JPH0255033B2 - - Google Patents

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JPH0255033B2
JPH0255033B2 JP56132662A JP13266281A JPH0255033B2 JP H0255033 B2 JPH0255033 B2 JP H0255033B2 JP 56132662 A JP56132662 A JP 56132662A JP 13266281 A JP13266281 A JP 13266281A JP H0255033 B2 JPH0255033 B2 JP H0255033B2
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cells
cell culture
reactor
medium
cell
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Robaato Torubaato Uiriamu
Maagaretsuto Hitsuto Marii
Fuedaa Jozefu
Chaaruzu Kimusu Richaado
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Monsanto Co
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は細胞の培養法、そしてより詳しくは懸
濁液中で細胞が付着するための微粒子担体（ミク
ロキヤリア）を使用した動物細胞の深部
（submerged）培養に関する。
近年、懸濁液中での細胞の培養のための種々の
方法の開発に急速な発展がみられている。高い細
胞濃度の達成がこれら多くのアプローチの第一義
的目的である。磁気攪拌棒またはシヤフト上の機
械的作動プロペラによる制御された攪拌を採用し
た細胞培養容器の使用はこれら方法の典型的な特
徴である。そのような装置の例は米国特許第
2958517号、同第3639932号、同第3572651号、同
第3622122号および同第3649465号各明細書に開示
されている。これらは本質的には細胞を適当な培
養条件下に細胞の増殖が停止するまで一定量の栄
養源中で培養する回分操作型のスピン培養装置ま
たはスピネルフラスコである。
連続細胞培養系および装置もまたこれまでに記
載されているが、この場合には米国特許第
4166768号および同第4178209号各明細書にみられ
るように連続的または半連続的基準で新しい培養
培地を加え、そして使用済培地を過によつて増
殖細胞から分離しそしてフラスコから除去するこ
とができる。
通常の懸濁培養はある種の哺乳動物細胞系の増
殖に対しては適当であるが、他の細胞、特にヒト
二倍体細胞は足場依存性で、細胞が付着するため
の支持体表面手段を要求する。そのような細胞の
培養系の例には、Ｔ型培養瓶、回転瓶、人工毛管
プロパゲーターおよびマルチプレートプロパゲー
ター中での単層増殖系がある。
大量懸濁培養の利点に細胞付着手段を与えるた
めに微粒子担体系が開発された。細胞培養に微粒
子担体を使用して成功した例はvan wezelによつ
て最初に報告されている〔Nature，第216巻、第
64〜65頁（1967）〕。このvan wezelの方法は、正
に荷電したDEAE−セフアデツクス ビーズ（グ
レードＡ−50、直径約100μ）を攪拌容器中の培
地に懸濁させ、ビーズの表面上に単層として細胞
を増殖させるものである。van wezelによつて使
用された攪拌容器はvan Hemert〔Biotechnol.
Bioeng.、第巻、第381〜401頁（1964）〕によ
り記載されたビルトホベン（Bilthoven）微生物
培養ユニツトである。この方法においては各種細
胞系、ヒト二倍体細胞および初代ウサギ腎細胞の
培養に成功している。微粒子担体培養でのポリオ
ウイルスの産生はvan wezelにより検討され、こ
のウイルスの増殖は単層培養の場合と本質的に同
様であることが見出された。微粒子担体系のその
他の解説は、van wezelらによつて、Process
Biochem.、1978年３月号第６〜８頁および第28
頁に開示されている。そこには非常に敏感な細胞
型例えばヒト二倍体細胞株の培養に関しては、こ
の系はまだ完全には満足できるものではないと記
載されている。
van wezel法の改良法がLevineらによつて
Somatic Cell Genetics、第３巻、第149〜155頁
（1977）ならびに米国特許第4036693号および同第
4189534号各明細書に記載されている。この系は
本質的には磁気的に作動される攪拌棒を装備した
スピネルフラスコを使用するものである。小規模
な100ml操作容量でこの系を使用した場合のいく
つかの成功例がLevineらによつて報告されてい
る〔Biotechnol.Bioeng.、第21巻第821〜45頁
（1979）〕。しかしながら、他の研究者達はヒト二
倍体細胞の大規模培養へのこの系の適用性に関し
ては疑問を投じている〔Develop.Biol.
