JPH0257560B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な置換アルドステロン類に係り、
これらの置換アルドステロン類はラジオイムノア
ツセイ（以下、RIAと略称することあり）、ある
いはエンザイムノアツセイ（以下、EIAと略称す
ることあり）によるアルドステロン（以下、
ALDと略称することあり）の測定に有用なもの
である。 従来、ALDの測定はステロイドホルモン測定
のうちで最も困難なものの一つで、公知のイムノ
アツセイはその特性において必ずしも充分なもの
とは言い難かつた。 すなわち、イムノアツセイ法の良否は使用する
抗ハプテン抗血清の適否に大きく支配されるが、
この抗血清の特性は、免疫原の構造によつて左右
される。抗ハプテン抗血清の場合、その免疫原と
しての化合物は官能基が出来る限り遊離の状態の
ものが望ましいと言われている。 これまで報告されているALDのハプテンとし
ては、その21―ヘミサクシネート、３―（Ｏ―カ
ルボキシメチル）オキシムおよび、18、21―ビス
ヘミサクシネートなどが挙げられるが、いずれも
ALD自体の官能基の一部がブロツクされた形の
もので、必ずしも満足なハプテンとは言えない。 上記の状況にかんがみ、本発明者らは、ALD
のすべての官能基が遊離の状態にあるハプテンの
合成を試み、これに成功した。 したがつて、本発明の目的は、上記ハプテンの
ほかそれらの製造方法、上記ハプテンを含有する
アルドステロン検査用試薬の提供にある。 該検査用試薬には抗ハプテン抗血清、上記ハプ
テンを用いた標識体が含まれ、これらのものを組
合せて使用すれば、ALDのRIA法あるいはEIA
法による測定が可能である。これらのものに加
え、さらに標準ALDを組合せればRIAあるいは
EIA用のキツトを提供することができる。 上記目的を達成するため本発明によれば、 式 （但し、式中、R¹およびR²のいずれか一方は水
素、R¹が水素のときR²は―Ｓ―（CH₂）_1-3COR³
または―Ｏ―CO―（CH₂）_1-5COR³で表わされる
基、R²が水素のとき、R¹は―Ｓ―
（CH₂）_1-3COR³で表わされる基、ここで、R³はヒ
ドロキシ基、またはそれぞれヨウ素化されていて
もよいチラミン残基、チロシン低級アルキルエス
テル残基、ヒスタミン残基、ヒスチジン残基ある
いは７―アミノヘプタノイルチロシン低級アルキ
ルエステル残基をあらわす）で表わされる置換ア
ルドステロン類がハプテンとして提供される。 これらの置換アルドステロン（）のうち、
R³がヒドロキシ基ものは、タンパク質たとえば
牛血清アルブミン（BSA）と結合させたものを
抗原として、たとえばウサギを免疫することによ
り抗ALD抗血清を得ることができる。また他の
タンパク質すなわち標識用酵素たとえばホースラ
デイシユ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスフア
ターゼ、β―Ｄ―ガラクトシダーゼあるいはグリ
コシダーゼなどと結合させて、EIA用標識体とす
ることができる。 好適な置換アルドステロン（）は、（11β，
18―エポキシ―18α，21―ジヒドロキシ―３，20
―ジオキソ―４―プレグネン―４―チオ）酢酸、
（11β，18―エポキシ―18α，21―ジヒドロキシ―
３，20―ジオキソ―４―プレグネン―6β―イル
チオ）酢酸、11β，18―エポキシ―18α，21―ジ
ヒドロキシ―３，20―ジオキソ―４―プレグネン
―6αまたは6β―イルヘミサクシネートとして例
示できる。 また、上記置換アルドステロン（）のうち、
R³がヒドロキシ基以外ものは、慣用されている
クロラミンＴ法、酵素法などにより放射性ヨウ
素、たとえば、 ¹²⁵I、 ¹³¹Iによつて標識したう
えRIA用標識体とすることができる。 好適なものは次のように例示できる。すなわ
ち、Ｎ―（ｐ―ヒドロキシフエネチル）―２―
（11β，18―エポキシ―18α，21―ジヒドロキシ―
３，20―ジオキソ―４―プレグネン―４―イルチ
オ）アセトアミド，11β，18―エポキシ―18α，
21―ジヒドロキシ―３，20―ジオキソ―４―プレ
グネン―6α（または6β）―イル＝４―（ｐ―ヒド
ロキシフエネチルアミノ）―４―オキソブチラー
トなどである。 また本発明によれば 式 （但し、式中R¹およびR²は前記と同意義、また
Ｘはグリコールの保護基を表わす）で表わされる
化合物を脱保護基反応に付することを特徴とす
る、 式 （但し、式中R¹およびR²は前記と同意義）で表
わされる置換アルドステロン類（）の製造方法
が提供される。 上記式中―Ｓ―（CH₂）_1-3COR³はカルボキシ
メチルチオ、カルボキシエチルチオ、カルボキシ
プロピルチオ基、―Ｏ―CO―（CH₂）_1-5COR³は
ヘミマロニルオキシ、ヘミサクシニルオキシ、ヘ
ミグルタリルオキシ、ヘミアジポイルオキシ、ヘ
ミピメロイルオキシ基を表わす。 上記製造方法を出発物質の合成経路を含めて概
括的に式示すれば次のとおりである： （ここで、R¹、R²およびＸは前記と同意義、R⁴
は低級アルキル基、Ｙはヒドロキシ基または臭素
を表わす） すなわち、先ずヘミアセタール型のALD、
11β，18―エポキシ―18α，21―ジヒドロキシ―
４―プレグネン―３，20―ジオン（）の３位カ
ルボニルをエノールエーテル化し、かつ20，21位
をアセトニド保護して、化合物（）を得る。こ
の化合物（）をブロム化した場合Ｙが臭素であ
る化合物（）が得られる。一方過酸（たとえ
ば、ｍ―クロル過安息香酸、あるいはモノ過フタ
ル酸）処理するとＹがヒドロキシ基である化合物
（）が得られる。 Ｙが臭素である化合物（）（Ｙ＝Br）をナト
リウム・メチルチオグリコールと反応させると、
対応するアセチルチオ誘導体（）（R¹，R²のい
ずれか一方がＨ、他方がSCH₂COOCH₃）が得ら
れる。 こうして得られたアセチルチオ誘導体（）の
一つを室温・窒素気流中、塩基性条件（含水メタ
ノール中、炭酸カリウム、１〜６時間）で加水分
解すると対応するカルボン酸（′）（R¹、R²の
いずれか一方がＨ、他方がSCH₂COOH）が得ら
れる。 一方Ｙがヒドロキシ基である化合物（）（Ｙ
＝OH）に無水コハク酸を塩基性条件（ピリジン
中、４―ジメチルアミノピリジン触媒存在下、24
〜63時間）、加温（30〜70℃）のもとに反応させ
ると、対応するヘミサクシニル誘導体（）（R¹
＝Ｈ，R²＝OCOCH₂CH₂COOH）が得られる。 これらのアセチルチオ誘導体（）（R¹、R²の
いずれか一方がＨ、他方がSCH₂COOH）あるい
はヘミサクシニル誘導体（）（R¹＝Ｈ，R²＝
OCO―CH₂CH₂COOH）に、氷冷下テトラヒド
ロフラン中で、チラミン、１けヒドロキシベンゾ
トリアゾールおよびジシクロヘキシルカルボジイ
ミドを順次加えて７〜21時間反応させると、それ
ぞれ対応するチラミン付加体（）［（R¹または
R²のいずれか一方がＨ、他方が

【式】あるいは （R¹＝Ｈ，

【式】が得 られる。 これらの化合物（）に対し、好ましくは室
温、不活性気流中、酸性条件下に脱保護基反応を
施せば、それぞれ対応する目的化合物（）、た
とえば、（11β，18―エポキシ―18α，21―ジヒド
ロキシ―３，20―ジオキソ―４―プレグネン―４
（または6β）―イルチオ）酢酸、または11β，18
―エポキシ―18α，21―ジヒドロキシ―３，20―
ジオキソ―４―プレグネン―6β（または6α）―イ
ル＝ヘミサクシネートなどが得られる。 この脱保護基反応は、ステロイド一般に関して
公知の、たとえばGreene，T.W.，著
“Protective Groups in Organic Synthesis
“（1981）に記載の条件で可能である。たとえば、
酸として塩酸、硫酸、過塩素酸などの鉱酸、ギ
酸、酢酸、プロピオン酸、ｐ―トルエンスルホン
酸などの有機酸、その他BCI₃などのルイス酸お
よび酸型イオン交換樹脂を利用した脱アセトニド
条件が適用可能である。さらに具体的には、70％
酢酸を用い２〜12時間反応させる条件、ジオキサ
ンあるいはテトラヒドロフラン中で1N―塩酸
（添加濃度；２〜20％）を作用させる条件、ある
いはメタノールあるいはアセトン中でｐ―トルエ
ンスルホン酸（濃度；0.1〜１％）を作用させる
条件が挙げられ、いずれも有利に化合物（）を
得られる。 これらは後記方法によつて牛血清アルブミンと
のコンジユゲートを作りこれを免疫原とする抗血
清の作製に用いられ、また、酵素で標識したう
え、EIA用のトレーサーとして用いられる。 また、化合物（）（R¹またはR²のいずれか一
方がＨ、他方が

