。カラムをＩＮ　　ＨＣＩにて溶出する。アミン生成物をシ リカゲルＴＬＣ板上にスポットし、ニンヒドリン試薬をスプレーし発色させて、 上記と同様に加熱する。生成物を含有する両分を集め、減圧下濃縮し、シロップ 状物質を得、さらに、これをメタノールと共蒸留し、薄黄色針状物質を得る（１ ７、塩酸塩として）。

（ｅ）６−Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−アミノ−１，２−ジ ヒドロキシプロパン（１８）：試薬：　９−フルオルメチルスフシミディル・カ ルボネート（Ｆｍ。

ｃ−ＮＨＳ）はバヘム社、（ドルランス、カリフォルニア、ＵＳＡ）から購入し た。

方法：　前の工程で得た収率による量の６−アミノ−１，２−ジヒドロキシヘキ サン塩酸塩（１７）を、水（１０ＩＩｌｌ）中に溶解し、５ＮＮａＯＨにて最終 ｐ）（を８．７に調整する。炭酸水素ナトリウム（５８Ｂ＋ｎｇ、７ミリモル） 、Ｐｍｏｃ−ＮＨＳ（２，７６ｇ、　、７ミリモル）およびアセトン（１０ｍｌ ）を添加する。溶液中にＦｍｏｃ−ＮＨＳを全部添加した後、懸濁液を室温にて 一夜攪拌する。反応混合物を減圧下濃縮し、アセトンを除去する。Ｉ　Ｎ　　、 ＨＣｌ（５０ｍ１）および酢酸エチル（１５０ｍｌ）を添加し、混合物を分岐ロ ートに移す。有機層を分離し、Ｏ，ＩＮ　　ＨＣＩ（５０＋ｎｌ）ついで水（２ Ｘ５０１１１１）で洗浄する。

次に、有機層を無水Ｍｇ５Ｏ，にて乾燥し、濾過、濃縮して油状物質を得る。生 成物を移動相としてクロロホルム／アセトン（５０：５０）を用いて、シリカゲ ルフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。画分を同じ溶媒系を用いて蛍 光シリカゲル板上で薄層クロマトグラフィーにより分析する。スポットを蛍光ラ ンプにより発光させる。生成物を含有する画分（Ｒ，０，２５）を集め、蒸発さ せ、白色固体結晶を得る（１８．１．２０ｇ）。出発物質、１．２．６−ドリヒ ドロキシヘキサンを基づき、最終収率は４５％である。

（ｆ）１−０−（ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−（フルオレニルメトキシカル ボニル）−６−アミノ−１，２−ジヒドロキシヘキサンの合成： 方法：　前の工程の生成物（１８，０，５ｇ、１．４１ミリモル）を、乾燥ピリ ジンと共蒸発させ（３ｘ３ｍｌ）、ついでアルゴン中乾燥ピリジン（８ｍｌ）に 溶解する。塩化メチレン（２ｍｌ）中ジメトキシトリチルクロリド（０，５７３ ６ｇ％　１．６９ミリモル）の溶液を数分間かけて攪拌しつつ、シリンジから添 加する。攪拌を室温にて２時間継続し、その後メタノールを添加して反応を止め る。溶媒を減圧下除去し、残渣をクロロホルム（１０ｈｌ）に溶解する。得られ た溶液を分液ロートに移し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（３ｘ２０＋ｅｌ）つ いで５Ｍ　　ＮａＣ１にて洗浄する。有機層を無水Ｍｇ５Ｏ，で乾燥し、濾過、 減圧下濃縮し、油状物質を得る。生成物を塩化メチレン／酢酸エチル／トリエチ ルアミン（９５：５：０．５）の溶媒系を用いて上記と同様にシリカゲルフラッ シュクロマトグラフィーにより精製する。両分を同じ溶媒を用いてシリカゲル板 上薄層クロマトグラフィーにより分析する：　板を発煙ＨＣＩにより処理してス ポットを発色させる。

生成物を含む画分（１９、Ｒ１０，３５）を集め、減圧下蒸発させ、泡状物質を 得る（９１０Ｄ、理論収率１００％）。

（ｇ）１−０−（ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−（フルオレニルメトキシカル ボニル）−２−０−（メチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミド）−６− アミノ−１，２−ジヒドロキシヘキサン（２０）の合成： 試薬：　原料は玉揚先行実施例記載と同様である。

方法：　　Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−メトキシホスフィニルクロリド（１０２μ ｍ、０．５１３ミリモル）を、アルゴン気流中、乾燥塩化メチレン中１９（２２ ５ｍｇ、０．３４ミリモル）およびＮ　、　Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ ２３６μｍ、１．３６ミリモル）の攪拌溶液に滴下しつつ添加する。９０分後、 反応混合物を、２％トリエチルアミン（５０ｍｌ）を含有する酢酸エチル中に希 釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２ｘ２５ｍｌ）にて洗浄する。有機層を 無水Ｍｇ５Ｏ，にて乾燥し、濾過し、減圧下蒸発乾固する。残渣をとルエン（２ ｍｌ）に溶解し、急速に攪拌しつつ、−２０℃にて石油エーテルに滴下しつつ添 加する。ついで、得られた混合物を一２０℃にて１６時間放置する。ついで、室 温に温め、上滑液をデカントする。ついで沈澱生成物（２０）を減圧下乾燥する ：　収率＝　１６０ｍｇ（５８％収率）。この物質の精製は塩化メチレン／酢酸 エチル／トリエチルアミン（１０：１：０．１）の溶媒系を用いてシリカゲル板 上にて薄層クロマトグラフィーにより行い、紫外線照射によって発光させる（出 発物質のＲｏ、２５と比較して、Ｒ，０，９）。

さらに、玉揚の実施例３（ａ）記載のリンカ−試薬の類似物質についても合成し た。これらの類似物質の構造を第５図（２１−２４）に図示する。これらの類似 物質の製造を下記の実施例に記載する。

実施例３（ｂ） ３−Ｎ−（グリシジル）−アミノ−１，２−プロパンジオール塩基性リンカ−試 薬（２１）の合成 第６図にこの合成の式を概略した。

（ａ）　　３−　Ｎ　−［Ｂ　−（フルオレニルメトキシカルボニルグリシジル コ−アミノ−１，２−プロパネジオール（２５）の合成。

［原料］ ベイケム・インコーホレイテッド（トランス、カリフォルニア、アメリカ合衆国 ）からＮ−（フルオレニルメトキシカルボニル）−グリシン−Ｎ−ヒドロキシス クシンイミド（）’ｍｏｃ−グリシンーＮＨＳ）を購入した。他の試薬は上述で 記載した。

［方法コ ・　３−アミノ−１，２−プロパンジオール（９１ｍｇ、１ミリモル）を、アセ トン（７ｍｌ）中にＦ　５ｏｃ−グリシン−ＮＨＳ（３９４ｍｇ、１ミリモル） を含む溶液に加えた。この溶液に、水（５ｍｌ）中に炭酸水素ナトリウム（８４ ｍｇ％　１ミリモル）を含む溶液を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌し た。シリカゲル板およびメチレンクロライド／メタノール／酢酸（２０：２：０ ．１）溶媒系を使用する薄層クロマトグラフィーは、反応が完結したことを示し た。生成物（２５）はフラスコ中で沈澱物として生じ、それをろ過してから真空 下でＰ！０．上で２日間乾燥させた。収量は３１０ｍｇ（８４％′）であった。

