JPH025860A - 組換えワクシニアウイルスｍｖａ - Google Patents

組換えワクシニアウイルスｍｖａ

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JPH025860A
JPH025860A JP1003875A JP387589A JPH025860A JP H025860 A JPH025860 A JP H025860A JP 1003875 A JP1003875 A JP 1003875A JP 387589 A JP387589 A JP 387589A JP H025860 A JPH025860 A JP H025860A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクシニアウィルス類は、ポックスウィルス（Ｐｏｘｖ
ｉｒｕｓｅｓ）科に属する。ワクシニアウィルス類のあ
る種の株、例えば、英国のりスター研究所（Ｌｉｓｔｅ
ｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）のエルストリー（Ｅｌｓｔｒ
ｅｅ）株は、天然痘に対して免疫性を与えるための生ワ
クチンとして長年使用されてきた。ワクチン接種により
引き起こされ得る合併症（ＳｃｈｉｒのＺｅｉｔｓｃｈ
ｅｒ。
ｆｉｒ　Ｐｒａｖｅｎｔｉｖｍｅｄｉｚｉｎ　１８．４
１−４４　［１９７３］参照）のため、また天然痘が撲
滅されたとのＷＨＯによる１９８０年における宣言以来
、今日では危険性の高い人々のみが天然痘に対するワク
チン接種を受けている。
最近、ワクシニアウィルス類は、また、外来抗原のため
のベクターとしても使用されている（Ｓｍｉｔｈらの、
　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　２．３
８３−４０７　　［１９８４］　）　、これは、ＤＮＡ
組換え技術によりワクシニアウィルス類のゲノム中に導
入された外来抗原をコードしているＤＮＡ配列（遺伝子
）を含んでいる。該遺伝子が、ウィルスの生命サイクル
に対して本質的ではないウィルスＤＮＡ中の部位に組込
まれた場合には、新たに生成された組換えワクシニアウ
ィルスは、感染性であり、すなわち、外来細胞に惑染す
ることができ、従って組込まれたＤＮＡ配列を発現する
ことができる（発行番号８３，２８６　［１９８３年７
月６日発行１および１１０，３８５　　［１９８４年６
月１３日発行］のヨーロッパ特許出願参照）。このよう
にして調製された組換えワクシニアウィルスは、方にお
いてこれらの抗原によって起こる感染症の予防接種用の
生ワクチンとして使用することができ、また他方におい
て真核性細胞内で異種蛋白質の調製用として使用するこ
とができる。文献中に記載されている組換えワクシニア
ウィルス類のほとんどは、ＷＲ株に基づいたものである
。一方、この株は、高い神経毒性を有し、従って、ヒト
や動物に対して使用するにはあまり適していないことが
知られている（ＭｏｒｉｔａらのＶａｃｃｉｎｅ　５．
６５−７０［１９８７］　）。
しかしながら、望ましくない副作用を排除するため特別
に培養されたウィルスの株が長い間知られている。従っ
て、ニワトリフィブロブラスト上においてワクシニアウ
ィルスのアンカラ株（ＣＶＡ）の連続的移行により、修
飾ワクシニアウィルスアンカラ（ＭＶＡ）を培養するこ
とが可能となった（スイス特許第５６８，３９２号）。
この修飾ワクシニアウィルスアンカラは、最良の低毒性
を有し、すなわち、ワクチン接種に用いた場合にも副作
用が伴わない。従って、これは免疫無防備状態の被検体
の初期ワクチン接種に対して特に好適である。
該ＭＶＡ株の優れた性質は、数多くの臨床試験において
示されている（ＭａｙｅｒらのＺｂｌ、Ｂａｋｔ、Ｈｙ
ｇ、　Ｉ、Ａｂｔ、Ｏｒｇ、Ｂ　１６７、３７５−３９
０　［１９７Ｂ］および５ｔｉｃｋｌらのＤｔｓｃｈ、
ｍｅｄ、Ｗｓｃｈｒ、９９．２３８６−２３９２　［１
９７４］　）。
従って、外来遺伝子をＤＮＡ組換えによりワクシニアウ
ィルスのＭＶＡ株に導入するための可能な方法が捜し求
められてきた。組換え部位を除き、ＭＶＡのゲノムを変
更すべきでないので、この要求に応じた方法を用いる必
要があった。ＭＶＡのチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ遺
伝子）は、該ウィルスの生命サイクルにおいて基本的に
重要ではないので、外来ＤＮＡ配列は、ワタシニアＴＫ
遺伝子のＤＮＡ中に組み込まれた。
従って、本発明は、外来抗原、好ましくは、病原性物質
をコードする遺伝子を含む組換えＭＶＡワクシニアウィ
ルス類、およびこのタイプのウィルスを生理学的に許容
し得る形態で含有するワクチン類に関するものである。
本発明は、また、このような組換えＭＶＡワクシニアウ
イルス類またはワクチン類の調製方法、およびこれらの
ワクチン類の前記抗原または病原物質に帰因する感染症
の予防のための使用に関するものである。
該組換えＭＶＡワクシニアウィルス類は、真核性細胞内
で異種ポリペプチド類を調製するためにも使用すること
ができる。これは、該組換えワクシニアウィルス類で惑
染される細胞を伴っている。
該外来抗原をコードする遺伝子は、細胞内において発現
される。該発現された異種ポリペプチドは、単離するこ
とができる。このような異種ポリペプチド類の製造に使
用される方法は、当業者に一般的に知られている　（例
えば、発行番号２０６□９２０［１９８６年１２月３０
日発行］および２０５，９３９　　［１９８６年１２月
３０日発行］のヨーロッパ特許出願参照）。該組換えＭ
ＶＡウィルス頻によって製造されたポリペプチド類は、
該ＭＶＡウィルス類の特殊な性質のために、ヒトおよび
動物に対する医薬としての使用においてより好適である
。
該組換えＭＶＡワタシニアウィルス類は、以下に示すよ
うにして調製することができる。真核性細胞、好ましく
は哺乳類細胞、特にＣＶＩサル細胞（フロラ　ラボラト
リイズ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタ
ログ番号０２−２４０から；アメリカンタイプカルチャ
ーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅＣｏｌ　１ｅｃｔｉｏｎ）　（＾ＴＣＣ）、１
２３０１パークローン　ドライブ、ロックビル、メリー