【式】あるい は ）より得られた化合物（）（R³＝チラミン残
基）たとえば、Ｎ―（ｐ―ヒドロキシフエネチ
ル）―２―（11β，18―エポキシ―18α，21―ジ
ヒドロキシ―３，20―ジオキソ―４―プレグネン
―４―イルチオ）アセトアミド、または11β，18
―エポキシ―18α（または18β）、21―ジヒドロキ
シ―３，20―ジオキソ―４―プレグネン―6β（ま
たは6α）―イル＝４―（ｐ―ヒドロキシフエネ
チルアミノ）―４―オキソブチラートは、後記す
るように放射性ヨウ素で標識してRIA用のトレー
サーとして用いられる。 前記した置換ALD類のうち少くとも一つは、
血清ALDのイムノアツセイ法のために、抗ハプ
テン抗血清作製用ハプテン、あるいは標識用抗原
（トレーサー）として使用することができるもの
である。これらは、さらに標準ALDと組合せて
RIAあるいはEIA用キツトとすることができる。 該イムノアツセイ法において使用する抗ハプテ
ン抗血清は、先ず前記化合物（）のうちR³が
水酸基である化合物（）（R³＝OH）を、それ
自体公知の慣用手段、たとえば混酸無水物法によ
つて牛血清アルブミンとの結合物（BSAコンジ
ユゲート）とした上、これを免疫原として家兎に
数回繰返し注射したのち、その家兎より採血して
得られるものである。 混酸無水物法は、化合物（）（R³＝Ｈ）を、
たとえばジオキサンに溶かし、乏にトリ―ｎ―ブ
チルアミンおよびイソブチルクロルカーボネート
を加え、８〜10℃で30分間撹拌すると、化合物
（）―COOCOOC₄H₉の活性エステルができる。
これにBSAの含水ジオキサン溶液（NaOHでPH
8.5に調整）を加え、撹拌をつづけると化合物
（）のBSAコンジユゲートが得られる方法であ
る。 乏に対し、冷水中での透析、PHの調整、遠心分
離による沈渣の採取、採取した沈渣の重曹溶液に
よる溶解、冷水中での再透析などの精製操作を施
して免疫原とする。 このほか、カルボジイミド法（エチルカルボジ
イミドまたはモルホカルボジイミドを用いる）あ
るいはイソキサゾリウム法も用いられる。 また、これらの方法は、次の酵素で標識する場
合も全く同様に利用される。BSAが酵素とおき
代るだけである。（たとえば鎮目和夫他編［新版
ラジオイムノアツセイ」朝倉書店1997年刊行、お
よび石川栄治他「酵素免疫測定法」医学書院1978
年刊行参照） また標識用抗原は、EIAの場合には、前記化合
物（）のうちR³が水酸基であるものを、公知
の慣用方法、たとえば活性エステル法によつて酵
素で標識して作製する。RIAの場合には、前記化
合物（）のうちR³が水酸基以外のものをそれ
自体公知の慣用手段、たとえばクロラミンＴ法あ
るいは酵素法などにより放射性ヨウ素（ ¹²⁵Iま
たは ¹³¹I）によつて標識して作製する。 すなわちクロラミンＴでヨウ素イオンを酸化す
るか、過酸化水素とラクトペルオキシダーゼとの
組合せで酸化して得た原子状ヨウ素を利用して、
たとえばヒドロキシフエニルのメタ位にヨウ素を
導入する方法が採用される（前記「新版ラジオイ
ムノアツセイ」参照）。 イムノアツセイ法はそれ自体公知の方法に従つ
て行ない、EIAの場合には、たとえば螢光強度測
定における、標準液と被測定血清との測定値を比
較することによつて定量する。 RIAの場合には、たとえばウエル型シンチレー
シヨン・カウンターで測定した標準液と被検血清
の放射活性との対比によつて求める。 本発明によつて提供されるハプテンを使用した
イムノアツセイ用キツトには標準物質としての
ALDと化合物（）の放射化あるいは酵素標
識物または化合物（）より得た抗血清が含ま
れる。後二者のうちいずれかは公知のALD誘導
体由来のものでもよい。その他所望に応じ、緩衝
液、Ｆ／Ｂ（遊離／結合）分離試薬［（たとえば
PEG）あるいは第２抗体（２抗体法で前記を
第１抗体とする場合）］を含むものであつてもよ
い。 前記したように、本発明によつて提供されるハ
プテンを用いれば、感度、交叉反応性においてす
ぐれたイムノアツセイを実施しうることが判明
し、次記実施例の記載において更に詳細に説明す
るように、本発明の公知技術に対する優位性が裏
付けられた。 以下の実施例および参考例において、化合物に
は、原則として前記参照番号に準拠し、関連する
番号を付した。なお化合物物性値の記載中、
NMRは、特記しない限り60MHzにおけるスペク
トルを示し、薄層クロマトグラフイ（TCL）の
RF値は、「プレコーテツド・シリカゲル―60―プ
レート0.25mm」（メルク社製）を用いて得られた
ものである。 実施例 １ （11β，18―エポキシ―18α，21―ジヒドロキ
シ―３，20―ジオキソ―４―プレグネン―４―
イルチオ）酢酸（）（R¹＝SCH₂COOH，R²
―Ｈ）の製造 メチル（11β，18；18α，20β―ビスエポキシ―
20α，21―イソプロピリデンジオキシ―３―オキ
ソ―４―プレグネン―４―イルチオ）アセテート
（）（R¹＝SCH₂COOCH₃，R²＝Ｈ，20，21（Ｓ）
アセトニド）82mgにメタノール８mlと水４mlを加
えたものに窒素ガス気流中、室温にて炭酸カルウ
ム90mgを加え２時間30分反応させた。 反応混合物を酢酸で中和し、酢酸エチルで抽出
した。抽出物を飽和食塩水で繰返し洗浄し、硫酸
ナトリリウムで乾燥、ついで減圧下に溶媒を留去
してアメ状の（11β，18；18α，20β―ビスエポキ
シ―20α，21―イソプロピリデンジオキシ―３―
オキソ―４―プレグネン―４―イルチオ）酢酸
（′）（R¹＝SCH₂COOH，R²＝Ｈ，20，21（Ｓ）
アセトニド）を得た。 （′）（R¹＝SCH₂COOH，R²＝Ｈ，20，21（Ｓ）
アセトニド） NMR（CDCl₃，δ） 1.34，1.50（9H，19Hおよび

