JPH0256499A - テネイシンの精製方法 - Google Patents
テネイシンの精製方法Info
- Publication number
- JPH0256499A JPH0256499A JP63205902A JP20590288A JPH0256499A JP H0256499 A JPH0256499 A JP H0256499A JP 63205902 A JP63205902 A JP 63205902A JP 20590288 A JP20590288 A JP 20590288A JP H0256499 A JPH0256499 A JP H0256499A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tenascin
- urea
- human
- fibronectin
- fraction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は細胞外基質成分の精製法に関し、さらに詳しく
は、細胞外基質成分であるテネイシンの精製方法に関す
る。
は、細胞外基質成分であるテネイシンの精製方法に関す
る。
（従来の技術）
テネイシンは、タイプＶコラーゲンに対するモノクロー
ナル抗体を得ようとした際に偶然にもタイプ■コラーゲ
ンとは異なる特異’ｈｈ染色性を示す抗体の抗原として
発見された糖蛋白質であり、細胞の間質側に発現される
物質である。テネイシンは、細胞外基質成分の一つとし
て、様々な生理作用を有することが明らかにされつつあ
る。すなわち、テネイシンはフィブロネクチンよりも強
い赤血球凝集能を有することから、組織形成の場におい
て、制御的に作用することが示唆されている（大地ら、
生体の科学、３９巻−８月号、１９８８年）。また、他
の分子との非共有結合的相互作用としては、フィブロネ
クチンとの相互作用が明らかにされており （チケット
ら、セル、５３巻：３８３−３９０頁、１９８８年）、
プロテオグリカンとの相互作用も示唆されている（チケ
ットら、シアーナル オブ セル バイオロジー、９８
巻：１９２６−１９３６頁、１９８４年）。さらには、
カルシウムに依存的な細胞接着活性を有しており（ボー
トンら、ジ丁−ナル オブ セル バイオロジー １０
５巻：１３８ａ）、また上皮性の癌の発生に伴い間充織
側に誘導され、細胞に対して増殖促進効果を持つことが
明らかにされる（チケットら、セル、４７巻： １３１
−１３９頁、１９８６年）など、多岐にわたる生理作用
を有し、細胞増殖や形態形成に重要な役割を担っている
。
ナル抗体を得ようとした際に偶然にもタイプ■コラーゲ
ンとは異なる特異’ｈｈ染色性を示す抗体の抗原として
発見された糖蛋白質であり、細胞の間質側に発現される
物質である。テネイシンは、細胞外基質成分の一つとし
て、様々な生理作用を有することが明らかにされつつあ
る。すなわち、テネイシンはフィブロネクチンよりも強
い赤血球凝集能を有することから、組織形成の場におい
て、制御的に作用することが示唆されている（大地ら、
生体の科学、３９巻−８月号、１９８８年）。また、他
の分子との非共有結合的相互作用としては、フィブロネ
クチンとの相互作用が明らかにされており （チケット
ら、セル、５３巻：３８３−３９０頁、１９８８年）、
プロテオグリカンとの相互作用も示唆されている（チケ
ットら、シアーナル オブ セル バイオロジー、９８
巻：１９２６−１９３６頁、１９８４年）。さらには、
カルシウムに依存的な細胞接着活性を有しており（ボー
トンら、ジ丁−ナル オブ セル バイオロジー １０
５巻：１３８ａ）、また上皮性の癌の発生に伴い間充織
側に誘導され、細胞に対して増殖促進効果を持つことが
明らかにされる（チケットら、セル、４７巻： １３１
−１３９頁、１９８６年）など、多岐にわたる生理作用
を有し、細胞増殖や形態形成に重要な役割を担っている
。
しかし、このように重要な生理物質であるにもかかわら
ず、今まで研究の対象にされたテネイシンの多くはヒト
由来のテネイシンではなく、ヒトにおけるテネイシンの
生理作用が充分に解明されたとは言い難かった。また、
現在までテネイシンの精製に用いられてきた方法は、ニ
ワ） ＩＪのモノクローナル抗体あるいはポリクローン
抗体をゲルビーズに共有結合させたアフィニティークロ
マトグラフィーを用いて行われるものであり、特殊な操
作を必要としているので広汎に用いられず、また、他の
種、特にヒト由来のテネイシンの精製に使用することも
できなかった。さらに、培養条件下でヒトのフィブロブ
ラストにより産生されるヒトーテネイシンの産生Ｉは、
フィブロネクチンの約２％であり、高度に精製されたテ
ネイシンを得ることは困難であった。
ず、今まで研究の対象にされたテネイシンの多くはヒト
由来のテネイシンではなく、ヒトにおけるテネイシンの
生理作用が充分に解明されたとは言い難かった。また、
現在までテネイシンの精製に用いられてきた方法は、ニ
ワ） ＩＪのモノクローナル抗体あるいはポリクローン
抗体をゲルビーズに共有結合させたアフィニティークロ
マトグラフィーを用いて行われるものであり、特殊な操
作を必要としているので広汎に用いられず、また、他の
種、特にヒト由来のテネイシンの精製に使用することも
できなかった。さらに、培養条件下でヒトのフィブロブ
ラストにより産生されるヒトーテネイシンの産生Ｉは、
フィブロネクチンの約２％であり、高度に精製されたテ
ネイシンを得ることは困難であった。
一方、最近になってＭ、 Ａ、ボートン（Ｂｏｕｒｄｏ
ｎ）らにより発見されたヒユーマン グリオーマーメゼ
ンキマル エクストラセルラー マトリクス アンチゲ
ン（Ｈｕｍａｎ Ｇｌｉｏｍａ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａ
ｌ巳ｘｔｒａｃｅｌ １ｕｌａｒλ１ａｔｒｉｘ Ａｎ
ｔｉｇｅｎ、Ｇ）、）巳！Ａ ａｎｔｉｇｅｎ、キャン
サー リサーチ４３巻：２７９６−２８０５頁、１９８
３年）がヒトーテネイシンであることが明らかにされた
が（ボートンら、ジャーナル オブセル バイオロジー
１０５巻： １３８ａ、１９８７年）、このヒトーテ
ネイシンの精製方法は、グリオーマＵ２５１に対するハ
イブリドーマが産生ずるモノクローナル抗体を天童に含
むマウスの腹水を得、抗体を精製した後に、アフイニテ
ィーゲルヲ作成するという特殊なものであり、工業的に
応用するのにはコストがかかるという欠点があった。
ｎ）らにより発見されたヒユーマン グリオーマーメゼ
ンキマル エクストラセルラー マトリクス アンチゲ
ン（Ｈｕｍａｎ Ｇｌｉｏｍａ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａ
ｌ巳ｘｔｒａｃｅｌ １ｕｌａｒλ１ａｔｒｉｘ Ａｎ
ｔｉｇｅｎ、Ｇ）、）巳！Ａ ａｎｔｉｇｅｎ、キャン
サー リサーチ４３巻：２７９６−２８０５頁、１９８
３年）がヒトーテネイシンであることが明らかにされた
が（ボートンら、ジャーナル オブセル バイオロジー
１０５巻： １３８ａ、１９８７年）、このヒトーテ
ネイシンの精製方法は、グリオーマＵ２５１に対するハ
イブリドーマが産生ずるモノクローナル抗体を天童に含
むマウスの腹水を得、抗体を精製した後に、アフイニテ
ィーゲルヲ作成するという特殊なものであり、工業的に
応用するのにはコストがかかるという欠点があった。
高度に精製されたヒトーテネイシンを用いてヒトーテネ
イシンに対するモノクローナル抗体を得ることができれ
ば、上皮癌等の診断、治療（ご応用することも可能であ
る。そのため、通常の生化学的手法のみを用いて工業的
に応用可能なテネイシンの精製方法の開発が望まれ、ま
た、高度に精製されたヒトーテネイシンを取得すること
が切望されていた。
イシンに対するモノクローナル抗体を得ることができれ
ば、上皮癌等の診断、治療（ご応用することも可能であ
る。そのため、通常の生化学的手法のみを用いて工業的
に応用可能なテネイシンの精製方法の開発が望まれ、ま
た、高度に精製されたヒトーテネイシンを取得すること
が切望されていた。
（発明が解決しようとする課題）
従って、本発明の目的は、通常の生化学的手法を用い、
高純度のテネイシンを高収量で得る方法を提供すること
にある。
