JPH025885A - 光学活性なシアンヒドリンの酵素的製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は光学活性なシアンヒドリンを、オキソ化合物と
シアン化水素酸とをオキシニトリラーゼの存在下に反応
させることにより製造する方法に関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）アル
デヒドまたはケトンからオキシニトリラーゼ触媒作用に
より形成される光学活性なシアンヒドリンは、例えばト
フエノキシベンズアルデヒドおよび置換された類似体の
ように、光安定性ピレトロイデンを合成するための構成
物質として用いられる。

さらに当該シアンヒドリンは光学活性なα−ヒドロキシ
カルボン酸の合成に使用されている。

他方、これらは食料へのまたは薬剤学的作用物質、ビタ
ミンおよび液晶を製造する際の添加物として使用されて
いる。

これらの光学活性なα−ヒドロキシカルボン酸は、Ｆ、
Ｅｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒら、　Ａｎｇｅｗ、Ｃｈｅｍ、
　９５　（１９８３２Ｎｏ、　１．　　第５０頁に従っ
て、好ましくは、製造が非常に困難なＮ−置換の光学活
性なα−アミノ酸に変えられ得る。

同様に、光学活性なシアンヒドリンから、光学活性なα
−アミノアルコールやさらにそれから誘導できる、作用
物質合成に重要な光学活性な化合物が容易に入手できる
。

ドイツ連邦共和国特許筒１，３００，１１１号から、ア
ルデヒドをオキシニドラーゼの存在下にシアン化水素酸
と共に反応に使用する、光学活性な（Ｒ）−シアンヒド
リンの製造方法が既に知られている。この既知の方法に
よれば、当該反応は水性または水アルコール性（５０χ
ν／Ｖ）反応環境中でｐＨ値５．４（あるいは４．８〜
５．４ｒ　Ｂｅｃｋｅｒ　ら、　ＪＡＣ３１９６６第４
２９９頁参照）で、即ち５．６〜６の間にある酵素活性
のｐＩ（最適条件より僅かに低いｐＨで行われる。この
方法により得られる（１？）−シアンヒドリンの光学純
度は確かに唯一の欠点である。

Ｆ、　Ｅｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒら（Ａｎｇｅｗ、Ｃｈｅ
ｍ、９９　（１９８７）　第４９１−２頁）は水アルコ
ール系でｐ・Ｈ値、温度および濃度を変えて、酵素触媒
的付加に加えて平行して同時に起こるラセミ化合物へ誘
導する、シアン化水素酸のアルデヒド基への化学的付加
を極力抑制することに関して酵素的シアンヒドリン形成
の研究をしている。このようにしても満足できる最善の
状態にする条件を見出すことができなかったので、Ｆ、
Ｅｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒらは化学的反応を水と混合し得
ない有機溶剤の使用により抑制することを提案している
。特に、エチルアセタートを用いてそして担体に固定し
た（Ｒ）−オキシニトリラーゼを使用して行っている。

この方法で高い光学純度をツする生成物が得られたが、
特に酵素の活性と安定性がこの環境で低下するので、こ
の反応は純粋な有機環境において方法技術上確かに不利
である。

従って、本発明の目的は、水性環境行われ、それにもか
かわらず高い光学純度を得ることができるシアンヒドリ
ンの酵素的製造方法を提供することである。

（課題を解決するための手段） この目的に示された本発明による方法は、脂肪族、芳香
族、ヘテロ芳香族アルデヒドまたはケトンから誘導され
た（Ｒ）−シアンヒドリンまたは（Ｓ）−シアンヒドリ
ンを、対応するオキソ化合物とシアン化水素酸とを水性
環境で（Ｒ）−オキシニトリラーゼ（４，１，２，ｌＯ
）またはオキシニトリラーゼ（４，１，２，１１）の存
在下にこのような酸性条件下でかつ化学的競合反応とラ
セミ化が酵素的合成と比べて無視できるような温度で反
応することにより製造することを特徴とする。

Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｏｃｏｌｏｒ由来のオキシニトリ
ラーゼ（４゜１．２．１１）は例えばＥ、　Ｂｏｖｅ　
リによってＪ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２３６　　（１９６１）　２０７に記載さ
れている。しかしながら、該オキシニトリラーゼの光学
的に純粋なＳ−シアンヒドリンの製造に関する有効性は
従来知られていなかった。以下、このオキシニトリラー
ゼを（Ｓ）−オキシニトリラーゼと略称する。

驚くべきことに、該酵素のシアンヒドリン合成に関する
活性は、比較的低いｐＨ値で確かに低下するがなお十分
であり、その際シアン化水素酸の化学的付加および形成
された生成物のラセミ化反応が抑制され得るということ
が見出された。更に、それぞれの最適ｐＨ範囲は用いら
れた基質によっである一定の範囲に決まり、その際最大
的４．５までの一般的ｐｉが望ましい。

水性系は最大４０％の、特に２５％までの有機助溶剤を
含有し得る。その際、ｐＨ値の低下と同時に助溶剤含有
量を低下した場合のみオキシニトリラーゼが十分な活性
を持っているということを考慮しなければならない。し
かしながら、酵素活性は少量のみの有機溶剤（エタノー
ル）の存在によってもかなり低下せしめられるので、特
にいがなる溶剤も添加せずに行わなければならない。

カルボニル化合物の化学的反応性および酵素に対するそ
の親和性は、ｐＨを温度に応じてどれほど低下すること
ができるか、それと共に化学的シアンヒドリン合成を酵
素的合成と比較して無視することができるかを決定する
。２．８未満の［）Ｈ値は、この場合オキシニトリラー
ゼは速やかに不活性化されるのでもちろん不適当である
。

水性環境で行うことはそれぞれの酵素を溶解して添加す
ることを可能にし計量を著しく容易にする。さらに、従
って、特に酵素膜反応器での連続的作業法は簡単に実行
されることができ、そして形成されたシアンヒドリンを
水不溶性または水と混和しない溶剤、例えばメチレンク
ロリド、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、酢酸
エチル、酢酸イソプロピル、メチルｔ−ブチルエーテル
を用いて簡単に後処理することが可能である。

本発明による反応の際、酵素活性および酵素の品質保持
が低下したｐＨ値で悪化することが受は入れられるが、
（Ｒ）−オキシニトリラーゼ（４，１，２，１０）はＰ
ｒｕｎｕｓ　ａｍｙｇｄａｌｕｓからそしてオキシニト
リラーゼ（４，１，２，１１）はＳｏｒｇｈｕｍ　ｂｉ
ｃｏｌｏｒから簡単に得られまた購入されることができ
るので、特に、酵素安定性の低下率はあまり高（ないの
で（例えば（Ｒ）−オキシニトリラーゼの場合ｐＨ３，
７５，２０℃で１日あたり８％）、増加した量の添加お
よび予備的な必然的追加は問題なくできる。

本発明により、オキシニトリラーゼに対する基質である
全てのカルボニル化合物（この場合純粋な化学的シアン
ヒドリン形成はｐＨ値を２．８まで低下することにより
抑制され得る）が変換され、（Ｒ）−または（Ｓ）−シ
アンヒドリンが非常に高い光学純度（ｅｅ＞９９％）で
製造され得る。

脂肪族シアンヒドリンの形成に加えて、芳香族アルデヒ
ドの反応が、特に、場合により置換されたベンズアルデ
ヒドからの（Ｒ）−または（Ｓ）−マンデル酸ニトリル
およびその誘導体の製造が特に研究され、その際ｐＨ値
３．２５で９９％ｅｅ以上の光学純度が得られた。また
、ｐｉｆ値３６７５で化学的合成は抑制され、それ以外
同一の条件下で９８％ｅｅ以上の光学純度が得られる。

