JPH0255035B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒト染色体由来のヒトインターフエロ
ン―β遺伝子〔インターフエロンβの遺伝子の全
転写領域に対応するDNA（デオキシリボ核酸）〕、
該遺伝子および該遺伝子の転写の調節に関与する
DNAを含むDNA、ならびに該DNAとベクター
DNAとの組換え体DNAに関する。 本発明者らは、組換えDNA技術を用い、プラ
スミドDNA（たとえば大腸菌由来のプラスミド
DNA）あるいはフアージDNA（たとえば大腸菌
由来のλフアージDNA）にヒトインターフエロ
ン遺伝子を挿入した組換え体DNAによるインタ
ーフエロンの大量増殖を目的に研究を行つた。そ
の結果、細菌たとえば大腸菌内で増殖、増幅さ
せ、最終的にはヒトインターフエロン―βを細菌
たとえば大腸菌に生産させるのに利用することが
でき、さらに真核細胞内たとえばマウス細胞の染
色体遺伝子中に組込み、あるいはウイルスに組み
込んで真核細胞内に取り込ませ、真核細胞たとえ
ばマウス細胞にヒトインターフエロン―βと全く
同一の化学構造を有する物質を生産させるのに利
用することのできる新規な組換え体DNAを見出
し、本発明を完成するに至つた。 該組換え体DNAはヒトインターフエロン―β
の染色体内遺伝子の少なくとも全転写領域、さら
に転写の調節に関与していると考えられる領域を
も含んだ部分を有する新規な組換え体DNAであ
り、本発明者らによつて始めて見出されたもので
ある。 本発明者らは先にヒトインターフエロン―βの
cDNAをmRNAを鋳型として取り出した〔Gene
10、11〜15、（1980）〕が、本発明ではヒトの染色
体遺伝子から直接ヒトインターフエロン―β遺伝
子ならびに該遺伝子とその転写調節に関与する
DNAとを含んだDNAを取り出すことに成功した
ものである。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明はヒト染色体由来のヒトインターフエロ
ン―β遺伝子、該遺伝子および該遺伝子の転写の
調節に関与するDNAを含むDNA、ならびに該
DNAとベクターDNAとの組換え体DNAに関す
る。 本発明の組換え体DNAは、概略次のようにし
て製造できる。 ヒト染色体全DNA、例えばヒト胎児肝臓から
抽出した洗色体DNAを、制限酵素を用いて適当
な長さに分断する。それをそのままもしくは適当
な長さの部分のみを取出して電気泳動法などによ
り濃縮する。これを組換えDNA技術によつてベ
クターDNAに挿入することによつて組換えDNA
を得る。この組換えDNAの中からヒトインター
フエロン―βメツセンジヤーRNAに相補性を示
すDNA（ヒトインターフエロン―βのcDNA）を
持つ組換え体DNAを放射性同位元素で標識した
ものを採針として、ヒトインターフエロン―βの
染色体遺伝子を含む本発明の新規組換え体DNA
を探索、採取することができる。 該組換え体DNAの製法についてさらに具体的
に説明する。 ヒト染色体全DNAを、ヒト胎児肝臓などから
フエノールなどで抽出する。この抽出DNAを制
限酵素、例えばHaeとAluなどで部分消化す
ることにより適当な長さに分断する。 こうして得られるヒト染色体全DNAの断片を
EcoRIリンカーなどを介してバクテリオフアージ
T4リガーゼなどを用いて大腸菌フアージλなど
のDNAに挿入し、組換え体DNAを作る。 これをさらにパツケージング法により、より感
染性の高いλフアージ粒子にする。このようにし
て得たヒト全遺伝子を含む組換え体の集合は、ヒ
ト遺伝子ライブラリーとよばれる。 ヒト遺伝子ライブラリーは、その構築の原理上
ほとんど総てのヒト遺伝子DNAを含んでおり、
ほとんど総ての遺伝子をそこから単離してくるこ
とができる。 ヒトインターフエロン―βの染色体内遺伝子の
場合には、後述するように、既に遺伝子周辺の制
限酵素による切断地図が明らかになつており、上
述のヒト全遺伝子ライブラリーを出発点とする代
りに、次のようなヒトインターフエロン―β遺伝
子について、より濃縮された組換え体の集合を出
発点としてもよい。 すなわちヒト染色体全DNAを制限酵素Hind
などで完全に消化し、約10キロベース（以下Kb
と略記する）程度のDNAをアガロース中の電気
泳動法などによつて分画し、これを上述のように
λフアージなどに組込むことによつて、Hind
切断個所を両端に持つ約10KbのDNAのライブラ
リーを得ることができる。ヒトインターフエロン
―βの染色体内遺伝子はHindによつて生じる
約10KbのDNA中に含まれている。この場合、全
遺伝子ライブラリーに比べ、約10倍程度は濃縮さ
れると考えられる。 上記ベクターとして用いたλフアージは
Charon系のフアージ、プラスミド例えば
pBR322、pCR1、pMB9、pSC1などに代えるこ
ともできる。 かくして得られたヒト遺伝子ライブラリーから
次のようにしてヒトインターフエロン―β遺伝子
を含むDNA断片を持つた組換え体DNAを探し出
すことができる。 ヒトインターフエロン―βメツセンジヤー
RNAに相補的に構造（cDNA）をもつた組換え
体プラスミドを大腸菌x1776／TpIF319−
13ATCC31712からCurrierとNesterの方法
〔Analyt.Biochem.Vol.76，431−441（1976）〕に
よつて取出す。これをニツクトランスレーシヨン
法〔Roopら、Cell15、671〜685（1978）〕に従つ
て〔 32P〕で標識し、これを探針とする。 一方、大腸菌フアージをペクターとして用いた
上述の遺伝子ライブラリーを寒天平板上に展開
し、各々のクローンに対応するフアージプラーク
中のDNAをBentonとDavisの方法〔Science、
196、180−182（1977）〕に従つてフイルター上に
固定する。 このフイルターに対して上記探針を用いてハイ
ブリダイゼーシヨンを行い、ラジオオートグラフ
イーにより、ヒトインターフエロン―βメツセン
ジヤーRNAに相補的な構造をもつた組換え体に
会合するDNAを持つたフアージのクローンを判
別する。 かくして得たフアージを増巾し、DNAを抽出
する。該DNAをEcoRなどのの制限酵素で消化
し、アガロースゲル電気泳動で分画する。得られ
