JPH025863A - 相補的鎖からなる関連する対象および参照高分子の処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

この発明は一般的には、相浦的鎖からなる高分子を特徴
付けする方法に関するものである。 更に詳しくはこの発明は、ゲノムＤＮＡやＲＮＡといっ
た２つの関連した複合高分子を表す代表的断片の集団（
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａ−
ｔｌｖｅ　「ｒａｇｎ＋ｅｎｔ：以下ＰＲＦと略記する
）の消去法的比較、および前記２つの高分子において違
いのある多形ＰＲＦ成分の部分的精製のための方法に関
するものである。

【発明の背景】

多形性は、１つの種の中の多様性の原因となりかつ遺伝
しつる２つの関連するゲノムの間の遺伝的相違である。 それらは、ゲノムをコードしているＤＮ、Ａ（またはＲ
ＮＡ）におけるサブユニットの構造的相違に相当する。 多くのＤＮＡの多形性は判然とした生理学的影響がない
が、遺伝特性の原因因子となるものもあり、いずれにせ
よ影響が明確か、はっきりしないか、あるいは遺伝病の
原因となる。従って、多形性部位を表す全体ゲノムＤＮ
Ａの断片を単離することは、生化学的および医学的研究
の重要な仕事となる。医学的な遺伝学の分野では、これ
ら断片の単離が遺伝病診断を進めるための一歩となる。 より一般的には、遺伝子を単離してそれらの機能を特徴
付けることは、生化学的研究プログラムの共通の構成要
素となる。 従来においては、ゲノムＤＮＡの遺伝的差異の検出と遺
伝子の単離は、ゲノムの複雑さによって制約があり、面
倒な比較ブロービング法（ｃｏＩＩｌｐａｒａｔｌｖｅ
　ｐｒｏｂｉｎｇ　ｔｅｅｈｎｌｑｕｅｓ）に頼らない
慣用的操作により分析されている。これら従来操作とそ
の欠点のいくつかについて、以下に説明する。 消去法的ハイブリッド形成法（ｓｕｂｔｒａｃｔｌｏｎ
ｈｙｂｒｌｄｌｚａｔｌｏｎ）は、遺伝子またはそれら
の対応するＲＮＡの単離に用いられている最初のアプロ
ーチの１つであった。この方法は、ＤＮＡやＲＮＡ／Ｄ
ＮＡハイブリッドの二重体すなわち二本鎖構造に依存し
ている。ＤＮＡ二本鎖は、ホルムアミドまたは高ｐＨ溶
液のごとき不安定化剤での処理あるいは熱処理によって
、変性させる、すなわちそれらの相浦的鎖に分けること
ができる。アニーリング条件をつくることによって、こ
れらの相浦的鎖を対にして二本鎖を再形成させることが
できる。二本鎖の安定性は、鎖の間の構成塩基の適切な
組み合わせに高度に依存している。ＤＮＡ分子中に見出
だされた４個の構成塩基はアデニン、チミン、グアニン
、およびシトシンである（以下、これらをそれぞれＡＳ
ＴＳＧ、およびＣと略記する）。鏡開の適切なサブユニ
ット対は、ＡとＴ、ＧとＣである。最初の消去法的ハイ
ブリッド形成実験においては、ウィルスの対象ＤＮＡと
宿主細胞ＤＮＡが用いられた。ウィルス感染細胞から抽
出された全ＲＮＡのウィルス成分は、ウィルスＤＮＡに
選択的に結合し、宿主細胞ＤＮＡへは結合しなかった。 ［ＢａｕＬｚ　ａｎｄ　ｌ１ａｌｌ、　　Ｔｈｅ　ｌ５
ｏｌａ−ｔｌｏｎ　ｏｒ　Ｔ４−３ｐｅｃｌ「ｌｃ　Ｒ
ＮＡ　ｏｎ　ａ　ＤＮＡ−Ｃａ！　ＩｕｌｏｓｅＣｏｌ
ｕｎ＋ｎ、　　４８　　Ｐｒｏ、　Ｎａｔ、　Ａｅａｄ
、　Ｓｃｉ、　　４００　（１９６２）］。２つの相補
的−本鎖のうちの一本が基質に安定に結合されていると
しても、ハイブリッド形成は２つの相補的−本鎖の間で
起るであろう。 従来の消去法的ハイブリッド形成に際しては、対象（５
ｕｂｊｅｃｔ　）ゲノムおよび関連する参照（ｆｅｆｅ
ｒｅｎｃｅ）ゲノムのＤＮＡが用いられる。両方の二本
鎖ＤＮＡは断片化され、次いで変性される。断片化され
た参照鎖は、アガロース、セルロース、ナイロンといっ
た基質に結合される。 断片化された対象鎖は、大過剰のモル量の結合された参
照鎖とアニーリングされる。このアニーリング処理によ
り、大部分の対象鎖は参照相補体と対となり、対象鎖お
よび参照鎖からなる二本鎖ハイブリッド中にトラップさ
れる。参照相補体を持たない対象鎖は、参照ＤＮＡとの
安定な二本鎖中に対を形成することができず、従って参
照ＤＮＡにトラップされない。このアニーリングの後、
基質を取り除くことによって、参照ＤＮＡとトラップさ
れた相同の対象ＤＮＡとが除去される。フリーの対象Ｄ
ＮＡは、求めている特有の対象ＤＮＡとハイブリッド二
本鎖中にトラップされずに逃れてきた共通ＤＮＡとから
なっている。前者は、投入された対象ＤＮＡ集団のとき
よりもフリーＤＮＡの割合が大となっており、これは共
通ＤＮＡの大部分が消去されて除かれてしまったからで