Standard.、第42巻第147〜151頁（1979）〕。
1980年６月20日出願の米国特許出願第161614号
明細書中には改良された細胞培養系および装置が
開示されており、これは攪拌懸濁培地中の微粒子
担体上での細胞培養への応用に際して特に有用で
ある。この攪拌機は敏感な細胞およびもろい微粒
子担体に対して静かな攪拌を与える可撓性シート
を有している。
本発明によれば、微粒子担体上での細胞の攪拌
懸濁培養のための改良された細胞培養法が提供さ
れる。この方法は微粒子担体の集塊を形成させ、
それによつて細胞が微粒子担体ビーズの表面上の
みならずビーズの間でも増殖して多数の細胞が隣
接担体間に広がつてこの際集塊化担体を取り囲ん
だ細胞のコクーン（繭）を形成することを包含す
る。この集塊化（aggregation）は担体表面の単
位面積当たりに生成される細胞数を著しく増大さ
せる。所望の集塊化は、一次または主細胞培養反
応器の通常の攪拌領域の外部に設けた分離された
領域またはコンパートメント内に、微粒子担体ビ
ーズおよび付着細胞を周期的に一時的に滞留さ
せ、そこでそれらに一次細胞培養反応器中と実質
的に同一の環境条件を有する限定空間内で穏和な
反転運動を与えることによつて実施される。
主細胞培養反応器攪拌領域の外部でのそのよう
な周期的な各滞留の後に、微粒子担体を前記反応
器に再循環させ、全過程を連続的または半連続的
基準で、細胞収穫のための所望の細胞濃度が達成
されるまで実施する。
本発明は添付図面に関する以下の説明から一層
明瞭に理解されるものと考える。
第１図は本発明の好ましい態様による細胞培養
系および装置を示す模式的ダイヤグラムである。
第２図は本発明の方法に使用される細胞培養容
器および沈降チヤンバーを示す一部断面の側面図
である。
第３図は本発明の方法に使用される別の態様の
細胞培養容器の一部分および付着する沈降チヤン
バーを示す一部断面の側面図である。
第１図に関して述べると、ここには主細胞培養
反応器または増殖容器１０、新鮮培地の貯蔵部１
２、NaHCO3貯蔵部１３、サテライト過容器
１４および流出液貯蔵部１５を包含する一連の相
互に連結された細胞培養器が示されている。細胞
は細胞培養反応器１０中の栄養培地の攪拌液体懸
濁液中で微粒子担体に付着して増殖する。追加の
新鮮培地は必要に応じてペリスタポンプ１７によ
り貯蔵部１２からライン１６を経て細胞培養反応
器中に給送される。細胞培養反応器の外側に付し
たそしてポンプ１７と作動関係にある容量レベル
制御系１８によつて反応器１０中には一定の液体
レベルが保持される。連続的なPH制御は、PHコン
トローラー２０に接続された容器サイドアーム中
のゴムストツパーを通して細胞培養反応器１０中
に沈めた高圧滅菌可能なPHモニター電極によつて
行われる。
空気混合物２１中のCO2を反応器１０中の細胞
培養懸濁液表面上に通し、そして酸素２２を必要
に応じて散布させる。約7.1以上のPHでは細胞培
養反応器中の液体表面の上を高CO2-空気混合物
（10〜15％CO2）を流し、一方約7.1以下のPHでは
低CO2-空気混合物（２〜５％CO2）が使用され
る。約7.0以下のPHでは、0.5M NaHCO3の水溶
液が必要に応じてPHコントローラー２０により作
動されるペリスタポンプ２４によつて貯蔵部１３
から細胞培養反応器中にライン２３を経て送られ
てPH＞7.0を保持する。低量の酸素散布（約０〜
２ml／分）を使用して、溶存酸素レベルを約10〜
約140mmHg分圧範囲、好ましくは約30〜約80mm
Hg分圧の範囲に保持する。
細胞および微粒子担体を含有する懸濁液を周期
的に主細胞培養反応器から一部分取り出して沈降
チヤンバー１１を通過させる。この沈降チヤンバ
ー中では、比較的密な細胞および微粒子担体を一
時的滞留の間に沈降させて集塊化させ、一方あま
り密でない培養培地はペリスタポンプ２６により
ライン２５を経てサテライト過容器１４中に給
送される。すなわち培養培地は圧力差によつて細
胞培養反応器中の液体水面下から沈降チヤンバー
を通り、ついでサテライト過容器の底部近くに
流入する。過されなかつた培地は周期的にペリ
スタポンプ２８によつてライン２７を経てサテラ
イト過容器の頂部近くから細胞培養反応器１０
の頂部に送り込まれる。過された使用済培地は
ペリスタポンプ３０によつて周期的にライン２９
を経てサテライト過容器から流出液貯蔵部１５
中に送り込まれる。ポンプ２６および２８または
好ましくはダブルヘツドポンプに接続されたパル
ス式タイマー３１は主細胞培養反応器とサテライ
ト過容器との間の培地の周期的循環を制御し、
一方ポンプ３０に接続されたパルス式タイマー３
２はサテライト過容器からの流出液貯蔵部への
使用済培地の液流を制御している。細胞培養反応
器からの細胞のサンプリングおよび細胞の収穫は
所望に応じて３３において実施することができ
る。
再循環系中の総流速は好ましくは毎分当たり沈
降ボトル容積の約1/10を越えないものでありそし
てこれは好ましくは流出液流速の約1.1倍以上で
ある。流出液流速（系中への新鮮培地の流入に等
しい）は主細胞培養反応器中で増殖する特定の細
胞の代謝要求により決定される。例えばヒト二倍
体包皮線維芽細胞の場合には最適な新鮮培地（ま
たは流出液）流速は反応器中の細胞199個当たり
約４〜８ml／時である。４反応器に対して約
150mlの体積そして44反応器に対して約1000ml
の体積を有する例示的沈降ボトルにおいては、最
高細胞濃度はそれぞれ細胞数約２×107個／mlお
よび約４×107個／mlまでの範囲である。沈降ボ
トルの狭窄部分での微粒子担体ビーズの自由な運