る画分をSouthernの方法〔J.Mol.Biol.98、503−
517（1975）〕でフイルターに固定する。上記の採
針を用いてハイブリダイゼーシヨンを行い、いわ
ゆるSouthernブロツテイング分析（同上文献）
する。このようにしてcDNAにハイブリダイズす
る、例えば1.8KbのEcoR断片をもつフアージ
クローンを得る。 このフアージクローンから、例えばSmithと
Birnstielらの方法〔Nucleic Acids Res.３、
2387−2398（1976）〕により、より詳細な制限酵素
地図を作成する。 さらに、例えばMaxamとGilbertらの方法
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA74、560−564、
（1977）〕によりDNAの塩基配列を決定する。こ
のDNAの塩基配列をヒトインターフエロン
cDNA〔Gene 10、11−15（1980）〕の塩基配列と
比較すると、得られたクローンがヒトインターフ
エロン―βメツセンジヤーRNAに対応する染色
体内遺伝子、すなわちヒトインターフエロン―β
の染色体内遺伝子を含むことが同定できる。 このヒトインターフエロン―β遺伝子ならびに
該遺伝子とそれの転写の調節に関与するDNAを
含むDNAは上記で得られた組換え体DNAの中か
らBentonとDavisの方法〔Science、196、180−
182（1977）〕やGrunstein−Hognessの方法
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA72、3961−3965
（1975）〕に従つて採取する。 実施例 １ ヒト遺伝子ライブラリーはTom Maniatis
（California Institute of Technology）から供
与を受けたが、これは次のようにして作られたも
のである。 ヒト胎児肝臓から染色体全DNAをフエノール
などで抽出し、制限酵素HaeとAluで部分消
化する。こうして得られたDNA断片の中から鎖
長が18−25Kb程度のフラグメントをシヨ糖密度
勾配遠心法により濃縮し、次に制限酵素EcoR
の切断箇所を持つ短鎖合成ヌクレオチドを介して
大腸菌フアージλCharon4AのアームDNAに接続
し、感染性のあるフアージDNA組換え体を作成
する。次に、さらに感染性を高める目的でパツケ
ージング法により完全なフアージλ粒子にしてあ
る。このようにして作られたヒト遺伝子ライブラ
リーは原理的にはほとんどすべてのヒト遺伝子を
含む鎖長18−25KbのヒトDNAを含んだ組換え体
の集合であると考えられる。 ヒト遺伝子ライブラリーからヒトインターフエ
ロン―βの遺伝子を含むDNA断片を持つ組換え
体フアージはヒトインターフエロン―βのcDNA
の蛋白に翻訳される部分すべてを持つcDNA断片
を〔 32P〕で放射標識したものを採針として
BentonとDavisの方法〔Science196、180−182
（1977）〕により探索した。以下にその詳細を述べ
る。 先ず、探針として用いるヒトインターフエロン
―βのcDNAの蛋白に翻訳される部分すべてを持
つ約0.57KbのDNA断片は次の様にして調製し、
放射標識した。 ヒトインターフエロン―βのcDNAを含む組換
え体プラスミドTpIF319−13を持つ大腸菌
x1776／TpIF319−13ATCC31712からCurrierと
Nesterらの方法〔Analyt.Biochem.76、431−441
（1976）〕によつてTpIF319−13プラスミドDNA
を精製し、制限酵素Hinc、Bgl、Hhaで消
化する。得られた消化物中、最も鎖長の長い
0.57KbのDNA断片が目的とするDNA断片であ
るが、これをTabakとFlavellの方法〔Nucleic
Acids Research ５、2321−2332（1978）〕によ
りアガロース電気泳動法で他の断片と分離し精製
する。これをニツクトランスレーシヨン法〔たと
えばRoopら、Cell15、671−685（1978）〕により
〔 32P〕で放射標識する。すなわちDNA（0.5μg）
を50mM Tris−HCl（PH7.8）、5mM MgCl2、
10mMβ―メルカプトエタノール、5μM dGTP、
150μMdTP、1ng DN ase（Worthington社
製）、〔 32P〕―α―dCTP（100μCi、2000−
3000Ci／mmol、RCC Amersham社製）、15unit
DNA polymerase（Boeringer Manheim社
製）を含む30μlの水溶液中で15℃、４時間インキ
ユペートした。ついでEDTAを添加し終濃度
20mMとし、65℃、10分間インキユペートし酵素
を失活させる。次にフエノールで除蛋白した後、
Sephadex Ｇ−50（Pharmacia Fine Chemical社
製）カラムクロマトグラフイーで脱塩し、探針に
供する。このようにして得られた〔 32P〕で放射
標識されたcDNA断片は108cpm／μg程度の放射
活性を持つ。 以上述べた方法により、ヒトインターフエロン
―βcDNAの断片を放射標識して調製したDNA断
片を探針としてヒト遺伝子ライブラリーからヒト
インターフエロン遺伝子を含むDNA断片を持つ
組換え体フアージを次のようにして探索する。 まず、寒天プレート〔Science 202、1279−
1284（1978）〕上に先のフアージλ粒子をまきフア
ージプラークを形成させる。このプラークの密度
は直径15cmのプレート１枚あたり１万〜３万個程
度にする。次にこの寒天プレート上にニトロセル
ロース紙（SchleicherとSchu¨ll社販売）を重層
し、方向づけのためにマークをつけ、４℃で約20
分間放置し、フアージを吸着させる。プレートは
４℃に保存しておき、ニトロセルロース紙を室温
で約90分間風乾する。これを0.1N NaOH、1.5M
NaClの水溶液中に約20秒間浸し、フアージDNA
を変性させる。次に0.2M Tris−HCl（PH7.4）、２
×SSC（SSCとは0.15M NaCl、0.015Mクエン酸
ソーダを含む水溶液を言う。２×SSCとはその２
倍の濃度のものを言う。）中で約20秒間中和し、
さらに２×SSC中で20秒間処理する。室温で１時