ベンズアルデヒドより低い反応性のカルボニル化合物は
、対応してより高いｐＨ値でエナンチオ選択性の損失な
く変換され得る。このようにフルフラールはそれ以外同
一の条件下で、しかしｐＨ４，０で９９％ｅｅの光学純
度を有するＲ−シアンヒドリンに変換され得る。

反応温度のより広い範囲でのおよび／または低下におけ
る基質濃度の変化により、化学的付随反応を阻止するこ
とが付加的に可能であり、その結果可能な最も有利な条
件に対する一定の余地が与えられる。

本発明により、特に、基質としての脂肪族、芳香族およ
び複素環式アルデヒドまたはケトンを（Ｒ）−オキシニ
トリラーゼの存在下であるいは芳香族またはへテロ芳香
族アルデヒドまたは同様にケトンを（Ｓ）−オキシニト
リラーゼを用いて反応させることができ、光学的に純粋
な、対応するシアンヒドリンの（Ｒ）−または（Ｓ）−
エナンチオマーが形成される。これらのうち特に重要な
のは、形成されたシアンヒドリンの薬剤学的領域におけ
る使用に関してみれば、芳香族アルデヒドである。

（実施例） 以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。

例１〜１３に（Ｒ）−エナンチオマーの製造が、例１４
〜１８に（Ｓ）−エナンチオマーの形成が開示されてい
る。

例１ ベンズアルデヒド５３　＋１ｇ　（０、５ｍｍｏ　ｌ　
）を５０ｍＭのシトラード緩衝液（ｐＨ３，２５）９．
４ｍｊ！に溶解し２０°ｃにする。

ここに（Ｒ）−オキシニトリラーゼ水溶液１２５　ｕｌ
（約０．２５■）および４．２ＭのＨＣＮ水溶液４７５
μｌを加える。反応を旋光測定（λ＝　５７８　ｎｍ）
で追跡する。

３０〜４５分後一定の旋光度となり、そして反応を終え
る。その後、反応混合物を１０　ｍＱのクロロホルムで
４回抽出する。

合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し溶剤を回転蒸
発器で除去する。次いで残留物を３回それぞれ１０　ｍ
ｌのペンタンで洗浄し生成物を減圧下に乾燥させる。

化学的収量：　６１．８ｍｇ　（理論量の９３％）光学
純度：〉９９％ｅｅ 光学純度の測定は（Ｒ）−マンデル酸ニトリルのＮ、Ｏ
−ビス−（ペンタフルオロプロピオニル）−２−アミノ
ー１−フェニルエタノール誘導体としてキャピラリーガ
スクロマトグラフィでＨ，Ｆｒａｎｋら（Ｊ。

Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　１４６　、　（１９８７）、
　１９７−２０６）に従ってキタル分離相に関して行っ
た（ＦＳ−Ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｖａｌ。

２５ｍ　”　０．３２ｍｍ）。

誘導は次のように行う。

１〜２ｍｇのマンデル酸ニトリルをＩＭのジボラン溶液
２５０μｌ（テトラヒドロフラン中）でクロロホルム中
で室温で３０分間還元する。エタノールを少量滴下して
過剰のジボランを加水分解し、溶剤を除去した後得られ
るアミノアルコールを直ちに２０μｌの無水ペンタフル
オロプロピオン酸でメチレンクロリド中で室温で１５分
間アシル化する。次いで過剰の酸無水物を回転蒸発器で
除去し、残留物をメチレンクロリドで再び抽出しガスク
ロマトグラフィーで分析する。

例２ 例１と対応してフルフラール４８［（０，５ｍｍｏｌ）
をｐＨ４，０で反応させる。約３０分後反応を終える。

（Ｒ）−シアンヒドリンの単離は例１に記載したように
行う。

化学的収量：　５５．３■（理論量の９０％）光学純度
：９９％ｅｅ 光学純度の測定のため、シアンヒドリンを（Ｒ）−α−
メトキシ−α−トリフルオロメチル−フェニル酢酸クロ
リドでり、　Ｅｌｌｉｏｔ、　Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｃｈｏｉ、
　Ｗ、Ｓ。

