JPH025397B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製
造法に関し、更に詳しくは酵素を利用してＮ−ア
セチル−DL−メチオニンアミドよりＮ−アセチ
ル−Ｌ−メチオニンを製造する方法に関する。 本発明の目的化合物であるＮ−アセチル−Ｌ−
メチオニンは、輸液成分などの医薬化合物あるい
は食品添加物等として有用な化合物である。 従来、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製造法
としては、(1)Ｎ−アセチル−DL−メチオニンに
光学活性リジンを作用させて塩を形成させた後、
分別結晶法により所望のＬ−体を得る方法（特開
昭48−22418号）、(2)Ｌ−メチオニンを無水酢酸で
アセチル化する方法（特開昭55−42986号）が知
られているが、(1)の製造法では光学純度の高い化
合物を得るためには再結晶をくり返す必要がある
ため収率が悪く、一方、(2)の製造法は反応中にラ
セミ化が起きやすく、そのため反応条件を厳密に
調節しなければならないという難点を有する。ま
た近年、酵素の持つ鏡像体区別加水分解能を利用
し、Ｎ−アセチル−DL−メチオニンのエステル
にセリンプロテアーゼやスルフイドリルプロテア
ーゼを作用させ、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン
を製造する方法の報告がある（特開昭51−142595
号）。しかし、この方法は酵素反応の進行にとも
ないＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンエステルが加
水分解されて生成する目的物Ｎ−アセチル−Ｌ−
メチオニンのため、反応液のPH値が低下する。従
つて酵素反応を維持継続するためには絶えず反応
液のPHを至適範囲に調整しなければならないとい
う難点がある。 かかる状況下、本発明者等は前記技術的、経済
的難点を克服すべく鋭意研究を重ねた結果、全く
意外にも化学合成で得られる安価なＮ−アセチル
−DL−メチオニンアミドにエルウイニア
（Erwinia）属に属する微生物を培養して得られ
る培養液、該培養液から採取した菌体または該菌
体の処理物を作用させた場合には、これらに含ま
れる酵素が触媒する鏡像体区別加水分解反応によ
り、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンアミドの１位
のアミド結合のみが特異的に加水分解されてＮ−
アセチル−Ｌ−メチオニンが生成することを見出
した。 本発明は、エルウイニア属に属し、Ｎ−アセチ
ル−DL−メチオニンアミドからＮ−アセチル−
Ｌ−メチオニンを生成せしめる能力を有する微生
物の培養液、該培養液から採取した菌体または該
菌体の処理物をＮ−アセチル−DL−メチオニン
アミドに作用せしめ、生成したＮ−アセチル−Ｌ
−メチオニンを採取するＮ−アセチル−Ｌ−メチ
オニンの新規製造法である。 以下、本発明方法を詳細に説明する。 本発明において使用する微生物は、エルウイニ
ア属に属し、Ｎ−アセチル−DL−メチオニンア
ミドからＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを生成せ
しめる能力を有する微生物であり、その例として
は例えばエルウイニア・カロトボラ（Erwinia
carotovora）3057（微工研菌寄第6176号）などを
あげることができる。 本発明の鏡像体区別加水分解反応を触媒する酵
素含有培養液は、上記微生物を通常の方法で培養
することにより調製することができる。即ち、栄
養培地の炭素源としては、上記微生物の利用可能
なものならばいずれも使用することができ、例え
ばグルコース、フラクトース、シユクロース、マ
ルトース、デキストリンなどの糖類、グリセロー
ル、ソルビトールなどの糖アルコール、フマール
酸、クエン酸などの有機酸等を好適に使用するこ
とができる。培地中に添加する量は通常0.1〜10
％程度で十分である。また、窒素源としては、例
えば塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、フ
マール酸アンモニウムなどの各種無機酸、有機酸
のアンモニウム塩や肉エキス、酵母エキス、コー
ンステイープリカー、カゼイン加水分解物などの
天然有機窒素源等があげられ、特に天然有機窒素
源は多くの場合炭素源として兼用することもでき
る。さらに、無機塩類としては例えばリン酸カリ
ウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナ
トリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄などが
使用できる。前記微生物の培養条件としては、温
度約20〜40℃、PH５〜８の範囲を採りうるが、よ
り好ましくは約30〜35℃、PH約６〜７において約
16〜72時間好気的な条件下に培養を行うのが好都