間風乾後、80℃で３時間風乾し、変性したフアー
ジDNAをニトロセルロース紙上に固定する。 このようにして作成したニトロセルロース紙上
のフアージDNAに対し、先に述べたようにして
放射標識されたヒトインターフエロン―βcDNA
を探針としてハイブリダイゼーシヨンを次のよう
に行つた。 ニトロセルロース紙を３×SSC中で65℃、30分
間処理し、３×SSCに0.2％ポリビニルピロリド
ン（半井化学社製）、0.2％ウシ血清アルブミン
（岩井化学社製）、0.2％フイコール（Pharmacia
Fine Chemical社製）を加えた溶液中で65℃、60
分間処理する。さらに1M NaCl、50mM Tris−
HCl（PH8.0）、10mM EDTA、0.1％SDS、
100μg／mlの超音波処理し、熱変性した大腸菌
DNAを含む溶液（ハイプリダイゼーシヨン溶液）
中で65℃、60分間の処理をすることによりハイブ
リゼーシヨンのための前処理とする。 一方、放射標識された探針のDNAを95℃、10
分間の処理をすることにより熱変性させておく。
次に、前処理したニトロセルロース紙と、この熱
変性した探針のDNAとを上記ハイブリダイゼー
シヨン溶液中、65℃でインキユベートし、ハイブ
リダイゼーシヨンを行う。12−18時間後、ニトロ
セルロース紙を取り出し、まず２×SSCで２回洗
い、0.3×SSC、0.1％SDSを含む溶液中で65℃、
60分間の処理を２回行い、最後に80℃で１時間風
乾させ、Ｘ線フイルムを用いてラジオオートグラ
フイーを行う。 ４℃に保存しておいた寒天板と、ラジオオート
グラムとを重ねあわせることにより探針と会合し
た部分のフアージをかき取り、さらに上記の操作
を繰返し行うことにより、インターフエロン―
βcDNAに会合するDNAを持つ組換え体フアージ
を単一クローンにまで精製する。 このようにして、約100万個のフアージプラー
クをスクリーニングすることにより11個のクロー
ンを得た。 次に各クローンの組換え体DNAをManiatisの
方法〔Cell、15、687−701（1978）〕により調製
し、以下の解析に用いた。 まず、各クローンの組換え体DNAを制限酵素
EcoRで切断し、アガロースゲル電気泳動によ
り生じたDNA断片の鎖長を測定する。すべての
クローンのDNAの消化物はベクターであるフア
ージλCharon4Aのアームに由来する20Kb、
11KbのDNA断片を持つが、それ以外にヒト染色
体内DNAに由来するいくつかのDNA断片を持
つ。この解析により11個のクローンは５種類に分
類された。さらに上述のスクリーニングのときに
用いたヒトインターフエロン―βcDNAを探針と
してサザンハイブリダイゼーシヨン〔Southern、
J.Mol.Biol、98、503−517（1975）〕を行なうこと
により、たとえばEcoR消化により得られたど
の長さのDNA断片がヒトインターフエロン
cDNAに会合するかということが同定された。 すなわち各フアージクローンのDNAをEcoR
で消化し、アガロースゲル電気泳動を行う。泳動
後ゲルを切り出し、0.5N NaOH、1M NaClを
含む水溶液中、室温で30分間処理することにより
DNAを変性する。さらに0.5N Tris−HCl（PH
7.0）、1.5M NaClを含む水溶液中で同様の処理を
２回くり返し行い、ゲルを中和する。ゲルを20×
SSCをしみ込ませた紙上に置き、ゲルの上にニ
トロセルロース紙を置き、さらにその上に紙、
紙タオルの順に重層し、ゲル中の変性したDNA
をニトロセルロース紙に吸着させる。12−18時間
後ニトロセルロース紙をゲルからはがし、80℃で
３時間風乾することにより、DNAをニトロセル
ロース紙上に固定する。以下は上述したフアージ
のスクリーニングに際して行つたと全く同様にし
てハイブリダイゼーシヨンを行なう。 このようにしてクローン化された５種類のヒト
染色体遺伝子断片のうち４種類が1.8KbのEcpＲ
によつて生ずるDNA断片（以下EcpＲ断片とい
う）を含み、この1.8KbのEcpＲ断片がヒトイン
ターフエロンcDNAと相補的な構造を持つている
ことが明らかになつた。他の１種類のクローンに
ついては、この1.8KbのEcpＲ断片の途中から始
まるDNA断片を含んでいることが明らかになつ
た。 11個のクローンのうち1.8KbのEcpＲ断片を生
ずるものの１つであるλHIFN―β1―121と名づけ
られたクローンについては、さらにHind、
BamHI、Bgl、Pstなどの制限酵素を用いて
同様の実験を行うことにより、制限酵素による切
断地図を作成した。これを第１図ａに示す。 次にヒトインターフエロン―βcDNAに相補性
を示す1.8KbのEcpＲ断片について詳細に検討を
加える目的で、この1.8KbのEcpＲ断片をプラス
ミドpBR322をベクターとして再びクローン化し
た。この方法を以下に示す。λHIFN―β1―
121DNA1μgを制限酵素EcpＲで消化した後、
0.1Mリン酸カリウム緩衝液（PH6.9）、6mM
MgCl2、6mMメルカプトエタノール、
1mMATP、1mMTTPを含む30μlの水溶液中で
５ユニツトのDNAポリメラーゼクレノーフラグ
メント（Boehringer Mannheim社製）を用い
て、EcpＲ切断箇所を修復する。フエノールで
除蛋白した後、ターミナルトランスフエラーゼを
30μlの反応液〔DNA1μg：カコジル酸カリ（PH
7.6）0.14M；トリス0.03M；ジチオスレイトール
0.1mM；CaCl2 1mM；dCTP1mM；２ユニツト
のターミナルトランスフエラーゼ〕中で37℃、15
分間反応させ、各EcpＲ断片の3′両端に約100個
のデオキシシチジン鎖を延長させる。一方
pBR322をPstで切断し、同様にしてPst切断
箇所の3′両端に約100個のデオキシグアニン鎖を
延長して作つたペクターを準備しておく。このよ
うにして得られたヒト染色体遺伝子DNAのEcpＲ
切断片0.05μgとpBR322DNA0.05μgとを0.1M
NaCl、50mM Tris−HCl（PH7.5）、5mM EDTA
よりなる溶液中で65℃、２分間、45℃、１時間、
37℃、１時間、室温、１時間インキユペートして
会合させる。これにEneaらの方法〔J.Mol.Biol.
