【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
〔技術分野〕
本発明は、新規なアミラーゼG4とβ−アミラ
ーゼを組み合せ、澱粉から収量よくマルトースを
製造する方法に関するものである。
〔従来技術〕
β−アミラーゼはアミロース及びアミロペクチ
ンの非還元性末端からマルトースを生成するが、
β−アミラーゼはアミロペクチン中の分岐結合
（α−１，６−グルコシド結合）を加水分解する
ことができないため、アミロペクチンやこれを含
む澱粉からのマルトースの収量は50〜60％であ
る。そして、これ以上に収量よくマルトースを得
るためには、α−１，６−グルコシド結合を加水
分解する、プルラナーゼ、イソアミラーゼなどの
α−１，６−グルコシダーゼをβ−アミラーゼと
併用して使用する必要がある。
〔目的〕
本発明は、澱粉からマルトースを70％以上の高
い収量で収得する新規なマルトースの製造方法を
提供するものである。
本発明者は数年来、澱粉からマルトース以上の
各種オリゴ糖の製法を確立することを目的とし
て、広く自然界より、新規なアミラーゼ産菌の検
索を行つたきた結果、アミロース、アミロペクチ
ン、澱粉などのα−グルカンを特異的にマルトテ
トラオース（G4）に加水分解する新規なアミラ
ーゼがバシルス・サーキユランス（Bacillus
circulans）と同定した細菌により生産されるこ
とを認めた。
澱粉からマルテトラオースを生成するアミラー
ゼとして、シユードモナス・スツツツエリ
（Pseudomonas stuzeri）の生産するアミラーゼ
が、アミロースやアミロペクチンの非還元性末端
からマルトテトラオース単位で加水分解すること
が知られている。しかし、この酵素はアミロペク
チンやグリコーゲンからは高分子量のリミツトデ
キストリンを残すと報告されている〔アーカイブ
バイオケミストリー アンド バイオフイジツ
クス（Archive Biochemistry and Biophysics）
145巻 105頁（1971）〕。そして、この酵素による
澱粉からのマルトテトラースの収量は約55％、ア
ミロペクチンからの収量は52％である。〔アメリ
カ合衆国特許USP3、654、082（1972）、アミラー
ゼ シンポジウム、６巻、31頁（1971）〕。
しかるに、バシルス属細菌の生産するアミラー
ゼは、澱粉から約65％〜75％の極めて高い収量で
マルトテトラオースを生成することが認められ
た。マルトテトラオースの収量は、使用する澱粉
の種類、液化度（DE）、酵素量などにより影響さ
れるが、通常、グルコース１〜５％、マルトース
５〜15％、マルトトリオース５〜15％、マルトテ
トラオース65〜75％、マルトペンタオース１〜５
％、その他の糖類１〜15％である。
たとえば、DE4.2のポテトスターチを使用した
ときの糖組成は第１表に示す通りである。表から
明らかなように、この酵素は、澱粉に作用させた
とき高分子のリミツトデキストリンを殆んど残す
ことなく、澱粉からマルトテトラオースを極めて
高い収量で生成する。
[Technical Field] The present invention relates to a method for producing maltose from starch in good yield by combining novel amylase G4 and β-amylase. [Prior art] β-amylase produces maltose from the non-reducing end of amylose and amylopectin, but
Since β-amylase cannot hydrolyze the branched bonds (α-1,6-glucoside bonds) in amylopectin, the yield of maltose from amylopectin or starch containing it is 50 to 60%. In order to obtain maltose in even higher yields, α-1,6-glucosidases such as pullulanase and isoamylase, which hydrolyze α-1,6-glucosidic bonds, are used in combination with β-amylase. There is a need. [Objective] The present invention provides a novel method for producing maltose that can obtain maltose from starch in a high yield of 70% or more. For several years, the present inventor has searched widely for new amylase-producing bacteria from the natural world with the aim of establishing a method for producing various oligosaccharides higher than maltose from starch. - A novel amylase that specifically hydrolyzes glucan to maltotetraose (G4) has been discovered in Bacillus circulans.