動を維持するためには再循環ポンプを好ましくは
全前進時間の約1/4までの間逆行させることがで
きる。これらのポンプはまた周期的に１分当たり
30秒間まで停止させて沈降を増強させることがで
きる。
微粒子担体の集塊の生成は本発明の方法におけ
る必須事項である。これは主細胞培養反応器１０
の通常の攪拌領域の外部での分離された領域また
はコンパートメント（例えば沈降チヤンバー１
１）中に微粒子担体ビーズおよび付着細胞を一時
的に滞留させ、そこでそれらに主細胞培養反応器
と実質的に同一の環境条件を有する限定空間内で
穏和な反転運動を与えることによつて実施でき
る。沈降チヤンバー１１は主細胞培養反応器の内
部かまたはそれに連結させて配置するのが便利で
ある。集塊形成を強化するに当たつては、沈降過
程の間長期間にわたつて微粒子担体と細胞とを緊
密に接触させることが重要である。これらの接触
はビーズの周囲を経てサテライト過容器１４の
再循環系中へ潅流される培地により非静止環境で
実施することができる。
沈降チヤンバー中に微粒子担体ビーズおよび細
胞が周期的に導入されてからそれらが主細胞培養
反応器領域に戻されるまでのこの沈降チヤンバー
中での微粒子担体ビーズおよび細胞の滞留時間は
好ましくは約１〜約10分の範囲である。
主細胞培養反応器はフラスコからなる組立装置
であり、その内部では培地中に下方向に懸垂され
た攪拌手段である１個または２個以上の比較的大
表面積の可撓性シートの緩徐な回転によつて、培
地が穏和に攪拌される。この可撓性シートの一側
の総表面積は培養容器の培養液含有部分の有効な
横切可能断面積の約0.25倍〜約1.0倍の範囲であ
ることが好ましい。これらの可撓性シートは、好
ましくは約５〜約100rpmの範囲内での攪拌手段
の回転時に、セールのように膨らんでシートの後
縁部から液体が溢出するような様式で攪拌機上に
配置される。
本発明に使用される沈降チヤンバーは前記のフ
ラスコからなる組立装置中に位置させるかまたは
それに連結させて装備することができる。第２図
および第３図は、本発明の方法における使用が好
ましい連結沈降チヤンバーを有する細胞培養反応
器の２種の実施態様を例示するものである。
特に第２図に関して、参照番号３５は微粒子担
体上での哺乳動物およびその他の動物の細胞の攪
拌懸濁培養に使用される細胞培養反応器またはフ
ラスコを一般的に示している。このフラスコは透
明なガラスまたは非毒性剛性プラスチツク材料か
ら作られることが好ましいが、また生物適合性金
属例えばステンレススチールから作られていても
よい。フラスコは側壁３６、底部３７、頚部３８
および口部３９を有する全体的に円筒状の形態と
して示されている。しかしながら、その他の形態
のフラスコまたは培養容器も使用できることは当
然である。
第２図においては、フラスコの口部は、中心に
１個の孔部を有する取り外し可能なストツパー４
０で閉じられたものとして示されている。勿論フ
ラスコには、他の気体および液体の導入および排
出の目的の例えば酸素、二酸化炭素、NaHCO3
溶液等の導入に適当な追加の開口部を設けること
が好ましい。これら開口部はストツパー４０自体
の中に設けることもできるしまたはフラスコ壁の
別個の開口部中に設けることもできる。
フラスコ３５は微粒子担体４２および付着細胞
４３を懸濁させた培養液４１で一部満たされてい
るように示されている。例示の目的でサイズおよ
び比率は共に拡大されている。
フラスコ中には回転可能な攪拌機ユニツト４５
が垂直に配置されているが、これは静止シヤフト
４６によつて頂部から下方向に懸垂されている。
シヤフト４６はストツパー４０の中心開口部また
は孔部に摩擦的に適合するように適応されてい
る。
攪拌機ユニツト４５は静止シヤフト４６のまわ
りを回転するように軸受けされた回転可能なスリ
ーブ部材４７、前記スリーブ部材に固定され前記
シヤフトの垂直軸に横方向の長手方向軸を有する
クロスピース部材４８、前記クロスピース部材の
両末端から下方向に従属している１組のアーム４
９および前記アームの間に懸垂した比較的薄い可
撓性シート５０を有するものとして示されてい
る。この可撓性シートは例えばワイヤ手段によつ
て、各アームの下端、およびより上方の位置例え
ば各アームの縦方向のほぼ中央点５１においての
み攪拌機アームに固定され、各アーム上のこれら
結合点の間のシートは非結合状態に放置されてい
る。磁気攪拌棒５２もまた攪拌機アームの下端に
取り外し可能に固定されたものとして示されてい
る。この攪拌機ユニツトは細胞培養フラスコの下
に配置した回転するＵ字形または棒状マグネツト
（図示されていない）の作動によつてシヤフト４
６の周囲を回転させることができる。矢印は回転
の方向を示す。
シート５０は攪拌機の回転時に液流の影響を受
けてたわむように可撓性を有することが好まし
く、それによつてセールのように膨らんで進行方
向に凹面構造をとることができる。この可撓シー
トはまた上方及び下方結合端の中間の実質的区間
では攪拌機アームと結合していないので、このよ
うに膨らむことが可能になる。
比較的薄い可撓性攪拌シート５０は微細なメツ
シユクロスまたは布、プラスチツクフイルムまた
は金属箔およびその他の透過性または非透過性可
撓性シート材料例えばナイロンスクリーン布また
は可撓性ガラス繊維シートから製造することがで
きる。NITEX（Tetko Inc.，Elmsford，
New Yorkの製品）の商品名で市販されている
約110μの公称メツシユの間〓および約0.0127cmの
厚さを有するモノスクリーンナイロンクロスは本
発明での使用は特に適している。
攪拌時には、第２図の攪拌機ユニツトは、攪拌