（ｂ）　　１−０−（ジメトキシトリチル）−３−Ｎ−［Ｎ−（フルオレニルメ トキシカルボニル）−グリシジルコ−アミノ−１，２−プロパンジオール（２６ ）の合成。

［原料］ 原料は、上述の前記実施例に記載されている。

［方法〕 化合物２５（１８５＋ｇ、０．５ミリモル）を乾燥ピリジン（３×３ｍｌ）と− 緒に濃縮することで乾燥した。その後、それを乾燥ピリジン（３×３ｍｌ）中に 溶かしてから、メチレンクロリド／ピリジンｌ：１の混合物（４烏ｌ）中にジメ トキシトリチルクロリドを含む溶液を撹拌しながら滴下した。１．５時間撹拌を 継続し、その後メチレンクロリド／メタノール（８：１）溶媒系を使用するシリ カゲル薄層クロマトグラフィーによって反応を観察した。メタノール（０，２Ｈ １）の添加によって反応を終了させ、１０分間撹拌を続けた。ピリジンを真空下 で濃縮した。残渣をメチレンクロリド（１５０ｍｌ）に溶かした後、飽和炭酸水 素ナトリウム溶液（２ｘ　５０＋ａｌ）を用いて洗浄し、水（５０ｍｌ）を用い て洗浄した。無水Ｍｇ５ＯＡ上で乾燥した後、メチレンクロリド溶液を真空下で 乾固するまで濃縮した。上記記載の方法により、０．１％ピリジンを含有するメ チレンクロリド／酢酸エチル（１１：５）溶媒系を使用するシリカゲルフラッシ ュクロマトグラフィーによって残渣を精製した。上述のように、シリカゲル薄層 クロマトグラフィーによって生成物を含有する画分を同定した。これらの両分を 保存し、濃縮乾固して、２５０ｍｇの（２６）を得た。（収率７５％）。

（ｃ）１−０−（ジメトキシトリチル）−２−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルア ミノ−メトキシホスフィンアミド）−３−Ｎ−［Ｎ−（フルオレニルメトキシカ ルボニル）−グリシジルコ−アミノ−１，２−プロパンジオール（２１）の合成 。

［原料］ 原料は、上述の前記実施例に記載されている。

化合物２１（２３５＋ｇ、０．３５ミリモル）を乾燥ピリジン（２×３　ｍｌ） と−緒に濃縮することで乾燥した。その後、それを乾燥ピリジンクロリド（２ｍ ｌ）中に溶かしてから、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２４Ｊｕｌ、１ ．４ミリモル）を加えた。続いて、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ−クロロメト キシホスフィン（１０５ｕｌ、０．５３ミリモル）を、アルゴン雰囲気下で撹拌 しながら滴下した。

メチレンクロリド／酢酸エチル／トリエチルアミン（１０：５：０゜５）溶媒系 を使用するシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより、２０分後に反応が完結し たことが分かった。その後反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２×２５ ｍυを用い酢酸エチル中に希釈した。無水Ｍｇ５Ｏａ上で乾燥した後、酢酸エチ ル層を真空下で濃縮した。残渣を酢酸エチル（３霞１）に再度溶かしてから、− ２５度（Ｃ）でヘキサン（１５０ｍ１）に注いだ。沈澱物をろ過し、真空下で乾 燥して２１０ｍｇの（２１）を得た（収率７２％）。

”　’　Ｐ　　Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　Ｃ１ｍ、トリメチルホスフェートに対応する ｐｐｍで）：１４７．５（ｄ）。’Ｈ−ＮＭＲ分析によっても構造を確認した。

実施例３（ｃ） Ｓ−Ｎ−Ｃ４−アミノブチリル）−アミノ−１，２−プロパンジオールおよび３ −Ｎ−（６−アミノカプロイル）−アミノ−１，２−プロパンジオール塩基性リ ンカ−試薬類（２２，２３）の製造。

この実施例に特有である合成の段階は、第７図に図示し、以下に記述する。

（ａ）４−アミノ酪酸および６−アミノカプロン酸のＮ−フルオレニルメトキシ カルボニル保護形の合成。

［原料コ アルドリッチ・ケミカル・コーポレーション（ミルウォーキー、ミシガン、アメ リカ合衆国）から４−アミノ酪酸および６−アミノカプロン酸を購入した。Ｆｔ ａｏｃ−ＮＨ５は実施例３（ａ）に記載した。

［方法］ エイ・バク（カナディアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー、１９８２年、６ ０巻、９７６頁）の方法に記載されているようにこれらの合成を行った。

（ｂ）３−アミノ−１，２−プロパンジオールを用いたＮ　−Ｆ　ｒｎｏｃ〜４ −アミノ酪酸およびＮ−Ｆｍｏｃ−６−アミノカプロン酸の各々アルドリッチ・ ケミカル・コーポレーション（ミルウォーキー、ミシガン、アメリカ合衆国）か らトリメチルアセチルクロリドを購入した。他の試薬は上述で記載した。

［方法］ 張切に化合物２７および２８の各々（１ミリモル）をピリジン（２Ｘ３ｍｌ）と −緒に濃縮することで乾燥させた。その後乾燥ジメチルホルムアミド（３ｍｌ） および乾燥テトラヒドロフラン（３＋ｎ＋）の混合物中に残渣を溶かした。生じ る溶液を水浴中で冷却してから、Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１ミ リモル）を加え、撹拌しながらトリメチルアセチルクロリド（１ミリモル）を徐 々に加えた。４５分間水浴中で撹拌を続けた。次いで、乾燥ジメチルホルムアミ ド（３ミリモル）中に３−アミノ−１，２−プロパンジオール（１，２ミリモル ）を含む溶液を加えに後、生じる混合物を室温まで昇温してから１時間撹拌した 。メチレンクロリド／メタノール／酢酸（１０：１：０．１）溶媒系を使用する 薄層クロマトグラフィーによって、反応を観察した。この分析に基づいて、反応 が、約９０％の完了になっていると決定した。その後反応混合物を真空下で濃縮 し、酢酸エチル（１００ａ＋１）を用いて希釈し別の容器に移した。飽和炭酸水 素ナトリウム溶液（２ｘ５０ｍｌ）および水（５０ｍｌ）を用いて、有機溶液を 洗浄した。無水Ｍｇ５Ｏ，上で乾燥した後、有機層を乾固するまで濃縮した。一 般に、得られる生成物は、９５％純度以上であると測定され、それ以上の精製な しに次ぎに段階に使用した。しかしながら、精製が必要な場合、上述の前記実施 例に記述したような、メチレンクロリド／メタノール（４０：Ｉ）溶媒系を使用 するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって行われる。（２８）およ び（２９）の純度を’Ｈ−ＮＭＲ分析によって確認した。

（ｃ）（２Ｂ）および（２９）の１−０−ジメトキシトリチル化この合成の原料 および方法は実施例３（ｂ）の（ｂ）に記述したのと同様である。これらの原料 の純度をＨ−ＮＭＲによって確認した。

（ｄ）　　上記（ｃ）部に述べた化合物の対応２　　ｏ　　（Ｎ、Ｎ−ジイソプ ロピルエチル）−ホスホルアミディト類（２２）および（２３）への転化： この合成の原料および方法は実施例３（ｂ）の（ｃ）に記述したのと同様である 。これらの原料の純度をＰ−ＮＭＲによって確認した。

実施例３（ｄ） ３−Ｎ−（６−アミノカプロイル）−アミノ−１，２−プロパンジオール塩基性 リンカ−試薬のさらに延長した類似体の合成。

この合成に特有の段階を第８図に図示し、以下に記載する。

（ａ）１−０−（ジメトキシトリチル）−３−Ｎ−６−アミノカプロイル）−ア ミノ−１，２−ジヒドロキシプロパン（３１）の合成。

Ｃ原料コ 化合物（３０）は、実施例３（ｃ）の（ｃ）に記載したように製造した。

［方法〕 濃水酸化アンモニウムおよびピラジン（１０ｍｌ）を用い、室温で一夜化合物（ ３０Ｘ０　、８９ｇ、１．１ミリモル）をアンモノリシスさせた。シリカゲルＴ ＬＣ板に反応物の適量をスポットし、ニンヒドリン試薬で処理し一級アミンの脱 保護を観察した。その後、反応混合物を真空下で乾固させ、生じる残渣（３０） を、精製なしで次の段階に使用した。