ＪｏｈｎｓｏｎＣＪ、　Ｏｒｇ、　ＣｈｅｌＩ＋、　４
８　（１９８３）、　２２９４−２２９５）に従ってジ
アステレオマーのエステルに誘導しジアステレオマー率
をキャピラールガスクロマトグラフィーで求めた（ＦＳ
−ＯＶ　１１０　ｍ　　０．３２　ｍｍ）。

例３ 例１に対応して、アセトアルデヒド２２ｍｇ（０，５ｍ
ｍｏりをｐｌ（３，２５で反応させる。約９０分後反応
を終える。後処理は例１と同様に行う。

化学的収量：　２６ｍｇ　（理論量の７３％）光学純度
＝７６％ｅｅ 光学純度の測定はＮ、０−ビス−ペンタフルオロプロピ
オニル−１−アミノ−２−プロパツールを介して例１に
従って行う。

例４ 例１に対応して３−メチルシクロへキサノン５６■（０
，５ｍｍｏｌ）をｐｔｔ４．ｏで反応させる。９０分後
反応を終える。

化学的収量：５７■（理論量の８３％）光学純度：測定
せず 例５ （Ｒ）−マンデル酸ニトリルの酵素膜反応器（Ｅｎｚｙ
ｌＩｅ−Ｍｅｍｂｒａｎ−Ｒｅａｃ　ｔｏｒ　：　ＥＭ
Ｒ）内での連続的製造ＥＭＲ内で当該方法を高められた
量を用いて連続的に行う。ＥＭＲ、（連続作働性撹拌式
反応器に相当する）の作業条件は、生成物の光学純度が
損失することなく穏やかな条件に対応して比較的高いｐ
Ｈ値の使用を可能にする。連続的製造は、限外濾過によ
る生成物の後処理を省くので、酵素の経済的利用になる
。

こうして連続的作業法で１０ｄのＥＭＲ内で２６時間で
７ｇの光学的に純粋な（Ｒ）−マンデル酸ニトリル（ｅ
ｅ＞９９％）が製造される。

作粟条往： ベンズアルデヒド：　　　　４８　　ｍｍｏｌ／１ＨＣ
Ｎ：１８０　　ｍｍｏｌ／１ シトラード緩衝液：　　　４５　　’ｍｍｏｌ／１　　
ｐＨ３，７５滞留時間：１０　　分 酵素濃度：　　　　　　　　０．３８　ｍｇ／ｍｌ平均
変換率＝８４　　％ 空時収量　　　　　　７７３　　ｇ／（１−ｄ）温度　
　　　　　　　　２０　　℃ 例６ 例１に対応して０．２モル規定のイソブチルアルデヒド
溶液をｐＨ３，６でかつ温度６℃で反応させる。

９０分後反応を終える。

化学的収量：理論量の８４％ 光学純度：９６％ｅｅ ［α］　　　＝　＋　１６．３°（Ｃ＝　５　（ＣＨＣ
１３中））例７ 例１に対応して０．２５モル規定のイソバレルアルデヒ
ド溶液をｐｌ＋３．７でかつ温度７℃で反応させる。

１００分後反応を終える。

化学的収量：理論量の９２％ 光学純度：　９６．８％ｅｅ ［α］　　＝　４２４．２０　’　（ｃ　＝　５　（Ｃ
ＨＣ１＋中））例８ 例１に対応して０．２５モル規定の３−メチルメルカプ
トプロピオンアルデヒド溶液をｐＨ３，３でかつ温度５
　’Ｃで反応させる。９０分後反応を終える。

化学的収量：理論量の８５．５％ 光学純度：　９７．３％ ［ｃｒｌ　　　−＋　４１．０’　（ｃ　＝　５　（Ｃ
ＯＣｌ２中））例９ 例１に対応して０．２５モル規定のヒドロ・ケイ皮アル
デヒド溶液をｐ＋＋４．ｏでかつ温度８℃で反応させる
。８０分後に反応を終える。