合である。 かくして得られる培養液は、そのまま本発明方
法に使用してもよく、また、培養液中の成分が本
発明方法の障害となる場合や菌体量を多く使用し
たい場合には培養液から遠心分離等により一旦菌
体を分離し、その分離した菌体を用いてもよい。
さらに、該菌体の処理物、例えば凍結乾燥菌体、
アセトン乾燥菌体、菌体磨砕物、菌体抽出物や該
菌体もしくはその処理物を公知の方法で固定化し
たもの等も使用できる。 本発明の鏡像体区別加水分解反応は、通常基質
たるＮ−アセチル−DL−メチオニンアミドと上
記培養液、該培養液から採取した菌体またはその
処理物とを水性媒体中で混合することにより実施
するのが好ましい。反応溶液中での基質濃度は約
0.1乃至20％程度の高濃度まで用いることができ、
高濃度基質で反応させる場合反応液中に基質が不
溶のまま残つていても反応の進行につれて溶解し
てゆくので反応の進行には何ら支障とならない。
基質と培養液等との混合方法は回分式方法でも、
カラムを用いる連続方法でもいずれも可能であ
る。反応は、反応液のPHが約５〜９、より好まし
くは約5.5〜7.5で、反応温度が通常約20〜60℃、
より好ましくは約30〜40℃であるときスムースに
進行する。 上記の如くして得られる本発明の目的化合物Ｎ
−アセチル−Ｌ−メチオニンの確認、同定は、例
えば反応液より目的物をイオン交換樹脂処理によ
り取出し、イソプロパノールより再結晶後、得ら
れる結晶を元素分析すると共に、各種展開溶媒に
よる薄層クロマトグラフイーのR値、融点、旋
光度、NMRスペクトル、IRスペクトル等を標準
物質のそれらと比較することにより実施した。ま
た、目的物の定量は、例えば反応液の一部を採
り、一方はそのまま、他方には市販のかびのアシ
ラーゼ（Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンのみに特
異的に作用する）を加えて37℃で反応させ、Ｎ−
アセチル−Ｌ−メチオニンを完全にＬ−メチオニ
ンに転換させ、両試料中のＬ−メチオニンをロイ
コノストツク・メゼンテロイデスＰ−60による微
生物定量法で定量し、アシラーゼ操作で増加した
Ｌ−メチオニンの量よりＮ−アセチル−Ｌ−メチ
オニンの生成量を換算した。 以上詳記した通り、本発明方法によれば、Ｎ−
アセチル−Ｌ−メチオニンアミドの１位のアミド
部の加水分解によりＮ−アセチル−Ｌ−メチオニ
ンが生成すると同時に当モルのアンモニアが副生
するため、本質的に反応溶液中でのPHの変動はな
く、全反応期間を通じて反応液のPHを調整する必
要がないので操作が極めて簡単であり、しかも反
応が酵素反応であるので光学異性体に対する特異
性が極めて高く、得られるＮ−アセチル−Ｌ−メ
チオニンの光学純度が非常に高いなど幾多の利点
がある。ちなみに、上記の新しい酵素反応を触媒
する酵素が、エルウイニア カロトボラの培養
液、培養液より採取した菌体および菌体処理物に
存在することは現在まで全く知られておらず、さ
らに酵素をＮ−アセチル−DL−メチオニンアミ
ドに作用してＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを生
成せしめる酵素反応についても全く報告されてい
ない。また、公知酵素であるアシルアミダーゼ或
はDL−アミノ酸アミドに作用してＬ−アミノ酸
を生成させる酵素、例えばロイシンアミノペプチ
ダーゼ、アミノアシルアミダーゼなどは全くＮ−
アセチル−DL−メチオニンアミドには作用しな
い。従つて、Ｎ−アセチル−DL−メチオニンア
ミドに作用してＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを
生成させる本発明の酵素反応を触媒する酵素は全
く新しい酵素である。 実施例 １ 第二リン酸ナトリウム・12水塩0.875％、第一
リン酸カリウム0.34％、硫酸アンモニウム0.1％、
硫酸マグネシウム・７水塩0.058％、塩化カムシ
ウム・２水塩0.006％、硫酸第一鉄・７水塩0.002
％、硫酸マンガン・６水塩0.0002％、Ｌ−アスパ
ラギン0.2％およびイーストエキス1.0％からなる
培地（PH7.0）の100mlを500ml容坂口フラスコに
仕込み、120℃で10分間滅菌した後、予め栄養寒
天培地上で30℃、20時間培養したエルウイニア・
カロトボラ3057（微工研菌寄第6176号）を一白金
耳接種し、30℃で24時間振とう培養（回転数
140γpm、振幅８cm）して得た培養液を種培養液
とする。 グリセロール２％、塩化アンモニウム0.1％、
第一リン酸カリウム0.1％、硫酸マグネシウム・
７水塩0.05％、コーンステイープリカー１％、ミ
ースト0.5％の組成からなる栄養液体培地（PH
7.0）50mlを500ml容坂口フラスコに仕込み、120
℃で10分間滅菌した後、上記種培養液を１ml接種
し、30℃で２時間振とう培養する。 培養液50mlから遠心分離により集菌し、一度50
mlの生理的食塩水で洗浄後、0.2M酢酸緩衝液