circulans). As an amylase that generates maltetraose from starch, it is known that amylase produced by Pseudomonas stuzeri hydrolyzes maltotetraose units from the non-reducing ends of amylose and amylopectin. However, it has been reported that this enzyme leaves high-molecular-weight limitodextrin from amylopectin and glycogen [Archive Biochemistry and Biophysics]
Volume 145, page 105 (1971)]. The yield of maltotetrase from starch by this enzyme is approximately 55%, and the yield from amylopectin is 52%. [United States Patent USP 3, 654, 082 (1972), Amylase Symposium, Volume 6, Page 31 (1971)]. However, amylase produced by bacteria belonging to the genus Bacillus was found to produce maltotetraose from starch at an extremely high yield of approximately 65% to 75%. The yield of maltotetraose is affected by the type of starch used, the degree of liquefaction (DE), the amount of enzyme, etc., but usually glucose is 1-5%, maltose is 5-15%, maltotriose is 5-15%, Maltotetraose 65-75%, Maltopentaose 1-5
%, other sugars 1-15%. For example, when potato starch with a DE of 4.2 is used, the sugar composition is shown in Table 1. As is clear from the table, when this enzyme acts on starch, it produces maltotetraose from starch in extremely high yields, leaving almost no residue of the high molecular weight limitodextrin.
〔効果〕〔effect〕
以上の通り、アミラーゼG4はα−１，６−グ
ルコシド結合を分解することはできないが、アミ
ロースがアミロペクチンをマルトテトラオース単
位で規則的に分解し、且つアミロペクチンの分岐
内鎖を切断する能力をもつているため、リミツト
デキストリンを殆んど残すことなく、アミロペク
チンや澱粉を分解することができる。このため、
本酵素はβ−アミラーゼのようなマルトース生成
酵素を併用して用いるとき、アミロペクチンやこ
れを含む澱粉からも70〜80％の高い収量でマルト
ースを得ることができる。本発明は、この知見に
基づいてなされたものである。
〔構成〕
すなわち、本発明は、澱粉、又はその派生物で
ある液化澱粉に、バシルス属アミラーゼG4とマ
ルトース生成酵素を作用させることを特徴とする
マルトースの製造方法に関するものである。以下
に、本発明の内容を更に具体的に説明する。
本発明において使用するアミラーゼG4は、土
壌中より分離し、バシルス・サーキユランス
（Bacillus circulans）と同定された細菌の生産す
る菌体外酵素であり、下記の酵素的性質を有す
る。
(1) 作用；アミロース、アミロペクチン、グリコ
ーゲンなどのα−グルカンを、マルトテトラオ
ースを主成分をする分解物に分解する。本酵素
はエンド型の分解様式を持つα−アミラーゼの
一種であり、液化澱粉に作用させるとき、約65
〜75％の収量でマルテトラオースが得られる。
(2) 作用温度範囲及び最適温度；１％可溶性澱
粉、0.05Mリン酸緩衝液の下で作用させたと
き、約75℃まで作用し、最適作用温度は約50℃
である〔第１図ａ〕。
(3) 作用PH範囲及び最適PH；約４〜約12の広い範
囲に作用する。最適作用PHは６〜8.5である
（0.05M酢酸またはリン酸緩衝液、１％可溶性
澱粉下で作用、第１図ｂ）。
(4) 熱安定性；0.1Mトリス緩衝液（PH7.0）の下
で加熱した場合、50℃、10分間の加熱で約40％
失活し、55℃、10分間の加熱で約85％失活し
た。〔第１図ｃ〕。
(5) PH安定性；0.1M緩衝液の下で、室温（25℃）
で３時間放置後、残存活性を測定した。その結
果、PH６〜９の範囲で安定であつた。〔第１図
ｄ〕
(6) 安定化；カルシウムイオンが存在するとき、
熱安定性の増加が認められた。〔第１図ｃの破
線〕
(7) 阻害剤；本酵素は、５×10-3MのHgCl2、
CuSO4、ZnSO4、AgNO3により、それぞれ約
100％、約95％、約50％、約30％阻害された。
(8) 精製方法；本酵素は、液体培養物の遠心上澄
液から、硫安分画、DEAE−セフアロース
（Sepharose）カラム、クロマトグラフイーと
バイオゲル（Biogel）A0.5ｍカラム、クロマ
トグラフイー及び同ゲルによる再クルマトグラ
フイーにより電気泳動的に均一まで精製するこ
とができる。
(9) 分子量；バイオゲル（Biogel）A0.5ｍを用
いたゲル濾過法により測定した分子量は約１万
であつた。
(10) 力価測定法；0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に
溶解させた２％可溶性澱粉0.5mlに、適量の酵
素を加え、水で全量１mlとし、40℃で反応させ
る。この条件で、１分間に1μモルのグルコー
スに相当する還元力を生成する酵素量を１単位
とした。
以上の酵素的性質について、本発明以前に知ら
れているシユードモナス スツツツエリのマルト
テトラオース生成アミラーゼと比較すると(1)最適
作用PHは本発明の酵素はPH６〜8.5の広いPH範囲
にあるのに対し、シユードモナス スツツツエリ
の酵素はPH８付近にあること、(2)本発明の酵素を
澱粉に作用させたとき、約65〜75％の収量でマル