棒がブランコのシート部分に相当する弓状に曲が
つたブランコの外観を呈する。可撓性シート５０
はシートの上側が好ましくはシート下側よりも長
い逆台形の形状を有するものとして示されている
が、これがシートを、攪拌機ユニツトの回転時の
液体流によつてセールのように曲がり膨らみやす
くする。攪拌機のアームを比較的可撓性の物質例
えばシリコーンチユーブから製造してこの回転時
にシート５０が膨らむ効果を更に増大させること
ができる。攪拌機の操作時には、培養フラスコ中
の培地の水面は可撓性シートの上に、スリーブ部
材の保持手段よりは下に保持される。
第２図においては、沈降チヤンバーは全体とし
て参照番号５５で表示されている。沈降チヤンバ
ーは逆円錐形の底部５７を有し、全体に円筒形の
側壁５６を有するものとして示されていて、この
底部は管状部５８を介してサイドアーム５９に連
絡し、一方、このサイドアームが培養培地の水面
以下のある一点で細胞培養フラスコ中に直接接続
されている。沈降チヤンバー５５はガラスｏ−リ
ングジヨイント６０を介してアーム５９に接続さ
れたものとして示されている。沈降チヤンバーの
頂部ではチユーブ６１（一部分が示されている）
が、すでに述べたように、サテライト過フラス
コに接続されている。沈降チヤンバーにはまた、
チヤンバーを貫通する溝が形成されるのを防止す
るための多孔型の液流分配装置６２が設けられて
いる。円錐形の底部は所望の微粒子担体ビーズと
細胞の接触を容易にするため、垂直から約15゜〜
約60゜（弧63により示されている）、好ましくは約
30゜（例示されているように）〜約45゜の範囲の傾
斜を有するテーパーつき表面を有している。チユ
ーブ５８およびアーム５９中の同様の傾斜つき表
面は更にこのような接触を増強させる。沈降チヤ
ンバーの容積は好ましくは再循環系中で使用され
る最大流速において担体ビーズの完全な沈降を可
能にするのに充分なものであるべきである。再循
環系を周期的に逆転させて沈降ビーズの自由な流
れを確保することができ、また再循環系を断続的
に作動させることもできる。磁極の反転およびパ
ルス式タイマー３１により制御されるダブルヘツ
ド再循環ポンプ（便宜上個々のポンプ２６および
２８として示してある）の使用がこれら交互変換
性の付与に適当である。
第３図は第２図の場合と同様であるが、側面か
ら内方向に曲げて装備する代わりに細胞培養反応
器（一部分が示されている）の頂部に沈降チヤン
バーを垂直に配置させた別の実施態様を示してい
る。細胞培養反応器６５は中心頂部開口部６６お
よびサイドアーム開口部６７を有し、後者は一穴
ストツパー６８により閉じられている。沈降チヤ
ンバー６９は内側にテーパーを有する表面７０、
および細胞培養反応器中の液体内容物の水面７５
の下に直接導かれる管状延長部７１を有する下方
斗部分を有している。図示されている円錐形の
底部７０は垂直から約30゜（弧72により示されてい
る）の傾斜を有している。沈降チヤンバーにはま
た液流分配装置７４と、サテライト過容器に導
かれる管状部７３（一部示されている）への頂部
開口部が設けられている。サテライト過容器は
米国特許第4184916号明細書に示された頂部から
下方に懸垂された回転過ユニツトを有するフラ
スコ装置と同様のもの、または頂部から下方に懸
垂された静止過ユニツトの周囲に同心円的に回
転可能な攪拌機が配置されている米国特許第
4178209号明細書に示されたフラスコ装置と同様
なものとすることができる。この回転可能な攪拌
機は米国特許出願第161614号明細書に記載の可撓
性シート構造を有することが好ましい。回転攪拌
機はサテライト過容器中に持込まれた細胞屑に
より生じるフイルターの目詰まりの防止を助け
る。
本発明による細胞培養は慣用の回転瓶中で同一
細胞について得られる濃度よりも約３〜約４倍大
きい単位面積当たり細胞濃度の生成を可能にす
る。微粒子担体は、培地容量基準での細胞増殖で
は慣用の回転瓶系より効率的であると報告されて
いることが多いが、表面積基準では回転瓶系より
もこれまでは効率が低かつた。本明細書に記載の
ように、主細胞培養反応器攪拌領域の外部の沈降
チヤンバー中での細胞および微粒子担体の一時的
滞留は個々の細胞と担体微粒子が相互に、細胞培
養反応器中での攪拌時に起こる瞬間的または一時
的接触よりもはるかに長時間の間、接触すること
を可能にする。担体微粒子に細胞が集密化した後
には、この長期接触の間に細胞ブリツジおよび集
塊が生成し、例えば従来技術に記載されているよ
うに攪拌を周期的に停止させて細胞および担体微
粒子を細胞培養反応器の底部に沈降させた場合に
生じるような限定的環境に置く必要がない〔微粒
子担体上での細胞の静止ペトリ皿培養における増
殖の限定効果については、Biotechnol.Bioeng.、
第17巻第713〜723頁（1975）を参照〕。培地がサ
テライト過容器を通つて再循環されると、沈降
チヤンバー中では培地は沈降細胞および担体微粒
子の上方に絶えず引き上げられて緩徐な穏和な反
転運動が起こる。一方、主細胞培養反応器中で細
胞と微粒子担体を長時間沈降させて集塊を生じさ
せた場合には、細胞および微粒子担体は過度にコ
ンパクトになり、細胞が死滅してしまう傾向があ
る。細胞培養反応器中で細胞を沈降させた場合に
生じる栄養素および酸素の枯渇、高濃度の排泄物
および極端なPHは細胞の死滅または細胞の損傷を
起こさせる。
本発明の方法による細胞の面積密度の大きい大
形の細胞−微粒子担体集塊の生成は、微粒子担体
支持体から付着細胞を遊離させる場合にも別の利
点を有している。微粒子担体培養におけるヒト二