ランド、米国（ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌ＋Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、寄託番
号ＣＣＬ７０から；およびザヨーロピアンコレクション
オブアニマルセルカルチャーズ（ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅ
ａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ
１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ）（ＥＣＡＣＣ）、ＰＨＬＳセ
ンターフォーアプライドマイクロバイオロジーアンド　
リサーチ（ＰＨＬＳ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ａｐｐ−
１ｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ）、ポートンダウン、サリスバリー、英国（
Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｉｙｎ、５ａｌｉｓｂｕｒｙ＋Ｇｒ
ｅａｔ　Ｂｒ１ｔａｉｎ）、寄託番号第８５０１１４３
４から入手可能なものであり、ＪｅｎｓｅｎらのＰｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ屓、５３−５９　［１９６４］に記載されている
）は、該ＭＶＡにより感染され得る。ＭＶＡおよびその
性質は、文献ＣＭａｙｅｒらの前出文献）に詳細に記載
されている。前記ＭＶＡウィルスは、ブダペスト条約の
要求に適合してＣＮ　ＣＭ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａ
５ｔｅｕｒ。
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒ−ｇａｎｉｓｍ
ｓ　　、　　ｒｕｅ　ｄｕ　Ｄｏｃｔｅｕｒ　Ｒｏｕｘ
　、　　７５７２４、ＰａｒｉｓＣｅｄｅｘ　１５）に
寄託番号第１−７２１の下に１９８４年１２月１５日に
寄託されている。該ＭＶＡウィルスは、実施例中に記載
されているようにニワトリ胚線維芽細胞上で生育し得る
。ＭＶＡは、その高度な弱毒化、すなわち、良好な免疫
性を維持しながら、減少された毒性または感染力によっ
て識別される。
毒性の減少の程度は、種々の方法、例えば細胞培養物上
でのウィルスの挙動、神経毒性もしくは皮下投与におけ
る毒性の測定、または免疫抑制マウス内での毒性試験に
より実験的に決定することができる。高度に弱毒化され
たＭＶＡ株は、細胞培養物上での挙動に大きな変化を示
し、かつワクシニアウイルスの天然型ＷＲの神経毒性よ
り、少なくとも１０７の因数だけ小さい神経毒性を示す
。また、この差異は、ＷＲ株の組換え体天然型ウィルス
とＭＶＡ株の組換え体ウィルスとの比較における証左と
もなる。
本発明によれば、ワクシニアウイルスＤＮＡの本質的で
ない分節に由来する部分配列と外来抗原をコードするＤ
ＮＡ配列とを含むＤＮＡが感染された細胞内に導入され
る。
ｇｌ　Ｄ　Ｎ　Ａは、細胞内にトランスフェクションに
より、例えばリン酸カルシウム沈澱法（Ｇｒａｈａｍら
のＶｉｒｏｌ、５２．４５６−４６７　［１９７３］　
；　ＷｉｇｌｅｒらのＣｅ１ｌ■、７７７−７８５　［
１９７９］　）、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法（ＮａｕｍａｎｎらのＥＭＢ
ＯＪ、　１．８４１−８４５　　［１９８２］　）　　
、マイクロインジェクション（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ　
らのＭｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０Ｌ４Ｂ２−
４９２［１９８３］　）　、リポゾーム法（Ｓ　ｔｒａ
ｕｂ　ｉｎｇｅｒらのＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ　１０１．５１２−５２７　［１９８３］
　）、スフェロプラスト（Ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ）法
（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒの　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａ
ｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　　ヱヱ、　２１６３−２１６７　
　　［１９８０１）または当業者に知られた他の方法に
より導入することができる。リン酸カルシウム沈澱法に
よるトランスフェクションが好適に使用される。
挿入されたＤＮＡは、線形または環状であり得る。環状
ＤＮＡが好適に使用される。プラスミドの使用は、特に
好適である。該ＤＮＡは、該ワクシニアウイルスＤＮＡ
の本質的ではない分節に由来する少な（とも一つの部分
配列を含んでいる。
該ワクシニアウイルスの本質的ではない分節は、当業者
において公知である。このタイプの木質的ではない分節
の一例は、チミジンキナーゼ遺伝子およびその隣接領域
である（ＷｅｉｒらのＪ、Ｖｉｒｏｌ、、５３０−５３
７　［１９８３コ）。好ましい部分配列は、プラスミド
ｐＨＧ５−２１５．１に含まれており、同プラスミドの
構築は、１９８６年１０月２２日発行のヨーロシバ特許
出願発行番号１９８，３２８に記載されている。
プラスミドｐＨＧ５−２１５．１は、マラリア病原であ
るプラスモジウムファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の５．１抗原をコードする遺
伝子を含んでいる　（ＨｏｐｅらのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３．３６９−３７９　［１９８５
］　）。該ＤＮＡは、マラリア抗原をコードするこの遺
伝子に代えて、病原性物質由来の他の公知の遺伝子を含
むことができる。病原性物質とは、疾患を引き起こすウ
ィルス類、細菌類および寄生虫に加え、生体中で制限な
く増え、かくして病的な増殖をもたらすＩｌ！ｌｌ瘍細
胞と理解されるべきである。このような病原性物質の例
は、Ｄａｖｉｓ。
Ｂ、Ｄ、ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ第３版、Ｈａｒ