高純度のテネイシンを高収量で得る方法を提供すること
にある。
（課題を解決するための手段）
本発明者は、ヒトのフィブロブラスト等からテネイシン
を抽出した後、フィブづネクチンを除去し、さらに生体
高分子分離用アニオン型イオン交換樹脂を用いて精製す
ることにより上記課題を解決できることを見出し、本発
明を完成するに至った。
を抽出した後、フィブづネクチンを除去し、さらに生体
高分子分離用アニオン型イオン交換樹脂を用いて精製す
ることにより上記課題を解決できることを見出し、本発
明を完成するに至った。
すなわち、本発明はテネイシンを含む細胞外基質抽出物
を、ゼラチンを共有結合させたアフィニティークロマト
グラフィー内を通過させてフィブロネクチンを溶質に対
して１重量％以下となる様に除いた後、塩基性陰イオン
交換樹脂を用いてテネイシンを精製することを特徴とす
る、テ不イシンの精製方法を提供するものである。
を、ゼラチンを共有結合させたアフィニティークロマト
グラフィー内を通過させてフィブロネクチンを溶質に対
して１重量％以下となる様に除いた後、塩基性陰イオン
交換樹脂を用いてテネイシンを精製することを特徴とす
る、テ不イシンの精製方法を提供するものである。
以下、本発明の詳細な説明する。本発明のテネイシン精
製方法に用いられるテネイシンの供給源としては、ヒト
のフィブロブラスト細胞の他、ヒトグリオーマ細胞、ヒ
トグリオーマ細胞、ヒトコンドロザルコーマ細胞等を用
いることができる。
製方法に用いられるテネイシンの供給源としては、ヒト
のフィブロブラスト細胞の他、ヒトグリオーマ細胞、ヒ
トグリオーマ細胞、ヒトコンドロザルコーマ細胞等を用
いることができる。
また、ヒト以外の種由来のテネイシンの供給源としては
、マウス胎児、ニワトリ胎児等を用いることもできる。
、マウス胎児、ニワトリ胎児等を用いることもできる。
ヒトのフィブロブラスト細胞等を用いる場合には、牛胎
児血清等を培養液として、細胞がコンフルエントに達し
た後に、テネイシンを含むタンバり混合物を抽出すれば
よい。
児血清等を培養液として、細胞がコンフルエントに達し
た後に、テネイシンを含むタンバり混合物を抽出すれば
よい。
これらの細胞から、常法により細胞表面抽出物を抽出す
ることができる。抽出には、尿素、グアニジン塩酸塩、
グアニジンイソチオシアネート等を用いることができる
が、−船釣には、尿素は、１Ｍ〜８Ｍ、好ましくは２Ｍ
の濃度で用いることができ、グアニジン塩酸塩、グアニ
ジンイソチオシアネートは３Ｍ以上の濃度で用いること
ができる。さらに、その他の添加剤、例えばフェニルメ
チルスルホニウムフルオライド（ＰＭＳＦ）等を添加し
て用いることもできる。
ることができる。抽出には、尿素、グアニジン塩酸塩、
グアニジンイソチオシアネート等を用いることができる
が、−船釣には、尿素は、１Ｍ〜８Ｍ、好ましくは２Ｍ
の濃度で用いることができ、グアニジン塩酸塩、グアニ
ジンイソチオシアネートは３Ｍ以上の濃度で用いること
ができる。さらに、その他の添加剤、例えばフェニルメ
チルスルホニウムフルオライド（ＰＭＳＦ）等を添加し
て用いることもできる。
ヒトフィブロブラスト細胞を用いる場合には、該細胞の
細胞壁から２Ｍ 尿素／燐酸バッファ−セーライン（Ｐ
Ｂ Ｓ） ／ ２ ｍＭ−ＦＭＳ Ｆ等の抽出液を用
いて抽出すればよい。
細胞壁から２Ｍ 尿素／燐酸バッファ−セーライン（Ｐ
Ｂ Ｓ） ／ ２ ｍＭ−ＦＭＳ Ｆ等の抽出液を用
いて抽出すればよい。
その後に、該抽出液から、硫酸アンモニウム等を用いて
、テネイシンを含むタンパク混合物を沈殿させることが
できる。硫酸アンモニウムは、通常６０−８０％として
用いればよく、４℃で約２時間処理することにより、テ
ネイシン、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネ
クチンそのイ也の未知タンパクを含むタンパク混合物を
沈澱させることができる。
、テネイシンを含むタンパク混合物を沈殿させることが
できる。硫酸アンモニウムは、通常６０−８０％として
用いればよく、４℃で約２時間処理することにより、テ
ネイシン、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネ
クチンそのイ也の未知タンパクを含むタンパク混合物を
沈澱させることができる。
通常、このタンパク混合物には約３００μｇ／艶、テネ
イシンに対して約５０倍のフィブロネクチンを含むので
、フィブロネクチンを除去することが必要である。沈澱
させたタンパク混合物を、２Ｍ尿素を含む溶液、好まし
くは４℃の、２Ｍ尿素１０、１５ Ｍ塩化ナトリウム１
５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解した後
、ゲル濾過法により粗精製することが好ましい。
イシンに対して約５０倍のフィブロネクチンを含むので
、フィブロネクチンを除去することが必要である。沈澱
させたタンパク混合物を、２Ｍ尿素を含む溶液、好まし
くは４℃の、２Ｍ尿素１０、１５ Ｍ塩化ナトリウム１
５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解した後
、ゲル濾過法により粗精製することが好ましい。
ゲル濾過に用いる充填剤としては、ゲル濾適用樹脂であ
るセファ０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） ＣＬ ２ Ｂ
。
るセファ０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） ＣＬ ２ Ｂ
。
ＣＬ４Ｂ、ＣＬ６Ｂ （ファルマシア社製）等を用いる
ことができ、特にセファロース−ＣＬ４Ｂが好ましい。
ことができ、特にセファロース−ＣＬ４Ｂが好ましい。
その他にバイオゲル（Ｂｉｏ−ｇｅｌ） ５ ｍ 。
１５ｍ（バイオ−ラッド社製）や、セファクリル（Ｓｅ
ｐｈａｃｒｙｌ） Ｓ ５００．５１００Ｏ（ファル
マシア社製）を用いることもできる。
ｐｈａｃｒｙｌ） Ｓ ５００．５１００Ｏ（ファル
マシア社製）を用いることもできる。
カラムより溶出するテネイシンは、テネイシン依存の細
胞接着活性により検出することができる（メソーズ イ
ン エンザイモロジー、８２巻二８０３−８３１頁 １
９８２年）。細胞接着性試験に用いることができる細胞
としては、ヒトメラノーマの他、ヒトフィブロブラスト
、ヒト上皮性ガン細胞等を挙げることができる。他の同
定法としては、ニワトリテネイシンに対するポリクロー
ン抗体を、用いた、エン゛ザイムーリンクトーイムノア
ッセイ（εＬＩＳＡ）法等を用いることもできる。また
フィブロネクチンは、フィブロネクチンに対する抗原性
を測定することにより検出できる（アーカイブス オブ
バイオケミストリー アンドバイオフィジクス： ３
９９−４０６頁、１９８１年）。
胞接着活性により検出することができる（メソーズ イ
ン エンザイモロジー、８２巻二８０３−８３１頁 １
９８２年）。細胞接着性試験に用いることができる細胞
としては、ヒトメラノーマの他、ヒトフィブロブラスト
、ヒト上皮性ガン細胞等を挙げることができる。他の同
定法としては、ニワトリテネイシンに対するポリクロー
ン抗体を、用いた、エン゛ザイムーリンクトーイムノア
ッセイ（εＬＩＳＡ）法等を用いることもできる。また
フィブロネクチンは、フィブロネクチンに対する抗原性
を測定することにより検出できる（アーカイブス オブ
バイオケミストリー アンドバイオフィジクス： ３
９９−４０６頁、１９８１年）。
テネイシンを２０％、好ましくは１０％以上含有する分
画を集めることにより、粗精製テネイシンを得ることが
できる。このようにして得られた粗精製テネイシンには
、通常５０％のフィブロネクチンが含まれるので、通常
の操作によりａ縮、透析を行った後に、さらにゼラチン
ゲルによりフィブロネクチンを除去する必要がある。
画を集めることにより、粗精製テネイシンを得ることが
できる。このようにして得られた粗精製テネイシンには
、通常５０％のフィブロネクチンが含まれるので、通常
の操作によりａ縮、透析を行った後に、さらにゼラチン
ゲルによりフィブロネクチンを除去する必要がある。
ａ ｍ ７Ｍ作は、例えばセントリフロー膜（アミコン
社製）を用いて４℃、２５ ’ＯＯＸ ｇで遠心濃縮す