ある。かくして、消去法的ハイブリッド形成方法は最終
的には、参照相補体のない捜し求める特有のＤＮＡに対
して部分的精製をもたらすことになる。 従来の消去法的ハイブリッド形成方法に際して望まれな
い対象ＤＮＡを除去する程度は、役人材料のモル比に依
存する′。−本鎖の二本鎖へのアニーリングは、従来の
質量作用の法則に従う二分子反応である。１０部の参照
ＤＮＡに対して１部の対象ＤＮＡとなるような投入比の
場合、アニーリング生成物の比率は０．１（対象）：２
（ハイブリッド）：９（参照二本鎖）となる。 かくして、投入された対象ＤＮＡ集団については、基質
に結合されたＤＮＡを取り除くことにより、対象相同を
持つ対象ＤＮＡの９０％が除去される。 従来の消去法的ハイブリッド形成技術はその適用が限定
されており、ウィルスや細菌のごとき単純な生物のゲノ
ムの欠失に相当する多形性に限定されていた。この技術
は点変異やリアレンジ多形性に対しては適用できない。 求められる対象ＤＮＡ多形性は参照ＤＮＡと相同性を有
しており、従ってトラップされて、消去法的ハイブリッ
ド形成操作に際して除去されてしまうだろう。さらに、
比較的高級な種のゲノムＤＮＡは、染色体全体にわたっ
て繰り返されかつ分散される膨大な塩基対配列を含んで
いる。例えば、ヒトのゲノムＤＮＡの約８０％は幾つか
の群の繰り返しく反復）ＤＮＡからなっており、最大の
群は数百から数千のコピーを持っている。 単一コピーの遺伝子あるいは配列は、ヒトのゲノムＤＮ
Ａの残りの２０％である。反復配列は望ましくない混乱
をもたらす。複雑なゲノムからなるＤＮＡ鎖のアニーリ
ングに際して、反復した配列は、より低濃度の単一コピ
ー配列に比べて迅速に接触する。従って、反復領域は、
隣接する単一コピー遺伝子領域の間の非相同性にかかわ
らず、安定な二本鎖領域を形成する。その結果、二本鎖
領域によって安定化されたＤＮＡの“無差別な°もつれ
（ｔａｎｇｌｅｓ）が広範囲に形成される。かような無
差別なもつれは、従来の消去法的ハイブリッド形成にお
ける精製効果を妨げる。 従来の消去法的ハイブリッド形成の別なアプローチは、
制限ヌクレアーゼを用いる。制限ヌクレアーゼは、二本
鎖ＤＮＡ分子中の特定の標的配列、塩基対を認識し、か
つＤＮＡ分子の両方の鎖を標的配列の部位で切断する能
力を有する酵素である。制限ヌクレアーゼでの消化によ
り生成されたＤＮＡ分子を制限断片という。特定の制限
ヌクレアーゼにより消化されたゲノムＤＮＡは、互いに
分かれたＰＲＦに変換される。 制限断片長多形（ＲＦＬＰ）は、比較される２つのＰＲ
Ｆの遺伝的に関連するいくっがの断片の長さの違いとし
て現れる多形の１つのタイプである。基本的な遺伝的表
現は、１つの切断部位を作ったり消したりする単一の塩
基対の変化といった微細なものや、切断部位の間のＤＮ
Ａの長さを変える遺伝的欠失のごとき著しいものがある
。ＲＦＬＰを検出するために、大きさに基づく二本鎖Ｄ
ＮＡ分子の分別を行う分析法が必要となる。かような分
別のために最も一般に使用されている技術は、アガロー
ス・ゲル電気泳動法である。この方法においてＤＮＡ分
子はゲル中を泳動し、ゲルは、最大分子の運動は最大限
に妨げるが最小分子の運動は最少限にしか影響を与えな
いような篩として働く。ゲル電気泳動により分別された
ＰＲＦを比較することによって、比較される対象および
参照ＰＲＦに共通な断片に対して、各ゲノムに特有な断
片が明らかになる。特有な断片はＲＦＬＰを表す。 分別されたＰＲＦを変性して、分別に用いたゲル領域内
でアニーリングを施すこともできる。 かようなその場での（Ｉｎ　５ｉｔｕ）アニーリングは
、反復したＰ　ＲＦ　構成物を選択的に検出する方法と
して、従来から採用されている。［ＲＯｎＩｎＳＯｎ。 Ｄｅｔｅｅｔｌｏｎ　ａｎｄ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｒｈ
ｏＩＩ＋ｏｌｏｇｕｓ、　ｒｅｐｅａｔ−ｅｄ　　ａｎ
ｄ　　ａｒＡｐｌｉｆｌｅｄ　　ＤＮＡ　　５ａｑｕｅ
ｎａｅｓ　　ｂｙＤＮＡｒｅｎａｔｕｒａｔｌｏｎ　１
ｎ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌｓ、　　１１　　Ｎｕｃｌ
ｅｌｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　５４１３−３１　（１９
８３）　］。 比較されるＤＮＡを塩基対の安定性によって区別する分
別法も使用されている。［ＦＩｓａｈｅｒａｎｄ　Ｌｅ
ｒｍａｎ、　Ｌｅｎｇｔｈ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　
５ｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆ　ＤＮＡ　Ｒｅ５ｔｒｉｃｔ
ｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　Ｉｎ　Ｔｖｏ−Ｄｌｍｅ
ｎ−ｓｌｏｎａｌ　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ、　　１８　　Ｃｅ１ｌ　１９１２００　（Ｊａ
ｎ、　１９７９）　］。 分別操作により各ＰＲＦの構成成分を分けることができ
れば、ＰＲＦの間の相違は容易に検出できる。例えば、
多くのウィルスＰＲＦに対しては一次元分別により、あ
るいは、細菌ＰＲＦに対しては断片長と熱安定性とに反
応する二次元分別により、所望の分離ができる。しかし
ながら、より高級な生物に対しては、たとえ最良の分別
方法を用いても、求める多形ＰＲＦ構成成分の分離は達
成できない。かような高級生物の場合には、大多数のＰ
ＲＦ構成物からの単一構成物の分離が起こるが、構成物
の数が非常に多いので重複する断片のバンドの連続体が
出現し、この連続体中の構成物の分離と検出を妨げる。 断片バンドの連続体が出現する場合には、特定遺伝子の
位置を表示するためにプロービング法が使用されている
。クローン化された求める遺伝子型に放射性または生化
学的ラベルを付与し、このラベルは後にその位置を確認
するために用いることができる。ラベルを付された遺伝
子はその相同を位置決めするためのプローブの働きをす
る。分別された対象ＤＮＡは構成成分路に変性され、次
いで膜に安定に結合し、例えば安定な膜上にブロッティ
ングされる。−本鎖ブローブとブロッティングされた対
象ＤＮＡは次いでアニーリングされる。プローブは塩基
対によってその遺伝的相同位置のみに安定に結合し、こ
れによって、プロット（ｂｌｏｔ）上の相同断片の位置
を検出できる。多くの単一遺伝子プローブでは、比較さ
れるＰＲＦは選択的に表示される断片に対して何ら差異
を示さない。それでもなお、関連するＰＲＦの面倒な比
較ブロービングを順次に行うことができ、またプローブ
の多数の集団を用いて、遺伝的診断に有用な多形性を検
出することができる。［Ｇｕｓｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、
。 Ａ　Ｐｏ１ｙ＋ｇｏｒｐｈｌｃ　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ
　Ｇｏｎｅｔｉｃａｌｌｙ　Ｌｌｎｋ−ｅｄ　ｔｏ　ｌ
ｌｕｎｔｌｎｇｔｏｎ　ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ、　　３０
８　Ｎａｔｕｒｅ　２３４（１９８３）］。 ウィルスのゲノムＤＮＡの多形性の下位集団（ｓｕｂ−
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を選択的に表示するために、も
う１つの方法が用いられている。この方法においては、
比較される２つのゲノムのゲノムＤＮＡのＰＲＦが調製
される。これらは等量プールされ、ハイブリッド形成操
作がなされる。ハイブリッド形成の生成物は次いで、Ｄ
ＮＡ二本鎖中の歪部位を切断するヌクレアーゼｓ１で処
理される。［５ｈｅｎｋ　ｅｔ　ａｌ、、　　ＢＪｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄ　　ｆ’ｏｒ　Ｍａｐｐｉ
ｎｇ　Ｍｕｔａｔｌｏａｌ　Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉ
ｎ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈ　ＳＩ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ：　　
Ｔｈｅ　ＬｏｃａＬｌｏｎ　ｏｆ’Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ
　ａｎｄ　ＴａｔａｐｅｒａＬｕｒｅ−８ｅｎｓｉｔｉ
ｖｅ　　Ｍｕｔａ−ｔｌｏｎｓ　Ｉｎ　ＳｌｍＩａｎ　
Ｖｉｒｕｓ　４０　　、７２　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ。 ＾ｃａｄ、　ｓｅｔ、　３：９８９−９９３　（１９７
５）　］　、多形ＤＮＡ鎖からなるいくつかのハイブリ
ッド二本鎖は十分な歪部位を有し、従ってこれらの部位
で切断される。かくして生成された二次的断片は分別に
よって検出されるが、この分別に際して、Ｓ１切断によ
る断片はそれ以前の損なわれていない断片より速く移動