（ｂ）　　化合物（２８）を用いた化合物（３１）のカップリング。

［原料］ 化合物（２８）は、実施例３（ｃ）の（ａ）に記載したように製造した。

［方法コ 上述の実施例３（ｃ）の（ｂ）に記載した方法によって、Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノ カプロン酸（２８，１，１ミリモル）をトリメチルアセチルクロリド（１，１ミ リモル）と反応させた。次いで、この場合も上述の実施例３（Ｃ）の（ｂ）に記 載した方法によって、乾燥ジメチルホルムアミド中に化合物（３０Ｘ１．１ミリ モル）を含む溶液を加えた。前記実施例に記載されたように、クロロホルム／メ タノール（３０：ｌ）溶媒系を使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィ ーによって、生じる付加生成物（３２）を精製した。生成物の収量は２５０ｍｇ （２３％）であった。

（ｃ）　　化合物（３２）の対応２−０−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）− メトキシホスホルアミディト（２４）への転化。

［方法］ 方法は、上述の実施例３（ｂ）の（ｃ）に記載したものと基本的に同様である。

すなわち、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１９８ｕｌ。

１．１４ミリモル）を含有する乾燥塩化メチレン中で、化合物（３２）（２４０ ｍｇ、０．２８５ミリモル）をＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ−クロロメトキシ ホスフィン（７３ｕｌ、０．３７１ミリモル）と反応させた。反゛応物を酢酸エ チル（５０ｕｌ）中の２％トリエチルアミンを用いて希釈し、飽和炭酸水素ナト リウム水溶液（２５ｕｌ）および水（２５ｍｌ）で抽出した。生じる有機層を無 水硫酸ナトリウム上で乾燥して濃縮した。前述実施例に記載のように残渣を数ミ リリットルの酢酸エチルに溶かしてから、ヘキサン類（１５０ｕｌ）で沈澱させ た。（３２）の収量は２００＋ｎｇで、その純度はＨ−および”Ｐ−ＮＭＲスペ クトロスコピーによって確認した。

実施例４ ２−（３−アミノプロピル）−１，３−ジヒドロキシプロパンに基づくリンカ− と合成オリゴヌクレオチドとの自動的結合。

実施例１記載の連結試薬（以後、「Ｌｌ」と称す）と様々な合成オリゴヌクレオ チドとの結合について記載する。

（ａ）ｒＬ　１　ｊ試薬をデオキシオリゴヌクレオチドの５°−末端に結合させ た。標準燐アミド（ホスファ−アミダイト）化学を用いたモデル３８０ＡのＤＮ Ａシンセサイザー（アプライド・バイオシステムズ、インコーホレイテッド）に より、多孔ガラス制御支持体上において、配列「５°−ＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＧ ＧＡＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴ−３°」を有するデオキシオリゴヌクレオチド を合成した。５°−ジメトキシトリチル基を除去し、「Ｌｌ」の乾燥アセトニト リル溶液−（０，１Ｍ）を、標準結合サイクルを用いて２回カップリングした。

各結合サイクルの最後に放出されたジメトキシトリチルの４９８ｎｍでの吸光度 を測定することにより、ｒＬＩＪの第一および第二付加のカップリング・パーセ ントを、完全長デオキシオリゴヌクレオチドの量に対して定量した。これらの値 はそれぞれ２９％および４２％であることが測定された。７Ｍ尿素含有２０％ポ リアクリルアミドゲルを用いたゲル電気泳動により５°−（Ｌｌ）−および５° −（Ｌｌ）−（Ｌｌ）−オリゴヌクレオチドを精製した。対応するバンドを紫外 線シャドウィングにより可視化した結果、対応する付加ヌクレオチドのスペーシ ングの場合の約１．５倍のスペーシングでゆっくりとゲル上を移動することが評 価された。これらのバンドを削り取り、リンカ−修飾デオキシヌクレオチドを標 準的方法により回収および精製した。

（ｂ）ｒＬ　Ｉ　Ｊ試薬をデオキシオリゴヌクレオチドの３°−末端に結合させ た。この合成においては、テフロン酸化可能固体支持体（モレキユラー・バイオ システムズ、インコーホレイテッド、アメリカ合衆国、サンディエゴ、カタログ ＃０ＳＳ−０１）を用いた。デオキシリボヌクレオチドをこの支持体から開裂さ せると、第一結合サイクル中に使用された化合物は３°−末端燐酸基と一緒に３ °−末端に残る。アプライド・バイオシステムズ、インコーホレイテッドのモデ ル３８０Ａ　　ＤＮＡシンセサイザーにおいて標準ホスファ−アミダイト化学に よる３結合サイクルを用いてｒＬＩＪの乾燥アセトニトリル溶液（０，２Ｍ）を この支持体に結合させた。次に、上記（ａ）項で示した配列と同一のデオキシオ リゴヌクレオチド配列を同カップリング化学を用いて付加した。ｒＬＩＪ試薬に よる開始時カップリング・パーセントを前記の要領で測定すると、第一、第二お よび第三カップリングに関してそれぞれ４０％、６３％および６３％であうた。

の場合と同じ配列を有するデオキシオリゴヌクレオチドを標準ホスファ−アミダ イト化学により結合させた。次いで、シンセサイザーから支持体材料を除き、濃 水酸化アンモニウムにより５５℃で１６時間処理した。次に、支持体を３回水洗 し、２０ミリモル燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）中５０ミリモルＮ　ａ　 Ｉ　Ｏａにより室温で２゜５時間処理した。最後に、この支持体を数回水洗し、 ｌＯ％ｎ−プロピルアミン水溶液により５５℃で３時間処理した。生成した溶液 を７Ｍ尿素含有２０％ポリアクリルアミドゲルに適用し、電気泳動させた。対応 する３°−（Ｌ　１）−（Ｌ　１）−（Ｌ　１）デオキシオリゴヌクレオチドを 前記と同様に回収した。

（ｃ）配列ｒ５’−ＡＡＡＴＡＡＣＧＡＡＣＣＣＴＴＧＣＡＧＧＴＣＣＴＴＴＣ ＡＡＣＴＴＴＧＡＴ−３°を有するデオキシオリゴヌクレオチドの３°−末端に ｒＬｌ」を結合させた。

この合成方法は（ｂ）項記載の方法と同じであるが、ただし、バイオサーチ・モ デル８７５０ＤＮＡシンセサイザーを使用した。

（ｄ）配列ｒ５’−ＣＡＧＴＣＡＡＡＣＴＣＴＡＧＣＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＴＡ ＡＡＧＴＣＡＴＴＴ−３°」を有するデオキシオリゴヌクレオチドの３°−末端 にｒＬｌｊを結合させた。

ここでもまた（ｂ）項記載の方法を用いたが、ただし、合成のオートメーション 部分はバイオサーチ・モデル８７５０ＤＮＡシンセサイザーにおいて行なわれた 。

（ｅ）ヌクレオチド塩基間に挿入された２−（３−アミノプロピル−１，３−ジ ヒドロキシプロパンリンカ−（ｒＬ　Ｉ　Ｊ）を含む合成デオキ　　−シオリゴ ヌクレオチド・プローブのハイブリダイゼーションおよび融点（Ｔ＋ａ）。

里粍： ３３−量体デオキシオリゴヌクレオチド・プローブの２つのＬｌ−誘導体を前記 方法と類似した方法により合成した。ｒＬｌ−挿入体」は、ヌクレオチド残基２ １および２２（５°−末端から数えて）間に挿入されたＬｌを有する。ｒＬｌ− 置換体」は、残基２１における置換としてヌクレオチド残基２０および２２間に Ｌｌを有する。両プローブは、クラミジア・トラコマテイス由来のリポソームＲ ＮＡに相補的な配列（「標的ｒＲＮ　Ａ　Ｊ）を有する。ジエン−プローブ、イ ンコーホレイテッドで開発された標準プロトコルによりこれらのプローブにｌ″ ＪＪ標識った。「水酸化燐灰石Ｊ（ＨＡ　Ｐ　）はベージング・ダイイブナステ ィック、カルビオケム・ディビジョン（ラジョラ、カリフォルニア）から入手さ れた。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、燐酸ナトリウム（モノおよびジ塩基 性塩）および塩酸は、フィッシャー・サイエンティフィック・コーポレーション の試薬用製品であった。ベータゲル（液体シンチレーシジン・カクテル）は、ウ エストケム（サンディエゴ、カリフォルニア）から入手された。他の材料も全て 試薬用製品であった。特記しない限り、操作は１．５ｉ１２スクリュー−キャッ プ・ポリプロピレン・エッペンドルフ管において行なわれた。