倍体線維芽細胞のスケール・アツプに際して一つ
の主要な限界は、細胞をより大型の培養容器への
接種に使用するため細胞を担体から遊離させるこ
との困難さにある。この困難さは通常の単層培養
からの一段階スケール・アツプを特に阻止する傾
向がある。全く思いがけなく、本発明により達成
される高い細胞密度においては、細胞はトリプシ
ンによつて低い細胞濃度におけるよりも容易に、
肉眼的な損傷を与えることもなく遊離されること
が見出された。
次の実施例は本発明を更に説明するものである
が本発明はこれら特定例に限定されるものではな
いことを理解すべきである。
例 １ AG1523ヒト二倍体包皮線維芽細胞系の試料は
米国ニユージヤージー州カムデンのInstitute for
Medical Researchから、継代数３回で得られ
た。この細胞を37℃で集密化するまで増殖させ、
ついで4.5ｇ／グルコースと10％胎児牛血清を
補充し抗生物質を添加しないダルベツコ改良イー
グルの最少必須培地（MEM）を含有する75cm2Ｔ
型培養瓶（フアルコン・プラスチツクス製品）お
よび690cm2回転瓶中で継代数14回まで二次培養し
た。ついで細胞を第１図に例示された本明細書に
説明された細胞培養系および装置を使用し、微粒
子担体上での攪拌懸濁培養で増殖させた。反応器
系は約500ml／時の総流速に保持された。再循環
ポンプは各２分間の間に90秒間はオン相に、30秒
間はオフ相に保持した。１分間のオン時間の40秒
間は前進方向（すなわち反応器→沈降ボトル→
過容器）にそして20秒間は逆方向に作動させた。
４の容量を有する微粒子担体細胞培養反応器
の使用に際しては計35ｇの微粒子担体ビーズを次
のようにして製造した。
16.5m2すなわち239個の回転瓶（それぞれ690cm2
の有効表面積を有する）に相当する膨潤表面積を
有するポリアクリルアミドビオ−キヤリアズ
（Bio−Carriers）（Bio−Rad Laboratories製品）
を0.05M Naclと0.05M ２−（Ｎ−モルホリノ）
エタンスルホン酸（MES）とからなるPH5.0の水
性緩衝液中で、オートクレーブによつて滅菌し
た。オートクレーブ滅菌時の沈降ビーズの深さは
２インチ以下（＜5.18cm）とし、温度は約40〜60
分間124℃に保持した。冷却後ビーズを燐酸緩衝
食塩水（PBS）で２回、ついで前記血清含有培
地で１回無菌的に洗浄した。このPBSは80ｇの
NaCl、２ｇのKCl、２ｇのKH2PO4および21.6ｇ
のNa2HPO4・7H2Oを10の蒸留水に溶解させ
ついでオートクレーブで滅菌して、調製された。
微粒子担体ビーズおよび新鮮培地を４の細胞
培養反応容器に加え、そして継代数14回の
AG1523細胞系の９個の回転瓶からの細胞を使用
して接種した。反応器中には中心に配置された回
転可能な攪拌機シヤフトが装備されていて、その
シヤフトはシヤフトの垂直軸の周囲に相互に等距
離間隔に配置され上部および下部の位置において
のみシヤフトに結合されている４枚の可撓性シー
トを有している。細胞増殖期間には反応器攪拌速
度は約30〜約40rpmにサテライト過容器攪拌機
は約80〜100rpmに保持された。この反応器には
また、第２図に例示されている種類の沈降チヤン
バーが装備されているが、これは第２図に示され
ているようなｏ−リングジヨイントではなく第３
図に示されているような１個の孔部を有するスト
ツパーを通して傾斜反応器サイドアームに接続さ
れていた。沈降チヤンバーの容量は155mlであつ
た。このチヤンバーの上部の直径は５cm、一方下
の管状延長部の直径は1.6cmとした。この系によ
り252時間増殖させた後、細胞核計数による細胞
濃度は8.26±0.25×106個／ml、総細胞数は３×
109個であつた。この細胞濃度は回転瓶１個当た
りの値を３×107個と仮定すれば1100本の回転瓶
に相当することを示している。細胞核計数は
SanfordらによつてJ.Natl.Cancer Inst.、第11巻
第773頁（1951）に記載された方法にほぼ従つて
実施された。
膨潤ビーズの体積は懸濁液の全体積の約1/4な
ので各種濃度は細胞核計数によつて調整しなけれ
ばならなかつた。試料４mlを採取し、100〜300×
ｇで２分間遠心してビーズを圧縮した。上澄液を
除去しそして0.2Mクエン酸をビーズに加えて全
体積を２mlとした。この混合物を１〜３時間37℃
で緩徐に攪拌した。ついで２mlの0.1Mクエン酸
中0.2％クリスタルバイオレツトを加え、染色さ
れた核を血球計数器で計数した。
前記微粒子担体上での攪拌懸濁培養の間に、ビ
ーズ１個当たり細胞１〜２個の初期接種はビーズ
を覆うまでに増加し、ついでビーズの漸増的集塊
化が観察された。一部のビーズは最初は細胞を付
着していなかつたが、これらの大部分はこの系中
での増殖の間にビーズ−細胞集塊中に組込まれ
た。収穫時にはほとんどすべてのビーズはさしわ
たしで５〜20個分のビーズ直径の大型集塊中に含
有されていた。細胞はビーズ上およびビーズ間で
増殖し、各集塊を囲む細胞のコクーン（繭）の外
観を形成した。合計29.2の培地を使用して33×
109個の細胞が製造された。１個当たり100mlの培
地を含有する通常の690cm2回転瓶に比べると、実
際の表面積基準の収量はこの例の系の場合4.6倍
大であり、回転瓶系の場合よりも必要な培地は
3.8倍少なかつた。
細胞−ビーズ集塊の一部をPBSで４回洗浄し、
蒸留水中での凍結−融解サイクルを２回反復して
溶解させた。ついで細胞抽出液をカルボキシメチ
ルセフアデツクスクロマトグラフイーにより濃縮
した。その蛋白分画はAuerbachら：Devel.
