JPH025888A - 住血胞子虫ファルシパルムのサーカムスポロゾイト遺伝子による組換え蛋白質製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［８業上の利用分野］ この発明は、有核細胞をクローニングしたり、発現さぜ
たりするに効果的な桿状ヴィールス−昆虫細胞ベクトル
系を用いて組換え蛋白質を生産する製造方法に関する。

［従来の技術およびその課題］ 病原体に対する効果的なワクチンの生産にあっては、人
体に投与されたとき保護的な免疫反応を起こす安全な抗
原をいかに大量に製造できるかにかかつている。安全で
経済的な免疫原となることが分かってから、ＤＮＡの組
換え技術が今では抗体生産における最適な方法とされて
いる。細菌、イースト菌あるいは他の有核細胞から、ど
の組換え系を選ぶかは、選んだ異種遺伝子やその精製物
がどんな性質をもっているかを考慮して決める。

選んだ遺伝子構成物は、配糖化して加水分解による特殊
な処理が必要である。この組換え技術により本物の物質
に類似した組換え物質が得られるようにして遺伝子物質
を処理できる。

ヒトの重要な病気のなかには、昆虫などの節足動物の吸
血によりを推動物の宿主間で移る感染原が関係している
場合がある。この病気の例には、マラリア、黄熱病、デ
ング熱、日本脳炎やリーシュマニア症およびトリパノソ
ーマ病があげられる。

一般には、これらの感染原は感染子である節足動物の細
胞内で増殖するが、病気や支障を引き起こすことはない
。自然界でもを推動物−節足動物を推動物の周期連鎖は
、ベクトルによって保存され、感染子からを推動物の血
液を摂取することで生涯感染を生ずる。

桿状ヴイールスは、昆虫の培養細胞内で組換え蛋白質を
生産する際に、効率の高い有核細胞のクローニングや発
現ベクトルとして用いることができる。この桿状ヴイー
ルスは、有核細胞のクローニングや発現ベクトルとして
使用するためには補って余り有る要件を備え、しかも宿
主が節足動物に限られる狭い範囲にある点で安全性が確
保できる。

つまり、これらの桿状ヴイールスは、外因性ＤＮＡを大
量に収容でき、これらの蛋白質の構造は後に翻訳されて
修正を受ける。また、これらの細胞培養は、安全で変形
がなく効率的ですらある。

さらには、高効率のポリヘトリン促進因子（プロモータ
）を有し、これはヴイールス感染有核細胞内のどんな促
進因子よりも活動的であることがこれまでに知られてい
る。

桿状ヴイールス系は、診断手法として用いる場合には、
ポリペプチドを生産する点で強力な利点がある。ヒトあ
るいは動物の多くのものは、−ｍに抗体を持っていて、
イースト菌ならびに異種の組織的適合性のある抗原に反
応するようになっている。これらの抗体が存在すると、
診断過程での信頼性を疑わせるようになる。これは、発
現系で生じた調製体に見られる細菌、イースト菌や哺乳
動物の蛋白質に汚染されて反応を起こし、疑似的な陽性
を呈するからである。ヒトとが動物は、大抵の場合には
鱗翅類昆虫細胞や桿状ヴイールスに晒された経験をもっ
た可能性は小さい。

したがって、この発明で組換え蛋白質に使用される鱗翅
類昆虫細胞や桿状ヴイールスは、ヒトとか動物に正規に
存在する抗体により確認されるといった汚染抗原の問題
は起きそうもない。

このため、汚染により混入した鱗翅類昆虫細胞や桿状ヴ
イールス自体が、組換え抗原を使用した診断過程で疑叡
陽性反応に至らせた原因とすることには懐疑的である。

こうして、桿状ヴィールス−昆虫細胞発現系には、正規
には昆虫に発現する免疫原を効果的に生産するためには
、魅力的かつ結実の多くなる機会が残されている。

マラリア病は、世界中の多くの地域で健康への重大な問
題となっており、年間におよそ３億人を罹患させ、２０
０万人から４００万人の死者を出している。この病気は
、寒けと熱とを交互にぶり返し、重篤な場合ではなくて
も昏睡状態や死に至ることがある。アフリカの熱帯地方
では、子供が一才位になると、はとんどの場合、マラリ
アに罹患し、罹患者のうちには年間に少なくとも１００
万人が死に至っている。殺虫剤ＤＤＴに対して耐性を有
する蚊の品種に培われて新たに進化し、薬剤に耐える種
類の寄生マラリア菌が増加している。