次の要領でハイブリダイゼーションを行った。４８μｅの１Ｍ燐酸ナトリウム（ ｐＨ６，８）、１０μ１２の１％Ｓ　Ｄ　Ｓ　（ｖ／ｖ）、ｌＯμＱの１！５Ｉ 標識プローブ（約２００００００ＰＭ）、２９．５μｇの水および２．５μρの ｒＲＮＡ溶液（０，５μｐ、「標的」）または２．５μｐの水（「対照」）を混 合し、６０℃で１時間インキュベーションした。次に、ｌＯμｇアリコートを１ ｊＩＱの０．１２Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ６，８）１０．０２％５ＤＳ１０．０ ２％ナトリウムアジド中に希釈し、５秒間渦状に撹はんした。希釈したアリコー トを水浴中でインキュベーションし、室温から８０℃に加熱した。アリコートを 前記温度で除去し、氷上で貯蔵した。次いで、０．１２Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ ６，８）１０．０２％５ＤＳ１０．０２％ナトリウムアジドにより平衡化した水 酸化燐灰石の小カラムに試料を通し、標準方法を用いたシンチレージョンにより 溶離剤を計数した。（カラムに結合したままのカウントはハイブリダイゼーショ ンしたプローブに対応する）。最初に形成されたハイブリッドの５０％が一本鎖 に熱変性する温度としてＴｍ値を計算した。結果ニ プローブ　　　　　　　　　　　Ｔｍ Ｌｌ−＝挿入　　　　　　　　　６９℃Ｌｌ−置換　　　　　　　　　　６６℃ 上記データは、両プローブが予想通り標的ｒＲＮＡとハイブリッドかったことを 示す。

実施例５ ｒＬＩＪ修飾デオキシオリゴヌクレオチドがビオチンおよびフルオレスセインに より標識され得ることを立証した。

（ａ）上記実施例４（ａ）記載の５°−（Ｌｌ）−および５°−（Ｌ　１　）− （Ｌｌ）−修飾デオキシオリゴヌクレオチド（「５°−Ｌ　１−ＧＣＴＣＧＴＴ ＧＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴ−３°」および「５°−Ｌｌ　−Ｌ　 １−ＧＣＴＣＧ’ＴＴＧＣＣＣＣＡＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴ−３°」）をＰ −３２により標識した。

原料： アルファ−３２９−アデノシン３燐酸をニューイングランド・ムコ国）から購入 した。末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）および５Ｘ テイリング緩衝液は、ベゼスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ガイザースバーグ 、破り一ランド、アメリカ合衆国）の製品であった。

２０ピコモルの５’−（Ｌｌ）−（Ｌｌ）修飾オリゴヌクレオチドを、３７℃で １時間２０μＱのＩＸティリング緩衝液中１６．５ピコモルのアルファーＰ−３ ２アデノシン３燐酸（比活性３０００Ｃｉ／ミリモル）および４０単位のＴｄＴ と反応させた。生成したＰ−３２標識オリゴヌクレオチドをネンソーブ−２０（ ＴＭ）カラムにニューイングランド・ニュクリアー、デュポン・コーポレーシヨ ン、ボストン、マサチューセッツ、アメリカ合衆国）において製造会社の示す手 順（これを引用して説明の一部とする）に従い精製した。

（ｂ）Ｐ−３２標識５°−（Ｌ　１　）−（Ｌ　１　）−オリゴヌクレオチドを 、ビオチン−Ｅ−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（「Ｂｉ。

−Ｘ　−Ｎ　ＨＳ　Ｊ、カルビオケムーベーリング・コーポレーション、サンデ ィエゴ、カリフォルニア、アメリカ合衆国）と反応させた。ストレプトアビジン −アガロースをベゼスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ガイザースバーグ、メリ ーランド、アメリカ合衆国）から購入し、Ｄ（＋）ビオチンをカルビオケムーベ ーリング・コーポレーション（サンディエゴ、カリフォルニア、アメリカ合衆国 ）から購入した。

前記の各修飾オリゴヌクレオチドｌピコモルを、１２．５％ジメチルスルホキシ ド含有１２５ミリモルはう酸緩衝液（ｐＨ９）中２．５ミリモルのＢｉｏ−Ｘ− ＮＨＳと１．５時間反応させた。次いで、生成した反応混合物の小アリコートを 、０．２ｍｙ／ｍｆｆＤ（＋）ビオチンの存在（「非特異結合」）または非存在 （「特異結合」）下、５０ミリモル燐酸ナトリウム（ｐＨ７，４）／２２ミリル ＥＤＴＡ１０．５ＮａＣＱ中におけるストレプトアビジン−アガロースとの結合 について試験した。結合材料をシンチレーション・カウントにより定量化した。

オリゴマー　　　　　　ｉ兆挫艮級含　　％特異結合５°−（Ｌｌ）　　　　　 　　　０．３％　　　　７１．８％５°−（Ｌｌ）−（Ｌｌ）　　　０．５％　 　　　９０．３％これらのＬｌ−修飾オリゴマーとビオチンの結合はまた、上記 反応混合物のアリコートを２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルにおいて電 気泳動させることにより確認された。代表的なバンドをオートラジオグラフィー により可視化すると、ビオチニル化形態（非ビオチニル化対照よりもゆっくりと 移動した）へのほぼ定量的な変換が示された。

（Ｃ）実施例４（ｃ％ｄ）記載の３°−Ｌｌ−修飾デオキシオリゴヌクレオチド （「５°−ＡＡＡＴＡＡＣＧＡＡＣＣＣＴＴＧＣＡＧＧＴＣＣＴＴＴＣＡＡＣＴ ＴＴＧＡＴ−Ｌｌ−３°」および「５°−ＣＡＧＴＣＡＡＡＣＴＣＴＡＧＣＣＡ ＴＴＡＣＣＴＧＣＴＡＡＡＧＴＣＡＴＴＴ−Ｌ　ｌ−３°」）をフルオレスセイ ン・イソチオシアナートおよびビオチン−Ｘ−ＮＨＳによりそれぞれ標識した。

まず、マキサムおよびギルバートの方法（プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・エイ、１ ９７７．７４巻、５６０頁、これを引用して説明の一部とする）に従いＴ４−ポ リヌクレオチドキナーゼを用いて［ガンマ−３″Ｐ］アデノシン３燐酸によりオ リゴヌクレオチドをキナーゼ処理した。

第一修飾オリゴヌクレオチドをフルオレスセイン・イソチオシアナート（ＦＩＴ Ｃ，シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズーリ、アメリカ合衆国 ）と反応させた。このオリゴマ−４０ピコモルを、９０％ＤＭＳＯ含有０．１Ｍ はう酸緩衝液（ｐＨ９）中９０ミリモルのＦＩＴＣと１２時間反応させた。次い で、反応混合物を２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルにおいて電気泳動さ せた。