ｐｅｒ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ
）に記載されている。好適な病原性物質の遺伝子は、マ
ラリア寄生虫プラスモジウム　ファルシパルム、結核を
引き起こすマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ａ）、ヘルペスウィルスならびにヒト免疫疾患ウィルス
、例えば旧ＶＩおよびＨＩＶＩＩの遺伝子である。
該ＤＮＡ配列または外来抗原をコードする遺伝子の発現
を可能とするためには、遺伝子の転写のために必要な制
御配列がＤＮＡ上に存在することが必要である。このよ
うな制御配列（プロモーターと呼ばれる）は、当業者に
知られており、例えばヨーロッパ特許出願発行番号１９
８，３２８に記載されているワクシニアの１１　ｋＤａ
遺伝子のもの、および、７．５　ｋＤａ遺伝子のもの（
ヨーロッパ特許出願発行番号１１０，３８５）である。
外来抗原をコードしている遺伝子を一旦真核性細胞内に
導入し、かつ外来ＤＮＡがウィルスＤＮＡと再結合すれ
ば、所望の組換えワクシニアウィルスをそれ自体公知の
方法、好ましくはマーカーにより単離することが可能で
ある　（ＮａｋａｎｏらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９．１５９３−１５９６　［
１９８２］、ＦｒａｎｋｅらのＭｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉ
ｏｌ、　５．１９１Ｂ−１９２４［１９８５］、Ｃｈａ
ｋｒａｂａｒｔｉ　　らのＭｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ
　　５．３４０３−３４０９［１９８５］　、Ｆａｔｈ
ｉらのＶｉｒｏｌｏｇｙ　１５５．９７−１０５　［１
９８６１参照）。これは、実施例に記載されているよう
に、好ましくは感染された真核性細胞をトランスフェク
ションから２日後に１４３８　ＴＫ−細胞（＾ＴＣＣ番
号ＣＲＬ　８３０３）に加え、後者をブロモデオキシウ
リジン（ＢＵｄＲ）の存在下で更に２日間培養すること
により行なう。この間、機能性チミジンキナーゼ遺伝子
（ＴＫ遺伝子）を含むすべての細胞は、死滅し、ＴＫ−
細胞に加え、外来遺伝子の組込みによりＴＫ遺伝子が不
活化されたワクシニアウィルスゲノムを含むＴＫ−細胞
のみが生存可能である。
この選択工程は、好ましくは数回行なわれる。
単一のウィルスクローンを得るために、ＢＵｄＲ選択の
後に実施例に記載されているように、まず１４３ＢＴＫ
−細胞の細胞懸濁液を用いてニワトリ胚線維芽細胞に感
染させ、それらをアガロース培地下で培養することがで
きる。外来抗原の発現は、クローン化ウィルス中で螢光
化抗体類により検出することができる。陽性クローン類
は、プラーク精製により更に精製することができる。こ
うして得られた組換えＭ、ＶＡワクシニアウィルス類は
、外来抗原をコードし、かつウィルスゲノム中に含まれ
ている遺伝子を発現することができる。このような遺伝
子の発現は、高度に弱毒化されたＭＶＡ株の組換え体と
通常使用されているＷＲ株の組換え体とにおいてほぼ同
等の強度であることが明らかとなった。
ワクチン類の調製のためには、本発明によるＭＶＡワク
シニアウィルス類は、生理学的に許容される形態に変換
される。これは、天然痘に対するワクチン接種に使用さ
れるワクチンの調製における長年の経験に基づいて行な
うことができる（ＫａｐｌａｎのＢｒ、Ｍｅｄ、Ｂｕｌ
ｌ、　２５．１３１−１３５　［１９６９］　）。
典型的には、約１０’−１０’の組換えＭＶＡ粒子を、
２％のペプトンと１％のヒトアルブミンの存在下で１０
０μ！のリン酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中でアンプル
、好ましくはガラスアンプル中にて凍結乾燥する。該凍
結乾燥物は、非経口的投与に適切な増量剤（例えばマン
ニトール、デクストラン、シュガー、グリシン、ラクト
ースまたはポリビニルピロリドン）または他の補助剤（
例えば、抗酸化剤、安定化剤等）を含有することができ
る。次いで、該ガラスアンプルを密封し、好ましくは一
２０°Ｃ以下の温度で数ケ月間保存することができる。
ワクチン接種のために凍結乾燥物を０．１ないし０．２
−の水溶液、好ましくは生理的食塩水に溶解し、非経口
的、例えば皮膚接種により投与することができる。本発
明によるワクチンは、好ましくは皮肉に注射投与される
。注射部位にはわずかな腫張、赤化、時にはかゆみが見
られることがある（Ｓｔｉｃｋｌ　らの前出文献）。投
与形態、投与量および投与回数は、当業者に知られてい
る方法により最適化することができる。該ワクチンを適
切な個所に長期にわたって数回投与することは、外来抗
原に対する高い抗体力価を得るために好ましい。
以下の詳細な実施例は、本発明のより良い理解を助ける
ためのものである。しかしながら、本発明は実施例の内
容に限定されることを意図するものではない。
実」１舛 １、ウィルス類の生育および精製 １．１　　ＭＶＡウィルスの生育 該ＭＶＡウィルスは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）
培養物上での元のＣＶＡ株の一連の移行により得られた
高度に弱毒化されたワクシニアウイルスである。該ワク
シニアＭＶＡ株の製造の経緯、性質および使用について
の一般的評論については、ＭａｙｒらによるＩｎｆｅｃ
ｔｉｏｎ　３．６−１４　［１９７５］において発行さ
れた要約が参考となるであろう。ＣＥＦへの適合性によ
り、ＭＶＡウィルスの他の細胞系上での生育は、かなり
制限され、該ウィルスによるプラーク形成は、現在ＣＥ
Ｆ細胞上でのみ検出可能である。サルＣＶ　１　（ＡＴ
ＣＣＮｏ、ＣＣＬ　７０）およびヒ）　１４３Ｂ　Ｔ’
に一細胞（ＡＴＣＣＮαＣＲＬ　８３０３；　　Ｂａｃ
ｃｈｅｔｌｉらのＰｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、　　［ＩＳＡ　　ヱ４、
１５９０−１５９４　　　［１９７７］　　）においで
は、プラーク形成は見出せないが、以下に記載するよう
に、少なくともこれらの２種の細胞株上においてＭＶＡ
ウィルスの転写が起こり、かつＣＥＦ細胞上での転写と
概ね比較可能であることを示すことが可能である。該Ｍ
ＶＡウィルスのＣＶＩおよび１４３Ｂ　ＴＫ−細胞上で
の転写能力は、外来抗原をウィルスゲノム中に組換える