ることが好ましく、また、透析は０．５Ｍ尿素を含む緩
衝液、好ましくは０．５Ｍ尿素１０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウム１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，４）を用いて、４
℃で１２時間行えばよい。
社製）を用いて４℃、２５ ’ＯＯＸ ｇで遠心濃縮す
ることが好ましく、また、透析は０．５Ｍ尿素を含む緩
衝液、好ましくは０．５Ｍ尿素１０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウム１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，４）を用いて、４
℃で１２時間行えばよい。
ゼラチンゲルとしては、ゼラチンセファロース（ファル
マシア社製）、イモビライズドゼラチン（ピアース社製
）、ゼラチンアガロース（シグマ社製）等を挙げること
ができ、これらはゼラチンが共有結合されたアフィニテ
ィークロマトクラフィーである。フィブロネクチンに対
する親和性の高い該ゼラチンカラムを用いることにより
、テネイシンは通過画分に溶出され、溶質に対しフィブ
ロネクチンを１重量％以下に除くことができる。
マシア社製）、イモビライズドゼラチン（ピアース社製
）、ゼラチンアガロース（シグマ社製）等を挙げること
ができ、これらはゼラチンが共有結合されたアフィニテ
ィークロマトクラフィーである。フィブロネクチンに対
する親和性の高い該ゼラチンカラムを用いることにより
、テネイシンは通過画分に溶出され、溶質に対しフィブ
ロネクチンを１重量％以下に除くことができる。
フィブロネクチンは、抗ヒトフィブロネタチンポリクロ
ーン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で同定することができ、
またテネイシンも同様にＥＬＩＳＡ法により同定可能で
ある。
ーン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で同定することができ、
またテネイシンも同様にＥＬＩＳＡ法により同定可能で
ある。
この様にして得られた分画を、通常の操作によリａ８し
、２Ｍ尿素を含む溶液、好ましくは２Ｍ尿素１５０ｍＭ
トリス塩酸（ｐ）１８．０ ）に対して透析して、テネ
イシンを高濃度で含む溶液を得ることができる。
、２Ｍ尿素を含む溶液、好ましくは２Ｍ尿素１５０ｍＭ
トリス塩酸（ｐ）１８．０ ）に対して透析して、テネ
イシンを高濃度で含む溶液を得ることができる。
該溶液は通常テネイシン１００μｇ／−を含むが、さら
に生体高分子分離用アニオン型イオン交換樹脂を用いた
精製をすることにより、極めて高純度のテネイシンを得
ることができる。
に生体高分子分離用アニオン型イオン交換樹脂を用いた
精製をすることにより、極めて高純度のテネイシンを得
ることができる。
その方法として、該溶液を、例えばＤＥＡＥ （ジエチ
ルアミノエチル）基を交換基として有するＤＥＡＥ−５
ＰＷカラム（東−ソー＠製）を用いたイオン交換高速液
体クロマトグラフィーにより精製する方法を挙げること
ができる。さら（こ、ＤＥＡＥ−）ヨパール６５０（東
−ソー＠ｕ） 、Ｍｏｎｏ−Ｑ （ファルマシア社製）
、ＤＥＡＥ−ＣＬ６Ｂ、 ＤＥＡＥ−セファセル（フ
ァルマシア２１Ｊ） 、ＤＥＡＥ−セルロファイン（生
化学工業社製）などのカラムを用いることもできる。こ
れらのうち、ＤＥＡＥ−５ＦＷを用いることが好ましい
。
ルアミノエチル）基を交換基として有するＤＥＡＥ−５
ＰＷカラム（東−ソー＠製）を用いたイオン交換高速液
体クロマトグラフィーにより精製する方法を挙げること
ができる。さら（こ、ＤＥＡＥ−）ヨパール６５０（東
−ソー＠ｕ） 、Ｍｏｎｏ−Ｑ （ファルマシア社製）
、ＤＥＡＥ−ＣＬ６Ｂ、 ＤＥＡＥ−セファセル（フ
ァルマシア２１Ｊ） 、ＤＥＡＥ−セルロファイン（生
化学工業社製）などのカラムを用いることもできる。こ
れらのうち、ＤＥＡＥ−５ＦＷを用いることが好ましい
。
溶出に用いる溶媒としては、１〜８Ｍの尿素、好ましく
は２Ｍの尿素中で０〜ＩＭ、好ましくは０〜０．４Ｍの
塩化ナトリウムを用いればよい。
は２Ｍの尿素中で０〜ＩＭ、好ましくは０〜０．４Ｍの
塩化ナトリウムを用いればよい。
ＤＥＡＥ−５ＦＷカラムを用いたイオン交換高速液体ク
ロマトグラフィーにおいて、２Ｍ尿素中で〇−０，４Ｍ
の塩化す） ＩＪウムを直線濃度勾配として溶出する場
合には、通常０．２−０゜３Ｍ、好ましくは約０．２５
Ｍの塩化ナトリウムでテネイシンが溶出される。溶出
されるテネイシンは、紫外吸収や、テネイシンに特異的
な細胞接着性により同定することができる。
ロマトグラフィーにおいて、２Ｍ尿素中で〇−０，４Ｍ
の塩化す） ＩＪウムを直線濃度勾配として溶出する場
合には、通常０．２−０゜３Ｍ、好ましくは約０．２５
Ｍの塩化ナトリウムでテネイシンが溶出される。溶出
されるテネイシンは、紫外吸収や、テネイシンに特異的
な細胞接着性により同定することができる。
この様な精製法により、はぼ１００％のテネイシンを１
尋ることができる。本発明により得られたヒトーテネイ
シンは、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で、２５０Ｋ及び
、２００Ｋにヒトーテネイシンに特徴的なバンドを明瞭
に与えた。本発明の精製方法によるテネイシンの収率は
、通常８０％以上である。
尋ることができる。本発明により得られたヒトーテネイ
シンは、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で、２５０Ｋ及び
、２００Ｋにヒトーテネイシンに特徴的なバンドを明瞭
に与えた。本発明の精製方法によるテネイシンの収率は
、通常８０％以上である。
さらに、培養液中からも３０−３５％、好ましくは３３
．３％の硫酸アンモニウムを用いることにより、粗テネ
イシン分画を得ることができ、前記の操作と全く同一の
方法により精製テネイシンを得ることができる。
．３％の硫酸アンモニウムを用いることにより、粗テネ
イシン分画を得ることができ、前記の操作と全く同一の
方法により精製テネイシンを得ることができる。
（発明の効果）
本発明により、工業的にも対応しろる純生化学的手法を
用いて、極めて高純度のテネイシンを、高収率で得るこ
とができた。
用いて、極めて高純度のテネイシンを、高収率で得るこ
とができた。
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、
本発明は本実施例により限定されることはない。
本発明は本実施例により限定されることはない。
実施例１
ヒトフィブロブラスト細胞をダルベツコ変法イーグル培
地／ハムＦ１２培地、１０％牛脂児血清清を培養液とし
て、ローラーボトル１００本を用いて、３７℃で培養を
継続し、細胞がコンフルエントに達した後に、２Ｍ尿素
／ハムＦ１２／２ｍＭフェニルメチルスルホニウムフル
オライド（ＰＭＳＦ＞を１０ｄ／ボトルとなるように細
胞層に加え、ヒトーテネイシンを含むタンパク混合物を
３７℃でローラーボトルを回転させながら（１ｒｐｍ）
２時間抽出した。抽出液を４℃に冷却し、硫酸アンモ
ニウムを７０％飽和となるように加えて静かに攪拌した
後に、２時間放置して、ヒトーテネイシンの４也、コラ
ーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、その他
の未知タンパク質を含むタンパク混合物を沈澱させた。
地／ハムＦ１２培地、１０％牛脂児血清清を培養液とし
て、ローラーボトル１００本を用いて、３７℃で培養を
継続し、細胞がコンフルエントに達した後に、２Ｍ尿素
／ハムＦ１２／２ｍＭフェニルメチルスルホニウムフル
オライド（ＰＭＳＦ＞を１０ｄ／ボトルとなるように細
胞層に加え、ヒトーテネイシンを含むタンパク混合物を
３７℃でローラーボトルを回転させながら（１ｒｐｍ）
２時間抽出した。抽出液を４℃に冷却し、硫酸アンモ
ニウムを７０％飽和となるように加えて静かに攪拌した
後に、２時間放置して、ヒトーテネイシンの４也、コラ
ーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、その他