バンドをオートラジオグラフィーにより可視化した。各レーンから最上のバンド を削り取り、ＦＩＴＣ標識オリゴマーをゲルから回収し、精製した。

抗ＦＩＴＣ抗体誘導体化固体支持体に対する結合アッセイを用いて、上記オリゴ ヌクレオチドとフルオレスセインとの結合を確認した。抗ＦＩＴＣ磁気ミクロス フイアをアドバンスト・マグネティックス、インコーホレイテッド（キャンプリ ッジ、マサチューセッツ、アメリカ合衆国、カタログ＃４３１０）から購入した 。精製３″Ｐ標識ＦＩＴＣ修飾オリゴヌクレオチドのアリコートを、２０ミリモ ルの加水分解ＦＩＴＣの存在（「非特異結合」）または非存在（「特異結合」） 下、２０μＱの抗ＦＩＴＣミクロスフイアを含む０　、５　ｗＱ緩衝液（５０ミ リモル燐酸ナトリウム、ｐＨ７，４／２ミリモルＥＤＴＡ１０゜５モルＮａＣ１ ）と混合した。１時間後、ミクロスフイアを磁気分離法により除き、上清をツェ レンコフ放射により計数して結合材料の量を測定した： 非特異結合パーセント二　０．１％ 特特異台パーセント　：８０．２％ 第２修飾オリゴヌクレオチドをビオチン−Ｘ−Ｎ）Ｉｓと反応させた。このオリ ゴマ−４０ピコモルを、２０％ＤＭＳＯ含有０．１モルはう酸緩衝液（ｐＨ９） 中１０ミリモルのビオチン−Ｘ−ＮＨ３により１時間処理した。生成したビオチ ニル化オリゴマーを前述のポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。こ のオリゴヌクレオチドに結合したビオチンの存在を、この実施例で上述したスト レプトアビジン−アガロースにおける結合の分析により確認した。

パーセント非特異結合二　〇、３％ パーセント特異結合　：８７．４％ 実施例６ ホスホジェステラーゼにより触媒された加水分解に対する３°−Ｌｌ−修飾チオ キンオリゴヌクレオチドの抵抗性。

原料： クロタルスーデュリッスス由来のホスホジェステラーゼをベーリンガーーマンハ イム・バイオケミカルズ（インジアナポリス、インジアナ、アメリカ合衆国）か ら購入した。この酵素は、オリゴヌクレオチドの３°−末端からのエキソヌクレ オリティック開裂を触媒した。標準ホスファ−アミダイト化学を用いたアプライ ド・バイオシステムズ・モデル３ｇ０Ａ　　ＤＮＡシンセサイザーにおいて「５ °−ＡＡＡＴＡＡＣＧＡＡＣＣＣＴＴＧＣＡＧＧＴＣＣＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＧ ＡＴ−３’ｊ配列を有する合成デオキシオリゴヌクレオチドを合成した。実施例 ４記載の方法に従い、同じ配列を有するが３゜−Ｌｌリンカ−が結合しているプ ローブを合成した。

両オリゴヌクレオチドを実施例５記載の方法に従い３！Ｐによりキナーゼ処理し た。各標識オリゴヌクレオチド約３５００００　ＣＰＭを、３Ｘ１０−５ま１こ は３Ｘ１０−＠単位のホスホジェステラーゼを含む緩衝液（０，１Ｍトリス−Ｈ Ｃｌ、ｐｌ（８，０／２０ミリモルＭｇＣｌ、）１０μＱ中で反応させた。１． ５μｇアリコートを５分、１０分、１５分および３０分間隔て除いに。３μＱの ０．ＩＮ　　ＮａＯＨを加えることにより反応を鎮静した。次に、ブロムフェニ ル・ブルーおよびキシラノールＸＣＰＦ色素を含む９０％ホルムアルデヒド５μ ｇを各アリコートに加え、得られた試料を２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素 ゲルにおいて電気泳動させた。次いで、ゲルをオートラジオグラフィーにより分 析した。

３°−Ｌｌ修飾オリゴヌクレオチドは、画濃度の試験酵素により３０分後ホスホ ジェステラーゼ触媒された加水分解に対して９５％を越える抵抗性を示すことが 見出された。ゲル上には目に見える完全長の非修飾オリゴヌクレオチドは本質的 には存在しなかったが、通常この酵素は３°−Ｌｌ基を伴わないオリゴマーを開 裂することが示されている。

実施例７ 合成オリゴヌクレオチドへの２．２−ジー（３−アミノプロピル）−１，３−ジ ヒドロキシプロパンに基づく連結試薬の自動的組み込み。

実施例２記載の連結試薬（以後、「Ｌ２」と称す）の組み込みは、合成オリゴヌ クレオチドの塩基間への挿入によるものであり、配列「５−ＣＧＴＴＡＣＴＣＧ ＧＡＴＧＣＣＣＡＡＡＴ（Ｌ２）ＡＴＣＧＣＣＡＣＡＴＴＣＧ−３°」が生成さ れた。使用される方法は、実施例１　（ａ）記載の方法と同様であったが、ただ し、実施例４（ａ）に記載された最終結合サイクルではなく、第１３結合サイク ルにおいて「Ｌ２」の溶液（０、１Ｍ、アセトニトリル中）を反応させた。ジメ トキシトリチルの放出量から推定したところによると、「Ｌ２」との結合効率は 約３０％であった（実施例４（Ｒ）参照）。

実施例８ 合成オリゴヌクレオチドへの３−アミノ−１，２−プロパンジオールに基づく連 結試薬の自動的組み込み。

配列「５°−ＣＣＣＧＣＡＣＧＴＣＣＣＴＡＴＴ（Ｌ３）ＡＡＴＣＡＴＴＡＣＧ ＡＴＧＧ−３’ｊを存する合成オリゴヌクレオチドへのこの連結試薬（以後、「 Ｌ３」と称す）の組み込みは、実施例４（ａ）記載の方法に従い行なわれた。こ の実施例では、「Ｌ３」の溶液（０，３Ｍ。

乾燥アセトニトリル中）を第１５結合サイクルにおいて反応させた。

ジメトキシトリチル放出から評価したところでは（実施例４（ａ）参照）、この 段階の結合効率は約６０％であった。

実施例８（ａ） 合成オリゴヌクレオチドへの連結試薬２０．２１，２２．２３および２４の自動 的組み込み。

連結試薬２０−２４の組み込みは（この合成は実施例３　（ａ）　−３（ｄ）に 記載されている）、実施例４（ａ）項記載の要領で行なわれた。これらの試薬を 組み合わせた対応するリンカ−を、以後各々「Ｌ４」、「Ｌ５」、「Ｌ６」、「 Ｌ７」および「Ｌ８」と称する。すなわち、前述の試薬のうちの１つの使用に対 応する特定の態様では、試薬の０．１２−０．２Ｍ溶液（乾燥アセトニトリル中 ）を、アプライド・バイオシステムズ・モデル３８０Ａ　　ＤＮＡシンセサイザ ー（フォスター・シティ−、カリフォルニア、アメリカ合衆国）の＃６位に仕込 んだ。

オリゴヌクレオチド・ポリマーへの試薬の組み込みは、標準ホスファ−アミダイ ト結合プロトコルに従い行なわれた。配列内の様々な位置にリンカ−Ｌ４−Ｌ８ が各々挿入された、１７〜３５塩基長の一連のオリゴヌクレオチドを製造した。

結合サイクルの最終時点でトリチル放出を測定したところ、これらの試薬に関連 する結合効率は７５％〜９８％の範囲であった。

実施例９ アクリジニウム・エステルによるアミンリンカー−アーム・プローブの標識およ び後続の精製。

アクリジニウムエステルの２５＋Ｍストック溶液（組成については、ウイークス 等、「クリニカル・ケミストリー」、２９巻、１４７４頁、（１９８３）参照） を蒸留ＤＭＳＯ中で調製した。実施例４．７または８（ａ）で生成された所望量 のポリマーを、１．５ｇｆｆ円錐形ポリプロピレン管中で濃縮乾固した。下記に 列挙した成分を順に加えることにより下記カクテルを構築した： ３μＱ　　ＨＩＯ １μｍ２　１Ｍ　　ＨＥＰＥＳ（８，０）４μＮ　　ＤＭＳＯ（蒸留） ２μｆｆ２５ａＭアクリジニウムエステル、ＤＭＳＯ（蒸留）中温合物を渦巻状 にし、小型遠心分離器中で２秒間回転させ（管の底部に内容物を集める）、３７ ℃で２０分間インキエベーシタンした。