96、495−509（1975）〕に従つて大腸菌x1776を形
質転換させる。得られたテトラサイクリン耐性株
の中から、400個の耐性株を選び各々のDNAをニ
トロセルロース紙上に固定する〔Grunstein
Hogness法、Proc.Natl.Acad.Sci.USA72、3961
−3965（1975）〕。このニトロセルロース紙上で上
記フアージのスクリーニングあるいはサザンハイ
ブリダイゼーシヨンのときに行なつたのと同様の
方法（ハイブリダイゼーシヨン溶液中に熱アルカ
リ処理して断片化し、さらに熱変性した
pBR322DNAを30μg／mlの濃度で加えた。）で、
同じ探針（インターフエロン―β cDNA）を用
いてハイブリダイゼーシヨンを行い、1.8KbのEcp
Ｒ断片を持つ組換え体プラスミドをもつ大腸菌
株を同定した。 このようにして得た大腸菌からヒトインターフ
エロン―β cDNAに会合する組換え体DNAを
含む1.8KbのEcpＲ片を持つ組換え体プラスミド
DNAを前記CurrierとNesterの方法で調製し、以
下の解析に供した。 このヒト染色体DNAに由来する1.8KbのEcpＲ
断片がヒトインターフエロン―βのメツセンジ
ヤーRNAに相補的なDNAを含んでいることは、
以上で明らかであるが、そのことをさらにはつき
りさせる目的で、制限酵素による切断地図を、組
換え体プラスミドのDNAあるいはその一部を１
種類あるいは２種類以上の制限酵素で切断する方
法により、または3′末端をポリヌクレオキナーゼ
を用いて〔32P〕で標識した断片を制限酵素で部
分消化する方法〔SmithとBirnstiel、Nucleic
Acids Res.３、2387−2398（1976）〕により生じ
たDNA断片の鎖長をアガロース電気泳動などに
より測定することにより作成した。（第１図ｂ，
ｄ）第１図ｃにインターフエロン―βcDNAの対
応する部分を示したが（白枠は蛋白コーデイング
領域を示す）、cDNAと全く同一の制限酵素切断
断地図を示す部分があることが発見された。 以上の事実から、ここで得られたヒト染色体
DNA由来の1.8Kb EcpＲ DNA断片上に、ヒ
トインターフエロン―βメツセンジヤーRNA（す
なわちcDNA）と全く同一の配列のあること、す
なわちこの1.8Kb EcpＲ DNA断片がヒトイン
ターフエロン―βの染色体内遺伝子（第１図ｂの
黒い帯）を含んでいることが明らかになつた。 さらに他の多くの真核細胞の遺伝子中に存在す
るインタービーニングシークエンス（介在配列）
がヒトインターフエロン―βの遺伝子に関して存
在しないことが明らかになつた。得られた1.8Kb
EcpＲ断片中に含まれているインターフエロン
―β遺伝子が介在配列を持つていないということ
は、この遺伝子DNAを用いて、介在配列を切り
出すメカニズムのない、例えば大腸菌などの原核
生物にインターフエロン蛋白を合成させることが
可能であることを示している。 上記のことを決定的に証明する目的で、この
1.8Kb EcpＲ断片の塩基配列をMaxamと
Gilbertの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA74、
560−564（1977）〕により決定した。その結果を第
２図に示す。 この1.8KbEcoR断片は大腸菌に挿入し、米
国アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨ
ンにEscherichia coli CI4 ATCC31905として寄
宅されている。
ン―β遺伝子〔インターフエロンβの遺伝子の全
転写領域に対応するDNA（デオキシリボ核酸）〕、
該遺伝子および該遺伝子の転写の調節に関与する
DNAを含むDNA、ならびに該DNAとベクター
DNAとの組換え体DNAに関する。 本発明者らは、組換えDNA技術を用い、プラ
スミドDNA（たとえば大腸菌由来のプラスミド
DNA）あるいはフアージDNA（たとえば大腸菌
由来のλフアージDNA）にヒトインターフエロ
ン遺伝子を挿入した組換え体DNAによるインタ
ーフエロンの大量増殖を目的に研究を行つた。そ
の結果、細菌たとえば大腸菌内で増殖、増幅さ
せ、最終的にはヒトインターフエロン―βを細菌
たとえば大腸菌に生産させるのに利用することが
でき、さらに真核細胞内たとえばマウス細胞の染
色体遺伝子中に組込み、あるいはウイルスに組み
込んで真核細胞内に取り込ませ、真核細胞たとえ
ばマウス細胞にヒトインターフエロン―βと全く
同一の化学構造を有する物質を生産させるのに利
用することのできる新規な組換え体DNAを見出
し、本発明を完成するに至つた。 該組換え体DNAはヒトインターフエロン―β
の染色体内遺伝子の少なくとも全転写領域、さら
に転写の調節に関与していると考えられる領域を
も含んだ部分を有する新規な組換え体DNAであ
り、本発明者らによつて始めて見出されたもので
ある。 本発明者らは先にヒトインターフエロン―βの
cDNAをmRNAを鋳型として取り出した〔Gene
10、11〜15、（1980）〕が、本発明ではヒトの染色
体遺伝子から直接ヒトインターフエロン―β遺伝
子ならびに該遺伝子とその転写調節に関与する
DNAとを含んだDNAを取り出すことに成功した
ものである。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明はヒト染色体由来のヒトインターフエロ
ン―β遺伝子、該遺伝子および該遺伝子の転写の
調節に関与するDNAを含むDNA、ならびに該
DNAとベクターDNAとの組換え体DNAに関す
る。 本発明の組換え体DNAは、概略次のようにし
て製造できる。 ヒト染色体全DNA、例えばヒト胎児肝臓から
抽出した洗色体DNAを、制限酵素を用いて適当
な長さに分断する。それをそのままもしくは適当
な長さの部分のみを取出して電気泳動法などによ
り濃縮する。これを組換えDNA技術によつてベ
クターDNAに挿入することによつて組換えDNA
を得る。この組換えDNAの中からヒトインター
フエロン―βメツセンジヤーRNAに相補性を示
すDNA（ヒトインターフエロン―βのcDNA）を
持つ組換え体DNAを放射性同位元素で標識した
ものを採針として、ヒトインターフエロン―βの
染色体遺伝子を含む本発明の新規組換え体DNA
を探索、採取することができる。 該組換え体DNAの製法についてさらに具体的
に説明する。 ヒト染色体全DNAを、ヒト胎児肝臓などから
フエノールなどで抽出する。この抽出DNAを制
限酵素、例えばHaeとAluなどで部分消化す
ることにより適当な長さに分断する。 こうして得られるヒト染色体全DNAの断片を
EcoRIリンカーなどを介してバクテリオフアージ
T4リガーゼなどを用いて大腸菌フアージλなど