【式】） 3.38（2H，ｓ，―SCH₂CO） 3.92，4.03（2H，ABq，J_AB＝９Hz，ν〓_AB＝6.3
Hz，21―CH₂―） 4.87（1H，ｄ，Ｊ＝６Hz，11―Ｈ） 5.33（1H，Ｓ，18―Ｈ） 7.22（1H broad―COOH） これをそのまま70％酢酸溶液３mlに加え、窒素
ガス気流中、室温にて６時間撹拌したのち氷水を
加え酢酸エチルで抽出した。抽出物を飽和食塩水
で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥、ついで減圧下
に溶媒を留去した。残渣をメタノールから再結晶
して無色針状晶の標記化合物（）（R¹＝SCH₂
―COOH，R²＝Ｈ）34mgを得た。（（）からの
収率46.7％） mp.121〜123℃ 元素分析：C₂₃H₃₀O₇S（450.536）として 計算値：Ｃ，61.31；Ｈ，6.71；Ｓ，7.12 実験値：Ｃ，61.11；Ｈ，6.95；Ｓ，6.88 ［α］²³ _D＋136.8±1.7 （ｃ＝1.068，クロロホルム；メタノール＝
１：１） UVλ^EtOH _nax（nm；ε）245.5（10700） 305（2250） IRν^Nujol _nax（cm^-1）3470（sh），3415，3238，2660
，
1710，1672，1550. NMR（CD₃OD，δ） 1.31，1.35（3H，19―Ｈ） 3.44（2H，ｓ，―SCH₂CO―） 3.70（1H，ｍ，6α―Ｈ） 4.58（1H，ｄ，Ｊ＝６Hz，11―Ｈ） 5.02，5.43（1H，18―Ｈ） 質量分析：ｍ／z432（M⁺・−18＜１％） 〃 414（M⁺.−36 ８％） 〃 342（M⁺.−108 ４％） 〃 44（100％） 〃 18（97％） このほか、本品はメチル（11β，18；18α，20α
―ビスエポキシ―20β，21―イソプロピリデンジ
オキシ―３―オキソ―４―プレグネン―４―イル
チオ）アセテート（）（R¹＝SCH₂COOCH₃，
R²＝Ｈ，20，21（Ｒ）アセトニド）を同様に処理
し、（11β，18；18α，20α―ビスエポキシ―20β，
21―イソプロピリデンオキシ―３―オキソ―４―
プレグネン―４―イルチオ）酢酸（′）（R¹＝
SCH₂COOH，R²＝Ｈ，20，21（Ｒ）アセトニド）
を得て得られた。 （参考物性値） （′）（R¹＝SCH₂COOH，R²＝Ｈ，20，21（Ｒ）
アセトニドmp.168〜170℃ 元素分析：C₂₆H₃₄O₇S（490.598）として 計算値：Ｃ，63.65；Ｈ，6.99；Ｓ，6.54 実験値：Ｃ，63.72；Ｈ，6.85；Ｓ，6.64 ［α］²³ _D＋104.1±1.4 （ｃ＝1.00，クロロホルム） NMR（CDCl₃，δ） 1.34，1.40，1.50（9H，19―Ｈおよび

【式】） 3.37（2H，ｓ，―SCH₂CO―） 3.89，4.18（2H，ABq，J_AB＝９Hz，ν〓_AB＝17
Hz，21―CH₂―） 4.83（1H，ｄ，Ｊ＝６Hz，11―Ｈ） 5.30（1H，ｓ，18―Ｈ） 5.90（1H，broad，―COOH） 質量分析：ｍ／z489（M⁺・−１，16％） 〃 471（M⁺・−19，７％） 〃 400（M⁺・−90，20％） 〃 43（100％） 実施例 ２ （11β，18―エポキシ―18α，21―ジヒドロキ
シ―３，20―ジオキソ―４―プレグネン―6β
―イルチオ）酢酸、（6β―カルボキシメチルチ
オALD）、（）（R¹＝Ｈ，R²＝β・
SCH₂COOH）の製造 実施例１と同様な操作をメチル（11β，18；
18α，20β―ビスエポキシ―20α，21―イソプロピ
リデンジオキシ―３―オキソ―４―プレグネン―
6β―イルチオ）アセテート（）（R¹＝Ｈ，R²＝
β・SCH₂COOCH₃，20，21（Ｓ）アセトニドに
施し、（11β，18；18α，20β―ビスエポキシ―
20α，21―イソプロピリデンジオキシ―３―オキ
ソ―４―プレグネン―6β―イルチオ）酢酸
（′）（R¹＝Ｈ，R²＝β・SCH₂COOH，20，21
（Ｓ）アセトニド）を経て、標記化合物（）
（R¹＝Ｈ，R²＝β・SCH₂COOH）を得た。 （物性値） （′）（R¹＝Ｈ，R²＝β・SCH₂COOH，20，21
（Ｓ）アセトニド）mp.210〜213℃ NMR（CD₃OD，δ） 1.50，1.54（9H，19―Ｈおよび

【式】） 5.41（1H，ｓ，18―Ｈ） 5.76（1H，ｓ，４―Ｈ） （）（R¹＝Ｈ，R²＝β・SCH₂COOH），
mp.164〜166℃ 元素分析：C₂₃H₃₀O₇S（450.536）H₂Oとして 計算値：Ｃ，58.95；Ｈ，6.85；Ｓ，6.84 実験値：Ｃ，58.38；Ｈ，6.65；Ｓ，6.31 質量分析：ｍ／z414（M⁺・−36＜１％） 〃 44（45％） 〃 18（100％） 本品はこのほか、メチル（11β，18，18α，20α
―ビスエポキシ―20β―イソプロピリデン―３―
オキソ―４―プレグネン―6β―イルチオ）アセ
テート（）（R¹＝Ｈ，R²＝β・SCH₂―
COOCH₃，20，21（Ｒ）アセトニド）を同様に処
理し、（11β，18；18α，20α―ビスエポキシ―20β
―イソプロピリデン―３―オキソ―４―プレグネ
ン―6β―イルチオ）酢酸（′）（R¹＝Ｈ，R²＝
β・SCH₂COOH，20，21（Ｒ）アセトニド）を
経て得られた。 （参考物性値） （′）（R¹＝Ｈ，R²＝β.SCH₂COOH，20，21
（Ｒ）アセトニド）、mp.164〜166℃ 元素分析：C₂₆H₃₄O₇S₄（490.598）として 計算値：Ｃ，63.65；Ｈ，6.99；Ｓ，6.54 実験値：Ｃ，63.90；Ｈ，6.76；Ｓ，6.46 ［α］²⁷ _D＋144.6±1.0 （ｃ＝1.010，クロロホルム） UVλ^EtOH _nax（nm；ε）243（13200） IR：ν^Nujol _nax（cm^-1）3300〜3000，2628，1730，
1722，1649，1599，1063，886. NMR（CDCl₃，δ） 1.40，1.50，1.54（9H，19―Ｈおよび

【式】） 3.16（2H，ｓ，―SCH₂CO―） 3.88，4.16（2H，ABq，J_AB＝９Hz，ν〓_AB＝
1.68Hz，21―CH₂―） 4.81（1H，ｄ，Ｊ＝６Hz，11―Ｈ） 5.31（1H，Ｓ，18―Ｈ） 5.81（1H，ｓ，４―Ｈ） 質量分析：ｍ／z472（M⁺・−18 １％） 〃 414（M⁺.−76 ７％） 〃 44（100％） 参考例 １ （実施例１，２用原料の製造） 上記実施例１および２において出発原料として
用いた化合物（）［（R¹＝SCH₂COOCH₃，R²＝
Ｈ，20，21（Ｓ）および（Ｒ）アセトニド）およ
び（R¹＝Ｈ，R²＝β・SCH₂COOCH₃，20，21
（Ｓ）アセトニド）］はそれぞれ次のようにして得
られたものである。 すなわち、先ずジメチルホルムアミド中で、ヘ
ミアセタール型のALD、すなわち11β，18―エポ
キシ―18α，21―ジヒドロキシ―４―プレグネン
―３，20―ジオン（）にｐ―トルエンスルホン
酸の存在のもとに２，２―ジメトキシプロパンを
作用させることにより11β，18；18α，20β―ビス
エポキシ―20α，21―イソプロピリデンジオキシ
―３―メトキシ―３，５―プレグナジエン（）
（20，21（Ｓ）アセトニドおよび11β，18；18α，
20α―ビスエポキシ―20α，21―イソプロピリデ
ンオキシ―３―メトキシ―３，５―プレグナシエ
ン（）（20，21（Ｒ）アセトニド）とした。 次に、これらの化合物（）［（20，21（Ｓ）ア
セトニド）および（20，21（Ｒ）アセトニド）］に
個別にＮ―ブロモアセトアミドを反応させ、それ
ぞれ6β―ブロモ―11β，18；18α，20β―ビスエポ
キシ―20α，21―イソプロピリデンジオキシ―４
―プレグネン―３―オン（）（R¹＝Ｈ，R²＝
β・Br，20，21（Ｓ）アセトニド）または6α―ブ
ロモ―11β，18；18α，20β―ビスエポキシ―20α，
21―イソプロピリデンジオキシ―４―プレグネン
―３―オン（）（R¹＝Ｈ，R²＝α・Br，20，21
（Ｓ）アセトニド）あるいは、6β―ブロモ―11β，
18；18α，20α―ビスエポキシ―20β，21―イソプ
ロピリデンジオキシ―４―プレグネン―３―オン
（）（R¹＝Ｈ，R²＝β・Br，20，21（Ｒ）アセト
ニド）または6β―ブロモ―11β，18；18α，―ビ
スエポキシ―20β，21―イソプロピリデンジオキ
シ―４―プレグネン―３―オン（）（R¹＝Ｈ，
R²＝α・Br，20，21（Ｒ）アセトニド）とした。
これらは単離することなくメチルチオグリコール
酸ナトリウムと室温下に反応させた結果、それぞ
れ主生成物として（）［（R¹＝SCH₂COOCH₃，
R²＝Ｈ，20，21（Ｓ）および（Ｒ）アセトニド）］
が得られ、同時に少量の（）［（R¹＝Ｈ，R²＝
β・SCH₂COO―CH₃，20，21（Ｓ）および（Ｒ）
アセトニド）］を得た。なお、後者はいずれも6β
体で6α体は得られなかつた。 以下、これら中間体の物性値を記載する。 （）（20，21（Ｓ）アセトニド）mp.164〜168℃
（アセトン／ヘキサンより再結晶） 元素分析：C₂₅H₃₄O₅（441.522）として 計算値：Ｃ，72.43；Ｈ，8.27 実験値：Ｃ，72.39；Ｈ，8.31 ［α］²⁶ _D−32.4±1.0 （ｃ＝0.701，クロロホルム） UV：λ^EtOH _nax（nm；ε）240.5（19500） IRν^Nujol _nax（cm^-1）1650，1625，1246，1236，
1168，1048，1020，996 NMR（CDCl₃，δ） 1.08，1.34，1.51（9H，19―Ｈおよび