化学的酸Ｍ：理論量の９３．８％ 光学純度：　９５．１％ｅｅ ［αｌ　　＝−６，２°（ｃ　＝　５　（ＣＨＣ１ｉ中
））例１０ 例１に対応して０．２５モル規定のケイ皮アルデヒド溶
液をｐＨ４，３でかつ温度８℃で反応させる。９０分後
に反応を終える。

化学的収量：理論量の９４％ 光学純度：　９４．７％ｅｅ ［α１　・＋２３．７５°（ｃ　＝　５　（ＣＩＩＣ１
ｉ中））例１１ 例１に対応して０．２５モル規定のピバリンアルデヒド
溶液をｐＨ３，３でかつ温度６℃で反応させる。

９０分後に反応を終える。

化学的収量−理論量の８１．４％ 光学純度二８５％ｅｅ ［αｌ　　　＝　＋　１３．２°（ｃ　□　５　（ＣＯ
Ｃｌ２中））例１２ 例１に対応して０．２モル規定のブチルアルデヒド溶液
をｐＨ３，５でかつ温度７℃で反応させる。２時間後反
応を終える。

化学的収量：理論量の８３％ 光学純度：　９６．４％ｅｅ ［α］　　　＝　＋　１３．６°（ｃ　＝　５　（ＣＨ
Ｃｈ中））例１３ 例１に対応して０．２モル規定のクロトンアルデヒド溶
液をｐＨ３，３でかつ温度５　’Ｃで反応させる。

２時間後反応を終える。

化学的収量：理論量の８２％ 光学純度：　９７．５％ｅｅ ［α］　　・＋２５．２’　（ｃ　＝　５　（ＣＩＩＣ
１３中））例１４ ｐ−ヒドロキシ−ベンズアルデヒド５２ｍｇ（０，５ｍ
ｍｏ１）を５０ｍＭのシトラード緩衝液（ｐＦ１３．７
５）９．４ｍｌに溶解し２０’Ｃにする。ここに（Ｓ）
〜オキシニトリラーゼ溶液５００　μｌおよび４．２Ｍ
のｌｌＣＮ水溶液８００　μｌを加える。

用いたＳ−オキシニトリラーゼ溶液は８４　［１／ｍｌ
　の活性を有していた。ここで１ｕは２０℃かつｐＨ３
，７５で１μｍｏｌ／ｍｉｎのｐ−ヒドロキシマンデル
酸ニトリル形成の触媒作用を行う。

反応を旋光測定（λ・５７８　ｎｍ）により追跡する。

１５〜３０分後一定の旋光度になり、この反応を終える
。その後反応混合物をジエチルエーテル１０ｍで４回抽
出する。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶
剤を回転蒸発器で除去する。次いで残留物を１回に１０
ｍ１のペンタンを用いて３回洗浄し、生成物を減圧下に
乾燥する。

化学的収量：　６４．８ｍｇ　（理論量の８７％）光学
純度：９９％ｅｅ 光学純度の測定はｐ−ヒドロキシ−マンデル酸ニトリル
のＮ、０−ビス−（ペンタフルオロプロピオニル）−２
−アミノ−１−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−エタノー
ル誘導体としてキャビラールガスクロマトクラフィーで
Ｈ，Ｆｒａｎｋらに従って行った。誘導は例１に挙げた
ように同様に行った。

例１５ 例１４に対応してｍ−ヒドロキシ−ベンズアルデヒド６
１ｍｇ（０，５ｍｍｏｌ）をｐＨ３，２５で４．２Ｍの
ＨＣＮ水溶液４５０μｌと反応させる。３０〜４０分後
反応を終える。

（Ｓ）−３−ヒドロキシマンデル酸ニトリルの単離を例
１４に記載されたように行う。

化学的収量：　６７ｍｇ　（理論量の９０％）光学純度
：９８％ｅｅ 光学純度の測定は例１に従ってＮ、Ｏ−ビス−ペンタフ
ルオロプロピオニル−２−アミノ−１−（ｍ−ヒドロキ
シフェニル）−エタノールを介して行った。