テトラオースが得られるに対し、シユードモナス
スツツツエリの酵素の場合は約55％であるこ
と、(3)本発明の酵素の分子量は１万前後にあるの
に対し、シユードモナス スツツツエリの酵素
は、48000と58000にある〔バイオケミストリーア
ンド バイオフイジクス アクタ
（Biochemistry and Biophysics Acta）566巻、
88頁（1979）〕など、本発明の酵素とシユードモ
ナス スツツツエリの酵素とは、澱粉からのマル
トテトラオースの収量、最適作用PH、分子量など
の性質において顕著な違いのあるものであり、新
規な酵素ということがきる。
本発明の酵素を生産するバシルス サーキユラ
ンス（Bacillus circulans）Ｇ−４の菌学的性質
は下記に示す通りであり、微工研条寄第820号と
して工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている。
(1) 形態；桿菌、巾0.5〜１×５〜6μ、運動性な
し、グラム陰性。
(2) 胞子；通常、末端近くに１個、胞子嚢のふく
らみは認められない。
(3) 肉汁；混濁、沈降する。
(4) 肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐色、周辺及
び表面凹凸あり。
(5) グルコース肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐
色。
(6) グルコース硝酸寒天；生育悪い。
(7) ポテト；生育良好、乳白色に生育。
(8) グルコース・アスパラギン寒天；生育あまり
良くない。淡黄〜黄褐色。
(9) チロリン寒天；良く生育する、わずかに褐
色。
(10) ミルク；ゆつくり凝固、ペプトン化。
(11) インドール；生成しない。
(12) カタラーゼ；生成する。
(13) アセチルメルカルビノール；生成しない。
(14) 硫化水素；生成しない。
(15) クエン酸；利用する。
(16) 硝酸塩の還元；陰性。
(17) クエン酸；利用する。
(18) 食塩肉汁；８％食塩含有培地までよく生育
し10％食塩でも少し生育する。
(19) 炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−リボース、マルトース、シユークロ
ス、澱粉などから酸を生成するが、ガスの生成
はしない。Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノース、
Ｌ−ソルボースの利用性は良くない。
(20) 最適生育温度；26℃前後。
(21) 最高生育温度；約60℃。
(22) 死滅温度；100℃、で30分間加熱しても死
滅しない。
以上の菌学的性質について、バージエイス マ
ニユアル オブ デタミネーテイブ バクテリオ
ロジー（Bergey's Mannual of Determinative
Bacteriology）の第７版及び第８版（ザ ウイ
リアムス アンド ウイルキンス カンパニー
（The Willams and Wilkins Company）、（1957
年及び1974年）を参照し、本菌をバシルス サー
キユランス（Bacillus circulans）の一種と同定
し、バシルス サーキユランスＧ−４と命名し
た。
本発明によるアミラーゼG4を生産するための
培養は、窒素源として、肉エキス、ペプトン、酵
母エキス、カゼイン、コース・ステイープ・リカ
ー、大豆粕など、通常、微生物の培養に対しよく
用いられる有機窒素源が使用され、炭素源として
は、澱粉、デキストリン、マルトース、グルコー
ス、シユークロスなどが使用される。そして、こ
れに補足する栄養源として、無機窒素源、リン酸
塩、マグネシウム塩と各種金属塩を含む培地が使
用される。培養はPH５〜９、温度20〜60℃で好気
的に行われる。
アミラーゼG4は、菌体外に生産される酵素で
あるので、培養終了後、濾過または遠心分離によ
り除菌し、上澄液を回収する。必要により濃縮
し、硫安、硫酸ナトリウムによる塩析によるか、
または、アセトン、イソプロパノール、エタノー
ル、メタノールなどの有機溶媒を加えて、酵素を
沈澱物として収得し、乾燥、保存する。
本発明において、アミラーゼG4と併用される
マルトース生成酵素としては、通常、大豆、小
麦、大麦など、植物起源のβ−アミラーゼや、バ
シルス属など細菌の生産するβ−アミラーゼ〔ア
グリカルチヤ・バイオロジカル・ケミストリー
（Agriculture Biological Chemistry）40巻、
1515頁（1976）など〕が使用されるが、この他、
バシルス属、アスペルギルス属、ストレプトマイ
セス属などの微生物の生産するマルトース生成α
−アミラーゼを使用することができる。
アミラーゼG4とマルトース生成酵素と組み合
せて行う澱粉の糖化反応は、次のようにして行
う。
澱粉は、通常、あらかじめ酸または液化型α−
アミラーゼにより液化される。液化度はマルトー
スの収量に影響し、なるべく低DEであることが
望ましい。通常、DE5以下の液化澱粉が使用され
る。反応は、基質濃度、通常５〜40％において通
常PH５〜８、温度は40℃〜60℃で行われる。アミ
ラーゼG4はカルシウムイオンの存在により熱安
定化されるので、糖化に際し、通常５×10-4〜２
×10-2M程度のカルシウム塩が添加される。
アミラーゼG4とβ−アミラーゼなどマルトー
ス生成酵素は、同時に澱粉に作用されるのが望ま
しいが、あらかじめ、マルトース生成酵素で糖化
し、反応途中でアミラーゼG4を添加して反応を
継続するか、あるいは、最初、アミラーゼG4で
反応を開始し、次いでマルトース生成酵素を添加
して反応を行なう。
次に、実施例により、本発明の詳細を説明す
る。
実施例 １
ポリペプトン１％、リン酸２カリ0.3％、硫酸
マグネシウム（７水塩）0.1％、可溶性澱粉１％
からなる培地30mlを200ml容三角フラスコに入れ、
120℃で10分間殺菌したのち、バシルス サーキ
ユランスG4（微工研条寄第820号）を接種し、30
℃で４日間振盪培養した。
培養後、遠心分離して得た上澄液について、生
産されたアミラーゼG4を測定した結果、培地１
ml当り、6.1単位であつた。
該上澄液に、冷アセトンを２倍容量加え、生成
した沈澱物を水に溶解し、アミラーゼG4の酵素
液とした。
バシルス・ズブチルスの液化型α−アミラーゼ
を用い、常法により液化した、DE4.2のポテト液
化澱粉１ｇ（形分として）に、アミラーゼG4を
４単位又は／及び大麦β−アミラーゼ500単位
（ベーリンガー・マンハイム製、活性の測定及び
定義はアグリカルチヤー・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Agric.Biol.Chem.）第40巻、1515頁