【式】） 3.58（3H，ｓ，―OCH₃） 3.88，4.04（2H，ABq，J_AB＝９Hz，ν〓_AB＝6.3
Hz，21―CH₂） 4.90（1H，ｄ，Ｊ＝６Hz，11―Ｈ） 5.14（2H，4Hおよび６―Ｈ） 5.33（1H，ｓ，18―Ｈ） （）（20，21（Ｒ）アセトアニド）mp.126〜129
℃（ジクロルメタン／メタノールより） 元素分析：C₂₅H₃₄O₅（414.522）として 計算値：Ｃ，72.43；Ｈ，8.27 実験値：Ｃ，72.38；Ｈ，8.27 ［α］²⁶ _D−86.1±2.0 （ｃ＝0.634，クロロホルム） UV：λ^EtOH _nax（nm；ε）240.5（19150） IR：ν^Nujol _nax（cm^-1）1648，1622，1233，1180，
1168，1071，1053，989、725 NMR（CDCl₃，δ） 1.09，1.40，1.50（9H，19―Ｈおよび

【式】） 3.59（3H，ｓ，―OCH₃） 3.90，4.20（2H，ABq，J_AB＝９Hz，ν〓_AB＝
17.9Hz，21―CH₂―） 4.90（1H，ｄ，Ｊ＝６Hz，11―Ｈ） 5.15（2H，4Hおよび６―Ｈ） 5.30（1H，ｓ，18―Ｈ） （）（R¹＝SCH₂COOCH₃，R²＝Ｈ，20，21
（Ｓ）アセトニド）mp.118〜120℃（アセトン／
ヘキサンより） 元素分析：C₂₇H₃₆O₇S（504.624）として 計算値：Ｃ，64.26；Ｈ，7.19；Ｓ，6.35 実験値：Ｃ，64.09；Ｈ，7.07；Ｓ，6.07 ［α］²⁴ _D＋169.3±2.1 （ｃ＝0.984，クロロホルム） UV：λ^EtOH _nax（nm；ε）242（11570）303（2550） IR：ν^Nujol _nax（cm^-1）1732，1667，1551，1226，
1192，1050，1012，990，885，815 NMR（CDCl₃，δ）100MHz 1.34，1.49（9H，19―Ｈおよび

【式】） 3.36，3.42（2H，ABq，J_AB＝14Hz，ν〓_AB＝5.9
Hz，―SCH₂CO―） 3.64（3H，ｓ，―OCH₃） 3.90，4.02（2H，AB_q，J_AB＝９Hz，ν〓_AB＝12
Hz，21―CH₂） 4.86（1H，ｄ，Ｊ＝６Hz，11―Ｈ） 5.30（1H，ｓ，18―Ｈ） 質量分析： ｍ／z504（M⁺.29％） ｍ／z446（M⁺.−58，37％） ｍ／z43（100％） （）（R¹＝Ｈ，R²＝β・SCH₂COOCH₃，20，
21（Ｓ）アセトニド）mp.206〜208℃（アセト
ン／ヘキサンより再結晶） 元素分析：C₂₇H₃₆O₇S（504.624）として 計算値：Ｃ，64.26；Ｈ，7.19；Ｓ，6.35 実験値：Ｃ，64.90；Ｈ，7.37；Ｓ，7.15 ［α］²⁴ _D＋210.3±3.2 （ｃ＝0.787，クロロホルム） UV：λ^EtOH _nax（nm；ε）241（15400） IR：ν^Nujol _nax（cm^-1）1732，1682，1605，1051，
1028，999 NMR（CDCl₃，δ）100MHz（サンプル中にジ
エチルエーテル混入） 1.42，1.49，1.52（9H，19―Ｈおよび

【式】） 3.14（2H，―SCH₂CO） 3.72（3H，ｓ，―OCH₃） 3.92，4.03（2H，AB_q，J_AB＝９Hz，ν〓_AB＝11
Hz，21―CH₂―） 4.83（1H，ｄ，Ｊ＝６Hz，11―Ｈ） 5.34（1H，ｓ，18―Ｈ） 5.70（1H，ｓ，４―Ｈ） 質量分析： ｍ／z504（M⁺.、80％） ｍ／z446（M⁺.−58，72％） ｍ／z43（100％） （）（R¹＝SCH₂COOCH₃，R¹＝Ｈ，20，21
（Ｒ）アセトニド）mp.140〜142℃（アセトン／
ヘキサンより） 元素分析：C₂₇H₃₆O₇S（504.624）として 計算値：Ｃ，64.26；Ｈ，7.19；Ｓ，6.35 実験値：Ｃ，64.34；Ｈ，7.24；Ｓ，6.32 ［α］²⁶ _D＋95.5±1.1 （ｃ＝1.034，クロロホルム） UV：λ^EtOH _nax（nm；ε）241.5（11760） 303（2540） IR：ν^Nujol _nax（cm^-1）1749，1730，1721，1556，
1202，1146，1068，1050，1020，997，882 NMR（CDCl₃，δ）100MHz 1.35，1.39，1.49（9H，19―Ｈおよび

【式】） 3.36、3.42（2H，ABq，J_AB＝14Hz，ν〓_AB＝6.1
Hz，―SCH₂CO―） 3.65（3H，ｓ，―OCH₃） 3.88，4.16（2H，ABq，J_AB＝９Hz，ν〓_AB＝28
Hz，21―CH₂―） 4.83（1H，ｄ，Ｊ＝６Hz，11―Ｈ） 5.28（1H，ｓ，18―Ｈ） 質量分析： ｍ／z504（M⁺・、62％） ｍ／z72（100％） （）（R¹＝Ｈ，R²＝β・SCH₂COOCH₃，20，
21（Ｒ）アセトニド）mp.192〜194℃（アセト
ン／ヘキサンより） 元素分析：C₂₇H₃₆O₇S（504.624）として 計算値：Ｃ，64.26；Ｈ，7.19；Ｓ，6.35 実験値：Ｃ，64.53；Ｈ，7.19；Ｓ，6.61 ［α］²⁴ _D＋150.1±1.9 （ｃ＝0.997，クロロホルム） UV：λ^EtOH _nax（nm；ε）241.5（15300） IR：ν^Nujol _nax（cm^-1）1720，1682，1607，1160，
1077，1063，1023 NMR（CDCl₃，δ）100MHz 1.39，1.49，1.53（9H，19―Ｈおよび

【式】） 3.10，3.19（2H，ABq，J_AB＝15Hz，ν〓_AB＝19
Hz，―SCH₂CO―） 3.73（3H，ｓ，―OCH₃） 3.86，4.16（2H，ABq，J_AB＝９Hz，ν〓_AB＝28
Hz，21―CH₂―） 4.81（1H，ｄ，Ｊ＝６Hz，11―Ｈ） 5.30（1H，ｓ，18―Ｈ） 5.71（1H，ｓ，４―Ｈ）