Biol.、第41巻第391〜４頁（1974）、ならびに
Folkman：Cancer Res.、第34巻第2109〜13頁お
よび第36巻第110〜114頁（1976）記載の方法によ
る10〜11日齢鶏胚中でのCAM（漿尿膜）検定によ
つて脈管形成誘導因子活性陽性であることが見出
された。
この細胞の他の部分を次のようにトリプシン処
理によつて遊離させた。すなわち細胞−ビーズ集
塊を0.02％EDTA含有PBSで３回洗浄し、ついで
等容量のトリプシン−EDTA溶液〔ブタトリプ
シン0.5mg／、GIBCOカタログNo.610−5300−
TRYPSIN（１：250）、国民医薬品集第14巻
（1975）、およびハンクスの平衡塩類溶液中
EDTA0.2ｇ／〕と共に15分間インキユベート
した。すべての細胞は良好な生存性をもつて容易
に遊離された。
例 ２ 11個の回転瓶からの継代数16回のAG1523細胞
を使用して例１に記載したような４の微粒子担
体反応器系中の約45ｇのポリアクリルアミドビオ
キヤリアズに接種した。実際のビーズ表面積は
21.2m2であつて307個の回転瓶（それぞれ690cm2の
有効表面を有する）に相当する。細胞培養反応器
系中で27.6の培地を使用した後、その細胞濃度
は7.78±1.37×106個／ml、総細胞数は31.1×109
個であつたが、これは1037個の回転瓶の場合に相
当した。通常の回転瓶系に比較してこの実施例で
は単位表面積当たり細胞数の3.4倍の増加、そし
て培地要求の3.8倍の減少が得られた。例１の場
合と同様な細胞−ビーズ集塊の形成が観察され
た。次いで前記培養細胞の別の部分をインターフ
エロンおよびプラスミノーゲンアクテイベーター
の製造に使用した。
インターフエロンの産生 前記ビーズ−細胞集塊の一部を２％血清中で熟
成させ、次のようにインターフエロンの製造に使
用した。微粒子担体反応器中での最大増殖後、高
濃度のAG1523細胞を含有する微粒子担体集塊の
一部を取り、血清を含まない培地で２回洗浄し、
２％胎児牛血清を補充した培地中に再懸濁した。
この２％血清培地を５日間の熟成期間中に３回交
換してPHを約6.8〜7.2に保持した。第２図に示し
たような単一シート可撓性攪拌機を含有する懸濁
容器を約40rpmで使用した。微粒子担体集塊中の
これらの細胞の一部を50μｇ／mlのシクロヘキシ
ミドを含有し血清を含まない培地で２回洗浄し、
ついで50μg／mlのシクロヘキシミドおよび
100μg／mlのポリリボイノシン酸−ポリリボシチ
ジル酸（polyr Ｉ−polyr Ｃ）含有の血清を含ま
ない培地に再懸濁した。37℃で４時間穏やかに攪
拌した後、アクチノマイシンＣを1μg／mlの濃度
に加えた。更に２時間37℃に置いた後、担体集塊
を２％胎児牛血清のみを補充した培地で４回洗浄
し、更に18〜20時間この培地中でインキユベート
した。ついでこの培地を収穫し、遠心により透明
にし、凍結させた。Finterの染料吸収法の
Armstrongによる改良法を使用して、HeLa細胞
にポリオウイルスをチヤレンジさせる標準的方法
で、この試料のインターフエロンンを検定した
〔Finter：J.Gen.Virol.、第５巻第419〜427頁
（1969）およびArmstrong：Appl.Microbiol.、第
21巻第723〜726頁（1971）参照〕。細胞500個当た
り１国際単位のインターフエロン力価が得られ
た。
プラスミノーゲンアクチベーターの産生 前記ビーズ−細胞集塊の他の一部分を前述のよ
うにして４日間２％胎児牛血清中で熟成させた。
熟成後、この細胞−微粒子担体集塊を血清を含ま
ない培地中で数回洗浄し、ついで5μg／mlのラク
トアルブミン水解物を含有する培地中に再懸濁さ
せた。細胞を７日間穏やかに攪拌し、この間ラク
トアルブミン水解物培地を一度交換した、この培
地を収穫し、遠心により透明にし、フイブリンデ
イツシユ検定法〔Fiderら：Biochem.Biophys.
Res.Comm.、第83巻第1164〜1170頁（1978）参
照〕によりプラスミノゲンアクチベーター活性を
分析した。プラスミノーゲンアクチベーター活性
１単位は１時間に1μgのフイブリンを可溶化する
酵素量として定義された。この方法によればラク
トアルブミン水解物培地の凍結分画の測定値は
1700単位／mlであつた。
例 ３ 22個の回転瓶からの継代数13および14回の
AG1523細胞を例１記載の４微粒子担体反応系
中、50ｇのポリアクリルアミドビオ−キヤリアズ
の接種に使用した。主細胞培養反応器中には約
18rpm、サテライト過容器には約80rpmの攪拌
速度を使用した。実際のビーズ表面積は23.5m2
で、これは340個の回転瓶（690m2／回転瓶）に相
当する。合計27.6の培地を使用して1.01±0.04
×107個／mlの最終細胞濃度すなわち合計4.04／
1010個の細胞が生成し、これは1347個の回転瓶に
相当した。通常の回転瓶系と比較すると、本例で
は単位表面積当たり細胞の４倍の増加と培地要求
量の4.9倍の減少が達成された。細胞−ビーズ集
塊の形成は例１の場合と同様に観察された。脈管
形成誘導因子の製造にこの細胞の一部を使用し、
一方残りの細胞は次の方法によつてビーズから遊
離させた。すなわち約１の沈降させた集塊を、
0.02％EDTA含有するPBSの温溶液各２で３回
洗浄した。100mlの10倍希釈トリプシン−EDTA
溶液（5g／のブタトリプシンおよび2g／の
EDTAをハンクスの平衡塩類溶液中に含有）を
ついで反応器に加えた。37℃で10分間約100rpm
において攪拌すると、すべての細胞がビーズから
遊離しついでこれを例４の44反応器の接種に使
用した。92％の細胞は生存していて、新しい担体
に付着した。