例１６ 例１４に対応してｍ−メチル−ベンズアルデヒド６０ｍ
ｇ（０，５ｍｍｏｌ）と４．２ＭのＨＣＮ水溶液４７５
μＩおよびオキシニトリラーゼ溶液５００　μｍとをｐ
Ｈ３，２５で反応させる。約４５分後、反応を終える。

後処理を例１と同様に行い、（Ｓ）−３−メチルマンデ
ル酸ニトリルを得た。

化学的収量：　５９ｍｇ　（理論量の８０％）光学純度
：９６％ｅｅ 光学純度の測定は例１に従って対応するアミノアルコー
ルのＮ、０−ビス−ペンタフルオロプロピオニルエステ
ルアミドを介して行った。

例１７ 例１４に対応してベンズアルデヒド５３　ｍｇ（０，５
ｍｍｏｌ）　と４．２ＭのＨＣＮ水溶液４７５μｍおよ
びＳオキシニトリラーゼ溶液１５００μｌとをｐＨ３，
２５で反応させる。約４５分後反応を終える。後処理は
例１と同様に行った。

化学的収ｆｆｉ：４８■（理論量の８０％）光学純度：
９６％ｅｅ 光学純度の測定は例１に従ってＮ、Ｏ−ビス−ペンタフ
ルオロプロピオニルエステルアミドを介して行った。

例１８ 攪拌式反応器内での固定（Ｓ）−オキシニトリラーゼを
用いた（Ｓ）−ρ−ヒドロキシマンデル酸ニトリルの連
続的製造 より多量の生成物を連続的作業法での形成する場合の反
応原理の転用を、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ＠Ｃ（Ｒ；ｈｍ。

Ｄａｒｍｓ　ｔａｄ　ｔ）の固定（Ｓ）−オキシニトリ
ラーゼを用いて行った。

連続的作業法で１０　ｍｌの反応器中で７２時間にわた
って空時収１ｔ５７．９ｇ／　（１−ｄ）で（Ｓ）−ｐ
−ヒドロキシマンデル酸ニトリルを製造した。

詩ｊエリυ【乙：久： ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド： ＨＣＮ　： Ｎａ−シトラード： 滞留時間： 触媒濃度： 操作時間： 酵素不活性化：　　　　　　約 反応率： エナンチオマー過剰：　　　　〉 温度： ２１　　ｍｍｏｌ／１ ４００　ｍｍｏｌ／１ ４５　ｍｍｏｌ／１ ３９６０秒 ０．１５ｇ／ｍ１ ２　　　ｈ ３　　χ／ｄ ８５　　χ ９８　　χ ２０　℃ ｐＨ ３，７５

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）脂肪族、芳香族、ヘテロ芳香族アルデヒドまたは
   ケトンから誘導された（Ｒ）−シアンヒドリンまたは（
   Ｓ）−シアンヒドリンを、対応するオキソ化合物とシア
   ン化水素酸とを水性環境で（Ｒ）−オキシニトリラーゼ
   （４．１．２．１０）またはオキシニトリラーゼ（４．
   １．２．１１）の存在下にこのような酸性条件下でかつ
   化学的競合反応とラセミ化が酵素的合成に比べて無視で
   きるような温度で反応することにより製造することを特
   徴とする、光学活性なシアンヒドリンを、オキソ化合物
   とシアン化水素とをオキシニトリラーゼの存在下に酵素
   的に反応させることにより製造する方法。
2. （２）反応をｐＨ４．５以下で行う請求項１記載の方法
   。
3. （３）−５℃〜＋５０℃の反応温度を持続する請求項１
   または２に記載の方法。
4. （４）反応を連続的に行う請求項１〜３のいずれか１項
   に記載の方法。
5. （５）反応を再利用酵素用保存手段を有する連続作働性
   撹拌式反応器で行う請求項４記載の方法。
6. （６）反応を芳香族アルデヒドを用いて行う請求項１〜
   ５のいずれか１項に記載の方法。