【表】 実施例 ３ Ｎ―（ｐ―ヒドロキシフエネチル）―２―
（11β，18―エポキシ―18α，21―ジヒドロキシ
―３，20―ジオキソ―４―プレグネン―４―イ
ルチオ）アセトアミド（） R²＝Ｈの製造 Ｎ―（ｐ―ヒドロキシフエネチル）―２―
（11β，18；18α，20β―ビスエポキシ―20α，21―
イソプロピリデンジオキシ―３―オキソ―４―プ
レグネン―４―イルチオ）アセトアミド（） R²＝Ｈ，20，21（Ｓ）アセトニド）27mgに70％酢
酸３mlを加え、窒素ガス気流中、室温において５
時間反応させた。反応混合物に氷水を加え酢酸エ
チルで抽出し、食塩水で繰返し洗浄し、硫酸ナト
リウムで乾燥したのち、減圧下に溶媒を留去す
る。残渣をメタノールに溶かして活性炭末で処理
し、これにエーテルを加えて粉末状の標記化合物
（） （ R²＝Ｈ）21mgを沈殿させた。114〜117℃にて軟
化。 NMR（d₆―アセトン，δ） 1.22，1.30、1.35（3H，19―Ｈ） 4.54，4.78（1H各，ｄ，Ｊ＝６Hz，11―Ｈ） 5.06，5.40（1H 各，ｓ，18―Ｈ） 6.77，7.05（4H，A₂B₂q，J_AB＝８Hz，ν〓_AB＝
17Hz，

【式】） NMR（CD₃OD，δ） 1.23，1.34（3H，19―Ｈ） 5.03，5.45（1H各，ｓ，18―Ｈ） 6.74，7.05（4H，A₂B₂q，J_AB＝８Hz，ν〓_AB＝
18.4Hz，

【式】） UV：λ^EtOH _nax（nm；ε）225.5（13800） 242（8900） 279（3000） 285.5（300） 299（2300） TLC Rf＝0.32（ジクロルメタン：アセトン１：１） また化合物（）は，Ｎ―（ｐ―ヒドロキシフ
エネチル）―２―（11β，18―18；18α，20β―ビ
スエポキシ―20α，21―イソプロピリデンジオキ
シ―３―オキソ―４―プレグネン―４―イルチ
オ）アセトアミド（）（ R²＝Ｈ，20，21（Ｒ）アセトニド）を同様に処理
することによつても得られた。 実施例 ３―１ Ｎ―（ｐ―ヒドロキシ―α―メトキシカルボニ
ルフエネチル）―２―（11―β，18―エポキシ
―18α，21―ジヒドロキシ―３，20―ジオキソ
―４―プレグネン―４―イルチオ）アセトアミ
ド（）（ R²＝Ｈ）の製造 Ｎ―（ｐ―ヒドロキシ―α―メトキシカルボニ
ルフエネチル）―２―（11β，18；18α，20β―ビ
スエポキシ―20―α，21―イソプロピリデンオキ
シ―３―オキソ―４―プレグネン―４―イルチ
オ）アセトアミド（）（20，21（Ｒ）アセトニ
ド），27mgに70％酢酸２mlを加え、窒素ガス気流
中、室温において７時間反応させた。反応混合物
に氷水を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水
中で繰返し洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた
のち、減圧下に溶媒を留去した。残渣を、逆相ク
ロマトグラフ（メルク社製ローバーカラム、RP
―８，サイズＢ；溶離液，含水65％メタノール）
に付し、得られた主画分にエーテルを加えて粉末
状の標記化合物（）18mgを得た。 収率，70.9％。 NMR（d₆―アセトン，δ） 1.23，1.33（3H，19―Ｈ） 3.31（2H，ｓ，―SCH₂CO） 3.65（3H，ｓ，―COOCH₃） 4.51（1H，ｍ，NHCＨCOO―） 4.56，4.77（1H各，ｄ，11―Ｈ） 5.06，5.40（1H各，ｓ，18―Ｈ） 6.77，7.06（4HA₂B_2q，J_AB＝８Hz，ν〓_AB＝
17.2，

【式】） 7.63（1H，ｄ，Ｊ＝7.5Hz，―CONH） 質量分析： ｍ／z627（M⁺・62％） 〃 178（100％） TCL： Rf，0.19（クロロホルム：アセトン＝１：１） Ｒ ，0.33（クロロホルム：メタノール＝９：
１） 実施例 ３―２ Ｎ―［２―（1H―イミダゾール―４―イル）
エチル］―２―（11β，18―エポキシ―18α，
21―ジヒドロキシ―３，20―ジオキソ―４―プ
レグネン―４―イルチオ）アセトアミド（）
（

【式】R²＝ Ｈ）の製造 Ｎ―［２―（1H―イミダゾール―４―イル）
エチル］―２―（11β，18；18α，20β―ビスエポ
キシ―20―α，21―イソプロピリデンオキシ―３
―オキソ―４―プレグネン―４―イルチオ）アセ
トアミド（20，21（Ｒ）アセトニド（），12mgに
70％酢酸１mlを加え、窒素ガス気流中、室温にお
いて6.5時間反応させた。反応混合物を前記実施
例３―１と同様に処理して粉末状（87℃にて軟
化）の標記化合物（）６mgを得た。収率，53.7
％。 NMR（d₆―アセトン，δ） 1.22，1.33（3H，19―Ｈ） 4.55，4.77（1H各，ｄ，11―Ｈ） 5.06，5.41（1H各，ｓ，18―Ｈ） 6.85，7.62（2H各，ブロードｓ，

【式】） 7.55（1H，―NH―） 質量分析： ｍ／z543（M⁺・１％） 〃 94（100％） TCL： Rf，0.19（クロロホルム：メタノール＝５：１） 参考例 ２ （実施例３の出発原料の製造） 上記実施例３の出発原料（） ［（ R²＝Ｈ） 20，21（Ｓ）または（Ｒ）アセトニド］は前記
参考例１に記載の化合物（） ［（R¹＝SCH₂COOCH₃，R²＝Ｈ）20，21（Ｓ）
または（Ｒ）アセトニド］を脱メチル化して得た
対応するカルボン酸に氷冷下テトラヒドロフラン
中で、チラミン，１―ヒドロキシベンゾトリアゾ
ールおよびジシクロヘキシルカルボジイミドを順
次加えて反応（W.Kｏ¨nig，ら：Chem.Ber.103，
788（1970）参照）させたのち精製して得られる。

【表】 質量分析： ｍ／z609（M⁺・３％） 〃 594（M⁺・−153％） 〃 120（100％） TCL： Rf，0.30（酢酸エチル：ベンゼン＝４：１） 0.41（クロロホルム：アセトン＝３：１） 参考例 ２―１ （実施例３―１の出発原料の製造） また、上記実施例３―１の出発原料（） ［ R²＝Ｈ，20，21（Ｓ）または（Ｒ）アセトニド］
は前記参考例１に記載の化合物（）［（R¹＝
SCH₂COOCH₃，R²＝Ｈ），20，21（Ｓ）または
（Ｒ）アセトニド］を前記と同様に処理して得ら
れる。（Ｒ）アセトニドの場合、エステル35mgよ
り、粉末状（軟化点108゜）の標記化合物が28mg得
られた。収率60.5％ （20，21（Ｒ）アセトニド） NMR（CDCl₃ δ） 1.26，1.31，1.40，1.49（19―Ｈおよび

【式】） 3.26（2H，ｓ，―SCH₂CO―） 3.85，4.13（2H，ABq、J_AB＝９Hz，ν〓_AB＝
16.6，21―CH₂―） 4.63（1H，ｍ，―NHCHCOOCH₃） 4.78（1H，ｄ，Ｊ＝６Hz，11―Ｈ） 5.24（1H，ｓ，18H） 6.66，6.96（4H，A₂B₂q、J_AB＝8.5Hz，ν〓_AB＝
17.7，

【式】） 7.64（1H，ｄ，Ｊ＝7.5Hz，―CONH―） IR：ν^CHCl3 _nax（cm^-1）3584，3280（ブロード）1745
，
1672，1613，1594. 質量分析： ｍ／z667（M⁺・２％） 〃 107（100％） TCL： Rf，0.41（クロロホルム：アセトン＝３：１） 参考例 ２―２ （実施例３―２の出発原料の製造） 上記実施例３―２の出発原料（） ［

【式】R² ＝Ｈ，20，21（Ｓ）または（Ｒ）アセトニド］は、
前記参考例１に記載の化合物［（R¹＝
SCH₂COOCH₃，R²＝Ｈ）20，21（Ｓ）または
（Ｒ）アセトニド］を前記と同様に処理して得ら
れる。但し、中間で得たカルボン酸（対応メチル
エステル22mgより得た量）はテトラヒドロフラン
でなく、ジメチルホルムアミド２mlに溶し、氷冷
下にヒスタミン塩酸塩９mg（1.1モル），Ｎ―メチ
ルモルホリン15.4μ（3.5モル）および１―ヒド
ロキシベンツトリアゾール6.5mg（1.1モル），続
いてジシクロヘキシルカルボジイミド11.7mg
（1.3モル）を順次加え、17時間反応させた。反応
完了後、減圧下に溶媒に留去し、残渣をクロマト
グラフイ（メルク社製ローバーカラム，サイズ
Ａ）にて処理し、得られた主画分にエーテルを加
え粉末状（軟化点，122〜124℃）の標記化合物
（）13mgを得た。収率51.1％。 （20，21（Ｒ）アセトニド） NMR（CDCl₃、δ） 1.30，1.39，1.49（19―Ｈ，および