脈管形成誘導因子の産生 前記の細胞−微粒子担体集塊の少量をPBSで
３回洗浄し、4M KClに再懸濁させて、90分間
時々攪拌して室温（約20〜25℃）でインキユベー
トした。透析後この上澄液を凍結乾燥し、CAM
アツセーによつて脈管形成誘導因子活性を検定し
た。非可溶化物質を更に4M KCl中で凍結−融解
処理し、上澄液を透析し、凍結乾燥し、検定し
た。３種の異なつた濃度での試料のCAM分析結
果は次の通りである。
KCl処理のみ 蛋白（μg） 活 性 200 卵10個のうち５個陽性 60 卵10個のうち４個陽性 20 卵10個のうち４個陽性 KCl＋凍結融解 蛋白（μg） 活 性 200 卵10個のうち９個陽性 60 卵10個のうち６個陽性 20 卵10個のうち５個陽性 対象試料 陰性対象 （200μg） 10個の卵のうち陽性は０ 陽性対象 （50μg） 10個の卵のうち６個陽性 例 ４ 例３に記載したように製造されたAG1523細胞
を使用して例３の４反応器からの残余のビーズ
（約50ｇ）および残余の細胞を含む400ｇのオート
クレーブ処理ポリアクリルアミドビオ−キヤリア
に接種した。これら細胞を第３図に示した種類の
沈降チヤンバーを装備した44の反応器を使用し
たほかは例１に記載したと同様の反応器系中で増
殖させた。この沈降チヤンバーの容積は1040mlで
あつた。このチヤンバーの上部は11cmの直径を有
し、一方下部の管状延長部は1.8cmの直径を有し
ていた。この反応器系を逆流させることなく１時
間約４の流速に保持した。微粒子担体ビーズは
オートクレーブ処理後に血清を含まない培地で３
回洗浄したほかは例１の場合と同様にして調製し
た。血清を含まない培地および牛胎児血清をつい
で約10の膨潤ビーズに加えて接種後10％血清44
の最終容量とした。攪拌機速度は反応器に対し
ては８〜12rpm、サテライト過容器に対しては
80rpmとした。実際のビーズ表面積は188m2であ
り、これは2725個の回転瓶（690m2／回転瓶）に
相当する。合計262.7の培地を使用して、7.68
±0.55×106個／mlの細胞濃度、合計3.38×1011個
の細胞が生成した。これは11264個の回転瓶に相
当した。通常の回転瓶系に比較してこの例では単
位表面積当たり細胞数の4.1倍の増加、培地要求
量の4.2倍の減少が達成された。例１の場合と同
様な細胞−ビーズ集塊の形成が観察された。
プラスミノゲンアクチベーターの産生 細胞−ビーズ集塊の一部を血清を含まない培地
で４回洗浄し、５mg／mlのラクトアルブミン水解
物を含む培地44を含有する反応容器に戻した。
オーバーレイガス中のCO2−空気混合物の調節お
よびNaHCO3溶液の添加によつてPHを約7.0〜7.1
のレベルに調整した。５日後に上澄液を収穫し、
反応器を新しいラクトアルブミン水解物培地で満
たした。更に６日後に上澄液を再び収穫した。両
上澄液を市販中空繊維および膜濃縮装置中で約10
〜15倍に濃縮した。各濃縮上澄液の一部を透析
し、凍結乾燥し、そして各濃縮上澄液の別の部分
は凍結させた。凍結乾燥および凍結両試料のプラ
スミノーゲンアクチベーター活性を例２と同様に
して検定した。次表に示すように、凍結乾燥物質
及び凍結物質の両者において高レベルの活性が測
定された。
第１収穫分 第２収穫分 凍結乾燥 22000単位／ml 18500単位／ml 凍 結 10000単位／ml 10500単位／ml 例 ５ 25個の回転瓶からの継代数19回のAG1523細胞
を第２図に例示したタイプの沈降チヤンバーを有
する例１記載の４微粒子担体反応器系中のオー
トクレーブ処理ポリアクリルアミドビオ−キヤリ
アズ50ｇに接種した。この沈降チヤンバーの容量
は200mlとした。チヤンバーの上部は５cmの直径
を有し、その下方の管状延長部は3.3cmの直径を
有していた。この反応器系を逆流させることなく
約500ml／時の流速に保持した。本例においては
例１に使用された100％牛胎児血清の代わりに数
回の継代培養（15〜19回）では培地に６％仔牛血
清を補充した。６％仔牛血清の補充はまた４反
応器中でも使用した。攪拌速度は反応器中では
16rpm、サテライト過容器中では80rpmとし
た。実際のビーズ表面積は23.5m2で、これは340
個の回転瓶（690cm2／回転瓶）に相当する。合計
31の培地を使用し、1.04±0.8×107個／mlの細
胞濃度、合計4.16×1010個の細胞が生成した。通
常の回転瓶系に比較して、この例では単位表面積
当たり細胞数の４倍の増加、培地要求量の4.5倍
の減少が達成された。例１の場合と同様な細胞−
ビーズ集塊の形成が観察された。
インターフエロンの産生 増殖期間の終了後、細胞−ビーズ集塊を血清を
含まない培地で２回洗浄し、２％仔牛血清補充培
地に再懸濁し、そして反応容器およびサテライト
過容器中の培地と共に、２％仔牛血清を使用し
た微粒子担体反応器系に再び供給した。２％仔牛
血清補強培地10を９日間にわたつてこの反応器
系に潅流させた。この細胞−ビーズ集塊の一部を
各種時点で採取し、インターフエロンを誘発さ
せ、例２に記載のようにして検定した。インター
フエロンの水準は次表のように３日目に細胞500
個／国際単位の最大値まで上昇した。熟成時間 細胞／単位 ０日 2000 ３日 500 ６日 4000 ９日 6000 前述の例においては特定の細胞培養培地および
微粒子担体が使用されているが、本発明の方法は
これら特定の培地および微粒子担体によつて限定
されるものではないことを理解すべきである。す
なわち本発明は任意の周知の組織培養培地例えば
イーグルの基礎培地（BME）、イーグルの最少必
須培地（MEM）、ダルベツコの改良イーグル培
地、培地199等と共に使用するのに適している。
これらは市販品を入手可能な組織培養培地であ