（1976）に記載の方法によつた）、CaCl2 ５×
10-3M量を加え、全量10mlとし、PH７付近、50℃
で20時間反応を行つた。反応後、糖化糖中の糖組
成を液体クロマトグラフ法により定量した。結果
は第２表に示す通りである。
As mentioned above, amylase G4 cannot break down α-1,6-glucoside bonds, but it has the ability to regularly break down amylopectin into maltotetraose units and cleave intrabranched chains of amylopectin. Therefore, it is possible to decompose amylopectin and starch without leaving much of the limit dextrin behind. For this reason,
When this enzyme is used in combination with a maltose-producing enzyme such as β-amylase, maltose can be obtained at a high yield of 70 to 80% from amylopectin and starch containing it. The present invention has been made based on this knowledge. [Structure] That is, the present invention relates to a method for producing maltose, which is characterized by allowing Bacillus amylase G4 and a maltose-producing enzyme to act on starch or liquefied starch that is a derivative thereof. The contents of the present invention will be explained in more detail below. Amylase G4 used in the present invention is an extracellular enzyme produced by a bacterium isolated from soil and identified as Bacillus circulans, and has the following enzymatic properties. (1) Action: Decomposes α-glucans such as amylose, amylopectin, and glycogen into decomposition products whose main component is maltotetraose. This enzyme is a type of α-amylase that has an endo-type decomposition mode, and when it acts on liquefied starch, it produces approximately 65%
Maltetraose is obtained with ~75% yield. (2) Action temperature range and optimum temperature: When used under 1% soluble starch and 0.05M phosphate buffer, it works up to about 75℃, and the optimum temperature is about 50℃.
[Figure 1a]. (3) Effective PH range and optimum PH: Acts over a wide range of about 4 to about 12. The optimal working pH is 6-8.5 (works in 0.05M acetic acid or phosphate buffer, 1% soluble starch, Figure 1b). (4) Thermal stability: Approximately 40% when heated under 0.1M Tris buffer (PH7.0) at 50℃ for 10 minutes
About 85% of the activity was lost by heating at 55°C for 10 minutes. [Figure 1c]. (5) PH stability; under 0.1M buffer at room temperature (25℃)
After standing for 3 hours, residual activity was measured. As a result, it was stable in the pH range of 6 to 9. [Figure 1d] (6) Stabilization; when calcium ions are present,
An increase in thermal stability was observed. [Dotted line in Figure 1 c] (7) Inhibitor: This enzyme was treated with 5×10 −3 M HgCl 2 ,
CuSO 4 , ZnSO 4 , AgNO 3 each