する。この歪部位切断法にとっては、生成物の比較分析
のために、各ＰＲＦのそれ自身に対するハイブリッド形
成からなるコントロールを行うことが不可欠である。か
ようなコントロールは二次的Ｓ１断片を産生ずる。この
断片は、ゲノムＤＮＡ内の反復配列および部分的相同の
ために生ずるものである。それらをコードする断片は、
ハイブリッド形成に際して歪んだ二本鎖と部分的な二本
鎖複合体を生成する。このようにして、二次的断片が８
１ヌクレアーゼによる消化の間に生ずる。これら二次的
断片を同定して、ゲノム内の内部的相同からのゲノム間
の多形性を区別する。この歪部位切断法は、細菌のゲノ
ムＤＮＡにも使用されている＠［Ｙｅｅ　ａｎｄ　Ｉｎ
ｏｕｙｅ、　Ｔｗｏ−旧ｍｅｎｓｌｏｎａｌＳｌ　ｎｕ
ｃｌｅａｓｅ　ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ　ｎ＋ａｐｐ
ｌｎｇ：　　Ｄｅｔｅｃ−口ｏｎ　ｏｒｒｅａｒｒａｎ
ＢｅｎＬｓ　Ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｌａｌ　ｇｅｎｏｍｅ
ｓ。 ８１　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、、＾ｃａｄ、　Ｓｃ１．２
７２３−２７２７　（１９８４）　］。内部的相同は細
菌ゲノム中の全ゲノムＤＮＡのわずかな部分であり、コ
ントロールから同定することができる。それに対して、
高級生物のゲノムＤＮＡにおいては、内部的相同が広範
囲にわたる。そのため、この方法を高級生物のＰＲＦの
場合に使用すると、広範囲にわたる内部的相同の結果と
して生ずる多量の二次的断片によって、求める多形性が
弱められる。 その他の多形性同定技術は、極く限られた分野で使用さ
れている。これらの技術は、その多形性が引き続き捜し
求められるゲノム断片のクローニングを予め必要とする
ものである。これらの方法のうちで最も精巧なものは比
較ヌクレオチド塩基配列決定法であり、これによって多
形性の特定サブユニットの相違が同定される。

【発明の目的】

従ってこの発明の目的は、例えば二本鎖ＤＮＡや二本鎖
ＲＮＡといった相浦的鎖からなる２つの関連する高分子
（以下単に高分子という）の間の少なくとも１つの相違
を検出するための新規な方法を提供することである。 この発明のもう１つの目的は、参照（ｆｏｒｅｒ−ｅｎ
ｃｅ）高分子の断片中に参〇補体のない対象（ｓｕｂｊ
ｅｃｔ）高分子のＰＲＦの多くの特有の構成物を、同時
に部分的に精製するための新規な方法を提供することで
ある。 この発明の第３の目的は、対象ゲノムＤＮＡへの非本質
的な付加や対象ゲノムＤＮＡ内の再配列を、適切な参照
ゲノムＤＮＡと比較して確認する新規な方法を提供する
ことである。

【発明の概要】

この発明は、ＰＲＦが非常に複雑であるために分別処理
それ自体では各ＰＲＦ内の構成物を分けることができな
い場合でも、対象ゲノムＤＮＡのＰＲＦの特有の構成物
群を、対象および参照ＰＲＦに共通な構成物から部分的
に精製しかつ引き続き検出することができる方法である
。 単一のＰ　ＲＦ　構成物は遺伝的に同じ断片であり、多
数の同じ基質ゲノムの同じセグメントに対応し、基質ゲ
ノムの特定部位切断により生成される。比較されるＰＲ
Ｆの特有の構成物の群は、選ばれる特定の分別操作によ
り決定される。かような分別操作には、例えば、断片長
さによる分離、平均サブユニット組成、二重螺旋から一
本鎖への転移の開始、二重螺旋から一本鎖への転移の終
了、および各□種試薬との結合能力などが利用できよう
。選ばれた一次分別により、特定のＰＲＦ構成物を、分
別処理に投入されたその相手の大部分から分離すること
ができる。対象および参照ゲノムＤＮＡの対応する遺伝
的位置から得られ、同時に分別されないＰＲＦ構成物は
、この発明方法により精製される多形構成物のプール中
にあるであろう。例えば、対象および参照ゲノムＤＮＡ
に対して対応する位置から誘導された構成物の長さが異
なる場合（すなわちＲＦＬＰである場合）、この発明方
法はＲＦＬＰ位置を示す対象構成物を生成することにな
る。 この発明はまた、比較的高級な真核生物（細胞に核を含
んでいる生物）の特徴である、多数の繰り返し配列によ
りもたらされる問題を克服することもできる。これは、
消去法的ハイブリッド形成処理に先立って上記の分別処
理を行うことによって達成される。分別処理により、繰
り返し配列をもつものを含むＰＩＦ構成物を、多数の別
個の両分に分解する。各両分の複雑さは全体の投入ＰＲ
Ｆの複雑さよりもかなり減少しているため、引き続く消
去法的ハイブリッド形成に際して、各両分内での無差別