例えばインドでは、マラリア病の罹患率は、１９６２年
には６０，０００件であったのに対し今日では４ρ、ｏ
ｏｏ、ｏｏｏ件に達している。

ヒトのマラリア病には、４つの種類がある。その一つに
住血胞子虫ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａ
ｌｃｉｐａｒｕｍ）があり、マラリア病関係で死ぬ原因
となる主な病原菌である。第２には、住血胞子虫ヴイヴ
アクス（Ｐ、ｖｉｖａｘ）で、広い範囲に広がり、死亡
率も相当に」−るが、住血胞子虫オーバレ（Ｐｏｖａｌ
ｅ）や住血胞子虫マラリア（Ｐ、ｍａｌａｒｉａｅ）の
種よりも頒布域が広くはない。マラリアには生態の寄生
周期に多くの段階があり、各段附は形態的および抗原的
関係においては互いに遠く離れている。雌のハマラダ蚊
などの蚊ベクトル（媒体）周期は、配偶体で分化する赤
血球寄生のマラリアに感染したヒトに吸血することによ
り行われる。この配偶体は、昆虫の腸内で急速に発生増
殖する。

２４時間以内に接合体は、卵子に変態し、牛腸に侵入し
て卵母細胞に変わり、ついにはスポロゾイト（ｓｐｏｒ
ｏＺｏｉｔｅｓ）を形成する。ヒトの血液に接種され、
肝臓細胞に急速に侵入すると、マラリア病の感染原とな
るのは、このスポロゾイトである。

住血胞子虫スポロゾイト（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　５ｐ
ｏｒｏｚ。

ｔｅｓ）は、免疫原のサーカムスポロゾイト（Ｃ３）蛋
白質により高度に被覆されている。このＣ８蛋白買は、
保護免疫を呈することが見出されて以来、マラリアに対
するワクチンとしての可能性が模索されている。Ｃ８蛋
白質の構造は、すべての種のマラリアにおいて、中央領
域に縦方向に繰り返して表われるアミノ酸配列をもって
おり、多くのマラリア種のなかでも傑出した特徴である
にュセンツバイグ　＆　ニュセンツバイグ　１９８５；
サントロ他　１９８３）。

住血胞子虫ファルシパルムにおけるＣ８蛋白質のエピト
−プは、アスパラギン−アラニン−アスパラギン−プロ
リンあるいはＮＡＮＰといったように４個のアミノ酸が
繰り返して連続配列されてなっている（ダーメ他　１９
８４．　　エニア他１９８４）。

マラリアに対する保護ワクチンの開発にあたっては、広
く良く知られた知識が用意されている（ミラー　１９８
５．　　ミラー他　１９８６．ラヴエッチ他　１９８５
）。　マラリアに対する保護は、Ｃ８蛋白に対して向け
られた抗体に関係していることが立証されている。ＮＡ
ＮＰエピトープに対するモノクロール抗体は、試験管の
中ではあるが、スポロゾイトを無毒化し、非感染状態に
することが分かっている。最近では、合成したＮＡＮＰ
のペプチドを蛋白質キャリヤーに繋いで、ヒトや動物に
スポロゾイトに対する特異的抗体を造らせている。

しかしながら、ヒトに対して保護作用を付与させるには
、まだ限られた成功例しかない。同様なワクチンに対し
て互いに別々に実験が行われた。

ヘリングトン他（１９８７）が臨床試験で用いたワクチ
ンは、合成によるペプチド、ならびに破傷風菌を自動免
疫化したトキソイドに繋げた（ＮＡＮＰ）、であった、
また、バロー他（１９８７）が行った試験では、３２個
のＮＡＮＰ、ならびにプラスミド　ベクトルから得られ
、Ｃ一端部を有する短い３２個のアミノ酸連鎖とからな
る組換え蛋白質を用いた。これらの各ワクチンには繰り
返して連続するアミノ酸連鎖により決められる線形のエ
ピトープが含まれている。各試験では最も高い抗体力価
を有する被試験者が、保菌原の蚊から接種されたスポロ
ゾイトからの攻撃を免れ、免疫保護がなされた。

これらの臨床試験結果を併せて考慮すると、Ｃ３Ａを基
礎とする副成分ワクチンは、ヒトの保護抗体を付与する
ことが分かる。しかしながら、有効なマラリア　ワクチ
ンを製造するには、下記の要件が必要となる。

１、有効なワクチンは、抗体仲介保護作用をなすために
は持続的で高い力価の抗体を生まなければならない（ミ
ラー他　１９８６）。抗体のレベルが常に高いことは、
住血胞子虫ファルシパルムスポロゾイトに序々に程度を
上げながら自然露出することにより維持が可１指となる
。

２、スポロゾイトに対する抗体の精製は、スポロゾイト
自体から得たほうが良好ではあるが、Ｔ−細胞の助けが
必要となる（グツド他　１９８７）。マウスの実験では
、スポロゾイトの蛋白質はＴ細胞の位置を反復帯域の内
外の両側に含むことが判明している。この反復帯域とは
、ワクチン被投与者の組織に適合性する系（ＭＨＣＣ１
ａｓｓ　　ＩＩ）により制限を受ける領域である（グツ
ド他　１９８６：　　１９８７．　　デル　ガイディス
１９８６）。