のDNAに挿入し、組換え体DNAを作る。 これをさらにパツケージング法により、より感
染性の高いλフアージ粒子にする。このようにし
て得たヒト全遺伝子を含む組換え体の集合は、ヒ
ト遺伝子ライブラリーとよばれる。 ヒト遺伝子ライブラリーは、その構築の原理上
ほとんど総てのヒト遺伝子DNAを含んでおり、
ほとんど総ての遺伝子をそこから単離してくるこ
とができる。 ヒトインターフエロン―βの染色体内遺伝子の
場合には、後述するように、既に遺伝子周辺の制
限酵素による切断地図が明らかになつており、上
述のヒト全遺伝子ライブラリーを出発点とする代
りに、次のようなヒトインターフエロン―β遺伝
子について、より濃縮された組換え体の集合を出
発点としてもよい。 すなわちヒト染色体全DNAを制限酵素Hind
などで完全に消化し、約10キロベース（以下Kb
と略記する）程度のDNAをアガロース中の電気
泳動法などによつて分画し、これを上述のように
λフアージなどに組込むことによつて、Hind
切断個所を両端に持つ約10KbのDNAのライブラ
リーを得ることができる。ヒトインターフエロン
―βの染色体内遺伝子はHindによつて生じる
約10KbのDNA中に含まれている。この場合、全
遺伝子ライブラリーに比べ、約10倍程度は濃縮さ
れると考えられる。 上記ベクターとして用いたλフアージは
Charon系のフアージ、プラスミド例えば
pBR322、pCR1、pMB9、pSC1などに代えるこ
ともできる。 かくして得られたヒト遺伝子ライブラリーから
次のようにしてヒトインターフエロン―β遺伝子
を含むDNA断片を持つた組換え体DNAを探し出
すことができる。 ヒトインターフエロン―βメツセンジヤー
RNAに相補的に構造（cDNA）をもつた組換え
体プラスミドを大腸菌x1776／TpIF319−
13ATCC31712からCurrierとNesterの方法
〔Analyt.Biochem.Vol.76，431−441（1976）〕に
よつて取出す。これをニツクトランスレーシヨン
法〔Roopら、Cell15、671〜685（1978）〕に従つ
て〔 32P〕で標識し、これを探針とする。 一方、大腸菌フアージをペクターとして用いた
上述の遺伝子ライブラリーを寒天平板上に展開
し、各々のクローンに対応するフアージプラーク
中のDNAをBentonとDavisの方法〔Science、
196、180−182（1977）〕に従つてフイルター上に
固定する。 このフイルターに対して上記探針を用いてハイ
ブリダイゼーシヨンを行い、ラジオオートグラフ
イーにより、ヒトインターフエロン―βメツセン
ジヤーRNAに相補的な構造をもつた組換え体に
会合するDNAを持つたフアージのクローンを判
別する。 かくして得たフアージを増巾し、DNAを抽出
する。該DNAをEcoRなどのの制限酵素で消化
し、アガロースゲル電気泳動で分画する。得られ
る画分をSouthernの方法〔J.Mol.Biol.98、503−
517（1975）〕でフイルターに固定する。上記の採
針を用いてハイブリダイゼーシヨンを行い、いわ
ゆるSouthernブロツテイング分析（同上文献）
する。このようにしてcDNAにハイブリダイズす
る、例えば1.8KbのEcoR断片をもつフアージ
クローンを得る。 このフアージクローンから、例えばSmithと
Birnstielらの方法〔Nucleic Acids Res.３、
2387−2398（1976）〕により、より詳細な制限酵素
地図を作成する。 さらに、例えばMaxamとGilbertらの方法
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA74、560−564、
（1977）〕によりDNAの塩基配列を決定する。こ
のDNAの塩基配列をヒトインターフエロン
cDNA〔Gene 10、11−15（1980）〕の塩基配列と
比較すると、得られたクローンがヒトインターフ
エロン―βメツセンジヤーRNAに対応する染色
体内遺伝子、すなわちヒトインターフエロン―β
の染色体内遺伝子を含むことが同定できる。 このヒトインターフエロン―β遺伝子ならびに
該遺伝子とそれの転写の調節に関与するDNAを
含むDNAは上記で得られた組換え体DNAの中か
らBentonとDavisの方法〔Science、196、180−
182（1977）〕やGrunstein−Hognessの方法
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA72、3961−3965
（1975）〕に従つて採取する。 実施例 １ ヒト遺伝子ライブラリーはTom Maniatis
（California Institute of Technology）から供
与を受けたが、これは次のようにして作られたも
のである。 ヒト胎児肝臓から染色体全DNAをフエノール
などで抽出し、制限酵素HaeとAluで部分消
化する。こうして得られたDNA断片の中から鎖
長が18−25Kb程度のフラグメントをシヨ糖密度
勾配遠心法により濃縮し、次に制限酵素EcoR
の切断箇所を持つ短鎖合成ヌクレオチドを介して
大腸菌フアージλCharon4AのアームDNAに接続
し、感染性のあるフアージDNA組換え体を作成
する。次に、さらに感染性を高める目的でパツケ
ージング法により完全なフアージλ粒子にしてあ
る。このようにして作られたヒト遺伝子ライブラ
リーは原理的にはほとんどすべてのヒト遺伝子を
含む鎖長18−25KbのヒトDNAを含んだ組換え体
の集合であると考えられる。 ヒト遺伝子ライブラリーからヒトインターフエ
ロン―βの遺伝子を含むDNA断片を持つ組換え
体フアージはヒトインターフエロン―βのcDNA
の蛋白に翻訳される部分すべてを持つcDNA断片
を〔 32P〕で放射標識したものを採針として
BentonとDavisの方法〔Science196、180−182
（1977）〕により探索した。以下にその詳細を述べ
る。 先ず、探針として用いるヒトインターフエロン
―βのcDNAの蛋白に翻訳される部分すべてを持
つ約0.57KbのDNA断片は次の様にして調製し、
放射標識した。 ヒトインターフエロン―βのcDNAを含む組換
え体プラスミドTpIF319−13を持つ大腸菌
x1776／TpIF319−13ATCC31712からCurrierと
Nesterらの方法〔Analyt.Biochem.76、431−441
（1976）〕によつてTpIF319−13プラスミドDNA
を精製し、制限酵素Hinc、Bgl、Hhaで消
化する。得られた消化物中、最も鎖長の長い
0.57KbのDNA断片が目的とするDNA断片であ
るが、これをTabakとFlavellの方法〔Nucleic
Acids Research ５、2321−2332（1978）〕によ