な複合体形成の可能性は大幅に低減する。この発明は、
ゲノムＤＮＡをそれらのＰＲＦに分解する際に生成され
る断片末端の当初の対の存在に依存する工程を含ませる
ことによって、上記の処理に際する無差別なりＮＡ破損
の問題を解決することができる。 この発明方法の好ましい態様は、次の工程からなる。す
なわち（１）対象および参照ゲノムをそれらの各々のＰ
ＲＦに変換し：（２）対象および参照ＰＲＦに識別しつ
る明瞭な生化学的および／または同位体的ラベルを付け
；（３）対象ＰＲＦと参照ＰＲＦとの混合物を生成し；
（４）混合物を分別し；（５）各両分内の断片を一本の
ＤＮＡ鎖に変性させ、かつこれらの−水路をアニーリン
グして、（ａ）対象および参照ＰＲＦの両方に共通の−
からなるハイブリッド二本鎖と、（ｂ）対象ＰＲＦに特
有の残留対象断片と、（Ｃ）過剰の参照断片とを含む二
本鎖を再生せしめ、（６）前記の明瞭な生化学的および
／または同位体的ラベルを利用して、参照相同物と共に
二本鎖内に取り込まれなかった対象断片の精製を行い、
これによって対象ＰＲＦに特有の断片の望ましい部分的
精製をもたらし；（７）対象ＰＲＦのみに対してコント
ロール精製を施し；（８）前記工程（７）の生成物を前
記工程（６）の生成物と比較して、前記工程（１）〜（
８）の部分的に精製された生成物中になお存在する非多
形対象断片を同定する。次いでその他の標準的方法論を
採用して、多形性を示すＰ　ＲＦ　構成物の完全な精製
をさらに施すことができる。

【実施例】

添付図面はこの発明の方法の１実施例のフローダイヤグ
ラムであり、２つの関連するゲノムのゲノムＤＮＡを表
示する２つのＰＲＦの消去法的比較方法、および参照ゲ
ノムＤＮＡのＰＲＦにおいては示されない対象ゲノムＤ
ＮＡの制限断片の部分的精製方法を説明するものである
。 この方法の第１工程においては、２つの関連するゲノム
のうちの１つは対象ゲノムと称され、もう１つは参照ゲ
ノムと称される。これら２つのゲノムのゲノムＤＮＡは
、それぞれの代表的断片の対象および参照集団（以下対
象および参照ＰＲＦと略称する）に変換される。各ゲノ
ムＤＮＡのＰＲＦへの変換は、二本鎖ＤＮＡ分子を慣用
的な制限ヌクレアーゼで切断することによって、あるい
はランダムに分断された鎖ではなく限定された断片を生
ぜしめるその他の方法によって行うことができる。 好ましい実施例においては、対象および参照ゲノムＤＮ
Ａは、慣用的なイソシゾマー・ヌクレアーゼを用いて第
１工程でそれらの各々のＰＲＦに変換される。二本鎖Ｄ
ＮＡ分子中の同じ標的塩基配列を認識するが、異なる塩
基残基で鎖を切断するような制限酵素を、互いのイソシ
ゾマーという。例えば、慣用的な制限酵素Ａｓｐ７１ｇ
は二本鎖ＤＮＡ分子中の下記のような６個の塩基対の標
的塩基配列を認識する：５’　−−−ＧＧＴＡＣＣ−−
−３’ ３’　−−−ＣＣＡＴＧＧ−−−５’ ここで破線はＤＮＡ鎖の非標的部分を表す。この制限酵
素Ａｓｐ７１ＢはＤＮＡ分子の鎖を２個のＧの１川で切
断する。Ａｓｐ７１ＢのイソシゾマーであるＫｐｎｌは
、同じ塩基配列を認識するが、ＤＮＡ分子の同じ鎖を２
個のＣの間で切断する。ゲノムＤＮＡの２つの同じ試料
のうちの１つをＡｓｐ７１ｇで切断し、もう１つをＫｐ
ｎｌで切断すると、同一の構成物を持つが断片末端が異
なるＰＲＦを生成する。Ａｓｐ７１８で生成されたＰＲ
Ｆは５’　−−−０３’ ３’−−−ＣＣＡＴＧ　　５’ の断片末端を有するのに対し、Ｋｐｎｌで生成されたＰ
ＲＦは ５’−−−ＧＧＴＡＣ３’ ３’　−−−Ｃ５’ の断片末端を有する。 ＤＮＡのための好ましい実施例においては、対象ＰＲＦ
をＡｓｐ７１８で調製し、参照ＰＲＦをＫｐｎｌで調製
する（その逆でも良い）。イソシゾマーを用いる利点は
、断片末端の相違を与えることによってＰＲＦにラベル
を付ける点である。 かような断片末端の相違により、違ったタイプの断片の
存在下で１つのタイプの断片を識別することができる。 さらに、イソシゾマーを用いることによって、プロセス
の最後に選択的な組み換え体ＤＮＡクローニングを行う
ことも可能にする。＾５ｐ７１１１とＫｐｎｌという特
定のイソシゾマーの対を選んだのは２つの理由による。 第１は、特徴的な断片末端がこの発明方法の後の工程で
の識別末端ラベルとして容易に使用できることである。 第２は、６個の塩基対の標的サイズが、長さによる一次
分別のための有用なサイズ分布を持つＰＲＦを生成する
ことである。ここで便宜上、二本鎖対象断片を“ｓｓ　
　と称し、二本鎖参照断片を“ｒｒ　　と称する。 添付図面に示す方法の第２工程では、第１工程の参照Ｐ
ＲＦにさらに生化学的および／または同位体的ラベルを
付ける。追加的ラベルを付された参照断片を“ｒ′　ｒ