100%, about 95%, about 50%, about 30% inhibited. (8) Purification method: This enzyme is purified from the centrifuged supernatant of liquid culture by ammonium sulfate fractionation, DEAE-Sepharose column, chromatography and Biogel A0.5m column, chromatography and It can be electrophoretically purified to homogeneity by rechromatography using gel. (9) Molecular weight: The molecular weight measured by gel filtration using Biogel A0.5m was approximately 10,000. (10) Titer measurement method: Add an appropriate amount of enzyme to 0.5 ml of 2% soluble starch dissolved in 0.1 M phosphate buffer (PH7.0), make the total volume 1 ml with water, and react at 40°C. Under these conditions, the amount of enzyme that produced a reducing power equivalent to 1 μmol of glucose per minute was defined as 1 unit. Regarding the enzymatic properties mentioned above, when compared with the maltotetraose-generating amylase of Pseudomonas stutzeri known before the present invention, (1) the enzyme of the present invention has an optimal action pH in a wide pH range of 6 to 8.5; (2) When the enzyme of the present invention is applied to starch, maltetraose can be obtained with a yield of approximately 65-75%, whereas the enzyme of Pseudomonas stutzeri has a pH of around 8. (3) The molecular weight of the enzyme of the present invention is around 10,000, while the molecular weight of the Pseudomonas stutzeri enzyme is around 48,000 and 58,000 [Biochemistry and Biophysics Acta] 566 volumes,
88 (1979)], the enzyme of the present invention and the enzyme of Pseudomonas stutzeri have significant differences in properties such as the yield of maltotetraose from starch, optimal action pH, and molecular weight, and are a novel enzyme. That can be said. The mycological properties of Bacillus circulans G-4, which produces the enzyme of the present invention, are as shown below, and it has been deposited with the National Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology as FAIKEN Article No. 820. There is. (1) Morphology: Bacillus, width 0.5-1 x 5-6μ, non-motile, Gram negative. (2) Spores: Usually one near the end, no swelling of the sporangia. (3) Meat juice; cloudy and sediment. (4) Juicy agar: Good growth, light yellow to light brown, with unevenness around the edges and surface. (5) Glucose juice agar; good growth, pale yellow to pale brown. (6) Glucose nitrate agar; growth is poor. (7) Potato: Good growth, milky white. (8) Glucose-asparagine agar; growth is not very good. Pale yellow to yellowish brown. (9) Tyrolin agar; grows well, slightly brown. (10) Milk; slow coagulation, peptonization. (11) Indole; not generated. (12) Catalase; produced. (13) Acetylmercarbinol; not produced. (14) Hydrogen sulfide; not generated. (15) Citric acid; use. (16) Nitrate reduction; negative. (17) Citric acid; use. (18) Salt broth: Grows well up to 8% salt in medium and slightly grows in 10% salt. (19) Utilization of carbohydrates: acids are produced from D-glucose, D-fructose, D-mannose, L-arabinose, D-ribose, maltose, sucrose, starch, etc., but no gas is produced. D-xylose, L-rhamnose,
The availability of L-sorbose is not good. (20) Optimal growth temperature: around 26℃. (21) Maximum growth temperature: approximately 60℃. (22) Killing temperature: Will not die even if heated at 100℃ for 30 minutes. The above mycological properties are described in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.