その時点で、下記に列挙した成分を順に反応カクテルに加えた：３μｉ２２５騰 Ｍアクリジニウムエステル、ＤＭＳＯ（蒸留）中１．５μＱ　ＨＩＯ ０，５μ（ｌ　　ＩＭ　　ＨＥＰＥＳ（８，０）再びカクテルを渦巻状に回し、 回転させ、さらに２０分間３７℃でインキュベージタンした。０．１ＭのＨＥＰ ＥＳ（８，０）、５０％ＤＭＳＯ中５μＱの０．１２５Ｍリゼンを加えることに より、５倍過剰のリジンを用いて未反応標識をクエンチングし、室温で５分イン キコベーションした。

その時点でアクリジニウムエステル標識オリゴマーを次の方法により精製した。

クエンチングされた反応混合物２０μＣに、３０μａの３Ｍ　　ｎａＯＡｃ（５ ，０）、２４５　ｔｔＱＯ）ＨｔＯおよび５μ１２のグリコーゲンを担体として 加えた（グリコーゲンは前処理してヌクレアーゼ活性を全て除去したもの）。試 料を短く渦巻状に回し、６４０μＱの無水ＥｔＯＨを加えた。この試料を短く渦 巻状に回し、５−１Ｏ分間氷上でインキュベージタンし、次いで小型遠心分離器 中１５００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離した。上溝を注意深く除去し、沈澱物を２ ０７１の０．１Ｍ　　Ｎａ０Ｓｃ（５，０）、０．１％ＳＤＳに再溶解した。試 料をさらにイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により次の要領 で精製した。ＩＢＭ９５３３ＨＬＰＣシステムに搭載したヌクレアーゼン−ＤＥ ＡＥ　　６０−７　　イオン交換ＨＰＬＣカラムに再溶解沈澱物２０μＱを注入 した。この方法において使用される緩衝剤は全て、ＨＰＬＣ用水、アセトニトリ ル（ＣＨｓＣユ　　　Ｎ）および酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、および試薬用 水酢酸（ＨＯＡＣ）およびＬｉＣ１により調製した。さらに、使用前に緩衝剤を 全て０゜４５μ！孔サイズのナイロン−６６フイルターによりろ過した。合計２ ６モノマ一単位（このうち１個のみが非ヌクレオチド・モノマ一単位であった） を宵するヌクレオチド／非ヌクレオチド多量体の実施態様においては、次の溶出 プロトコルを使用した。緩衝液Ａは、２０ミリモルＮａ０Ａｃ、ｐＨ５，５，２ ０％ＣＨｓ　ＣＮであった。緩衝液Ｂは、２０ミリモルＮａＯＡｃ（＋）Ｈ５、 ５）、２０％ＣＨ＠ＣＮおよび１モルＬｉＣ１であった。５５％緩衝液Ａ１４５ ％緩衝液Ｂから３０％緩衝液Ａ１７０％緩衝液Ｂへの直線勾配により流速１　ｍ ９１分で２５分間溶出させた。溶出中２６０ｎｍでの吸光度をモニターした。

０　、５　ｚＱのフラクションを１．Ｆ＋ｙ（２円錐形ポリプロピレン管に集め た。

溶出直後、５μＱのｌＯ％ＳＤＳを容管に加え、次いで容管を渦巻き状に回した （これは、アクリジニウムエステル標識プローブが管壁に付着していないことを 確実にするために行った）。０．５μＱアリコートをフラクション２１−４２か ら除去し、！２Ｘ７８ｉｘ管中２００μＱの水に加えた（持ち越すという問題を 回避するため、分離ピペット・チップを各アリコートに使用した）。次に、ベル トイド・クリニルマットにおいて２００μＱの０　、２５　Ｎ　　ＨＮ　Ｏｓ、 ０．１％Ｈ！０２、次いで１秒遅れで２００）ｔＱのＩＮ　　ＮａＯＨを自動注 入した後、１０秒間化学発光を読み取ることにより、各アリコートの化学発光を 測定した。

フラクション２９−３３に各々５μρのグリコーゲンを加え、各々を渦巻き状に 回し、各渦巻にｔｉｃのＥｔＯＨを加え、５−１０分間氷上でインキュベージタ ンし、小型遠心分離器中１５００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離することにより、そ れらをＥｔＯＨ沈澱させた。

各上清を注意深く除去し、各沈澱物を２０μＱの０．１Ｍ　　Ｎａ０Ａｃ。

ｐＨ５，０，１％ＳＤＳに再溶解し、次いでこれらの分離フラクションをプール した。

全て「発明の要旨」の項で前述した通り、この発明の試薬が各々非ヌクレオチド 骨格、第１および第２結合基並びにリガンドを有するものとして調製され得るこ とが上記実施例により立証された。特に、試薬（５）は、メチル−Ｎ、Ｎ−ジイ ソプロピルホスファ−アミドの第１結合基が結合している非ヌクレオチドプロピ ル骨格、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）により保護されたＩ−ヒトミキシの第２ 結合基、およびトリフルオロアセチルにより保護されているアミノプロピル連結 アーム形態のりガントを有する。試薬（１０）は試薬（５）と概ね同じであるが 、ただし、後者の場合２つの同一リガント（２つの保護連結アーム形感トリフル オロアセチルアミノプロピル）が存在する。また試薬（１３）は試薬（５）と類 似しているが、非ヌクレオチド骨格はプロピルではなくエチルであり、連結アー ムの長さは短く、トリフルオロアセチル保護メチルアミンのみであって、同様に 保護されているアミノプロピルではない。

また上記で立証した通り、この発明の単一試薬を用いれば、望ましくないヌクレ オチドを導入せずに、ヌクレオチド多量体の予め選択された位置（複数も可）に のみ特異的に連結アームを提供することができる。また既に記載した通り、骨格 をヌクレオチドおよび別の骨格に連結することにより、（次にこれはまた別の骨 格に連結され、その結果、鎖を生じる）、この発明の試薬は、一連の隣接リガン ド（例えば、標識または標識が結合し得る連結アーム）をヌクレオチド多量体に 導入させ得るものである。すなわち、多重隣接標識をプローブに連結することに より、前記プローブを用いたハイブリダイゼーション・アッセイの感度が高めら れ得る。

さらに、この発明の非ヌクレオチド骨格の一つまたはそれらを続けて連結した一 連の非ヌクレオチド骨格を追加的に用いることにより、標的ヌクレオチド多量体 の対応する配列に相補的なプローブの２つのヌクレオチド配列間に橋を形成させ ることができ、試料中で単一の異なるヌクレオチドまたは異なる配列により架橋 され得る。

すなわち、標的ヌクレオチド多量体は、実際に、興味の対象である共通ヌクレオ チド配列から成る２つまたはそれ以上のヌクレオチド多量体の群であり得、それ らは興味の対象外の単一の異なるヌクレオチドまたは互いに異なるヌクレオチド 配列により架橋される。単一標的配列が興味の対象である場合でも、任意の２つ のヌクレオチド間に結合された、標識基を伴う非ヌクレオチドモノマ一単位を有 する相補的配列によるプローブの製造は可能である。その場合、プローブは通常 の方式で標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、標識基を有するモノマ 一単位は、前述のハイブリダイゼーションを妨害しない形で配置されやすい（す なわち、それはハイブリッド構造から「ループ・アウト」しやすい）。かかる配 置は、挿入（インターカレーション）効果の利用（アラセライン等により、プロ シーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・ オブ・ザ・ニー・ニス・エイ、８１巻、３２９７−３３０１頁に記載）、例えば 恐らくはプローブ特異性の向上が望ましい状況においては特に有利であり得る。

勿論、この発明が非ヌクレオチドモノマ一単位を用いるという事実は、ヌクレオ チドモノマ一単位を用いる先のプローブと共に、前述のタイプの妨害をかなり低 減化する。

前記「発明の要旨」において述べた通り、化合物（４）、（９）および（１２） は、それらの主たるヒドロキシル基により固相合成支持体に結合され得る（前記 用途に適合し得る技術に関してガイドおよびサラングのテキスト参照、前出）。