′　　と称する。これらのラベルの選定は、遺伝的に同
じｓｓＳ　ｒｒおよびｒ′　ｒ′断片が、後の一次分別
工程すなわち第４工程において同じ移動性を持たなくて
はならないために、どうしても行う必要がある。 第２工程で追加されたラベルは、第６エ程の二次分別に
おいて、対象ＤＮＡから参照ＤＮＡと対象および参照Ｄ
ＮＡ鎖のＤＮＡハイブリッドとを分離することを可能に
する。 好ましい実施例においては、参照制限断片の光感性ビオ
チン化を第２工程に含む。これは、光処理を用いて参照
断片にビオチン・ラベルを付けるものである。この工程
により、参照ＰＲＦに第２のタイプのラベル付けができ
る。ビオチン化されたＤＮＡは、アビジンまたはストレ
バビジンを取り込ませたクロマトグラフィー樹脂に強力
に結合する。かようなりロマトグラフィー処理により、
ビオチン化された参照ＤＮＡ分子と対象およびビオチン
化された参照ＤＮＡ鎖の二本鎖ハイブリッドとは保持さ
れ、ビオチン化されていない対象ＤＮＡは第６エ程の二
次分別処理中に保持されずに自由に通過する。 添付図面に示す方法の第３工程では、ｒ′ｒ′参照ＰＲ
Ｆおよびｓｓ対象ＰＲＦの混合物が生成され、この混合
物を“ｓｓ／ｒ’ｒ’と称する。この好ましい実施例で
は、混合物の量は、第４工程で用いる分別方法や、第７
エ程の後でなされるクローニングによる多形対象ＤＮＡ
断片の増幅処理に適合するような量とすべきである。対
象ＰＲＦに対する参照ＰＲＦの比を高くすることによっ
て、対象制限断片成分を同質遺伝子型参照制限断片成分
とともに、対象および参照ＤＮＡ鎖からなる二本鎖ＤＮ
Ａハイブリッド中に高率で取り込ませることができる。 同質遺伝子型という用語は、遺伝的物質の同じ配列がコ
ードされていることを意味する。同質遺伝子型断片は点
変異（例えば１つの塩基対）だけ異なっていてもよいが
、遺伝子含量や順序に実質的な相違を有していない。こ
の工程は、ビオチン化参照ＰＲＦ　：対象ＰＲＦが１：
１の比を用いて行うことができる。しかしながら上述し
たように、この比が高くなるほど効率は向上する。例え
ば、ビオチン化参照ＰＲＦ　：対象ＰＲＦが１０：１の
比を用いて実際に行なわれた。好ましい実施例では、１
００　：　１から１０００　：１の比でも効率よく行え
ることが予想される。 この方法の第４工程では、第３工程で生成された混合物
が慣用的な分別操作を用いて分別される。このときの分
別操作は、（１）１つのＰＲＦの各特定構成物を、その
ＰＲＦの大多数の他の構成物から分離でき、（２）ラベ
ルの相違に関係なく、対象および参照ＰＲＦ中の遺伝的
に同じ構成物が共に移行できるようなものであればいか
なる分別操作でもよい。各投入構成物は、分別処理中に
投入されたその相手の大部分から区画されることが重要
であるけれども、ＰＲＦ構成物の物理的に重複する領域
が分別中に分けられる必要はない。この分別により２つ
の対象構成物の群が限定される。共通の対象構成物は、
共に移行しかつ同質遺伝子型の参照物相手を有するもの
である。特有の対象構成物は対象多形ＤＮＡ断片であり
、この断片は、同質遺伝子型でかつ共に移行する参照物
相手を有していない。 この発明の正味プロセスすなわち全体プロセスを通じて
精製されるものは、これらの特有の多形断片である。 投入された各構成物の相手の大部分から各構成物を実質
的に分離することは、第２の重要な目的である。この分
離は、どれかの構成物が、例えば反復配列といった偶発
的相同をもつ共存構成物を有する可能性を低減させるも
のである。 その結果、引き続＜　ＤＮＡハイブリッド形成における
無差別なもつれを大幅に減少させる。各構成物は、投入
された最初のＰＲＦにおけるよりもかなり少ない構成物
としか共存しない。 混合物の分別を達成するための好ましい方法は、アガロ
ース・ゲルを通す電気泳動によるサイズ分別である。こ
の方法では、最大分子の移動を最大限に阻止しかつ最小
分子の移動は最小限にしか阻止しない篩のようにゲルが
作用し、従ってＤＮＡ分子はゲルを通って移動する。す
なわち、制限断片が小さければ小さいほど、アガロース
・ゲル中の電気泳動下での動きは大きくなる。対象ＰＲ
Ｆにおける長さの多形性を示す構成物は、参照ＰＲＦの
部分的相同物と共に分別されないが、同質遺伝子型の対
象構成物と参照構成物は共に分別される。この分別プロ
セスは、ＤＮＡがゲル内にトラップされたままの状態で
終了させるか、あるいはこのプロセスで生成された両分
を集めることによって終了させることができる。ＤＮＡ
をゲル内にそのまま維持することが、分別プロセスで得
られた分離構成物を保存するためには最も良い。ここで
画分という用語は、トラップされた構成物を含むゲルの