ために使用された（下記参照）。
しかしながら、該ＭＶＡウィルスの性質を変えないよう
に、それを通常は、適合した宿主細胞であるＣＥＦ細胞
上で生育させた。ＣＥＦ細胞を調製するために、ふ卵さ
れたニワトりの卵から１１日令の胚を単離し、末端部を
除去し、そして胚を小片に切断して０．２５％のトリプ
シンからなる溶液中に室温で２時間かけてゆっくり解離
させた。得られた細胞懸濁液を、５％の牛胎児血清（Ｆ
Ｃ８）、ペニシリン（１００単位／ｄ）、ストレプトマ
イシン（１００μｇ／ｍ／）および２ｍＭのグルタミン
を含有した１容の培地１　（ＭＥＭ　Ｅａｇｌｅ、例え
ばスイス、バーゼルのＧｉｂｃｏ社から人手可能；オー
ダ一番号０７２−１５００）を用いて希釈し、セルスク
リーン（例えば、スイス、チューリッヒのＴｅｃｈｎｏ
ｍａｒ　ＡＧから人手可能；オーダ一番号Ｂｅ１ｌｃｏ
　１９８５．１５０メツシユ）を通して濾過し、そして
細胞を卓上遠心分離機（西ドイツ、ゴスハイムＤ−７２
０９のＨｅｒｍｌｅ　ＫＧ製）により２０００ｒｐｍで
室温下に５分間遠心分離することにより沈降させた。該
細胞沈降物を元のス体積の培地Ｉ中に取り出し、そして
こうして得られたＣＥＦ細胞を細胞培養皿に展開した。
それらを培地■中でＣＯ□培養器内で３７°Ｃにおいて
、所望の細胞密度に応じ１−２日間生育のため放置し、
これらを直接にまたは更に１−２の細胞推移の後に感染
のために使用した。初期培養物の調製についての明解な
記述は、Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎｅｙによる著書”Ｃｕ１
ｔｕｒｅ　　ｏｆ　　ａｎｉｍａｌ　　ｃａｌｌｓ”、
　八ｌａｎ　　Ｒ，ＬｉｓｓＶｅｒｌａｇ、　ニューヨ
ーク［１９８３］の１１章９９頁以下に見られる。
ＭＶＡウィルスを以下のようにして感染に使用した。Ｃ
ＥＦ細胞を１７５ｃ＋ｆｌの細胞培養ビン中で培養した
。８０−９０％のコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃ
ｅ）において培地を除去し、細胞をリン酸緩衝食塩水（
ＰＢＳ／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　、例えばスイス、ミュテン
ツのＡｎｉｍｅｄ　ＡＧ　、オーダ一番号２３．１００
．１０）中のＭＶＡウィルス懸濁液（細胞あたり０．０
１感染粒子（＝ｐｆｕ）、０．０１ｍｆ／ｃ＋ｆｌ）を
用いて１時間培養した。次いで、培地■を添加しく０．
２ｍＺ／ｃｆｆｌ）、これらのビンを約８０％のＣＥＦ
細胞が溶解するまで、３７°Ｃで２−３日間培養した。
ウィルス溶解物は、続いての処理（精製等）の前に、処
理することなく細胞培養ビン中に細胞と培地とを共に一
３０°Ｃにて保存した。
１．２　　ＷＲウィルスの生育 ＭＶＡウィルスとは対照的に、ＷＲウィルス（ＡＴＣＣ
Ｎｏ、　ＶＲ−１１９）は、実質的にすべての細胞系で
生育することができ（Ｄｒｉｌ　ｌ　ｉｅｎらのＪ、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ皿、８４３−８５０）、その生育は、プ
ラーク形成により直接観察することができる。このよう
にこのウィルスをＣＥＦ細胞上で生育させることを強い
る理由はないが、２種のウィルスＭＶＡとＷＲとの直接
的比較において、宿主細胞に特有の因子を掻力除くため
に、以下に記載する実験において、通常これらの細胞を
選択した。生育は、ＭＶＡウィルスについて記載したと
同様にして行なった。
１．３　ウィルス類の精製 できるだけ純粋であり、かつ宿主細胞に特有の成分を含
まないウィルス調製物を得るために用いた精製工程は、
ＭＶＡとＷＲウィルス類とに対して同様であった（Ｊｏ
ｋｌｉｋのＶｉｒｏｌｏｇｙ　１８％９−１８　［１９
６２］　、ＺｗａｒｔｏｕｗらのＪ、ｇｅｎ、Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ。
益、５２３−５２９　［１９６２］　）。感染され、次
いで一３０°Ｃにて保存された細胞培養物を解凍し、残
留細胞をプラスチックの基層から振り落とすか、あるい
はかき落とし、そして細胞およびウィルスを培地から遠
心分離（ツルバール（Ｓｏｒｖａｌｌ）遠心分離機、Ｇ
ＳＡローター、５０００ｒｐｍおよび１０°Ｃにて１時
間）により分離した。ウィルスおよび細胞粒子からなる
沈降物を、−旦、ＰＢＳ　（沈降物の１０−２０倍容）
中に懸濁し、該懸濁液を上記と同様に遠心分離した。新
たな沈降物を１０倍容のＲ３Ｂ緩衝液（１０ｍＭのトリ
ス−）ＩｃＩ　ｐＨ８，０，１０ｍＭのＭＣＩ、１ｍＭ
のＭｇＣ１ｚ）に懸濁し、該懸濁液を、元のまま残って
いる細胞を崩壊させ、かつウィルス粒子を細胞膜から遊
離させるために、手短に超音波により処理をした（直径
４ｍｍのチップを取付けたラブソニック（Ｌａｂｓｏｎ
ｉｃ）　１５１０、スイス、チューリッヒのＢｅｎｄｅ
ｒ　ａｎｄ　Ｈｏｂｅｉｎより人手可能；６０ワツトお
よび室温下で２Ｘ１０秒）。
細胞核およびより大きい細胞残渣を、引き続いて懸濁液
の手短かな遠心分離により除去した（西ドイツ、バット
　ナウハイムＤ−６３５３のＤｕＰｏｎｔ社より入手可
能なツルバールＧＳＡローター；３０００ｒｐｍおよび
１０’Ｃにて３分間）。沈降物を再びＲ３Ｂ緩衝液に懸
濁し、上記と同様にして超音波処理し、遠心分離した。
遊離のウィルス粒子を含む採取した上澄を合わせ、１０
ｍＭのトリスＨＣＩ、　　ｐＨ８，０中に３５％シュク
ロースを含む１０−の充填物上に積層し、コントロン（
Ｋｏｎｔｒｏｎ）ＴＳ７２８．３８／１７　ローター（
スイス、チューリッヒのＫｏｎｔｒｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｅ、、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＳＷ　２７０−ターに
相当する）内で１４．００Ｏｒｐｍ　、　ｌｏ’ｃにて
９０分間遠心分離にかけた。上澄をデカントし、ウィル
ス粒子を含む沈降物を１０−の１０ｍＭ　）リスＨＣＩ
、ｐＨ８，０中に取出し、手短かな超音波処理（室温に
て２Ｘ１０秒間、上記と同様の装置）により均質化し、
更に精製するために階段的勾配にかけた。勾配の段階は
、それぞれ１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　　ｐＨ８，０
中の５ｍｌのシュクロースから成っていた（シュクロー