【式】） 3.87，4.15（2H，ABq、J_AB＝９Hz，ν〓_AB＝
16.8Hz，21―CH₂―） 4.80（1H，ｄ，Ｊ＝６Hz，11―Ｈ） 5.27（1H，Ｓ，18―Ｈ） 6.81，7.55（2H各，ブロードｓ，

【式】） 6.41，7.92（2H，―NH―） 質量分析： ｍ／z583（M⁺・１％） 〃 94（100％） TCL： Rf 0.39（クロロホルム：メタノール＝６：１） 実施例 ４ 化合物（）（R¹＝SCH₂COOH，R²＝Ｈ）に
よる免疫原および抗血清の作製 ） 免疫原 実施例１記載の化合物（）（R¹＝
SCH₂COOH，R²＝Ｈ）18mgをジオキサン500μ
に溶かし10〜12℃に保ちながらトリブチルア
ミン9.3μとイソブチルクロルカーボネート
4.9μを加え、30分間撹拌して活性エステル液
とする。 一方、牛血清アルブミン（BSA）69mgを水
２mlに溶かし、ジオキサン２mlを加えて混和し
たのち、1N―水酸化ナトリウムでPH8.5に調整
する。これに、上記エステル液を氷冷下に滴下
したのち、さらにPH8.5に保ちながら４時間撹
拌を続けてカツプリングさせ、水を用いて透析
し、つづいて凍結乾燥し、標記化合物（）
BSAコンジユゲート50mgを得た。 担体タンパクに対するハプテンの結合モル比
は15であつた。 ） 前記免疫原250μｇを生理食塩水250μに
溶かし、フロイント・コンブリート・アジユバ
ント250μを加えエマルジヨンとする。これ
を家兎の背部に皮内注射し、これを３週間間隔
で５回繰返す。最終免疫後10日目に全採血して
抗血清を得た。 この抗血清の力価を、後述のRIA系で測定し
たところ、 ¹²⁵I標識ALD2.2×10⁴dpmの50％を
結合させるのに要する抗血清の希釈倍数で表わ
した値で、4.6×10⁴倍であつた。 実施例 ５ 化合物（）（ R²＝Ｈ）の標識 実施例３に記載した方法に従つて調製した化合
物（）（ R²＝Ｈ）500ng，ジメチルホルムアミド5μ，
0.5M―リン酸緩衝液（PH7.5）25μおよび ¹²⁵I
―ヨウ化ナトリウム1mCi：をガラスチユーブに
入れ、これにクロラミンT20μｇを含むリン酸緩
衝液（PH7.5）5μを加え、室温で45秒間撹拌し
たのち、メタ重亜硫酸ナトリウム100μｇを含む
水溶液5μを加えて反応を停止させた。 これにヨウ化カリウム500μｇを加え、ジクロ
ルメタン１mlで抽出、硫酸ナトリウムで乾燥後ク
ロマトグラフイー（セフアデツクスLH―20，0.7
cmφ×20cm，ジクロルメタン：メタノール＝９：
１）を行ない、1000―1500μCi／μｇの標記化合
物を得た。クロマトグラム（溶出曲線）は第１図
に示す通りであつた。 実施例 ５―１ 化合物（）［ R²＝Ｈ］および化合物（）
［

【式】R²＝ Ｈ］の標識 前記実施例５前半の記載に従つて、実施例３―
１および３―２で得た標記化合物（）の標識を
行つた。標識物は、それぞれクロマトグラフイ
（セフアデツクスLH―20，９mmφ×90mm，エタ
ノール―Ｍ／10 クエン酸緩衝液PH2.2）によつ
て精製し、放射活性500μCi／μｇのチロシンメ
チルエステル体および同400μCi／μｇのヒスタ
ミン体を得た。クロマトグラム（溶出曲線）を、
それぞれ第５および６図に示す。 実施例 ６ 11β，18―エポキシ―18α，21―ジヒドロキシ
―３，20―ジオキソ―４―プレグネン―6β―
イル＝ヘミサクシネート（）（R¹＝Ｈ，R²＝
β・OCOCH₂CH₂COOH）の製造 11β，18；18α，20β―ビスエポキシ―20α，21
―イソプロピリデンジオキシ―３―オキソ―４―
プレグネン―6β―イル＝ヘミサクシネート（）
（R¹＝Ｈ，R²＝β・OCOCH₂CH₂COOH）35mgを
70％酢酸４mlに溶かし、窒素ガス気流中、室温に
て16時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸
エチルで抽出し、飽和食塩水で繰返し洗浄，硫酸
ナトリウムで乾燥したのち減圧下で溶媒を留去し
た。得られた残渣をメタノールに溶かし活性炭末
で処理した。 これにエーテルを加え粉末状の標記化合物
（）（R¹＝Ｈ，R²＝β・OCOCH₂CH₂COOH）
16mgを沈殿させた。収率49.6％。 また化合物（）（R¹＝Ｈ，R²＝β・
OCOCH₂CH₂COOH，20，21（Ｓ）アセトニド）
の代りに同（）（R¹＝Ｈ，R²＝β・
OCOCH₂CH₂COOH，20，21（Ｒ）アセトニド）
79mgを同様に処理し標記化合物（）34mgを得
た。 （）（R¹＝Ｈ，R²＝β・OCOCH₂CH₂COOH） 元素分析：C₂₅H₃₂O₉１／２H₂O（485，514）として、 計算値：Ｃ，61.84；Ｈ，6.85 実験値：Ｃ，62.09；Ｈ，7.30 質量分析： ｍ／z458（M⁺・−18，２％），ｍ／z429（M⁺−
47，11％） ｍ／z358（M⁺・−118，57％），ｍ／z149（100
％） NMR（CDCl₃ δ） 1.28，1.39，（3H，19―Ｈ） 2.66（4H，ｓ，

【式】） 5.33（1H，ｓ，18―Ｈ） 5.45（1H，ｗ１／２＝８Hz，6α―Ｈ） 5.94（1H，ｓ，４―Ｈ） TLC Rf＝0.17 （酢酸エチル：シクロヘキサン：酢酸：エタノ
ール＝20：10：１：２） 実施例 ７ 11β，18―エポキシ―18α，21―ジヒドロキシ
―３，20―ジオキソ―４―プレグネン―6α―
イル＝ヘミサクシネート（）（R¹＝Ｈ，R²＝
α・OCOCH₂CH₂COOH）の製造 実施例６に記載したものと同様な操作を、
11β，18；18α，20β―ビスエポキシ―20α，21―
イソプロピリデンジオキシ―３―オキソ―４―プ
レグネン―6α―イル＝ヘミサクシネート（）
（R¹＝Ｈ，R²＝α・OCOCH₂CH₂COOH，200，
21（Ｓ）アセトニド）23mgに施して標記化合物
（）（R¹＝Ｈ，R²＝α・OCOCH₂CH₂COOH）
10mgを得た。収率47.1％。 本品は、また11β，18；18α，20α―ビスエポキ
シ―20β，21―イソプロピリデンジオキシ―３―
オキソ―４―プレグネン―6α―イル＝ヘミサク
シネート（）（R¹＝Ｈ，R²＝α・
OCOCH₂CH₂COOH，20，21（Ｒ）アセトニド）
49mgを同様に処理しても26mg得られた。 （）（R¹＝Ｈ，R²＝α・OCOCH₂CH₂COOH） 元素分析：C₂₅H₃₂O₉・2H₂O（512，538）として 計算値：Ｃ，58.58；Ｈ，7.08 実験値：Ｃ，57.99；Ｈ，6.78 質量分析：ｍ／z458（M⁺・−18，＜１％） ｍ／z429（M⁺−47，20％） ｍ／z358（M⁺・−118，57％） ｍ／z28（100％） NMR（CDCl₃ δ） 1.27（19―Ｈ） 2.70，2.67（sh） （4H，