Bacteriology, 7th and 8th editions (The Willams and Wilkins Company), (1957
(1974), this bacterium was identified as a type of Bacillus circulans and named Bacillus circulans G-4. The culture for producing amylase G4 according to the present invention uses organic nitrogen sources commonly used for culturing microorganisms, such as meat extract, peptone, yeast extract, casein, coarse steep liquor, and soybean meal. is used, and starch, dextrin, maltose, glucose, sucrose, etc. are used as carbon sources. As a supplementary nutrient source, a medium containing an inorganic nitrogen source, phosphate, magnesium salt, and various metal salts is used. Cultivation is carried out aerobically at pH 5-9 and temperature 20-60°C. Since amylase G4 is an enzyme produced outside the bacterial cells, after the culture is completed, bacteria are removed by filtration or centrifugation, and the supernatant is collected. Concentrate if necessary and salt out with ammonium sulfate or sodium sulfate, or
Alternatively, an organic solvent such as acetone, isopropanol, ethanol, or methanol is added to obtain the enzyme as a precipitate, which is then dried and stored. In the present invention, the maltose-producing enzyme used in combination with amylase G4 is usually β-amylase derived from plants such as soybean, wheat, and barley, or β-amylase produced by bacteria such as Bacillus [Agriculture Biological Chemistry] (Agriculture Biological Chemistry) Volume 40,
1515 pages (1976)] are used, but in addition,
Maltose-producing α produced by microorganisms such as Bacillus, Aspergillus, and Streptomyces
-Amylase can be used. The starch saccharification reaction, which is carried out in combination with amylase G4 and maltose-producing enzyme, is carried out as follows. Starch is usually pretreated with acid or liquefied α-
It is liquefied by amylase. The degree of liquefaction affects the yield of maltose, and it is desirable that DE be as low as possible. Typically, liquefied starch with a DE5 or lower is used. The reaction is carried out at a substrate concentration of usually 5 to 40%, a pH of 5 to 8, and a temperature of 40 to 60°C. Amylase G4 is thermostabilized by the presence of calcium ions, so during saccharification, it usually contains 5×10 -4 ~2
Calcium salt of approximately ×10 −2 M is added. It is desirable that maltose-generating enzymes such as amylase G4 and β-amylase act on starch at the same time. , the reaction is started with amylase G4, and then a maltose producing enzyme is added to carry out the reaction. Next, the details of the present invention will be explained with reference to Examples. Example 1 1% polypeptone, 0.3% dipotassium phosphate, 0.1% magnesium sulfate (heptahydrate), 1% soluble starch
Put 30ml of the medium consisting of into a 200ml Erlenmeyer flask,
After sterilizing at 120°C for 10 minutes, inoculation with Bacillus circulans G4 (Feikoken Joyori No. 820) was carried out for 30 minutes.