の未知タンパク質を含むタンパク混合物を沈澱させた。
該タンパク混合物を、４℃で１時間遠心（２０，０００
ｒｐｍ） して分離し、上清をデカントして除いた後、
沈澱物を４℃、２００ｍ１の２Ｍ尿素１０、１５ Ｍ塩
化ナトリウム１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０）に溶
解した。得られたタンパクのタンパク量は、ＢＣＡ
プロティン アッセイ （ピアス社製）を用いた分析で
１００ ｍｇであった。
ｒｐｍ） して分離し、上清をデカントして除いた後、
沈澱物を４℃、２００ｍ１の２Ｍ尿素１０、１５ Ｍ塩
化ナトリウム１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０）に溶
解した。得られたタンパクのタンパク量は、ＢＣＡ
プロティン アッセイ （ピアス社製）を用いた分析で
１００ ｍｇであった。
該タンパク混合物溶液１０ｍ１を、セファロースＣＬ４
Ｂカラム（ファルマシア社製、５００蔵）にアプライし
て、２Ｍ尿素１０．１５Ｍ塩化ナトリウム１５０ｍＭ）
リス塩酸（ｐＨ８，０）を用いて１５℃でテネイシンと
フィブロネクチンを分離溶出させた（第１図）。
Ｂカラム（ファルマシア社製、５００蔵）にアプライし
て、２Ｍ尿素１０．１５Ｍ塩化ナトリウム１５０ｍＭ）
リス塩酸（ｐＨ８，０）を用いて１５℃でテネイシンと
フィブロネクチンを分離溶出させた（第１図）。
テネイシン依存性の細胞接着活性は、以下に述べる方法
にしたがった。各画分から２００μｌの試料を、ＢＬＩ
ＳＡプレート（Ｌｉｂｒｏ、７６−２０３−０５ 、Ｔ
ｉｔｅｒｔｅｋ社製）のウェルに入れ、さらに各ウェル
に２０μβの５０ｒｎＭ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
）１９．６ ）を入れ、４℃で１２時間コートした。そ
の後ウェルをＰＢＳｌｏ、５％−ＢＳＡで３回洗った後
、抗フィブロネクチン抗体（Ｃａｐｐｅ１社製、ＰＢＳ
ｌｏ、５％−ＢＳＡ中５％）２ｏｏＪＪ！！を加え、３
７℃で２時間保温し、その後各ウェルをＰＢＳｌｏ、５
％−ＢＳＡで洗った。一方、ヒトフィブロブラスト細胞
をコンフルエントになるまで、ダルベツコ変法イーグル
培地／ハムＦ１２培地、１０％牛脂児血清中で維持し、
ＢＤＴＡを含まないトリプシン（タイプ■、シグマ社製
、０．１ ｍｇ ／献）溶液で３７℃、１時間保温して
細胞をはがし、ｌＸｌ０６セル／−（ＰＢＳ／ソイビー
ン トリプシン インヒビター０．５ｍｇ、シグマ社）
に細胞溶液を調製した。この細胞溶液をミクロタイター
プレートのウェルに１００μβずつ加えて、３７℃で１
時間保温した。ついで、プレートをＰＢＳｌｏ、５％−
ＢＳＡで１回洗い、プレートに接着した細胞を３％のパ
ラホルムアルデヒドで固定し、１％−トルイジンブルー
（メルク社製）／３％−バラホルムアルデヒドで染色し
て、接着した細胞数を顕微鏡下で観測した。
にしたがった。各画分から２００μｌの試料を、ＢＬＩ
ＳＡプレート（Ｌｉｂｒｏ、７６−２０３−０５ 、Ｔ
ｉｔｅｒｔｅｋ社製）のウェルに入れ、さらに各ウェル
に２０μβの５０ｒｎＭ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
）１９．６ ）を入れ、４℃で１２時間コートした。そ
の後ウェルをＰＢＳｌｏ、５％−ＢＳＡで３回洗った後
、抗フィブロネクチン抗体（Ｃａｐｐｅ１社製、ＰＢＳ
ｌｏ、５％−ＢＳＡ中５％）２ｏｏＪＪ！！を加え、３
７℃で２時間保温し、その後各ウェルをＰＢＳｌｏ、５
％−ＢＳＡで洗った。一方、ヒトフィブロブラスト細胞
をコンフルエントになるまで、ダルベツコ変法イーグル
培地／ハムＦ１２培地、１０％牛脂児血清中で維持し、
ＢＤＴＡを含まないトリプシン（タイプ■、シグマ社製
、０．１ ｍｇ ／献）溶液で３７℃、１時間保温して
細胞をはがし、ｌＸｌ０６セル／−（ＰＢＳ／ソイビー
ン トリプシン インヒビター０．５ｍｇ、シグマ社）
に細胞溶液を調製した。この細胞溶液をミクロタイター
プレートのウェルに１００μβずつ加えて、３７℃で１
時間保温した。ついで、プレートをＰＢＳｌｏ、５％−
ＢＳＡで１回洗い、プレートに接着した細胞を３％のパ
ラホルムアルデヒドで固定し、１％−トルイジンブルー
（メルク社製）／３％−バラホルムアルデヒドで染色し
て、接着した細胞数を顕微鏡下で観測した。
フィブロネタチンはフィブロネクチンに対する抗原性を
測定することにより、以下の方法を用いて検出した。各
画分から２０μβの試料を取り、ＥＬＩＳＡプレート（
３９１２ファルコン社製）のウェルに移し、５０ｍＭ
の炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６） １８０μ
ｌを各ウェルに加えて４℃で１２時間保温した。各ウェ
ルをＰＢＳｌｏ、５％（１ツ／Ｗ）−ツウィーン２０１
０．５％（Ｗ／ｌ’ｌ） −Ｂ Ｓ Ａを用いて３回洗
った後に、ウサギの抗フィブロネクチン抗体（０，４％
、Ｃａｐｐｅ１社製）２００．ｕｊ２を加え、２０℃で
１時間保温した。さらに、抗体溶液をすて、ＰＢＳｌｏ
、５％（Ｗ／Ｗ）−ツウィーン２０７０．５％（１す／
Ｗ）−ＢＳＡで各ウェルを洗い、パーオキシダーゼ標識
されたヤギの抗ウサギ抗体（０，４％、Ｃａｐｐｅ１社
製）を加えて更に１時間反応させた。
測定することにより、以下の方法を用いて検出した。各
画分から２０μβの試料を取り、ＥＬＩＳＡプレート（
３９１２ファルコン社製）のウェルに移し、５０ｍＭ
の炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６） １８０μ
ｌを各ウェルに加えて４℃で１２時間保温した。各ウェ
ルをＰＢＳｌｏ、５％（１ツ／Ｗ）−ツウィーン２０１
０．５％（Ｗ／ｌ’ｌ） −Ｂ Ｓ Ａを用いて３回洗
った後に、ウサギの抗フィブロネクチン抗体（０，４％
、Ｃａｐｐｅ１社製）２００．ｕｊ２を加え、２０℃で
１時間保温した。さらに、抗体溶液をすて、ＰＢＳｌｏ
、５％（Ｗ／Ｗ）−ツウィーン２０７０．５％（１す／
Ｗ）−ＢＳＡで各ウェルを洗い、パーオキシダーゼ標識
されたヤギの抗ウサギ抗体（０，４％、Ｃａｐｐｅ１社
製）を加えて更に１時間反応させた。
ＰＢＳｌｏ、５％（１ツ／Ｗ）−ツウィーン２０１０．
５％（Ｗ／Ｗ） −Ｂ Ｓ Ａで各ウェルを洗い、オル
ト−フェニレンジアミン塩酸塩を基質として、パーオキ
シダーゼ活性を４９２ｎｍの吸収で測定した。
５％（Ｗ／Ｗ） −Ｂ Ｓ Ａで各ウェルを洗い、オル
ト−フェニレンジアミン塩酸塩を基質として、パーオキ
シダーゼ活性を４９２ｎｍの吸収で測定した。
以上の操作を１０回繰り返した。第１図から明らかな様
に、テネイシンとフィブロネクチンはセファロースカラ
ムによりやや分離され、テネイシンはＫｄ値０．１１の
所に溶出された。第１図中のフラクションＮα３０−Ｎ
α４０ （各フラクションは５−）を、集めて、テネイ
シンを高濃度で含む溶液５００ｍｆ！を得た。タンパク
の収量は２．６ ｒｎｇであった。
に、テネイシンとフィブロネクチンはセファロースカラ
ムによりやや分離され、テネイシンはＫｄ値０．１１の
所に溶出された。第１図中のフラクションＮα３０−Ｎ
α４０ （各フラクションは５−）を、集めて、テネイ
シンを高濃度で含む溶液５００ｍｆ！を得た。タンパク
の収量は２．６ ｒｎｇであった。
該溶液をセントリフロー膜（アミコン社製）を用いて４
℃、２５００Ｘｇで遠心して５０ｍ１！に濃縮した後、
０．５Ｍ尿素１０．１５Ｍ塩化ナトリウム１５０ｍＭ）
リス塩酸（ｐ）１７．４ ） １１に対して、４℃で
１２時間透析した。
℃、２５００Ｘｇで遠心して５０ｍ１！に濃縮した後、
０．５Ｍ尿素１０．１５Ｍ塩化ナトリウム１５０ｍＭ）
リス塩酸（ｐ）１７．４ ） １１に対して、４℃で
１２時間透析した。
透析後、該溶液６０Ｉ？ｔ１！をゼラチンカラム（ゼラ
チンセファロース、ファルマシア社製、１０ｍ１りにア
プライし、フィブロネクチンを特異的に吸着せしめた。
チンセファロース、ファルマシア社製、１０ｍ１りにア
プライし、フィブロネクチンを特異的に吸着せしめた。
テネイシンは通過画分に溶出され、フィブロネクチンを