ス濃度段階；２０％、２５％、３０％、３５％および４
０％）。該勾配をコントロンＴＳＴ　２８．３８／１７
０−ター内で１４．００Ｏｒｐｍおよび１０°Ｃにて３
５分間遠心分離にかけた。この遠心分離の後、ウィルス
粒子を含む数条の分散した帯が、３０％および４０％シ
ュクロースの間の勾配の領域において見ることができた
。この領域を勾配から抜き取り（１０ｍＺ）、該シュク
ロース溶液をＰＢＳ（２０ｒｎｌ）により希釈し、ウィ
ルス粒子をこれから遠心分離（コントロンＴＳＴ　２８
．３８／１７０−ター、１４．００Ｏｒｐｍ　、１０°
Ｃで９０分間）により沈澱させた。ここでほぼ純粋なウ
ィルス粒子からなる沈澱物（ＯＤ測測定プラーク試験と
の比較、下記参照）をＰＢＳ中にウィルス濃度が平均１
−５　Ｘ　１０９ｐｆｕ　／−に相当するように取出し
た。精製されたウィルスの保存溶液は、次の実験におい
て、直接またはＰＢＳにより希釈して使用した。
１．４　濃度の測定 ウィルス調製物の濃度の測定を、常に、２つの方法によ
って行ない、従ってウィルス株の純度について行なわれ
る記述もなされている。溶液中のウィルスの粒子の絶対
濃度は、１０Ｄｚｂ。
が１ｒｎ１当り１．２Ｘ１０”粒子のウィルス濃度に対
応する分光光度計（０口２６゜）中、２６０ｎｍにおけ
るウィルス溶液の光学密度の測定によって決定された（
Ｊｏｋｌｉｋの前出文献）。この目的のため、前記ウィ
ルス溶液をＰＢＳでＬ　：　１００の比率に希釈し、吸
収はＰＢＳ溶液を対照区として用いて石英キュベツト中
で測定された。このタイプの調製物からの各々約６０分
の１個のウィルス粒子だけが細胞培養を感染することが
できる、すなわち感染的であると仮定すると、（Ｊｏｋ
ｌｉｋ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｒｅｖ、３０３３−６６　［１９
６６］　）　、光学密度の測定からの計算したウィルス
力価と以下に述べる方法によって得られるウィルス力価
とを直接比較することができる。
細胞培養物におけるウィルス溶液を滴定するために、Ｃ
ＥＦ培養物を８ｃＩＩｌのプラスチック製の細胞培養皿
中の培地Ｉ中で生育させた。該培地を８０−９０％コン
フルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）の冬服に吸引し、Ｐ
ＢＳで希釈された０、　２　ｍＺのウィルスをそれ′ぞ
れに添加した。次いでこれらの皿を室温で１時間放置し
た。該ウィルス溶液を、１０分の１の段階をもって希釈
した。室温でのこの培養の後、２−のアガロース培地Ｉ
　（培地Ｉ＋１％アガロースから成る）をそれぞれの皿
に添加し、ＣＯ２培養器中、これらの皿を１６−２４時
間培養した。生細胞を染色するために更に０．２％のニ
ュトラルレッド（ｎｅｕｔｒａｌ　ｒｅｄ）を含んだ２
ｄのアガロース培地Ｉの層を頂部に置き、これらの皿を
更に１６−２４時間培養した。この時間が経過した後、
双眼顕微鏡下に無色のプラークを数えることが可能であ
り、得られたプラークの数を光学密度から計算した値と
比較した。はとんどの場合、良く一致していた。光学測
定から計算したウィルス力価は、通常、約２〜４の高い
因子であった。
（本頁以下余白） １．５ ＬＭ　　ＴＫ− Ｋ１３ ＣＶＩ ＩＴＡ ＨｅＬａ 八Ｇ１５２３ １４３Ｂ　ＴＫ 各種細胞系にけるＭＶＡウィルスの生育星土表 １１５００　１１５０　１１５　　　１：２０　１：１
００＋＋　　　＋＋　　　＋＋＋　　　　５／９　　０
１０＋　　　　＋　　　　＋＋＋＋　　　１０／１３　
３／３＋＋　　　＋＋＋　　　＋＋＋ｕ＋　　ｎｄ　　
５００／ｎｄ＋＋　　　＋＋＋＋＋　　＋＋＋＋＋＋　
　３１／３８　１０１５＋＋　　　＋＋　　　＋＋＋＋
＋＋　　３１／３９　１０／９＋＋＋＋＋　　＋＋＋＋
＋　　＋＋＋＋＋＋　　１１／８　　１１０＋＋　　　
＋＋＋＋＋　　＋＋＋＋＋＋　１５６／ｎｄ　　６０／
８６１：５００ １１０／１４０ ３０／２９ 第１表に示した細胞系ＬＭ　ＴＫ−（ＡＴＣＣＮｏ、　
ＣＣＬｌ、３）、　ＲＫ１３（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＣＬ
　３７）、ＣＶＩ（ＡＴＣＣ，Ｎｏ、　ＣＣＬｌ０）、
Ｒｉ　ｔａ　（ＲＣ−３７，５ｃｈｒ６ｄｅｒ　らのＪ
、ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ。
虹、４９３−５０１　　［１９７８］）、ＨｅＬａ（Ａ
ＴＣＣＮｏ、　ＣＣＬ　２）、ＡＧ１５２３（Ｈｕｍａ
ｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｅｐ
ｏｓｉｔｏｒｙ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ
ｅ　ｏｆ　Ｇｎｅｎｅｒａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｉ
ｅｎｃｅ　ＮＩＧＭＳ、カムデン、ニューシャーシー、
アメリカ合衆国）および１４３Ｂ　ＴＫ−（ＡＴＣＣＮ
ｏ、　ＣＲＬ８３０３）を８ｃｍ１の皿（それぞれの系
に対して１２個の皿）に塗布し、ＣＯ□培養器中、３７
°Ｃ１培地Ｉ中で８０−９０％コンフルエンスまで培養
した。次いで培地を吸引し、細胞を、０．２　ｍｌのＭ
ＶＡウィルス（ＰＢＳ中）で、特に、それぞれ５００．
５０または５個の細胞当り、１個の感染ウィルス粒子（
ｐｆｕ）の濃度で、それぞれ感染させた。室温で１時間
後、２ｍｌの培地Ｉを該細胞に添加し、次いで３７°Ｃ
でこれを培養した。２日後、培養皿の半分から培地を除
去し、該細胞を固定し、１８％エタノール中２％のニュ
トラルレッド？夜で染色した（１ｍｌ／皿）。染色した
培養物のいずれにもプラークは検出されなかったが、そ
れぞれの培養物中の細胞は、細胞系に応じて（＋＋＋＋
）と述べることができまたは弱い（＋）細胞変性効果（
細胞の変化）を示した。高いウィルス濃度（１ｐｆｕ／
　５細胞）は多くの場合−船釣な細胞死（＋＋＋＋＋＋
＋をもたらした。第１表の左側参照。
ＭＶＡウィルスの生育が種々の細胞系中において起った
かどうかを前記実験から確証することは不可能である。
この理由により、残存する未染色培養皿のそれぞれから
培地および細胞を集め、超音波によって手短に均質化さ
せ、この方法によって得られた均質化物はＣＥＦ細胞を
感染するために使用された。均質化物を１：２０．１　
：　１００および１　：　５００の比率にＰＢＳで希釈
した。８０−９０％コンフルエンスであり、培地が予め