りアガロース電気泳動法で他の断片と分離し精製
する。これをニツクトランスレーシヨン法〔たと
えばRoopら、Cell15、671−685（1978）〕により
〔 32P〕で放射標識する。すなわちDNA（0.5μg）
を50mM Tris−HCl（PH7.8）、5mM MgCl2、
10mMβ―メルカプトエタノール、5μM dGTP、
150μMdTP、1ng DN ase（Worthington社
製）、〔 32P〕―α―dCTP（100μCi、2000−
3000Ci／mmol、RCC Amersham社製）、15unit
DNA polymerase（Boeringer Manheim社
製）を含む30μlの水溶液中で15℃、４時間インキ
ユペートした。ついでEDTAを添加し終濃度
20mMとし、65℃、10分間インキユペートし酵素
を失活させる。次にフエノールで除蛋白した後、
Sephadex Ｇ−50（Pharmacia Fine Chemical社
製）カラムクロマトグラフイーで脱塩し、探針に
供する。このようにして得られた〔 32P〕で放射
標識されたcDNA断片は108cpm／μg程度の放射
活性を持つ。 以上述べた方法により、ヒトインターフエロン
―βcDNAの断片を放射標識して調製したDNA断
片を探針としてヒト遺伝子ライブラリーからヒト
インターフエロン遺伝子を含むDNA断片を持つ
組換え体フアージを次のようにして探索する。 まず、寒天プレート〔Science 202、1279−
1284（1978）〕上に先のフアージλ粒子をまきフア
ージプラークを形成させる。このプラークの密度
は直径15cmのプレート１枚あたり１万〜３万個程
度にする。次にこの寒天プレート上にニトロセル
ロース紙（SchleicherとSchu¨ll社販売）を重層
し、方向づけのためにマークをつけ、４℃で約20
分間放置し、フアージを吸着させる。プレートは
４℃に保存しておき、ニトロセルロース紙を室温
で約90分間風乾する。これを0.1N NaOH、1.5M
NaClの水溶液中に約20秒間浸し、フアージDNA
を変性させる。次に0.2M Tris−HCl（PH7.4）、２
×SSC（SSCとは0.15M NaCl、0.015Mクエン酸
ソーダを含む水溶液を言う。２×SSCとはその２
倍の濃度のものを言う。）中で約20秒間中和し、
さらに２×SSC中で20秒間処理する。室温で１時
間風乾後、80℃で３時間風乾し、変性したフアー
ジDNAをニトロセルロース紙上に固定する。 このようにして作成したニトロセルロース紙上
のフアージDNAに対し、先に述べたようにして
放射標識されたヒトインターフエロン―βcDNA
を探針としてハイブリダイゼーシヨンを次のよう
に行つた。 ニトロセルロース紙を３×SSC中で65℃、30分
間処理し、３×SSCに0.2％ポリビニルピロリド
ン（半井化学社製）、0.2％ウシ血清アルブミン
（岩井化学社製）、0.2％フイコール（Pharmacia
Fine Chemical社製）を加えた溶液中で65℃、60
分間処理する。さらに1M NaCl、50mM Tris−
HCl（PH8.0）、10mM EDTA、0.1％SDS、
100μg／mlの超音波処理し、熱変性した大腸菌
DNAを含む溶液（ハイプリダイゼーシヨン溶液）
中で65℃、60分間の処理をすることによりハイブ
リゼーシヨンのための前処理とする。 一方、放射標識された探針のDNAを95℃、10
分間の処理をすることにより熱変性させておく。
次に、前処理したニトロセルロース紙と、この熱
変性した探針のDNAとを上記ハイブリダイゼー
シヨン溶液中、65℃でインキユベートし、ハイブ
リダイゼーシヨンを行う。12−18時間後、ニトロ
セルロース紙を取り出し、まず２×SSCで２回洗
い、0.3×SSC、0.1％SDSを含む溶液中で65℃、
60分間の処理を２回行い、最後に80℃で１時間風
乾させ、Ｘ線フイルムを用いてラジオオートグラ
フイーを行う。 ４℃に保存しておいた寒天板と、ラジオオート
グラムとを重ねあわせることにより探針と会合し
た部分のフアージをかき取り、さらに上記の操作
を繰返し行うことにより、インターフエロン―
βcDNAに会合するDNAを持つ組換え体フアージ
を単一クローンにまで精製する。 このようにして、約100万個のフアージプラー
クをスクリーニングすることにより11個のクロー
ンを得た。 次に各クローンの組換え体DNAをManiatisの
方法〔Cell、15、687−701（1978）〕により調製
し、以下の解析に用いた。 まず、各クローンの組換え体DNAを制限酵素
EcoRで切断し、アガロースゲル電気泳動によ
り生じたDNA断片の鎖長を測定する。すべての
クローンのDNAの消化物はベクターであるフア
ージλCharon4Aのアームに由来する20Kb、
11KbのDNA断片を持つが、それ以外にヒト染色
体内DNAに由来するいくつかのDNA断片を持
つ。この解析により11個のクローンは５種類に分
類された。さらに上述のスクリーニングのときに
用いたヒトインターフエロン―βcDNAを探針と
してサザンハイブリダイゼーシヨン〔Southern、
J.Mol.Biol、98、503−517（1975）〕を行なうこと
により、たとえばEcoR消化により得られたど
の長さのDNA断片がヒトインターフエロン
cDNAに会合するかということが同定された。 すなわち各フアージクローンのDNAをEcoR
で消化し、アガロースゲル電気泳動を行う。泳動
後ゲルを切り出し、0.5N NaOH、1M NaClを
含む水溶液中、室温で30分間処理することにより
DNAを変性する。さらに0.5N Tris−HCl（PH
7.0）、1.5M NaClを含む水溶液中で同様の処理を
２回くり返し行い、ゲルを中和する。ゲルを20×
SSCをしみ込ませた紙上に置き、ゲルの上にニ
トロセルロース紙を置き、さらにその上に紙、
紙タオルの順に重層し、ゲル中の変性したDNA
をニトロセルロース紙に吸着させる。12−18時間
後ニトロセルロース紙をゲルからはがし、80℃で
３時間風乾することにより、DNAをニトロセル
ロース紙上に固定する。以下は上述したフアージ
のスクリーニングに際して行つたと全く同様にし
てハイブリダイゼーシヨンを行なう。 このようにしてクローン化された５種類のヒト
染色体遺伝子断片のうち４種類が1.8KbのEcpＲ
によつて生ずるDNA断片（以下EcpＲ断片とい
う）を含み、この1.8KbのEcpＲ断片がヒトイン
ターフエロンcDNAと相補的な構造を持つている
ことが明らかになつた。他の１種類のクローンに
ついては、この1.8KbのEcpＲ断片の途中から始
まるDNA断片を含んでいることが明らかになつ
た。 11個のクローンのうち1.8KbのEcpＲ断片を生