【式】） 5.32（1H，ｓ，18―Ｈ） 5.94（1H，ｄ，Ｊ＝２Hz，４―Ｈ） TLC Rf＝0.17 （酢酸エチル：シクロヘキサン：エタノール：
酢酸＝20：10：２：１） 参考例 ３ （実施例６，７用原料の製造） 上記実施例６および７の出発原料である化合物
（）［（R¹＝Ｈ，R²＝β・OCOCH₂CH₂COOH），
20，21（Ｓ）または（Ｒ）アセトニド、および
（R¹＝Ｈ，R²＝α・OCOCH₂CH₂COOH），20，
21（Ｓ）または（Ｒ）アセトニド］は先述の参考
例１に記載された化合物（）［20，21（Ｓ）また
は（Ｒ）アセトニド］より、それぞれ次のように
して得られる。 先ず、化合物（）［20，21（Ｓ）または（Ｒ）
アセトニド］をそれぞれ、10％含水テトラヒドロ
フランに溶かし、氷冷撹拌下にｍ―クロル過安息
香酸を加えて反応させたのち、クロマトグラフイ
分画を施せば、それぞれ11β，18；18α，20β―ビ
スエポキシ―6β―ヒドロキシ―2α，21―イソプ
ロピリデンジオキシ―４―プレグネン―３―オン
（）（R¹＝Ｈ，R²＝β・OH，20，21（Ｓ）アセ
トニド）と11β，18；18α，20β―ビスエポキシ―
6α―ヒドロキシ―20α，21―イソプロピリデンジ
オキシ―４―プレグネン―３―オン（）（R¹＝
Ｈ，R²＝α・OH，20，21（Ｓ）アセトニド）、お
よび11β，18；18α，20α―ビスエポキシ―6β―ヒ
ドロキシ―20β，21―イソプロピリデンジオキシ
―４―プレグネン―３―オン（）（R¹＝Ｈ，R²
＝β・OH，20，21（Ｒ）アセトニド）と11β，
18；18α，20α―ビスエポキシ―6α―ヒドロキシ
―20β，21―イソプロピリデンジオキシ―４―プ
レグネン―３―オン（）（R¹＝Ｈ，R²＝α・
OH，20，21（Ｒ）アセトニド）が得られる。

【表】 次に、これらの化合物（）を別個にピリジン
に溶かし、無水コハク酸と４―ジメチルアミノピ
リジンを加え、加温（β―OH体は67℃、α―
OH体は38℃）して反応させ、それぞれ対応する
化合物（）［（R¹＝Ｈ，R²＝β・
OCOCH₂CH₂COOH），20，21（Ｓ）または（Ｒ）
アセトニド、および（R¹＝Ｈ，R²＝α・
OCOCH₂CH₂COOH），20，21（Ｓ）または（Ｒ）
アセトニド］を得た。

【表】 実施例 ８ 化合物（）［（R¹＝Ｈ，R²＝βおよびα・
OCOCH₂―CH₂COOH）］による免疫原および
抗血清の作製 ） 免疫原； 実施例６および７記載の方法によつて製造し
た標記化合物（）を、個別に実施例４記載の
方法と同様の方法に従つて処理し、それぞれ
（）（R¹＝Ｈ，R²＝β・OCOCH₂CH₂COOH）
―BSAおよび（）（R¹＝Ｈ，R²＝α・
OCOCH₂CH₂COOH）―BSAコンジユゲート
を得た。出発物質14.5mgから得られたコンジユ
ゲートの量は、それぞれ65mg，68mgであつた。
また担体タンパクに対するハプテンの結合モル
比は、それぞれ11および20であつた。 ） 抗血清 前記免疫原を用い実施例４、）記載と同様
の方法で免疫を行い、抗血清を得た。これらの
抗血清の力価を前記と同一表現で示すと、それ
ぞれ９×10⁴倍および６×10³倍であつた。 実施例 ９ 11β，18―エポキシ―18α，21―ジヒドロキシ
―３，20―ジオキソ―４―プレグネン―6β―
イル＝４―（ｐ―ヒドロキシフエネチルアミ
ノ）―４―オキソブチラート（）R¹＝Ｈ，

【式】）および 11β，18―エポキシ―18α，21―ジヒドロキシ
―３，20―ジオキソ―４―プレグネン―6α―
イル＝４―ｐ―ヒドロキシフエネチルアミノ）
―４―オキソブチラート（）（R¹＝Ｈ，

【式】）の製造 11β，18；18α，20β―ビスエポキシ―20α，21
―イソプロピリデンジオキシ３―オキソ―４―プ
レグネン―6β―イル＝４―（ｐ―ヒドロキシフ
エネチルアミノ）―４―オキソブチラート（） （R¹＝Ｈ，

【式】20，21 （Ｓ）アセトニド）13mgおよび11β，18；18α，
20α―ビスエポキシ―20α，21―イソプロピリデ
ンジオキシ―３―オキソ―４―プレグネン―6β
―イル＝４―（ｐ―ヒドロキシフエネチルアミ
ノ）―４―オキソブチレート（） （R¹＝Ｈ，

【式】20，21 （Ｒ）アセトニド）21mgを合せて、70％酢酸２ml
に溶かし、アルゴンガス気流中、室温にて16時間
撹拌したのち、氷水を加え酢酸エチルで抽出し
た。これを飽和食塩水にて繰返し洗浄したのち、
硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に溶媒を留去し
た。 残渣をメタノールに溶かして活性炭末処理を施
し、油状物として標記化合物（）（R¹＝Ｈ，

【式】）24mgを得 た。 同様にして11β，18；18α，20β―ビスエポキシ
―20α，21―イソプロピリデンジオキシ―３―オ
キソ―４―プレグネン―6α―イル＝４―（ｐ―
ヒドロキシフエネチルアミノ）―４―オキソブチ
レート（） （R¹＝Ｈ，

【式】20，21 （Ｓ）アセトニド）６mgおよび11β，18；18α，
20α―ビスエポキシ―20β，21―イソプロピリデ
ンジオキシ―３―オキソ―４―プレグネン―6α
―イル＝４―（ｐ―ヒドロキシフエネチルアミ
ノ）―４―オキソブチレート（） （R¹＝Ｈ，

【式】20，21 （Ｒ）アセトニド）８mgより標記化合物（） （R¹＝Ｈ，

【式】）10mgを得 た。

【表】

【表】 参考例 ４ （実施例９用原料の製造） 上記実施例９の出発原料である化合物（）
［（R¹＝Ｈ）（R²＝βまたは

【式】）20， 21（Ｓ）または（Ｒ）アセトニド］は、参考例３
によつて製造された化合物（）［（R¹＝Ｈ）（R²
＝βまたはα・OCOCH₂CH₂COOH），20，21
（Ｓ）または（Ｒ）アセトニド］をそれぞれジシ
クロヘキシルカルボジイミド・１―ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール法（参考例２に記載と同様の方
法）によつてチラミンと結合させて製造した。

【表】

【表】 実施例 10 ¹²⁵Iによる化合物（）（R¹＝Ｈ，R²＝βまた
は

【式】）の 標識 実施例９の記載の方法に従つて調製した化合物
（）（R¹＝Ｈ，R²＝βまたは

【式】）に実施 例５と同様の操作を施して、それぞれ ¹²⁵―
（）（R¹＝Ｈ，

【式】） 330μCiおよび ¹²⁵（）（R¹＝Ｈ，

【式】）600μCi を得た。クロマトグラム（溶出曲線）はそれぞれ
第２図および第３図に示す通りであつた。 参考例 ５ 実施例５および10に記載したALD標識化合物
のほか、公知の11β，18―エポキシ、18α，21―
ジヒドロキシ―４―プレグネン―３，20―ジオン
＝３−｛Ｏ―［Ｎ―（ｐ―ヒドロキシルフエネチ
ル）カルバモイルメチル］オキシム｝（）をク
ロラミンＴ法によりヨウ素化して ¹²⁵―（）
を作製し、その比放射能が680Ci／mmolである
ことを確認した。 参考例 ６ 血清ALDのRIA １） 操作法 血清100μを試験管に採取し、上記実施例
５および10，および参考例５のいずれかによつ
て得た ¹²⁵I標識ALD（2.2×10⁴dpm）を含む緩
衝液（0.1％牛血清γ―グロブリンを含む0.1M
クエン酸緩衝液，PH5.0）100μ、８―アニリ
ノナフタレン―１―スルホン酸溶液（625mg／
ml）400μおよび後記希釈倍率の各種抗血清
溶液（実施例４および８により作製）100μ
を加え、４℃で16時間インキユベーシヨンを行
つたのち、25％ポリエチレングリコール6000溶
液１mlを加え、10秒間振り混ぜ、ついで遠心分
離（2250×ｇ，20分間）し、その上澄を吸引除
去し、沈殿の放射活性をウエル型シンチレーシ
ヨン・カウンターで測定した。