（PH5.5）25ml中にけん濁し、別に同緩衝液で100
mg／mlになるように溶かしたＮ−アセチル−DL
−メチオニンアミド溶液25mlを加え30℃で酵素反
応を行なわせる。 適宜反応液から0.5mlサンプリングし、100℃、
５分間の加熱により反応を停止させた後、水4.5
mlを加えて遠心分離により菌を除去する。上澄の
一部を適当に希釈して、標品のＮ−アセチル−Ｌ
−メチオニンと同時に薄層クロマトグラフイー
（溶媒；クロロホルム：メタノール：酢酸＝85：
15：３）を行い、ヨウ素発色によりＮ−アセチル
−Ｌ−メチオニンの生成を確認する。また上澄の
一部をPH7.5の50ｍＭリン酸緩衝液で50倍に希釈
後、その１mlに市販のアスペルギルス・オリザエ
のアシラーゼを10mg加えて37℃で１時間反応さ
せ、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンをＬ−メチオ
ニンに加水分解する。この溶液を50〜100倍希釈
し、ロイコノストツク・メゼンテロイデスＰ−60
を用いる微生物定量法によりＬ−メチオニンを定
量し、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン量を求め
た。 反応時間に対するＮ−アセチル−Ｌ−メチオニ
ンの生成量は、100mg／mlのＮ−アセチル−DL−
メチオニンアミドより20時間後には50mg／mlのＮ
−アセチル−Ｌ−メチオニンが生成し、その時間
的経過は第１表に示す通りである。

【表】 実施例 ２ 実施例１と同様に種培養したエルウイニア・カ
ロトボラ3057（微工研菌寄第6176号）をグリセロ
ール２％、塩化アンモニウム0.1％、ポリペプト
ン２％、第一リン酸カリウム0.1％、硫酸マグネ
シウム・７水塩0.05％の組成からなる栄養液体培
地（PH7.0）に１％接種し、30℃で28時間振とう
培養した。 培養液200mlから遠心分離で集菌し、一度生理
食塩水で洗浄後、純水にけん濁して100mlとした。
そこへ、Ｎ−アセチル−DL−メチオニンアミド
15ｇを含む水溶液100mlを加え、酢酸にてPHを6.0
に調製した。30℃で24時間反応させた後、遠心分
離で菌体を除いた上澄区分に含まれるＮ−アセチ
ル−Ｌ−メチオニン量は実施例１と同様の方法で
定量すると7.2ｇ（転換率98％）であつた。 この上澄を塩酸でPH２とした後、弱塩基性イオ
ン交換樹脂WA−10（OH^-型、三菱化成製の商品
名）カラムに通し、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニ
ンを吸着させる。カラムを充分水洗後、３％アン
モニア水でＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを溶出
させる。減圧下に過剰のアンモニアを除いた溶出
液を強酸性イオン交換樹脂IR−120（H⁺型、ロー
ムアンドハース社製の商品名）カラムに通し、通
過液を濃縮してＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの
粗結晶を得る。これを少量のイソプロパノールよ
り再結晶することによりＮ−アセチル−Ｌ−メチ
オニン5.8ｇを得る。本品の融点は104℃で、比旋
光度は〔α〕_D−20.2゜（Ｃ＝４、水）である。 実施例 ３ 実施例２と同様に調製したエルウイニア・カロ
トボラ3057（微工研菌寄第6176号）の生菌体２ｇ
に生理食塩水２mlを加えてけんだくし、そこへ予
め調製した５％カラギーナンゾル8.5mlを加える。
氷冷してゲル化させ、２％塩化カリウム水溶液に
30分間浸漬後、３×３×３mmの立方体に成型す
る。この成型ゲル６mlを30℃の水が循環している
外とう管付カラムに充填し、50mg／mlのＮ−アセ
チル−DL−メチオニンアミド水溶液（２％酢酸
アンモニウム共存、PH6.0に酢酸で調製）をSV＝
0.2で流下させる。流下液中のＮ−アセチル−Ｌ
−メチオニンを実施例１と同様の方法で定量する
と24.9mg／ml（転換率99％）含まれている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ エルウイニア（Erwinia）属に属し、Ｎ−ア
   セチル−DL−メチオニンアミドからＮ−アセチ
   ル−Ｌ−メチオニンを生成せしめる能力を有する
   微生物の培養液、該培養液から採取した菌体また
   は該菌体の処理物をＮ−アセチル−DL−メチオ
   ニンアミドに作用せしめ、生成したＮ−アセチル
   −Ｌ−メチオニンを採取することを特徴とするＮ
   −アセチル−Ｌ−メチオニンの製造法。 ２ 微生物がＮ−アセチル−DL−メチオニンア
   ミドからＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを生成せ
   しめる能力を有するエルウイニア・カロトボラ
   （Erwinia carotovora）3057である特許請求の範
   囲第１項記載の製造法。