ずるものの１つであるλHIFN―β1―121と名づけ
られたクローンについては、さらにHind、
BamHI、Bgl、Pstなどの制限酵素を用いて
同様の実験を行うことにより、制限酵素による切
断地図を作成した。これを第１図ａに示す。 次にヒトインターフエロン―βcDNAに相補性
を示す1.8KbのEcpＲ断片について詳細に検討を
加える目的で、この1.8KbのEcpＲ断片をプラス
ミドpBR322をベクターとして再びクローン化し
た。この方法を以下に示す。λHIFN―β1―
121DNA1μgを制限酵素EcpＲで消化した後、
0.1Mリン酸カリウム緩衝液（PH6.9）、6mM
MgCl2、6mMメルカプトエタノール、
1mMATP、1mMTTPを含む30μlの水溶液中で
５ユニツトのDNAポリメラーゼクレノーフラグ
メント（Boehringer Mannheim社製）を用い
て、EcpＲ切断箇所を修復する。フエノールで
除蛋白した後、ターミナルトランスフエラーゼを
30μlの反応液〔DNA1μg：カコジル酸カリ（PH
7.6）0.14M；トリス0.03M；ジチオスレイトール
0.1mM；CaCl2 1mM；dCTP1mM；２ユニツト
のターミナルトランスフエラーゼ〕中で37℃、15
分間反応させ、各EcpＲ断片の3′両端に約100個
のデオキシシチジン鎖を延長させる。一方
pBR322をPstで切断し、同様にしてPst切断
箇所の3′両端に約100個のデオキシグアニン鎖を
延長して作つたペクターを準備しておく。このよ
うにして得られたヒト染色体遺伝子DNAのEcpＲ
切断片0.05μgとpBR322DNA0.05μgとを0.1M
NaCl、50mM Tris−HCl（PH7.5）、5mM EDTA
よりなる溶液中で65℃、２分間、45℃、１時間、
37℃、１時間、室温、１時間インキユペートして
会合させる。これにEneaらの方法〔J.Mol.Biol.
96、495−509（1975）〕に従つて大腸菌x1776を形
質転換させる。得られたテトラサイクリン耐性株
の中から、400個の耐性株を選び各々のDNAをニ
トロセルロース紙上に固定する〔Grunstein
Hogness法、Proc.Natl.Acad.Sci.USA72、3961
−3965（1975）〕。このニトロセルロース紙上で上
記フアージのスクリーニングあるいはサザンハイ
ブリダイゼーシヨンのときに行なつたのと同様の
方法（ハイブリダイゼーシヨン溶液中に熱アルカ
リ処理して断片化し、さらに熱変性した
pBR322DNAを30μg／mlの濃度で加えた。）で、
同じ探針（インターフエロン―β cDNA）を用
いてハイブリダイゼーシヨンを行い、1.8KbのEcp
Ｒ断片を持つ組換え体プラスミドをもつ大腸菌
株を同定した。 このようにして得た大腸菌からヒトインターフ
エロン―β cDNAに会合する組換え体DNAを
含む1.8KbのEcpＲ片を持つ組換え体プラスミド
DNAを前記CurrierとNesterの方法で調製し、以
下の解析に供した。 このヒト染色体DNAに由来する1.8KbのEcpＲ
断片がヒトインターフエロン―βのメツセンジ
ヤーRNAに相補的なDNAを含んでいることは、
以上で明らかであるが、そのことをさらにはつき
りさせる目的で、制限酵素による切断地図を、組
換え体プラスミドのDNAあるいはその一部を１
種類あるいは２種類以上の制限酵素で切断する方
法により、または3′末端をポリヌクレオキナーゼ
を用いて〔32P〕で標識した断片を制限酵素で部
分消化する方法〔SmithとBirnstiel、Nucleic
Acids Res.３、2387−2398（1976）〕により生じ
たDNA断片の鎖長をアガロース電気泳動などに
より測定することにより作成した。（第１図ｂ，
ｄ）第１図ｃにインターフエロン―βcDNAの対
応する部分を示したが（白枠は蛋白コーデイング
領域を示す）、cDNAと全く同一の制限酵素切断
断地図を示す部分があることが発見された。 以上の事実から、ここで得られたヒト染色体
DNA由来の1.8Kb EcpＲ DNA断片上に、ヒ
トインターフエロン―βメツセンジヤーRNA（す
なわちcDNA）と全く同一の配列のあること、す
なわちこの1.8Kb EcpＲ DNA断片がヒトイン
ターフエロン―βの染色体内遺伝子（第１図ｂの
黒い帯）を含んでいることが明らかになつた。 さらに他の多くの真核細胞の遺伝子中に存在す
るインタービーニングシークエンス（介在配列）
がヒトインターフエロン―βの遺伝子に関して存
在しないことが明らかになつた。得られた1.8Kb
EcpＲ断片中に含まれているインターフエロン
―β遺伝子が介在配列を持つていないということ
は、この遺伝子DNAを用いて、介在配列を切り
出すメカニズムのない、例えば大腸菌などの原核
生物にインターフエロン蛋白を合成させることが
可能であることを示している。 上記のことを決定的に証明する目的で、この
1.8Kb EcpＲ断片の塩基配列をMaxamと
Gilbertの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA74、
560−564（1977）〕により決定した。その結果を第
２図に示す。 この1.8KbEcoR断片は大腸菌に挿入し、米
国アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨ
ンにEscherichia coli CI4 ATCC31905として寄
宅されている。
第１図ａは、λHIFN−β1−121にクローン化さ
れた15Kb染色体DNA切片の制限酵素地図を示
す。図中断続線はCharon4Aからのベクター
DNAの腕を示す。第１図ｂおよびｄは、ヒト染
色体DNAに由来する1.8KbのEcpＲ断片の制限
酵素地図を示す。図中黒い帯はメツセンジヤー
RNAがそこから転写されることを示す。第１図
ｃは、ヒト染色体DNA中のインターフエロン―
β cDNAに対応する部分を示す。図中白枠は蛋
白コーデイング領域を示す。第１図ｅは、配列決
定の始点と方向を示す。図中矢印は分析した各画
分の配列の方向および広がりを示す。 第１図中の記号は、下記文献に記載された制限
酵素を示す。EcpＲ：Methods Mol.Biol.７、
87（1974）、Bgl：Nucleic Acids Res.、３、
1747（1976）、Hind：J.Mol.Biol.92、331
（1975）、BamH：J.Mol.Biol.，97、123
（1975）、Pst：Nucleic Acids Res.、３、343
（1976）、Pvu：Gene ８、329−343（1980）、
Hinf：J.Mol.Biol.，110、297（1977）、Alu：
J.Mol.Biol.，102、157（1976）、Hae：J.