区域を意味するととともに、分別装置から取り出されて
集められた生成物をも意味する。 添付図面に示す方法の第５工程は、第４工程で得られた
各両分内でのＤＮＡハイブリッド形成操作を含む。この
ＤＮＡ形成に際しては、分別された制限断片が先ず変性
される。すなわち、例えば高ｐＨ１熱またはホルムアミ
ド溶液といった変性条件を用いて、二本鎖制限断片がそ
れらの相補的な一本のＤＮＡ鎖に分離される。−木のＤ
ＮＡ鎖は次いでアニーリングされて二本鎖とされる。Ｄ
ＮＡハイブリッド形成のこの時期には、共通の対象物鎖
は、共存する過剰の相浦的参照物鎖と共に、ｓｒ’ハイ
ブリッド二本鎖中へと移行させられる。これに対して、
特有の構成物は、共存する同質遺伝子型参照ＤＮＡを持
っていないため、ハイブリッド中へ取り込まれることが
できない。その代わり、これらの特有の多形路はそれら
の対象相補体と二本鎖をつくる。過剰の参照物鎖はそれ
らの相補体と二本鎖をつくる。このアニーリング反応の
速度は、構成物が利用されて反応物の濃度が減少するに
伴って低下する。その結果、このアニーリング工程の生
成物は、ハイブリッドＤＮＡ二本鎖と、純粋な対象ＤＮ
Ａ二本鎖と、純粋な対象ＤＮＡ二本鎖と、−本の対象お
よび参照ＤＮＡ鎖の残留物である。ハイブリッド形成処
理後の両分の部分的または完全なプールを作成すること
は、この方法の第６エ程の準備のために好ましい。 サイズの群に分けてＤＮＡをプールしておくと後の組み
換え体ＤＮＡの形成に便利である。 好ましい実施例においては、ＤＮＡハイブリッド形成操
作をその場で（１ｎ　５ｌｔｕ）で、すなわち分別処理
で用いたアガロース・ゲル中で行うことが好ましい。そ
の場でハイブリッド形成を行えば、第４工程で得られた
分別物を最も無駄無く使用することができ、両分を集め
る際の希釈の問題がなく、隣接する両分との対流的混合
をなくすことができるので有利である。 ＤＮＡハイ、ブリッド形成操作に続いて、二次分別工程
である第６エ程においては、第２工程で参照ＰＲＦに付
けられた生化学的および／または同位体的識別ラベルを
利用する。これらのラベルは、対象ＤＮＡからの参照Ｄ
ＮＡと対象および参照ＤＮＡ鎖のＤＮＡハイブリッドと
の分離を可能にする。この工程では過剰の役人参照ＤＮ
Ａをハイブリッドと共に取り除く。この二次分別処理の
結果、対象ＰＲＦの特有の多形構成物が部分的に精製さ
れる。好ましい実施例では、ビオチン化参照ＤＮＡが、
同質遺伝子型対象物鎖とそれらとのハイブリッドと共に
、アビジンまたはストレパビジンを付着せしめた樹脂を
用いるクロマトグラフィーによって除去される。すなわ
ち、ビオチンでラベルした参照ＤＮＡがアビジンを結合
させた基質に強固に結合するのである。フリーの対象Ｄ
ＮＡ中の求める多形対象ＰＲＦ構成物の集団は、共通の
ＰＲＦ構成物を除去することにより実質的に増加する。 フリーな対象ＤＮＡのこの集団は、多形性濃縮構成物（
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｅｎｒｌｃｌｔｅｄ　ｎ＋
ｏｍｂｅｒｓ　：以下ＰＥＭと略記）と称する。 望まない参照ＤＮＡおよびハイブリッドＤＮＡを上記し
たように除去することにより、残留ＰＥＭ容量の実質的
な減少を図ることができる。 この容量減少は極めて望ましい。なぜならば、引き続く
精製工程や組み換え体ＤＮＡ操作のための濃度依存性反
応には、高価な酵素試薬が必要となるからである。対象
ＤＮＡ濃度も対応して高まるため、残留する対象物鎖の
二本鎖へのアニーリングをさらに行うことができる。 完全な一本鎖や破損した一本鎖、破損した二本鎖、さら
にはいくらかの無差別なもつれといったＤＮＡの処理破
片と共に、共通な対象ＰＲＦ　ｅｌｌ成物の一部が、こ
の方法の第６エ程で残存することが予想される。これら
の汚染物が一緒になって、共通断片の低減バックグラン
ドを構成し、この中に求める特有の構成物が確認される
ことになる。この低減されたバックグランドの確認がこ
の方法の第７および第８工程で提供されている。第７エ
程では、第１および第２工程で参照ＰＲＦが調製された
のと全く同じ様にして、対象ＰＲＦの一部が調製される
。このようにして調製された対象断片は“Ｓ′　Ｓ′　
と称する。次いで、第３工程で生成されかつ第４〜第６
エ程で利用されたｓｓ／ｒ’ｒ’混合物に対応するｓｓ
／ｓ’ｓ’混合物が生成される。 この混合物のＳ′　Ｓ′酸成分、第３工程の混合物ｓｓ
／ｒ’ｒ’のｒ′　ｒ′と同じ末端を有している。この
ｓｓ／ｓ’ｓ’混合物は次いで、混合物ｓｓ／ｒ’ｒ’
が処理されたと同じ第４〜第６エ程によって処理される
。このＳＳ／ｓ′　ｓ′混合物は特有の成分を持ってい
ないため、第４〜第６エ程のこの繰返しの生成物は、Ｐ