これらの誘導体化された支持体が追加のポリマー合成に使用された結果、生成し たヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーの３°−末端に非ヌクレオチドモノマ 一単位が結合される。

上記発明に対して多くの変形が可能であるものとする。例えば、リガンドは、現 実に、この発明の試薬がヌクレオチド多量体のヌクレオチドに連結される前に、 それらに組み込まれる標識または挿入剤（インターカレーター）であり得る。さ らに、前記「要旨」において基が使用され得る。しかしながら、トリフルオロア セチルおよび９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ保護基のいずれか一方 の使用が特に好ましい。それは、既知標準オリゴヌクレオチド合成において環外 ヌクレオチド・アミンの脱保護に使用される条件（一般的には５０℃で１−１２ 時間濃ＮＨ，ＯＨを用いる）と同じアルカリ条件下で開裂されアミンを脱保護す るためである。同様に、ジメトキシトリチル５°ヒドロキシ保護、メチルまたは ベーターシアノエチルホスファイト０保護および結合中のホスファイト脱離基と してＮ。

Ｎ−ジイソプロピルの使用全部により、試薬は現行の標準オリゴヌクレオチド固 相合成技術に充分匹敵し得るものであるため、追加の特別な段階に対する必要性 は最小限に抑えられる。

この発明の態様の他の変形および代替法は、当技術分野の熟練者であれば容易に 想到できるものである。従って、この発明は、詳しく上述したそれらの実施態様 に限定される訳ではない。