含まないテネイシン溶液７０ｍｊ！を得ることができた
。
含まないテネイシン溶液７０ｍｊ！を得ることができた
。
該溶液をセントリフロー膜（アミコン社製）を用いて４
℃で２５００Ｘｇで遠心して２０ｄに濃縮した後、１１
００．５Ｍ尿素１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０）を
用いて、４℃で１２時間透析した。
℃で２５００Ｘｇで遠心して２０ｄに濃縮した後、１１
００．５Ｍ尿素１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０）を
用いて、４℃で１２時間透析した。
透析後、該溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷ （東−ソー■製、
カラム径７．５ｍｍ、カラム長５０ｍｍ）のカラムをも
ちいて高速液体クロマトグラフィーによりｌｉｌした。
カラム径７．５ｍｍ、カラム長５０ｍｍ）のカラムをも
ちいて高速液体クロマトグラフィーによりｌｉｌした。
該溶液の１ｍ１をカラムにインジェクトした後、２Ｍの
原票中０−０．４Ｍの塩化す） ＩＪウム直線濃度勾配
溶液を用い、流速０．５ｍｌ’／分、カラム圧１５ｋｇ
／ ｃｎｆ、カラム温度１５℃で分離すると、目的と
するテネイシンは、４２分−４５分に２Ｍ尿素１０、２
５ Ｍ塩化ナトリウムで溶出された。テネイシンは２８
０ｎｍの吸収、及び前述したテネイシンに特異的な細胞
接着活性により検出した。その結果を第２図及び第３図
に示す。図から明らかなように、テネイシンはシャープ
な単一ピークとして分離された。ローラーボトル１００
本（細胞数約２００億）より総収量２００μｇのヒトー
テネイシンを得ることができた。
原票中０−０．４Ｍの塩化す） ＩＪウム直線濃度勾配
溶液を用い、流速０．５ｍｌ’／分、カラム圧１５ｋｇ
／ ｃｎｆ、カラム温度１５℃で分離すると、目的と
するテネイシンは、４２分−４５分に２Ｍ尿素１０、２
５ Ｍ塩化ナトリウムで溶出された。テネイシンは２８
０ｎｍの吸収、及び前述したテネイシンに特異的な細胞
接着活性により検出した。その結果を第２図及び第３図
に示す。図から明らかなように、テネイシンはシャープ
な単一ピークとして分離された。ローラーボトル１００
本（細胞数約２００億）より総収量２００μｇのヒトー
テネイシンを得ることができた。
得られたヒトーテネイシン５μｇを、１％−２−メルカ
プトエタノール／２％−３ＤＳ１５０ｍＭトリス塩酸（
ｐＨ８，０）を用いて７０℃で３０分間還元した後、４
％−２０％の５ＯＳ−ＰＡＧ［Ｅで分析した。
プトエタノール／２％−３ＤＳ１５０ｍＭトリス塩酸（
ｐＨ８，０）を用いて７０℃で３０分間還元した後、４
％−２０％の５ＯＳ−ＰＡＧ［Ｅで分析した。
ヒトーテネイシンに特徴的な２５０にと２００にのバン
ドを検出することができた。他にバンドは検出されず、
本発明により得られたヒトーテネイシンの純度は、はぼ
１００％であることが確認できた。
ドを検出することができた。他にバンドは検出されず、
本発明により得られたヒトーテネイシンの純度は、はぼ
１００％であることが確認できた。
実施例２
ヒトフィブロブラスト細胞を８、ダルベツコ変法イーグ
ル培地／ハムＦ１２培地、１０％牛脂児血清を培養液と
して、ローラーボトル（８５０ｃｒｌ）１００本を用い
、３７℃、１１０ｄ／本、Ｌｌｒｐｍで培養し続け、細
胞がコンフルエントに達した後に５日目ごとに培地を交
換した。この培地１００１を４℃に冷却し、硫酸アンモ
ニウムを３３％飽和となるように加えて静かに攪拌した
後、４℃で１２０分間放置して、ヒトーテネイシンの他
、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、
その他のタンパク質を含むタンパク混合物を沈澱させた
。
ル培地／ハムＦ１２培地、１０％牛脂児血清を培養液と
して、ローラーボトル（８５０ｃｒｌ）１００本を用い
、３７℃、１１０ｄ／本、Ｌｌｒｐｍで培養し続け、細
胞がコンフルエントに達した後に５日目ごとに培地を交
換した。この培地１００１を４℃に冷却し、硫酸アンモ
ニウムを３３％飽和となるように加えて静かに攪拌した
後、４℃で１２０分間放置して、ヒトーテネイシンの他
、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、
その他のタンパク質を含むタンパク混合物を沈澱させた
。
該タンパク混合物を４℃で６０分間、２０．０００ Ｘ
ｇで遠心して分離し、上清をデカントして除いた後、沈
殿物を４℃、７５０ｍ１．の２Ｍ尿素１０．１５Ｍ塩化
ナトリウム１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐ）１８．０）に溶
解せしめた。タンパク量は、ＢＣＡプロティンアッセイ
（ピアス社製）で３．９ｇであった。
ｇで遠心して分離し、上清をデカントして除いた後、沈
殿物を４℃、７５０ｍ１．の２Ｍ尿素１０．１５Ｍ塩化
ナトリウム１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐ）１８．０）に溶
解せしめた。タンパク量は、ＢＣＡプロティンアッセイ
（ピアス社製）で３．９ｇであった。
該タンパク混合物溶液２５−を、セファロースＣＬＳＢ
カラム（ファルマシア社製、約５００ｒｎｌ）にアプラ
イし、２Ｍ尿素／ ０．１５ Ｍ塩化ナトリウム１５０
ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０＞を用いて、１５℃でテネ
イシンとフィブロネクチンを分離溶出させた。
カラム（ファルマシア社製、約５００ｒｎｌ）にアプラ
イし、２Ｍ尿素／ ０．１５ Ｍ塩化ナトリウム１５０
ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０＞を用いて、１５℃でテネ
イシンとフィブロネクチンを分離溶出させた。
テネイシンは、テネイシン依存の細胞接着性により、実
施例１に記載の方法で検出した。フィブロネクチンは、
フィブロネクチンに対する抗原性を測定することにより
、実施例１に記載の方法で検出した。以上の操作を３０
回繰り返した。両者の溶出パターンを第４図に示す。図
から明らかなように、テネイシンとフィブロネクチンは
セファロースカラムによりやや分離され、テネイシンは
Ｋｄ値０の所に溶出された。第３図中のフラクションＮ
［１２５−Ｎｏ、３０ （各フラクションは５ｒｎ！
！、）を集めることにより、テネイシンを高濃度で含む
溶液９００ｍｌを得た。タンパクの収量は９０．０ ｍ
ｇであった。
施例１に記載の方法で検出した。フィブロネクチンは、
フィブロネクチンに対する抗原性を測定することにより
、実施例１に記載の方法で検出した。以上の操作を３０
回繰り返した。両者の溶出パターンを第４図に示す。図
から明らかなように、テネイシンとフィブロネクチンは
セファロースカラムによりやや分離され、テネイシンは
Ｋｄ値０の所に溶出された。第３図中のフラクションＮ
［１２５−Ｎｏ、３０ （各フラクションは５ｒｎ！
！、）を集めることにより、テネイシンを高濃度で含む
溶液９００ｍｌを得た。タンパクの収量は９０．０ ｍ
ｇであった。
該溶液をセントリフロー膜（アミコン社製）を用いて、
４℃、２５００Ｘｇで遠心して１００顎１− ’ａ Ｉ
Ｌ ｆｓ後、０．５Ｍ尿素１０．１５Ｍ塩化す） Ｉ
Ｊウム１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７；４ ） ２１
に対して、４℃で１２時間透析した。
４℃、２５００Ｘｇで遠心して１００顎１− ’ａ Ｉ
Ｌ ｆｓ後、０．５Ｍ尿素１０．１５Ｍ塩化す） Ｉ
Ｊウム１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７；４ ） ２１
に対して、４℃で１２時間透析した。
該溶液１２０ｍｆを、ゼラチンカラム（ゼラチンセファ
ロース、ファルマシア社製、３０ｍ１’）にアプライし
、フィブロネクチンを特異的に吸着せしめた。テネイシ
ンは通過画分に溶出され、フィブロネクチンを含まない
テネイシン溶液２２０−を得ることができた。
ロース、ファルマシア社製、３０ｍ１’）にアプライし
、フィブロネクチンを特異的に吸着せしめた。テネイシ