ＥＭを汚染する共通バックグランドと同じである。この
生成物をコントロール断片構成物（ｃｏｎｔｒｏｌ　［
’ｒａｇｍｅｎｔ　ｎ＋ｏｍｂｅｒｓｂｌｐ　：以下Ｃ
ＦＭと略記）と称する。この方法の第８工程においては
、ＰＥＭとＣＦＭとが比較される。ＰＥＭとＣＦＭとの
間の相違が、対象ＰＲＦの求めている特有の多形構成物
である。 この後さらに処理を行う目的は、ＣＦＭにより示される
共通バックグランドから特有の多形構成物を確認するこ
とおよび／または精製することである。この方法の第１
工程で生じた末端ラベルは、対象多形ＰＲＦ成分をさら
に特徴付けかつさらに処理するために利用される。これ
らの特徴付けおよび処理工程としては、ＰＥＭとＣＦＭ
のデイスプレィ比較、組み換え体ＤＮＡの形成、組、み
換え体ＤＮＡの増幅、およびＰＥＭまたは増幅ＰＥＭを
処理原料として用いる第１〜第７エ程の再循環がある。 組み換え体ＤＮＡの形成および増幅に際しては、ｓｓ断
片のＡｓｐ７１ｇでつくられた断片末端に対して相補的
な末端を有する組み換え体ＤＮＡ形成用ベクターＤＮＡ
が利用できる。かようなベクターＤＮＡはハイブリッド
形成処理の汚染物やＤＮＡ処理の破片とは塩基対をつく
らず、ｓｓ断片と塩基対をつくり、酵素反応によりｓｓ
断片に結合して生存可能な組み換え体ＤＮＡに対する前
駆物質として用いられる線状分子を生成する。従って、
第１工程でつくられたイソシゾマーによる断片末端の相
違を利用して、求める多形ｓｓ断片の選定や生成を行う
ことができる。 この発明の方法は、二本鎖メツセンジャーＲＮＡや相補
的鎖からなるその他の高分子物質の同様な処理に使用す
ることができる。

【発明の効果】

この発明の方法は上述したごとき構成を有するものであ
るから、ＰＲＦが非常に複雑であるために従来から慣用
されている分別処理では各ＰＲＦ内の構成物を分けるこ
とができないような場合でも、１度に多くのＰＲＦの多
形構成物を確認しかつ部分的な精製を行うことができる
という利点がある。その結果、ウィルス病や癌や遺伝病
の原因となるゲノムの変化の検出に役立つものである。 また、この発明はゲノムの確認や同定にも役立つもので
あり、農業や生物工学の分野の技術に有用である。 この発明の新規な特徴は特許請求の範囲に記載された通
りである。この明細書に記載された好ましい実施例に対
する種々の変更や改変は、当業者にとって自明であるこ
とを理解すべきである。かような変更や改変は、この発
明の範囲および均等物から外れることなくかつこの発明
の効果を低減させることなく、行うことができる。従っ
て、この発明およびその変更や改変は特許請求の範囲に
よって保護されるものである。

【図面の簡単な説明】

添付図面は、特有のＰＲＦ構成物を部分的に精製するた
めのこの発明方法の実施例を示すフローダイヤグラムで
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、相補的鎖からなる関連する対象および参照高分子を
   、それら対象および参照の各々の代表的断片集団（ＰＲ
   Ｆ）に処理し、特有の多形対象断片の部分的精製を行う
   方法であって、次の各工程からなることを特徴とする相
   補的鎖からなる関連する対象および参照高分子の処理方
   法： （ａ）前記対象および参照高分子を各々の対象および参
   照ＰＲＦに変換する； （ｂ）前記参照ＰＲＦのそれぞれに明瞭なラベルを付け
   る； （ｃ）前記ラベル付けした参照ＰＲＦおよび前記対象Ｐ
   ＲＦからなる混合物を生成する；（ｄ）前記混合物中の
   前記ＰＲＦの構成物を分別する； （ｅ）前記分別された混合物のハイブリッド形成を行う
   ； （ｆ）前記の明瞭なラベルを利用して、前記参照二本鎖
   と前記対象および参照断片のハイブリッドとを前記対象
   断片から分離し、かつ前記多形対象断片の部分的精製を
   行う； （ｇ）前記（ａ）および（ｂ）工程で参照ＰＲＦを調製
   したのと全く同様にして対象ＰＲＦを調製し、前記ラベ
   ル付き参照ＰＲＦに代えて前記ラベル付き対象ＰＲＦを
   用いて前記（ｃ）〜（ｆ）工程を繰り返す；および （ｈ）前記（ｆ）および（ｇ）工程の生成物を比較して
   、前記部分的に精製された多形対象断片内の多形性を確
   認する。 ２、前記明瞭なラベルは、生化学的および／または同位
   体的ラベルである請求項１記載の方法。 ３、前記高分子は２つの二本鎖ゲノムＤＮＡである請求
   項１記載の方法。 ４、前記高分子は２つの二本鎖ＲＮＡである請求項１記
   載の方法。 ５、前記高分子は、ゲノムＤＮＡおよび二本鎖ＲＮＡか
   らなる群から選ばれる請求項１記載の方法。