３．７−細胞を活性化させる位置とは別の抗体では、直
接Ｔ−細胞により肝臓内で寄生の促進を禁止することが
要求される。このことは、副成分ワクチンに対して放射
線処理したスポロゾイトを用いてネズミ科感染のマラリ
アにモデルをとった場合に見られる（イーガン化　１９
８７）。

組換えヴイールス感染形の昆虫細胞から得られる無削除
の組換え蛋白質は、可能性の高い免疫原となり、従来多
く試されてきたワクチンよりも重要なりおよびＴ−細胞
を多量に含むことが期待される。

［課題を解決するための手段］ この発明によれば、ヒトのマラリアの病因となる寄生形
住血胞子虫ファルシパルムの組換えによるサーカムスポ
ロゾイト抗・魚蛋白質製造方法を特徴する 請求項２によれば、請求項１記載の寄生形住血胞子虫フ
ァルシパルムの組換えによるサーカムスポロゾイト抗原
から略構成されるワクチン製造方法およびそのキャリア
ーを構成している。

請求項３によれば、桿状ヴィールス−昆虫細胞ベクトル
系で発現され、回収されたことを特徴とする請求項１記
載の寄生形住血胞子虫フγルシパルムの組換えによるサ
ーカムスポロゾイト抗原蛋白質製造方法を構成している
。

請求項４によれば、請求項３記載の寄生形住血胞子虫フ
ァルシパルムの組換えによるサーカムスポロゾイト抗原
から略構成されるワクチン製造方法を構成している。

請求項５によれば、組換えサーカムスポロゾイト抗原か
らなり、ヒトのマラリア病診断用に調製された請求項７
記載の組成物製造方法およびそのキャリアーを構成して
いる。

請求項６によれば、組換えサーカムスポロゾイト抗原蛋
白質は、無削除の組換えによることを特徴とする請求項
１記載の製造方法を構成している。

請求項７によれば、ベクトルｐ　３６９１による組換方
法を構成している。

請求項８によれば、ベクトルｐ　４１４８による組換方
法を構成している。

請求項９によれば、請求項１記載の組換えサーカムスポ
ロゾイト抗原蛋白質の生産および発現のため、桿状ヴィ
ールス−昆虫細胞ベクトル系のベクトルｐ　３６９１を
用いて成ることを特徴とする請求項１記載の組換えサー
カムスポロゾイト抗原蛋白質製造方法を構成している。

第１０の請求項によれば、請求項１記載の組換えサーカ
ムスポロゾイト抗原蛋白質の生産および発現のため、桿
状ヴィールス−昆虫細胞ベクトル系のベクトルｐ　４１
４８を用いて成ることを特徴とする請求項１記載の組換
えサーカムスポロゾイト抗原蛋白質製造方法を構成して
いる。

第１１の請求項によれば、桿状ヴィールス−昆虫細胞ベ
クトル系は、組換え発現ベクトルからなることを特徴と
する請求項７記載の製造方法を構成している。

第１２の請求項によれば、桿状ヴィールス−昆虫細胞ベ
クトル系は、組換え発現ベクトルからなることを特徴と
する請求項８記載の製造方法を構成している。

第１３の請求項によれば、前記抗原蛋白質を適当量だけ
効果的に投与することによりヒトのマラリア病を治療す
ることを特徴とする請求項１記載の製造方法を構成して
いる。

第１４の請求項によれば、前記抗原蛋白質をヒトの血清
に適当量効果的に添加することにより精製し、これをヒ
トのマラリア病の診断に適用するようにしたことを特徴
とする請求項１記載の製造方法を構成している。

［発明の作用および効果］ この発明によれば、桿状ヴィールス−昆虫細胞ベクトル
系が、高効率の有核細胞クローニングや発現手法として
組換え蛋白質生産に資する。この桿状ヴィールス−昆虫
細胞ベクトル系の適用の一つにヒトおよび動物の病気に
重要なｒＤＮＡ　　ワクチンの製造がある。

さらには、この桿状ヴィールス−昆虫細胞ベクトル系を
使うと、ヒトのマラリア病を引き起こす住血胞子虫ファ
ルシパルムといった寄生虫のサーカムスポロゾイト（Ｃ
ｉ　ｒｃｔｌｍｓｐＯｒＱ　ｉ　ｔｅ）抗原を発現させ
るに好都合となる。

最終的に得る組換え蛋白質は、無削除のサーカムスポロ
ゾイトの抗原であり、組換え組成物が高度になれば本物
の組成物に似通ってくる。さらに、組換え組成物の精製
を行い、−様な組成物に近付ける。桿状ヴィールス−昆
虫細胞ベクトル系においては、遺伝子が昆虫で発現され
ることがら、この遺伝子の発現により所期の望ましい結
果が得られる。このようにして得られる組換えサーカム
スポロゾイト蛋白質は、マラリア予防用の副成分ワクチ
ンの要素やマラリア診断の手段としての適用が図られる
。