補正書の写しく翻訳文）提出書 請求の範囲 （特許法第１８４条の７第１項） 平成１　年５月　２２　鴫■

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーの製造に適した非ヌクレオチド試 薬であって、 （ａ）化学部分および非不適条件下で活性化されることにより化学部分と連結し 得るリンキングアームから選択されるリガンドを有する、非ヌクレオチドモノマ ー単位、 （ｂ）モノマー単位に連結された第１および第２非ヌクレオチド結合基（ただし 、前記第１結合基は非ヌクレオチドモノマー単位を第１追加モノマー単位に連結 させ得、第２結合基は不活化された状態であるため実質的には結合し得ないが、 その後非不適条件下で活性化されることにより、非ヌクレオチドモノマー単位を 第２追加モノマー単位に結合させ得、第１および第２追加モノマー単位の少なく とも一方はヌクレオチドモノマー単位である）を含む試薬。
2. （２）リガンドが、標識、挿入剤、金属キレート剤、薬剤、ホルモン、蛋白質、 ペプチド、ハプテン、ラジカル生成剤、核酸分解剤、蛋白質分解剤、触媒、特異 結合物質、ＤＮＡ輸送修飾剤、およびヌクレオチド多量体の溶解性を変える物質 、並びに前記化学部分のいずれかに連結され得る連結機能基から選択されるもの である、請求項１記載の試薬。
3. （３）ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーの製造に適した非ヌクレオチド試 薬であって、 （ａ）化学部分および非不適条件下で脱保護されることにより化学部分と連結し 得る保護リンキングアームから選択されるリガンドを有する、非ヌクレオチドモ ノマー単位、（ｂ）モノマー単位に連結された、非ヌクレオチドの、第１結合基 および保護第２結合基（ただし、前記第１結合基は非ヌクレオチドモノマー単位 を第１追加モノマー単位に連結させ得、第２結合基は実質的には結合し得ないが 、その後非不適条件下で脱保護されることにより、非ヌクレオチドモノマー単位 を第２追加モノマー単位に結合させ得、第１および第２追加モノマー単位の少な くとも一方はヌクレオチドモノマー単位である） を含む試薬。
4. （４）リガンドが、標識、挿入剤、金属キレート剤、薬剤、ホルモン、蛋白質、 ペプチド、ハプテン、ラジカル生成剤、核酸分解剤、蛋白質分解剤、触媒、特異 結合物質、ＤＮＡ輸送修飾剤およびヌクレオチド多量体の溶解性を変える物質、 並びに前述の化学部分のいずれかに連結され得る連結機能基から選択される、請 求項３記載の試薬。
5. （５）第１および第２結合基が、非ヌクレオチドモノマー単位をモノマー単位の ５′ヒドロキシおよび３′ホスフェートと各々結合させ得るものである、請求項 ４記載の試薬。
6. （６）非ヌクレオチドモノマー単位が非環状骨格を有し、その各末端に第１およ び第２結合基が連結されている、請求項５記載の試薬。
7. （７）非ヌクレオチドモノマー単位が、その各末端に第１および第２結合基が連 結されている骨格を有し、前記骨格が１〜２０個の原子鎖で構成されている、請 求項５記載の試薬。
8. （８）非ヌクレオチドモノマー単位が、その各末端に結合基が連結されている骨 格を有し、その骨格が１〜１０個の炭素原子から成る非環状炭化水素鎖である、 請求項５記載の試薬。
9. （９）非ヌクレオチドモノマー単位が、各末端に結合基が連結されている骨格を 有し、連結アームが前記骨格から延びている１〜２５個の原子鎖である、請求項 ５記載の試薬。
10. （１０）式： ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼［ 式中、 （ａ）Ｒ２は非ヌクレオチドモノマー単位の骨格であり、（ｂ）▲数式、化学式 、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼は、第１結合基で あり、（式中、 Ｘ２は、ハロゲンまたは置換アミノであり、Ｘ４は、ハロゲン、アミノまたはＯ −であり、Ｒ３は、アルキル、アルコキシまたはフェノキシであり、Ｒ５は、ア ルキル、アルコキシまたはアリールオキシ、またはＸ４＝Ｏの場合のみＨであり 得る） （ｃ）Ｒ１−Ｘ１−は保護第２結合基であり、（式中、 Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＨＮ＝Ｎ−であり、Ｒ１は、結合基脱保護条件下で 開製して第２結合基Ｈ−Ｘ１−を回復させ得る保護基であり、 （ｄ）ｎは整数である］ を有する化合物の１つから選ばれる、請求項２記載の試薬。
11. （１１）Ｘ２＝Ｃｌまたは第２アミノ、Ｒ２＝クロロフェノキシ、メトキシ、エ トキシまたはベータ−シアノエトキシ、 Ｘ４＝Ｃｌ、第２アミノまたはＲ３＝Ｈの場合ＯＲ５＝メトキシ、エトキシ、モ ノクロロフェノキシまたはべータ−シアノエトキシ、またはＸ４＝Ｏ−の場合の みＨであり得る、請求項１０記載の試薬。
12. （１２）リガンドが保護リンキングアーム（ただし、Ｘ３はＣ−によりＲ２およ びＮ−によりＲ４に連結されたアルキルアミノであり、Ｒ４はトリフルオロアセ チルおよび９−フルオレニルメトキシカルボニルから選ばれる）である、請求項 １１記載の試薬。
13. （１３）Ｒ２が−Ｏ−に連結された第２炭素を有する、請求項１１記載の試薬。
14. （１４）第２アミノ基がジアルキルアミノおよび複素環Ｎ−アミン類から選ばれ るものである、請求項１０記載の試薬。
15. （１５）Ｒ１がトリフェニルメチルまたはそのアルコキシ誘導体である、請求項 １０、１１またはｌ４記載の試薬。
16. （１６）Ｘ１がＯおよびＲ１がトリフェニルメチルまたはそのアルコキシ誘導体 である、請求項１０、１１または１４記載の試薬。
17. （１７）Ｘ１＝ＯおよびＲ１＝ジメトキシトリフェニルメチルである、請求項１ ０、１１または１４記載の試薬。
18. （１８） （ａ）非ヌクレオチドモノマー単位、および（ｂ）化学部分、および化学部分が 非不適条件下で連結され得るリンキングアームから選択される、非ヌクレオチド モノマー単位に連結されたリガンド を有する試薬から置換ヌクレオチドを製造する方法であって、非不適条件下で非 ヌクレオチドモノマー単位を、ヌクレオチドモノマー単位並びに第２モノマー単 位および固体支持体のうちの一方に結合させることを含む方法。
19. （１９） （ａ）官能部分および官能部分が連結され得る保護リンキングアームから選択さ れるリガンドを有する非ヌクレオチドモノマー単位、および （ｂ）非ヌクレオチドモノマー単位に連結された第１結合基および保護第２結合 基 を有する試薬から置換ヌクレオチドを製造する方法であって、非不適条件下、 （ａ）まず、第１結合基を介して非ヌクレオチドモノマー単位を第１追加モノマ ー単位に結合させ、 （ｂ）次いで第２結合基を脱保護し、 （ｃ）次いで第２結合基を介して非ヌクレオチドモノマー単位を第２追加モノマ ー単位に結合させる ことを含む（ただし、第１および第２モノマー単位の少なくとも一方がヌクレオ チドモノマー単位であり、他方がモノマー単位および固体支持体から選ばれる） 方法。
20. （２０）第１および第２追加モノマー単位の両方がヌクレオチドモノマー単位で ある、請求項１８または１９記載の方法。
21. （２１）第１および第２結合基が、非ヌクレオチドモノマー単位を、ヌクレオチ ドモノマー単位の５′ヒドロキシルおよび３′ホスフェートにそれぞれ結合させ ることができる、請求項１８記載の方法。
22. （２２）非ヌクレオチドモノマー単位が、その各末端に第１および第２結合基が 連結されている非環状骨格を有している、請求項１９記載の方法。
23. （２３）試薬が、式 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼［ 式中、 （ａ）Ｒ２は非ヌクレオチドモノマー単位の骨格であり、（ｂ）▲数式、化学式 、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼は、第１結合基で あり、（式中、 Ｘ２は、ハロゲンまたは置換アミノであり、Ｘ４は、ハロゲン、アミノまたはＯ であり、Ｒ３は、アルキル、アルコキシまたはフェノキシであり、Ｒ５は、アル キル、アルコキシまたはフェノキシ、またはＸ４＝Ｏの場合のみＨであり得る） （ｃ）Ｒ１−Ｘ１−は保護第２結合基であり、（式中、 Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＨＮ＝Ｎ−であり、Ｒ１は、結合基脱保護条件下で 開製して第２結合基Ｈ−Ｘ１−を回復させ得る保護基であり、 （ｄ）ｎは整数である］ を有する化合物の一つから選ばれる、請求項１９記載の方法。
24. （２４）リガンドが、標識、挿入剤、金属キレート剤、並びに標識、挿入剤およ び金属キレート剤のうちの一つと連結され得る連結官能基から選択されるもので ある、請求項２３記載の方法。
25. （２５）Ｘ２＝Ｃｌまたは第２アミノ、Ｒ３＝クロロフェノキシ、メトキシ、エ トキシまたはベータ−シアノエトキシ、 Ｘ４＝Ｃｌ、第２アミノまたはＲ３＝Ｈの場合Ｏ、Ｒ５＝メトキシ、エトキシ、 モノクロロフェノキシまたはべータ−シアノエトキシ、またはＸ４＝Ｏ−の場合 のみＨであり得る、請求項２４記載の方法。
26. （２６）試薬の第２アミノ基が、ジアルキルアミノおよび複素環Ｎ−アミン類か ら選択されるものである、請求項２４記載の方法。
27. （２７）試薬のＲ１がトリフェニルメチルまたはそのアルコキシ誘導体である、 請求項２３または２６記載の方法。
28. （２８）試薬のＲ１がジメトキシトリフェニルメチルである、請求項２３または ２６記載の方法。
29. （２９）試薬のＸ１がＯおよびＲ１がジメトキシトリフェニルメチルである、請 求項２３または２６記載の方法。
30. （３０）さらに、別のモノマー単位を結合ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマ ーに結合させることにより、標的ヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的な ヌクレオチド配列（ただし、この相補的ヌクレオチド配列は、そこに配列した形 で少なくとも１つの非ヌクレオチドモノマー単位を有する）を有するポリマーを 生成させ、次いでヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー配列を標的配列とハイ ブリダイゼーションさせることを含む、請求項２３〜２６のいずれか１項記載の 方法。
31. （３１）存在する全ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーの大部分として単一 配列ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーを含む組成物であって、この単一ヌ クレオチド／非ヌクレオチドポリマーが、（ａ）官能部分および非不適条件下で 官能部分と連結され得るリンキングアームから選択されるリガンドを連結してい る状態で有する非ヌクレオチドモノマー単位、 （ｂ）非ヌクレオチドモノマー単位に結合した第１ヌクレオチドモノマー単位、 および （ｃ）非ヌクレオチドモノマー単位に結合した追加モノマー単位を含むものであ る、組成物。
32. （３２）リガンドが、標識、挿入剤、金属キレート剤並びに標識、挿入剤および 金属キレート剤のうちの一つに連結され得る連結官能基から選択されるものであ る、請求項３１記載の試薬。
33. （３３）追加単位がヌクレオチドモノマー単位である、請求項３１または３２記 載の組成物。
34. （３４）追加モノマー単位が、別の非ヌクレオチドモノマー単位に結合している 非ヌクレオチドモノマー単位である、請求項３１または３２記載の組成物。
35. （３５）ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー含有組成物であって、（８）飽 和連結基を介して骨格に連結されている官能部分、および非不適条件下でリガン ドに連結され得る飽和リンキングアームから選択されるリガンドを連結している 状態で有する非ヌクレオチドモノマー単位、 （ｂ）非ヌクレオチドモノマー単位に結合した第１ヌクレオチドモノマー単位、 および （ｃ）非ヌクレオチドモノマー単位に結合した追加モノマー単位を含む組成物。
36. （３６）リガンドが、標識、挿入剤、金属キレート剤並びに標識および挿入剤の うちの一方に連結され得る飽和連結アームから選択されるものである、請求項３ ５記載の組成物。
37. （３７）リガンド基が飽和連結アームである請求項３６記載の組成物。
38. （３８）非ヌクレオチドモノマー単位が、その両端に結合基が連結されている骨 格を有し、リガンドが、アルキルアミノおよびアルキルチオから選ばれる連結基 を介して骨格に連結された標識を含んでいる、請求項３４記載の組成物。
39. （３９）連結アームがアルキルアミノおよびアルキルチオから選択される、請求 項３７記載の組成物。
40. （４０）非ヌクレオチドモノマー単位が、その両端に結合基が連結されている骨 格を有し、その骨格が１〜２０個の炭素原子を有する非環状炭化水素鎖である、 請求項３５、３７または３９記載の組成物。
41. （４１）標識が化学発光性アクリジニウムエステルである、請求項３５記載の組 成物。
42. （４２）挿入剤がアクリジニウムエステルである、請求項３６記載の組成物。
43. （４３）標識が、ビオチン、フルオレスセイン、ジニテオベンゼン、ローダミン およびテキサス・レッドから選択されるものである、請求項３５記載の組成物。
44. （４４）挿入剤が、プソラレン、アクリジン、アクリジニウム塩、アクリフラビ ンおよびエチジウムから選択されるものである、請求項３５記載の組成物。
45. （４５）複数のヌクレオチドモノマー単位を含み、プローブの対応するモノマー 単位に少なくとも１個のアクリジニウムエステル部分が連結されているポリマー 性プローブ。
46. （４６）アクリジニウムエステル標識が化学発光性アクリジニウムエステル標識 である、請求項４５記載のプローブ。
47. （４７）複数のヌクレオチドモノマー単位を有するポリマーの対応するモノマー 単位に少なくとも１個のアクリジニウムエステル部分を連結させることを含む、 プローブの製造方法。
48. （４８）アクリジニウムエステル標識が化学発光性アクリジニウムエステル標識 である、請求項４７記載の方法。