除去されているＣＥＦ細胞の２つの皿に０、２　ｒｒｉ
の希釈物をそれぞれ添加した。該細胞を室温で１時間培
養し、次いでアガロース培地Ｉの層を頂部に塗布した（
２ｒｎｌ／皿）。３７°Ｃで１６２４時間培養した後、
０．２％のニュトラルレッドを含むアガロース培地Ｉを
添加しく２ｍ／／皿）、該皿を更に１６−２４時間培養
した。無着色のプラークは、容易に見ることができ、数
えられた（ｐｆｕ／皿）。個々の細胞系における結果は
、第１表の右側に記録されている。これらは中間ウィル
ス濃度（１ｐｆｕ１５０個の細胞）の希釈物に対する数
字である。使用したＭＶＡウィルスの粒子の元の数（ｐ
ｆｕ／細胞）、均質化物の希釈およびＣＥＦ細胞の感染
に使用した量から、ＭＶＡウィルスが個々の細胞系に於
て生育しなかったと仮定して、ＣＥＦ上に塗布した（＝
添加したウィルスの量）ウィルス粒子の数を計算するこ
とが可能である。これらのプラークの数は試験した細胞
系の２つ（Ｃｖｌおよび１４３Ｂ　ＴＫ−）　ニおいて
のみ添加したウィルスの量から予期される数字よりはっ
きりと高く、すなわち、ＭＶＡウィルスの測定可能な生
育がそれらの２つの細胞系においてのみ生じていたとい
うことが表から明らかである。
２、外来抗原の挿入 ２．１　　マラリア５．１抗原を有するプラスミド外来
抗原を、ウィルスＴＫ遺伝子中の均質組換えに基づ＜　
　Ｍａｃｋｅｔｔら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。
ＤＳＭ頚、７４１５−７４１９　　［１９８２］　）に
よって述べられた方法によってワクシニアウィルスゲノ
ムに挿入した。本実施例における組換えに使用したプラ
スミドｐＨＧ５−２１５．１の構築は、１９８６年１０
月２２日に発行されたヨーロッパ特許発行番号第１９８
゜３２８号に詳細に記述されている。出発プラスミドｐ
ＨＧ５−２は、プラスミドｐＨＧ５−２を用いて形質転
換させたＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩの培養物の形態で、
ブタペスト条約に基づき西独ゲテインゲンのＤｅｕｔｓ
ｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｎ　ＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ　３２４９の
下に１９８５年２月２１日に寄託され、１９８６年１０
月４日付で自由に入手可能になっている。ＤＳＭは、１
９８７年１１月以来、Ｄ−３３００Ｂｒａｕｎｓｃｈｗ
ｅｉｇ　ａｔ　Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　ＩＢ
に所在している。
２．２　　ＷＲウィルス中の組換え ＷＲウィルス中の５．１抗原の組換えを、組換えウィル
スのために２重選択が許されるプロトコールによって行
なった。第１の工程に於て、培地を、８０−９０％コン
フルエンスなＣＶＩサル細胞を含む８ｃＴＡの培養皿か
ら除去し、次いで温度感染性ワタシニア変異株ｔｓ　Ｎ
７　（Ｄｒｉｌｌｉｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　　１３
１．３８５−３９３　［１９８３］　）の０．２　ｍＺ
のウィルス懸濁液の層を、頂部に塗布した（０．１ｐｆ
ｕ／細胞）。これらの皿を室温で１時間放置した。次い
で培地Ｉを感染させた細胞に添加（２−７皿）し、これ
らの皿を、ＣＯ□培養器中、該ウィルスに対し許容する
３３°Ｃの温度で２時間培養した（Ｋｉｅｎｙら、Ｎａ
ｔｕｒｅ　３１２．１６３−１６６　［１９８４］　）
。
この培養時間が経過する３０分前に、ＤＮＡ類を含有す
るリン酸カルシウム沈澱物が調製された（Ｇｒａｈａｍ
らの前出文献）。この目的のために、０．５５ｒｎｌの
Ｈｅ’ｓ緩衝液（ｐＨ７，１に調整された１、５ｍＭの
リン酸水素二ナトリウム、２８０ｍＭのＮ　ａ　Ｃ１％
５０ｍＭのＨＥＰＥＳ）を導入し、次いでそれぞれ１μ
２のＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣ１ｐＨ７，５
，１ｍＭのＥＤＴＡ）中の２００ｎｇの精製ワタシニア
ＷＲウィルスＤＮＡおよび２００ｎｇの精製プラスミド
ｐＨＧ５−２１５．１　Ｄ　Ｎ　Ａを導入した。２５０
ｍＭの塩化カルシウム溶液０．５５−を、ゆるやかに撹
拌しながら滴下し、該混合液を室温で２０分間放置した
。
次いで培地を培養皿から吸引し、該細胞をそれぞれの場
合ＤＮＡ類を含有する０、２５Ｉｎ！の沈澱物と混合し
た。室温で１時間培養した後、２ｒｎｌの培地■をそれ
ぞれに添加し、該細胞を、ＣＯ２培養器中、３９．５°
Ｃで２時間培養した（Ｋｉｅｎｙらの前出文献）。最初
に使用したｔｓ　Ｎ７ウイルスは、少なくともｔｓ７遺
伝子座中に組換えを受けたウィルス類の選択が許される
この高められた温度に於ては生育することができない。
細胞上に存するリン酸カルシウムは、細胞の生育に対し
て長期間逆効果を持っていたため、該培地を２時間培養
後、除去し、これらの細胞をゆるやかに撹拌しながら、
それぞれの場合１艷のＰＢＳを用いて３回洗浄し、それ
ぞれの場合ＰＢＳ溶液を吸引し、それぞれの場合、２ｒ
ｎｌの培地Ｉを再び細胞に添加し、これをＣＯ２培養器
中、３９．５°Ｃで更に２日間維持した。次いで細胞お
よび培地を含む培養皿を一３０°Ｃで凍結させ、再び解
凍し、なお付着している細胞を皿からかき取り、該懸濁
液を前記した様に手短かに超音波で処理した。
第２の選択工程のために、ＰＢＳでそれぞれ未希釈また
は１：５または１：３０に希釈した０、２−の均質物を
、それぞれの場合において培地をあらかじめ除去した８
ｃＪの培養皿中のヒト１４３ＢＴＫ−細胞のほぼコンフ
ルエンスなローン上に置いた。感染した細胞を室温で１
時間保持し、次いで０．１ｍｇ／ｍｌのブロモデオキシ
ウリジン（ＢｔｌｄＲ）を含有する２ｒｄのアガロース
培地■　（培地■＋非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ　
；注文番号０４３−１１４０）＋ビタミン［Ｇｉｂｃｏ
　；注文番号０４３−１１２０］＋１％のアガロース）
の層をそれぞれに置いた。次いで皿を、ＣＯ□培養器中
、３７゛ｃで１６２４時間培養した。０．２％のニュト
ラルレッドを追加的に含むアガロース培地■の第２の層
を頂部に置き、これらの皿を更に１６−２４時間培養し
た。その後、無色のプラークが通常容易に見え、アガロ
ースシリンダーの状態でその中に含まれているウィルス