り、またIn Vitro、第６巻第89〜108頁（1970）
に詳細に記載されている。これら慣用の培地は既
知の必須アミノ酸、無機塩、ビタミンおよび炭水
化物を含有している。それらはまた哺乳動物血清
例えば胎児牛血清で補強されることが多い。
微粒子担体は無機材料例えばガラスビーズ、球
状シリカ等から製造することができ、または有機
重合体材料の微小球体例えばDEAEセフアデツク
ス、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリ
ル、ポリスチレンラテツクスの粒子および類似の
微粒子担体物質として製造することができる。細
胞培養に対して特に適当な市販品を入手可能な微
粒子担体は本明細書に上述したポリアクリルアミ
ドビオ−キヤリアズ、フアルマシア・フアイン・
ケミカルズ（Piscataway，NJ）から入手可能な
「サイトデツクス（Cytodex）１」微粒子担体お
よびフロー・ラボラトリーズ社（McLean，VA）
から入手可能な「スーパービード（Superbead）」
微粒子担体である。
本発明はヒト二倍体細胞に関して特に有用であ
るが、本発明は例えば哺乳動物、鳥類および両棲
類細胞を含むすべてのタイプの動物細胞に対して
適応可能である。すなわち胚、成体または腫瘍組
織から採取した初代細胞ならびに樹立細胞系の細
胞を使用することができる。細胞の典型的な例と
しては、初代ルーサスサル腎細胞、ベビーハムス
ター腎細胞、ブタ腎細胞、マウス胚線維芽細胞、
正常ヒト肺胚線維芽細胞、HeLa細胞、初代およ
び二次鶏線維芽細胞ならびにSV−40またはポリ
オーマウイルスで形質転換された各種細胞があ
る。
適当に細胞を増殖させた後、その細胞を収穫
し、更に種々の方法で処理して所望の生成物を産
生させることができる。例えば本発明の方法によ
つて培養されたヒト二倍体包皮線維芽細胞を処理
して脈管形成誘導因子、プラスミノーゲンアクチ
ベーターおよびインターフエロンを産生させるこ
とができる。脈管形成誘導因子は生育培地または
細胞から単離することができる。プラスミノーゲ
ンアクチベーターは細胞がその最大濃度に達した
後の熟成期の間に血清を含まない保存培地から収
穫することができる。インターフエロンは熟成線
維芽細胞中に誘発させることができ、その産生は
細胞−微粒子担体集塊中での高い細胞濃度によつ
て増強される。
本発明の範囲から逸脱することなく様々な実施
例および前記例の修飾が可能なことは当業者には
明白であろう。すべてのそのような例および修飾
は本発明の範囲内に包含されるべきものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の好ましい態様による細胞培養
系および装置を示す模式的ダイヤグラムであり、
第２図は本発明の方法に使用される細胞培養容器
および沈降チヤンバーを示す一部断面の側面図で
あり、そして第３図は本発明の方法に使用される
細胞培養容器（一部）および付属する沈降チヤン
バーの別の態様を示す一部断面の側面図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 微粒子担体および細胞を、主細胞培養反応器
    内にまたはそれと連結させてその反応器の攪拌領
    域の外部に設けた分離されたコンパートメント内
    に周期的に一時的に滞留させてそこでそれらに、
    前記主細胞培養反応器中と実質的に同一の環境条
    件を有する限定空間内で穏和な反転運動を与える
    ことによつて前記の微粒子担体および細胞を集塊
    化させることを特徴とする、攪拌微粒子担体懸濁
    培養における足場依存性細胞の増殖方法。 ２ 懸濁培養培地を圧力差で限定空間内の反転領
    域を通過させさらにサテライト容器へ潅流させる
    ことによつて微粒子担体および細胞を周期的に前
    記領域内に送つてそこで沈降させる事を特徴とす
    る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 細胞培養培地をサテライト容器から主細胞培
    養反応器に再循環させることを特徴とする、特許
    請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 微粒子担体および細胞を主細胞培養反応器に
    続いている狭窄開口部を頂部に有する逆円錐形状
    の沈降チヤンバー内に周期的に給送してそこで沈
    降させることを特徴とする、特許請求の範囲第１
    項記載の方法。 ５ 懸濁培養培地を圧力差で沈降チヤンバーを通
    過させてさらにサテライト容器中へ潅流させるこ
    とにより、微粒子担体および細胞を前記沈降チヤ
    ンバーに周期的に送りこみ、そこで沈降させるこ
    とを特徴とする、特許請求の範囲第４項記載の方
    法。 ６ 細胞培養培地をサテライト容器から主細胞培
    養反応器に再循環させることを特徴とする、特許
    請求の範囲第５項記載の方法。 ７ 細胞がヒト二倍体包皮線維芽細胞であること
    を特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の方
    法。 ８ 細胞をインターフエロン産生のために処理す
    ることを特徴とする、特許請求の範囲第７項記載
    の方法。 ９ 細胞をプラスミノーゲンアクチベーター産生
    のために処理することを特徴とする、特許請求の
    範囲第７項記載の方法。 １０ 細胞を脈管形成誘導因子産生のために処理
    することを特徴とする、特許請求の範囲第７項記
    載の方法。
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