【表】 ２） 標準曲線： 上記１）の操作法により、ALD標準液（０
〜5000pg／ml）について作成した標準曲線は
第４図に示す通りであつた。ここでB₀は非放
射性ALDのないときに得られた抗原・抗体結
合物の放射能，Ｂは非放射性ALDを加えたと
きの結合物の放射能である。 ３） 交差反応性： 本発明によつて得た各種置換アルドステロン
の各種ステロイドとの交差反応性検定試験（方
法は上記１）による結果を次表に総括する。

【表】 参考例 ６―１ 血清ALDのRIA 前記実施例１に記載の操作法に従つて、実施例
５―１で得た標識体と、実施例11，１）表中に記
載した抗（）（R¹＝Ｈ，R²＝α・
OCOCH₂CH₂COOH）―BSAとを用いて作成し
たＢ／B₀標準曲線は第７図に示す通りであつた。 参考例 ７ 血清ALDのEIA １） 酵素標識抗原の作製： 前記した、ALDのカルボン酸誘導体［実施
例１に示した（）（R¹＝SCH₂COOH，R²＝
Ｈ）、実施例２に示した（）（R¹＝Ｈ，R²＝
β・SCH₂COOH）、実施例６に示した（）
（R¹＝Ｈ，R²＝β・OCOCH₂CH₂COOH）、実
施例７に示した（）（R¹＝Ｈ，R²＝α・
OCOCH₂CH₂―COOH）および公知の11β，18
―エポキシ―18α，21―ジヒドロキシ―４―プ
レグネン―３，20―ジオン＝３−（Ｏ―カルボ
キシメチル）オキシム（）］各6μmolを個別
にジオキサン400μに溶かし、トリ―ｎ―ブ
チルアミン3.3μmolを含むジオキサン50μを
加え10〜12℃に冷却下イソブチル クロルカー
ボネート6μmolを含むジオキサン50μを加え
30分間撹拌し活性エステル液とした。 一方、β―Ｄ―ガラクトシターゼ（30U／
mg，ベーリンガー・マンハイム社製）２mgを10
％ジオキサン3.5mlに溶かし、0.1N―水酸化ナ
トリウムでPH9.2に調整しておく。これに上記
活性エステル液を氷冷・撹拌下に滴下し、５分
後、PH8.5に調整した。さらに４℃で４時間撹
拌を続けたのち0.05％ナトリウムアジドを含む
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.4）に対して２日間
透析し、得られたβ―Ｄ―ガラクトシダーゼ・
ALD誘導体・コンジユゲート（被標識化合物
の記載順に従つて、それぞれａ，ｂ，ｃ，ｄ
またはｅと指称する）を酵素標識抗原とした。 ２） EIA： ALD標準溶液100μを試験管に採り、0.1M
リン酸緩衝液（PH7.4）300μおよび酵素標識
抗原希釈液（酵素標識抗原を10万倍に希釈）
100μを加え混和後、抗血清溶液50μを加え
４℃で５時間静置した。 ついでイムノビード（Immunobead；Bio―
Rad社商品名，１mg／ml）100μを加え４℃に
１時間静置したのち、遠沈し（2000×ｇ，５分
間）、その上澄を吸引除去し、沈殿を0.1M―リ
ン酸緩衝液（PH7.4）で２回洗浄した。 これを、0.1M―塩化ナトリウム、0.001M・
塩化マグネシウム、0.05％ナトリウムアジド、
0.5％BSAを含む0.01M―リン酸緩衝液（PH7.3）
に懸濁させ、さらに４―メチルウンベリフエリ
ル―β―Ｄ―ガラクトシド溶液（80μｇ／ml）
400μを加え、37℃で30分間インキユベート
したのち、0.1M―グリシン緩衝液（PH10.5）
３mlを加えて反応を停止させ、その螢光強度
（励起360nm、螢光448nm）を測定した。 なお、血清中ALDの測定の場合は、標準溶
液100μおよび緩衝液300μの代りに、それ
ぞれ被検血清100μおよび８―アニリノナフ
タレン―１―スルホン酸溶液（800μｇ／ml）
300μを用い、以下上記と同様に操作する。
また、用いる酵素標識抗原と抗血清との可能な
組合せ（○印）は第１表に示すとおりである。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１，２および３図はそれぞれ、 ¹²⁵I―（）
（ R²＝Ｈ）， ¹²⁵I―（）（R¹＝Ｈ，

【式】）およ び ¹²⁵I―（）（R¹＝Ｈ，

【式】）のカ ラムクロマトグラフ溶出曲線である。また第４図
は標識物あるいは抗ALD抗血清のいずれか一方、
あるいは双方共に本発明による置換ALDを用い
て作成したＢ／B₀標準曲線である。第５および
第６図は、それぞれ ¹²⁵I―（） R²＝Ｈおよび ¹²⁵I―（）
（

【式】R²＝ Ｈ）のカラムクロマトグラフ溶出曲線である。第
７図は、標識物および抗ALD抗血清が双方共に
本発明による置換ALDを用いたＢ／B₀標準曲線
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 （但し、式中、R¹およびR²のいずれか一方は水
   素、R¹が水素のときR²は―Ｓ―（CH₂）_1-3COR³
   または―Ｏ―CO―（CH₂）_1-5COR³で表わされる
   基、R²が水素のときR¹は―Ｓ―（CH₂）_1-3COR³
   で表わされる基、ここでR³はヒドロキシ基、ま
   たはそれぞれヨウ素化されていてもよいチラミン
   残基、チロシン低級アルキルエステル残基、ヒス
   タミン残基、ヒスチジン残基あるいは７―アミノ
   ヘプタノイルチロシン低級アルキルエステル残基
   をあらわす）であらわされた置換アルドステロン
   類。 ２ 式 （但し、式中R¹およびR²のいずれか一方は水素、
   R¹が水素のときR²は―Ｓ―（CH₂）_1-3COR³また
   は―Ｏ―CO―（CH₂）_1-5COR³で表わされる基、
   R²が水素のときR¹は―Ｓ―（CH₂）_1-3COR³で表
   わされる基、ここでR³はヒドロキシ基、または
   それぞれヨウ素化されていてもよいチラミン残
   基、チロシン低級アルキルエステル残基、ヒスタ
   ミン残基、ヒスチジン残基あるいは７―アミノヘ
   プタノイルチロシン低級アルキルエステル残基を
   表わす。またＸはグリコールの保護基を表わす）
   で表わされる化合物を脱保護基反応に付すること
   を特徴とする 式 （但し、式中R¹およびR²は前記と同意義）であ
   らわされる置換アルドステロン類の製造方法。 ３ 式 （但し、式中、R¹およびR²のいずれか一方は水
   素、R¹が水素のときR²は―Ｓ―（CH₂）_1-3COR³
   または―Ｏ―CO―（CH₂）_1-5COR³で表わされる
   基、R²が水素のときR¹は―Ｓ―（CH₂）_1-3COR³
   で表わされる基、ここでR³はヒドロキシ基、ま
   たはそれぞれヨウ素化されていてもよいチラミン
   残基、チロシン低級アルキルエステル残基、ヒス
   タミン残基、ヒスチジン残基あるいは７―アミノ
   ヘプタノイルチロシン低級アルキルエステル残基
   をあらわす）であらわされた置換アルドステロン
   類を含有するアルドステロン検査用試薬。 ４ R³が放射性ヨウ素で標識されている残基で
   ある特許請求の範囲３記載の置換アルドステロン
   類を含有するアルドステロン検査用試薬。 ５ R³が生物学的に活性な蛋白質と結合してい
   る反応性残基である特許請求の範囲３記載の置換
   アルドステロン類を含有するアルドステロン検査
   用試薬。 ６ 該生物学的に活性な蛋白質が牛血清アルブミ
   ン（BSA）である特許請求の範囲５記載の置換
   アルドステロン類を含有するアルドステロン検査
   用試薬。 ７ 該生物学的に活性な蛋白質が標識用酵素であ
   る特許請求の範囲６記載の置換アルドステロン類
   を含有するアルドステロン検査用試薬。 ８ 該標識用酵素がホースラデイシユ・ペルオキ
   シダーゼ、アルカリホスフアターゼ、β―Ｄ―ガ
   ラクトシダーゼおよびグリコシダーゼからなる群
   より選ばれたものである特許請求の範囲７記載の
   置換アルドステロン類を含有するアルドステロン
   検査用試薬。