をパスツールピペットを用いて刺すことにより単一のク
ローンとして除去することができた（プラーク精製）。
この様にして刺すことによって除去したクローンを、通
常の方法によってＣＶＩ細胞上で生育させ、生育後、第
２および第３のプラーク精製に付した。この最終の生育
およびこの様にして得られた組換えΔＲ５，１ウィルス
の精製を前記と同様にして行った。
２．３　　ＭＶＡウィルス中に於ける組換え前記と同様
におよび第１表に記した様に、プラーク形成が生じない
が、ＭＶＡウィルスはＣｖｌおよび１４３Ｂ　ＴＫ−細
胞中で生育することができる。この事実は、ＭＶＡウィ
ルスのＴＫ遺伝子中に於ける外来抗体の組換えを二つの
方法で容易にする。一方では、ＣＶＩ細胞はＣＥＦより
も良い宿主を組換え工程に提供するということが実験か
ら明らかとなった。他方では、１４３ＢＴＫ−細胞中に
於けるウィルスの複製によすＴＫ−ウィルスの選択も簡
素化される。
ＭＶＡウィルス中の外来抗原の組換えは、ＷＲウィルス
のために述べた方法から、実質的に二つの点で異なる。
一方では、ＴＫ遺伝子中を除いてＭＶＡウィルスの構造
が変更しないため、温度感受性ウィルスｔｓ　Ｎ７を経
ての選択を用いることは不可能であった。他方では、Ｂ
ＵｄＲ選択に於て、１４３Ｂ　ＴＫ−細胞はアガロース
培地■とは混合せず正常培地■　（培地■十非必須アミ
ノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ　；注文番号０４３−１１４０３
＋ビタミン類（Ｇｉｂｃｏ　；注文番号０４３−１１２
０　）　）と混合し、刺すことによる個々のプラークの
除去は、選択されたＴＫウィルスによるＣＥＦの感染お
よびアガロース培地下に於ける培養後迄行なわれなかっ
た。
ＭＶＡウィルスに使用した組換えプロトコールは、ＷＲ
ウィルス用にＭａｃｋｅｔｔら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　　ヱ旦、　７４１５−７４
１９　　　［１９８２］　　によって述べられた方法と
ほぼ対応している。培地を、８０−９０％コンフルエン
スで、８ｃｆＩの培養皿上のＣＶＩ細胞から除去し、０
．２　ｍｌのＭＶＡウィルス懸濁液の層をそれぞれの頂
部に置き（０，１ｐｆｕ／細胞）、それらを室温で１時
間培養した。次に２ｍｌの培地Ｉを感染された細胞のそ
れぞれにピペットで分注し、該細胞をＣＯ２培養器中、
３７°Ｃで２時間培養した。以下の工程は、リン酸力ル
シラム沈澱物を調製するに当ってＷＲウィルスＤＮＡが
添加されなかったことを除いて、ＷＲウィルスに使用し
た方法に対応しく前記参照）、細胞の続いての培養を３
７°Ｃで行ない、アガロースを伴なわず０．１■／−の
ＢＵｄＲを有する２ｆｆ１／の培地■の層を１４３８　
ＴＫ−細胞の頂部に置いた。
２日間培養後、培養皿を手短に一３０°Ｃに冷却し、溶
液を再び解かし、該溶液を再び吸引し、残存する細胞を
基質からかき落し、細胞および培地を先に述べた手短な
超音波処理によって均質化させた。ＣＥＦで８０−９０
％過生育させた８　ｃｉの培養皿から培地を除去後、こ
の均質物のウィルス希釈溶液を細胞に添加しく２．０ｍ
ｆ／皿）、感染を室温で１時間保持した。次いでアガロ
ース培地Ｉの２ｍｆの層を、３７°Ｃで１６−２４時間
培養したＣＥＦの頂部に置き、続いて０．２％のニュー
トラルレッドを追加的に含んでいるアガロース培地Ｉ（
２ｄ）の第２の層を頂部に置いた。更に１６−２４時間
後、無色のプラークは容易に見ることができ、重層アガ
ロースと共にそこに含まれたウィルスをパスツールピペ
ットで刺すことにより除去することができた。この様に
して単離したウィルスのクローンをＣＶＩ細胞細胞体育
させて該ウィルスのクローンを精製するため、１４３Ｂ
ＴＫ−細胞上に於ける選択およびそれに続く工程を１−
２回繰返えした（プラーク精製）。この様にして得られ
た組換えＭＶＡ　５．１ウイルスの最終の生育および精
製を前記した方法によって行った。
３．５．１抗原の発現 ３．１　細胞培養物中におけるイン・ビトロ発現ＣＶＩ
細胞中における組換え−Ｒ５，１およびＭＶＡ５．１ウ
イルスによってマラリア５．Ｉ　Ａｇの発現を試験する
ために、組換えウィルスによって感染させたＣＶＩ細胞
を、ベンチ遠心分離（ＨｅｔｔｉｃｈＭｉｋｒｏｒａｐ
ｉｄ　Ｋ、　Ａ、Ｈａｔｔｉｃｈ　ＡＧ、　Ｂａｃｈ、
スイスより入手可能；２０°Ｃ１３分間で最大速度）に
おいて手短に遠心分離させることによって沈澱させ、沈
澱物をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中に取り出し、ガラ
ス製の顕微鏡用のスライドに適用し、そこで乾燥させた
。他の方法は、スライド上で直接ＣＶＩ細胞を培養し、
ウィルスでそれらを感染させ、■−２日後、ＰＢＳを用
いて洗浄することにより、この様な方法によって感染さ
せた細胞から培養培地を除去し、それらを室温にてガラ
ススライド上で乾燥させることから成る。
細胞を固定するために、スライドをアセトン中、３０’
Ｃで少なくとも１時間培養し、次いで室温で放置し乾燥
させた。
ＰＢＳ中で希釈されたウサギアンチ−５，１抗血清を、
細胞が液体の層でおおわれる様な方法で調製されたスラ
イド上に置いた。スライドを加湿室中、３７°Ｃで１時
間培養し、次いで乾燥させることなく数回ＰＢＳで洗浄
し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で
標識し、ＰＢＳ　　（ヤギ　アンチ−ウサギＩｇＧ、　
Ｎｏｒｄｉｃ　ＧＡＲ／Ｉｇ／ＦｒＴＣ，Ｂｉｏｇｅｎ
ｚｉａ　Ｌｅｍａｎｉａ　ＳＡ、　Ｌａｕｓａｎｎｅ。
スイスより人手可能）中に希釈した第２の抗体を細胞に
添加した。加湿室中、３７°Ｃで１時間培養後、スライ
ドをＰＢＳで数回洗浄し、放置し完全に乾燥させた。そ
の後、ＵＶ先光下顕微鏡において螢光発光により細胞調
製物を試験することができた。
３．２　マウス中に於けるイン・ビボ発現イン・ビボ中
に於て組換えＭＶＡウィルスによるワラリヤ５．１抗原
の発現と組換えＷＲウィルスの発現との比較を可能とす
るため、これらの組換えウィルスのいずれかで免疫させ
たマウス中でアンチ−５，１抗体の生産を測定した。こ
の目的のために、スイス先天性色素欠乏症のマウスに、
ＷＲウィルスの５．１組換え体（１０”　ｐｆｕ／マウ
ス）または非常に弱毒化されたＭＶＡウィルスの５．１
組換え体（１０’　ｐｆｕ　／マウス）のいずれかを２
週間の間隔を置いて皮下注射した。
最後の注射から２週間後、しっぽの先端を切取り、少量