The cells were cultured with shaking at ℃ for 4 days. As a result of measuring the amylase G4 produced in the supernatant obtained by centrifugation after culturing, it was found that medium 1
It was 6.1 units per ml. Two times the volume of cold acetone was added to the supernatant, and the resulting precipitate was dissolved in water to obtain an enzyme solution of amylase G4. Using liquefied α-amylase from Bacillus subtilis, add 4 units of amylase G4 or/and 500 units of barley β-amylase to 1 g (as a form) of DE4.2 potato liquefied starch (Boehringer). (manufactured by Mannheim, activity was measured and defined according to the method described in Agric.Biol.Chem., Vol. 40, p. 1515 (1976)), CaCl 2 5×
Add 10 -3 M amount to make a total volume of 10 ml, pH around 7, 50℃
The reaction was carried out for 20 hours. After the reaction, the sugar composition in the saccharified sugar was determined by liquid chromatography. The results are shown in Table 2.
【表】
実施例 ２
実施例１と同様にして調製した液化度（DE）
の異なる液化ポテト澱粉各１ｇ（固形分として）
に、アミラーゼG4を10単位、大麦製β−アミラ
ーゼ1000単位とCaCl2 ５×10-3M量加え、全量10
mlとして、50℃で３日間反応を行つた。反応後、
糖化液中の糖組成を液体クロマトグラフ法により
定量した。結果は第３表に示す通りである。[Table] Example 2 Degree of liquefaction (DE) prepared in the same manner as Example 1
1g each of different liquefied potato starch (as solid content)
To this, add 10 units of amylase G4, 1000 units of barley β-amylase, and 5×10 -3 M amount of CaCl 2 to make a total amount of 10
ml, and the reaction was carried out at 50°C for 3 days. After the reaction,
The sugar composition in the saccharified solution was determined by liquid chromatography. The results are shown in Table 3.
【表】
実施例 ３
実施例１において、マルトース生成酵素として
大豆β−アミラーゼの代りに、バシルス・セレウ
ス・バリエータス・ミコイデスのβ−アミラーゼ
（北海道糖業(株)より入手することができる）を500
単位／ｇを加え、50℃で２日間反応を行つた。得
られた糖化液の糖組成を分析した結果は第４表に
示す通りであつた。[Table] Example 3 In Example 1, Bacillus cereus varietus mycoides β-amylase (available from Hokkaido Sugar Co., Ltd.) was used instead of soybean β-amylase as the maltose-producing enzyme.
unit/g was added, and the reaction was carried out at 50°C for 2 days. The results of analyzing the sugar composition of the obtained saccharified solution are shown in Table 4.
【表】【table】
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図ａ，ｂ，ｃとｄは、それぞれアミラーゼ
G4の最適PH、最適温度、熱安定性とPH安定性を
示している。
Figure 1 a, b, c and d are amylases, respectively.
It shows the optimum PH, optimum temperature, thermal stability and PH stability of G4.