ンは通過画分に溶出され、フィブロネクチンを含まない
テネイシン溶液２２０−を得ることができた。
該溶液をセントリフロー膜（アミコン社製）を用いて４
℃、２５００Ｘｇで遠心して４０ｍ１に濃縮した後、２
１の２Ｍ尿素１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０＞を用
いて、４℃で１２時間透析した。
℃、２５００Ｘｇで遠心して４０ｍ１に濃縮した後、２
１の２Ｍ尿素１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０＞を用
いて、４℃で１２時間透析した。
透析後、該溶液をＤＥＡＥ−５Ｐｌツ（東−ソー■製、
力５ Ａ径７．５ ｍｍ、カラム長５０ｍｍ）のカラム
をもちいて高速液体クロマトグラフィーにより精製した
。
力５ Ａ径７．５ ｍｍ、カラム長５０ｍｍ）のカラム
をもちいて高速液体クロマトグラフィーにより精製した
。
該溶液の１ｍｌをカラムにインジェクトした後、２Ｍの
尿素中０−０．４ Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配溶
液を用い、流速０．５ｄ／分、カラム圧１５ｋｇ ／
ｃｔ、カラム温度１５℃で分離すると、目的とするテネ
イシンは、４２分−４５分に２Ｍ尿素１０、２５ Ｍ塩
化ナトリウムで溶出された。テネイシンは２８０％ｍの
吸収、及び実施例１に記載したテネイシンに特異的な細
胞接着活性により検出した。その結果を第５図及び第６
図に示す。図から明らかなようにテネイシンはシャープ
な単一ピークとして分離された。ローラーボトル１００
本（細胞数約２００Ｘ１０’）、培地１００βより総収
量６．６ ｍｇのヒトーテネイシンを得ることができた
。
尿素中０−０．４ Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配溶
液を用い、流速０．５ｄ／分、カラム圧１５ｋｇ ／
ｃｔ、カラム温度１５℃で分離すると、目的とするテネ
イシンは、４２分−４５分に２Ｍ尿素１０、２５ Ｍ塩
化ナトリウムで溶出された。テネイシンは２８０％ｍの
吸収、及び実施例１に記載したテネイシンに特異的な細
胞接着活性により検出した。その結果を第５図及び第６
図に示す。図から明らかなようにテネイシンはシャープ
な単一ピークとして分離された。ローラーボトル１００
本（細胞数約２００Ｘ１０’）、培地１００βより総収
量６．６ ｍｇのヒトーテネイシンを得ることができた
。
得うしたヒトーテネイシン５μｇを、１％−２メル力プ
トエタノール／２％−３ＤＳ１５０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ６，８）を用いてＬｏｏｔ：で３分間還元した後、４
％−２０％の５Ｏ５−ＰＡＧＥで分析した。
トエタノール／２％−３ＤＳ１５０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ６，８）を用いてＬｏｏｔ：で３分間還元した後、４
％−２０％の５Ｏ５−ＰＡＧＥで分析した。
ヒトーテネイシンに特徴的な２５０にと２００にのバン
ドを検出することができた。他にバンドは検出されず、
本発明により得られたヒトーテネイシンの純度は、はぼ
１００％であることが確認できた。
ドを検出することができた。他にバンドは検出されず、
本発明により得られたヒトーテネイシンの純度は、はぼ
１００％であることが確認できた。
実施例３
ヒトメラノーマ細胞（Ｍ−１４）をヌードマウスに２Ｘ
１０’セル／匹となるように皮下に注射し、約１ケ月後
に癌化した組織を摘出した。
１０’セル／匹となるように皮下に注射し、約１ケ月後
に癌化した組織を摘出した。
該摘出組織５ｇをミンチし、２Ｍ尿素１５０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ７，４χ１０．１５Ｍ塩化ナトリウム／２ｍ
Ｍ−ＰＭＳＦを４５ｍ１加えて４℃で１２時間攪拌した
後、実施例２に記載の方法により、テネイシンを含む両
分３１０ｍｇを得た。セファロースＣＬ−６Ｂの溶出条
件は、実施例２に記載の条件によった。そのボイド画分
（９ｍｇ）を、実施例１に記載の方法により、フィブロ
ネクチンを除去した後にＤＥＡＩＥ−５ＰＷを用いて精
製することにより、テネイシン７００μｇを得た（第７
図）。実施例１の方法で５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分析す
ると、得られたテネイシンの純度はほぼ１００％であっ
た。
塩酸（ｐＨ７，４χ１０．１５Ｍ塩化ナトリウム／２ｍ
Ｍ−ＰＭＳＦを４５ｍ１加えて４℃で１２時間攪拌した
後、実施例２に記載の方法により、テネイシンを含む両
分３１０ｍｇを得た。セファロースＣＬ−６Ｂの溶出条
件は、実施例２に記載の条件によった。そのボイド画分
（９ｍｇ）を、実施例１に記載の方法により、フィブロ
ネクチンを除去した後にＤＥＡＩＥ−５ＰＷを用いて精
製することにより、テネイシン７００μｇを得た（第７
図）。実施例１の方法で５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分析す
ると、得られたテネイシンの純度はほぼ１００％であっ
た。
実施例４
ヒト−コンドザルコーマの組織３ｇに、２７艷の２Ｍ尿
素１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐｆ１７．４ ） １０、１
５ Ｍ塩化ナトリウム／２ｍＭ−ＰＭＳＦを加えて４℃
で１２時間攪拌した後、テネイシンを含む画分３０ｍｇ
をえた。セファロースＣＬ−６Ｂの溶出条件は実施例２
に記載の条件によった。そのボイド画分（１ｍｇ）を実
施例１に記載の方法により、フィブロネクチンを除去し
た後に（８００ｇｇ）、ＤＥＡＥ−５ＦＷを用いて精製
し、テネイシンを２００ｇｇ得た（第８図）。実施例１
記載の方法で５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分析すると、得ら
れたテネイシンの純度は、はぼ１００％であった。
素１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐｆ１７．４ ） １０、１
５ Ｍ塩化ナトリウム／２ｍＭ−ＰＭＳＦを加えて４℃
で１２時間攪拌した後、テネイシンを含む画分３０ｍｇ
をえた。セファロースＣＬ−６Ｂの溶出条件は実施例２
に記載の条件によった。そのボイド画分（１ｍｇ）を実
施例１に記載の方法により、フィブロネクチンを除去し
た後に（８００ｇｇ）、ＤＥＡＥ−５ＦＷを用いて精製
し、テネイシンを２００ｇｇ得た（第８図）。実施例１
記載の方法で５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分析すると、得ら
れたテネイシンの純度は、はぼ１００％であった。
実施例５
９日目のマウス胎児４００匹（１，５ｇ）に、１３、５
ｍｆの２Ｍ尿素／ ５０ ｍ！、１ ）リス塩酸（ｐ
）１８．０ ）１０．１５Ｍ塩化ナトリウム／ ２ ｍ
Ｍ −Ｐ Ｍ Ｓ Ｆを加えて４℃で１２時間攪拌し
た後、マウスーテネイシンを含む画分１５ｍｇを得た。
ｍｆの２Ｍ尿素／ ５０ ｍ！、１ ）リス塩酸（ｐ
）１８．０ ）１０．１５Ｍ塩化ナトリウム／ ２ ｍ
Ｍ −Ｐ Ｍ Ｓ Ｆを加えて４℃で１２時間攪拌し
た後、マウスーテネイシンを含む画分１５ｍｇを得た。
セファロースＣＬ、 −６Ｂの溶出条件は、実施例２に
記載の条件によった。そのボイド画分（５００ｇｇ）を
、実施例１に記載の方法によりフィブロネクチンを除去
した後に（４００ｇｇ）、ＤＥＡＥ−５Ｐｌすを用いて
精製し、テネイシン１００μｇを得た。溶出パターンは
、実施例１とほぼ同じであった。実施例１の方法により
５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分析すると、得られたテネイシ
ンの純度は、はぼ１００％であった。
記載の条件によった。そのボイド画分（５００ｇｇ）を
、実施例１に記載の方法によりフィブロネクチンを除去
した後に（４００ｇｇ）、ＤＥＡＥ−５Ｐｌすを用いて
精製し、テネイシン１００μｇを得た。溶出パターンは