Virol.，10、42（1972）、Taq：Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、74、542（1977）、Ava：
Biochem.J.，159、317（1976）、Hin：Gene
８、329−343（1980）、EcpＲ：Nature New
Biol.，244、７（1973） 第２図は、1.8Kb EcpＲ断片の塩基配列を示
す。図中＋１〜＋561はヒトインターフエロン―
βの蛋白質をコードする部分を示し、−73〜−75
の矢印は転写開始部位を示し、下線はTATAボ
ツクスを示す。
れた15Kb染色体DNA切片の制限酵素地図を示
す。図中断続線はCharon4Aからのベクター
DNAの腕を示す。第１図ｂおよびｄは、ヒト染
色体DNAに由来する1.8KbのEcpＲ断片の制限
酵素地図を示す。図中黒い帯はメツセンジヤー
RNAがそこから転写されることを示す。第１図
ｃは、ヒト染色体DNA中のインターフエロン―
β cDNAに対応する部分を示す。図中白枠は蛋
白コーデイング領域を示す。第１図ｅは、配列決
定の始点と方向を示す。図中矢印は分析した各画
分の配列の方向および広がりを示す。 第１図中の記号は、下記文献に記載された制限
酵素を示す。EcpＲ：Methods Mol.Biol.７、
87（1974）、Bgl：Nucleic Acids Res.、３、
1747（1976）、Hind：J.Mol.Biol.92、331
（1975）、BamH：J.Mol.Biol.，97、123
（1975）、Pst：Nucleic Acids Res.、３、343
（1976）、Pvu：Gene ８、329−343（1980）、
Hinf：J.Mol.Biol.，110、297（1977）、Alu：
J.Mol.Biol.，102、157（1976）、Hae：J.
Virol.，10、42（1972）、Taq：Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、74、542（1977）、Ava：
Biochem.J.，159、317（1976）、Hin：Gene
８、329−343（1980）、EcpＲ：Nature New
Biol.，244、７（1973） 第２図は、1.8Kb EcpＲ断片の塩基配列を示
す。図中＋１〜＋561はヒトインターフエロン―
βの蛋白質をコードする部分を示し、−73〜−75
の矢印は転写開始部位を示し、下線はTATAボ
ツクスを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記塩基配列を有し、ヒト染色体由来のヒト
インターフエロン―β遺伝子および該遺伝子の転
写の調節に関与するDNAを含むDNAとベクター
DNAとの組換え体DNA。 【表】 【表】
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1437381A JPS57130998A (en) | 1981-02-04 | 1981-02-04 | Human interferon-beta-gene |
| PCT/JP1982/000034 WO1982002715A1 (fr) | 1981-02-04 | 1982-02-04 | Gene d'interferon (beta)humain |
| EP82900385A EP0070906B1 (en) | 1981-02-04 | 1982-02-04 | Human interferon-beta gene |
| DE1982900385 DE70906T1 (de) | 1981-02-04 | 1982-02-04 | Menschliches gen fuer interferon-beta. |
| DE8282900385T DE3273787D1 (en) | 1981-02-04 | 1982-02-04 | Human interferon-beta gene |
| US07/070,120 US4738931A (en) | 1981-02-04 | 1987-07-06 | Human interferon-β gene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1437381A JPS57130998A (en) | 1981-02-04 | 1981-02-04 | Human interferon-beta-gene |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57130998A JPS57130998A (en) | 1982-08-13 |
| JPH0255035B2 true JPH0255035B2 (ja) | 1990-11-26 |
Family
ID=11859239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1437381A Granted JPS57130998A (en) | 1981-02-04 | 1981-02-04 | Human interferon-beta-gene |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57130998A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5810599A (ja) * | 1981-07-11 | 1983-01-21 | Japan Found Cancer | ヒトインタ−フエロン−β遺伝子 |
| US4707445A (en) * | 1984-07-31 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Intact gene and method of excising and cloning same |
| US4709324A (en) * | 1985-11-27 | 1987-11-24 | Motorola, Inc. | Data processor control unit having an interrupt service using instruction prefetch redirection |
| US6696423B1 (en) | 1997-08-29 | 2004-02-24 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for therapies using genes encoding secreted proteins such as interferon-beta |
| KR100511749B1 (ko) * | 2001-11-06 | 2005-09-02 | 선바이오(주) | 변형된 인터페론-베타, 및 이의 화학적으로 변형된 배합체 |
-
1981
- 1981-02-04 JP JP1437381A patent/JPS57130998A/ja active Granted
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PROC JAPAN ACAD=1979 * |
| PROC NATL.ACAD SUI USA=1980 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57130998A (en) | 1982-08-13 |
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