の血液をヘパリン化された毛細管中に吸引した（１０μ
ｌ／マウス）。毛細管を９０ｕｌのＰＢＳ中に吹き出し
、遠心分離によってこの溶液から血清分画を得た。その
中に含まれそしてマラリア５．１抗原に対して支配され
る抗体の量について、血清の種々の一連の希釈をＥＬＩ
ＳＡ（ＶｏｌｌｅｒらのＴｈｅ　ｅｎｚｙｍｓ−１ｉｎ
ｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬ
ＩＳＡ）、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　［１９７９］　、Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈＰｒｏｄｕｋｔｅ　ＡＧ、、Ｅｍｂｒａｃｈ
、スイスより入手可能）中にて試験した。この目的のた
め、マルチタイター皿（例えばＤｙｎａｔｅｃｈ　Ｐｒ
ｏｄｕｋｔｅ　ＡＧ　；注文番号６５５００１）に、Ｅ
、ｃｏｌｉより単離した０、２５μｇノくぼみの組換え
５．１抗原を被覆した（ＨｏｐｅらのＮｕｔｕｒｅ　３
０Ｂ、　１９１−１９４　［１９８４コ）。このタイプ
の比較実験の結果を第■表にまとめた。
（本頁以下余白） 、ＬＬ表 抗体の生成 アンチ−５，１、ＥＬＩＳ八 ａ）へＷＲ５，１（１０１１ｐｆｕ／マウス）讐ＲＷＴ ｂ）　　ＭＶＡ　５．１ １：２００ （１０’ｐｆｕ／マウス） ３週令のスイス先天性色素欠乏症のマウスの５つの群を
、前記した様にａ）組換えＷＲワクシニアウィルス（Ｗ
Ｒ５，１）またはｂ）組換えＭＶＡワクシニアウィルス
（ＭＶＡ　５．１）で免疫させ、血清中のアンチ−５，
１抗体の力価をＥＬＩＳＡによって測定した。加えて、
マウスの２つの群に対照接種として出発ウィルス（ＷＲ
ＷＴまたは門νＡＷＴ）の対応する量を注射した。対照
血清中で測定した力価は、１　：　２００（ＷＲＷＴ）
および１　：　２５０（ＭＶＡ　ＷＴ）であったが、組
換えウィルスで処理した動物からの血清の値は、対照血
清に対する値以上ノ３０（ＭＶＡ　５．１）または１２
０（ＷＲ５，１）　ノ係数の平均であった。
４、組換えＭＶＡウィルスの毒性挙動 ４．１　細胞培養物中の挙動 出発ウィルス（ＭＶＡ　ＷＴ）に対比して、組換えＭＶ
　Ａ　ウィルス（ＭＶＡ　５．１）は、ｃｖｉ細胞上に
於てプラークを形成する。従って、細胞培養物中の組換
えＭＶＡウィルスの挙動が、ＭＶＡの出発ウィルスに比
べてわずかに変更していたかの印象を得た。この変更は
ウィルスの他の菌株による汚染に起因していなかったの
で、ウィルスＴＫ遺伝子中の５．１抗原の組換えのため
、毒性が増加したかまたは宿主ウィルスの挙動が変化し
たかも知れないという疑念が生じた。
４．２　マウス中の神経毒性 細胞培養物中の組換えＭＶＡウィルスの挙動に於けるわ
ずかな変化は、即ち、Ｃνｌ綱胞上に於けるプラークの
形成は、ウィルスチミジンキナーゼ遺伝子中への外来Ｄ
ＮＡの挿入によってもたらされる毒性の増加が多分有っ
たのではないかとの疑問を促す。この疑問を試験するた
めの可能な方法は、ウィルス類の神経毒性を測定するこ
とであった。この目的のためにウィルス類を１〜２日令
のマウスに脳内注射した後、ＬＤ、。
値を測定した。最初に５つの試験した全てのウィルス類
の濃度を、ＰＢＳを用いて４Ｘ１０９ｐｆｕ／ｍｌの初
期濃度に調整した。これらから出発して、ＰＢＳ中の１
０倍希釈溶液を調製し４Ｘ１０２ｐｆｕ／−の濃度に下
げた。使用したウィルス類は、ＷＲウィルス（ＡＴＣＣ
Ｎｏ、　ＶＲ−１１９＝ＷＲＷＴ）、それらに基づく組
換えＷＲ５゜■ウィルス（Ｗｌ？　５．１）、Ｅｌｓ　
ｔｒｅｅウィルス（ＡＴＣＣＮｏ、　ＶＲ−８６２＝Ｌ
Ｓ　ＷＴ）、ＭＶＡ出発ウィルス（ＭＶＡ　ＷＴ）、お
よびその５．１組換え体（ＭＶＡ　５．１）であった。
１〜２日令のマウス（スイス先天性色素欠乏症のマウス
）を、５匹のマウスの群に分け、それぞれ、その２つの
群をケージ中で母マウスの管理下に置いた。５匹のマウ
スはそれぞれのタイプのウィルスおよびウィルス濃度で
１０μｌのウィルス懸濁液の注射を脳の左半分に受け、
動物の挙動を２週間またはそれらが死に至るまで観察し
た。あるタイプのウィルスのＬＤｓｏを、Ｒｅｅｄらの
式（Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｈｙｇ。
近、　４９３−４９７　　［１９３Ｂ］　）を用いて、
個々の群に於けるマウスの生存率から計算した。これら
の実験の結果を第■表にまとめた。少なくとも神経毒性
に関してウィルスの病原性における増加は、ＭＶＡウィ
ルス中の組換え工程においては起らず、また、他のワク
シニアウィルス類に比ヘテＭＶＡつ（ルス［（ＭＶＡ　
ＷＴおよびＭＶＡ　５．１）の神経毒性において大きな
差異が有ることが明らかである。
第Ｊ遣２ 誓ＲＷＴ ＷＲ５，Ｉ Ｓ　　ＷＴ ＭＶＡ　　ＷＴ ＭＶＡ　　５．１ ８．７ −７．７ −５．８ −１．６ 出願人　エフ・ホフマン・う・ロシュ・ラントコンパニ
ー・アクチェンゲゼルシャフト代理人　弁理士　平　木
　祐　輔

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、外来抗原をコードするＤＮＡ配列を含むＭＶＡワク
    シニアウイルス。 ２、請求項１に記載の組換えＭＶＡワクシニアウイルス
    を含むワクチン。 ３、ワクチンとしての請求項１に記載の組換えＭＶＡワ
    クシニアウイルス。 ４、ａ）真核性細胞をＭＶＡワクシニアウイルスで感染
    させ、 ｂ）ワクシニアウイルスＤＮＡの本質的でない分節由来
    の部分配列内に於て、外来抗原をコードするＤＮＡ配列
    を含むＤＮＡを感染させた細胞に導入し、および ｃ）組換えＭＶＡワクシニアウイルスをそれ自体公知の
    方法により単離することを特徴とする請求項１に記載の
    組換えワクシニアウイルスの製造方法。 ５、病原性物質に起因する感染の予防のための請求項１
    に記載のＭＶＡワクシニアウイルスを含むワクチン。 ６、病原性物質に起因する感染の予防のための請求項１
    に記載の組換えＭＶＡワクシニアウイルスまたは請求項
    ２に記載のワクチンの使用。 ７、真核性細胞中で異種蛋白質を製造するための請求項
    １に記載の組換えＭＶＡワクシニアウイルスの使用。 ８、請求項４に記載の製造方法によって製造した組換え
    ＭＶＡワクシニアウイルス。
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