、実施例１とほぼ同じであった。実施例１の方法により
５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分析すると、得られたテネイシ
ンの純度は、はぼ１００％であった。
実施例６
ニワトリ胎児（ハンバーガー−ハミルトン ステージ
２３．５）３００匹に、９ｒｎ１の２Ｍ尿素１５０ｍＭ
）リス塩酸（ｐＨ８，０） １０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ム／２ｍＭ−ＰＭＳＦを加えて４℃で１２時間攪拌して
マウスーテネイシンを含む画分１０ｍｇを得た。セファ
ロースＣＬ−６Ｂの溶出条件は、実施例２に記載の条件
によった。“そのボイド画分（３００ｇｇ）を、実施例
１に記載の方法によりフィブロネクチンを除去した後（
２５０ｇｇ）、Ｄ Ｅ Ａ Ｅ −５Ｐ Ｗを用いて精
製して、テネイシン６０μｇを得た。溶出パターンは実
施例１とほぼ同様であった。実施例１の方法で５Ｏ５−
ＰＡＧＥにより分析すると、得られたテネイシンの純度
は、はぼ１００％であった。
２３．５）３００匹に、９ｒｎ１の２Ｍ尿素１５０ｍＭ
）リス塩酸（ｐＨ８，０） １０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ム／２ｍＭ−ＰＭＳＦを加えて４℃で１２時間攪拌して
マウスーテネイシンを含む画分１０ｍｇを得た。セファ
ロースＣＬ−６Ｂの溶出条件は、実施例２に記載の条件
によった。“そのボイド画分（３００ｇｇ）を、実施例
１に記載の方法によりフィブロネクチンを除去した後（
２５０ｇｇ）、Ｄ Ｅ Ａ Ｅ −５Ｐ Ｗを用いて精
製して、テネイシン６０μｇを得た。溶出パターンは実
施例１とほぼ同様であった。実施例１の方法で５Ｏ５−
ＰＡＧＥにより分析すると、得られたテネイシンの純度
は、はぼ１００％であった。
第１図はヒトフィブロブラスト細胞より抽出したヒトー
テネイシンをセファロースＣＬ−４Ｂカラムで分離溶出
させたパターンであり、第２図、第３図は、それぞれゼ
ラチンカラム通過画分をＤＥＡＥ−５ＰＷを用いて分離
した場合の高速液体クロマトグラフィーのＵＶ吸収パタ
ーン、細胞接着性パターンである。第４図は、ヒトフィ
ブロブラスト細胞の培養液より得たヒトーテネイシンを
セファロースＣＬ−４Ｂカラムで分離溶出させたパター
ンであり、第５図、第６図は、それぞれゼラチンカラム
通過画分をＤＥＡＲ−５ＰＷを用いて分離した場合の、
高速液体クロマトグラフィーのＵＶ吸収パタ−ン、細胞
接着性パターンである６第７図、第８図は、それぞれヒ
トーメラノーマ細胞、ヒト−コンドザルコーマ細胞より
得たゼラチンカラム通過画分をＤ Ｅ Ａ Ｅ −５Ｐ
Ｗを用いて分離した場合の高速液体クロマトグラフィ
ーのＵＶ吸収パターンを示す。 ＯＤ （４９２ｎｍ） フヲクラヨンＮ。 第３図 第５図 第７図
テネイシンをセファロースＣＬ−４Ｂカラムで分離溶出
させたパターンであり、第２図、第３図は、それぞれゼ
ラチンカラム通過画分をＤＥＡＥ−５ＰＷを用いて分離
した場合の高速液体クロマトグラフィーのＵＶ吸収パタ
ーン、細胞接着性パターンである。第４図は、ヒトフィ
ブロブラスト細胞の培養液より得たヒトーテネイシンを
セファロースＣＬ−４Ｂカラムで分離溶出させたパター
ンであり、第５図、第６図は、それぞれゼラチンカラム
通過画分をＤＥＡＲ−５ＰＷを用いて分離した場合の、
高速液体クロマトグラフィーのＵＶ吸収パタ−ン、細胞
接着性パターンである６第７図、第８図は、それぞれヒ
トーメラノーマ細胞、ヒト−コンドザルコーマ細胞より
得たゼラチンカラム通過画分をＤ Ｅ Ａ Ｅ −５Ｐ
Ｗを用いて分離した場合の高速液体クロマトグラフィ
ーのＵＶ吸収パターンを示す。 ＯＤ （４９２ｎｍ） フヲクラヨンＮ。 第３図 第５図 第７図
Claims (1)
- テネイシンを含む細胞外基質抽出物をゼラチンを共有
結合させたアフィニティークロマトグラフィー内を通過
させてフィブロネクチンを溶質に対して１重量％以下と
なる様に除いた後、該通過画分から塩基性陰イオン交換
樹脂を用いてテネイシンを精製することを特徴とする、
テネイシンの精製方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63205902A JPH0256499A (ja) | 1988-08-19 | 1988-08-19 | テネイシンの精製方法 |
| EP89909433A EP0434836B1 (en) | 1988-08-19 | 1989-08-17 | Method for purifying tenascin |
| PCT/JP1989/000839 WO1990002140A1 (fr) | 1988-08-19 | 1989-08-17 | Procede de purification de teneicine |
| DE68924650T DE68924650T2 (de) | 1988-08-19 | 1989-08-17 | Verfahren zur reinigung von tenascin. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63205902A JPH0256499A (ja) | 1988-08-19 | 1988-08-19 | テネイシンの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0256499A true JPH0256499A (ja) | 1990-02-26 |
| JPH0555520B2 JPH0555520B2 (ja) | 1993-08-17 |
Family
ID=16514641
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63205902A Granted JPH0256499A (ja) | 1988-08-19 | 1988-08-19 | テネイシンの精製方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0434836B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0256499A (ja) |
| DE (1) | DE68924650T2 (ja) |
| WO (1) | WO1990002140A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7506434B2 (en) | 2003-06-09 | 2009-03-24 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Electronic parts mounting method |
| JP2010073929A (ja) * | 2008-09-19 | 2010-04-02 | Panasonic Corp | 電子部品実装装置および電子部品実装方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5610148A (en) * | 1991-01-18 | 1997-03-11 | University College London | Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment |
| US5629287A (en) * | 1991-01-18 | 1997-05-13 | University College London | Depot formulations |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61148127A (ja) * | 1984-12-21 | 1986-07-05 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＨＢｃ抗原の精製方法 |
-
1988
- 1988-08-19 JP JP63205902A patent/JPH0256499A/ja active Granted
-
1989
- 1989-08-17 WO PCT/JP1989/000839 patent/WO1990002140A1/ja not_active Ceased
- 1989-08-17 EP EP89909433A patent/EP0434836B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-17 DE DE68924650T patent/DE68924650T2/de not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7506434B2 (en) | 2003-06-09 | 2009-03-24 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Electronic parts mounting method |
| JP2010073929A (ja) * | 2008-09-19 | 2010-04-02 | Panasonic Corp | 電子部品実装装置および電子部品実装方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE68924650T2 (de) | 1996-04-11 |
| DE68924650D1 (de) | 1995-11-30 |
| EP0434836A4 (en) | 1991-10-16 |
| JPH0555520B2 (ja) | 1993-08-17 |
| EP0434836A1 (en) | 1991-07-03 |
| WO1990002140A1 (fr) | 1990-03-08 |
| EP0434836B1 (en) | 1995-10-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Buée et al. | Binding of secreted human neuroblastoma proteoglycans to the Alzheimer's amyloid A4 peptide | |
| Alhadeff et al. | Human liver alpha-L-fucosidase. Purification, characterization, and immunochemical studies. | |
| Wu et al. | Collagen-binding proteins in collagenase-released matrix vesicles from cartilage. Interaction between matrix vesicle proteins and different types of collagen. | |
| Lotan et al. | Purification of cell membrane glycoproteins by lectin affinity chromatography | |
| Schubert et al. | Characterization of an amyloid beta precursor protein that binds heparin and contains tyrosine sulfate. | |
| Smalheiser et al. | Purification of cranin, a laminin binding membrane protein: identity with dystroglycan and reassessment of its carbohydrate moieties | |
| Bernard et al. | Carbohydrates selectively protect a specific domain of fibronectin against proteases. | |
| Ou et al. | Purification and characterization of a processing protease from rat liver mitochondria. | |
| Davis et al. | Brain ankyrin. Purification of a 72,000 Mr spectrin-binding domain. | |
| Müller et al. | Quantitative and qualitative analyses of proteoglycans in cartilage extracts by precipitation with 1, 9-dimethylmethylene blue | |
| JPH04505014A (ja) | 新規の蛋白質及びその製法 | |
| Lamberg et al. | Synthesis of hyaluronic acid is decreased and synthesis of proteoglycans is increased when cultured mouse epidermal cells differentiate | |
| Burgess et al. | Sorting and secretion of adrenocorticotropin in a pituitary tumor cell line after perturbation of the level of a secretory granule-specific proteoglycan. | |
| Sherr et al. | Isolation of a disulfide-stabilized, three-chain polypeptide fragment unique to the precursor of human collagen | |
| US4746731A (en) | Isolated tissue protein PP18 | |
| Damsky et al. | Integral Membrane Glycoproteins Related to Cell–Substratum Adhesion in Mammalian Cells | |
| AU619177B2 (en) | Receptor of the small rhinovirus receptor group | |
| Tomida et al. | A serum factor capable of stimulating hyaluronic acid synthesis in cultured rat fibroblasts | |
| Cammarata et al. | Identification of noncollagenous components of calf lens capsule: Evaluation of their adhesion‐promoting activity | |
| JPH0256499A (ja) | テネイシンの精製方法 | |
| ISEMURA et al. | Isolation and characterization of human placenta fibronectin | |
| Lotan et al. | Biochemical and immunological characterization of K-1735P melanoma galactoside-binding lectins and their modulation by differentiation inducers | |
| Nadimpalli et al. | Mannose 6-phosphate receptors (MPR 300 and MPR 46) from a teleostean fish (trout) | |
| Seto et al. | Disc electrophoresis analysis of sialidase from influenza virus | |
| Klein et al. | Renal localization of heparan sulfate proteoglycan by immunohistochemistry |