［実施例］ 設遣方法 桿状ヴイールスのオートグラフ　力リフオルニカ（Ａｕ
ｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｒｉｆｏｒｎｉｃａ）ポリヘド
ロシスヴイールス（ＡｃＭＮＰＶ＞を用いた。発現用の
促進因子（プロモータ）列には、上記のヴイールスから
得られたポリヘトリン（ＯＣＣ）遺伝子のプロモータを
用いた。ＡｃＭＮＰＶおよび組換えヴイールスを保つに
は、夜盗蛾の幼虫である行列うじ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）　　の細胞に入れて保存し
た。この組換えは、組換えヴイールス　０ＣＣ−となる
Ｐｎ遺伝子を取り除いて構築される。この手法により単
なる斑点形態構造（ｐｌａｑｕｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
）に基いて組換えヴイールスを容易に同定することがで
きる。

ベ　　ルの　ｌ 桿状ヴイールス内での異種蛋白の配列構造のクローニン
グおよび発現にあたっては、その配列構造がポリヘトリ
ン促進因子および上流の配列に同心的に並んで配置され
ており、切形のポリヘトリン配列構造をもつ反対側は、
桿状ヴイールスのゲノム（染色体）同−源的組換えによ
りポリヘトリン促進因子および不活性ポリヘトリン遺伝
子に一列に並んでいる異種蛋白の配列構造に転移が起こ
る。

したがって、挿入ベクトルはこれらの遺伝子構造の配列
設計に用いたものである。

第１図には、野生型（ｗｔ）およびベクトルＤＮＡの制
限酵素断片地図が示されている。第１図の記号Ａで示す
ように、ＡｃＭＮＰＶ　　ＤＮＡのＥｃｏＲＩ−Ｉの断
片が示されている。ポリヘトリン解明配列領域は、黒く
塗り潰した部分であり、転写の方向はＡＴＧ翻訳始端コ
ドンからＴＡＡ翻訳終端コドンまでである。左端部に控
える側鎖配列には、ポリヘトリン転写終端信号を備え、
斜線を加えて示しである。

第１図のＢでは、技術処理されたＥｃｏＲＩ断片の線形
地図が示され、挿入ベクトルとして作用するようになっ
ている。この断片は下記のように技術処理される。

合成したオリゴマー（ＥｃｏＲＶの位置からＡＴＧにか
けての配列、および万能停止コドン配列に始まりＫｐｎ
Ｉの適合尾端に終わる多数の特異的制限位置を含む）は
、クローニングされてＥｃｏＲＶ位置とＫｐｎＩ位置と
の間にある配列に置き換わった。これに伴い、ポリヘト
リン遺伝子の半数は、Ｎ−終端部に欠損が生じ、挿入に
よりべクトルには本物のＡＴＧ転写開始コドンから直下
流のクローニング位置を含むようになる。

したがって、第１図に見られるように、Ｅｃ。

ＲＩ＠片（第１図のＡのようにポリヘトリン遺伝子とそ
の制限要素を含む）は、第１図のＢのポリヘトリン遺伝
子のＡ　’ｌ’　Ｇ翻訳開始コドンの直下流に存する複
合クローニング位置を含むように技術処理される。さら
に、複合クローニング領域は、一連のＴＡＡ翻訳終端コ
ドンにより特定された。

加えて、ポリヘトリン配列領域のＮ一端部は削除された
。下記の各挿入ベクトルは、ＡＴＧＨ翻訳開始コドシを
供給するように配されている。これらのベクトルに異種
の配列構造を挿入すると、翻訳開始コドンにより形成さ
れた翻訳配列構造が異種の配列構造により誤りなく正常
に維持される。

挿入ベクトルｐＭＧｓ３＋１は、Ｐｆ−Ｃ８Ａの発現に
用いられる。このベクトルは、下記により構成されてい
る。つまり、４０００ｂｐのポリヘトリン遺伝子のＡＴ
Ｇ翻訳開始コドンの上流に位置する繋ぎ配列構造；　変
′ＦＡ精製位置により導入された多連錯形体くポリリン
カー）で、これはポリへドリノ　コドンに正確に対応す
る位置にあるＡＴＧ開始コドンと、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ
、ＢｇｌＩＩの制限位置と、万能停止コドン断片とから
なる；　ポリヘトリン遺伝子の内部でＫｐｎＩの位置か
らＥｃｏＲＩ　　クローンの終端ＥｃｏＲＩ制限位置を
介して伸びる１７００ｂｐの配列構造とである。

挿入ベクトルｐＭＧＳ−ｍａｌの挿入によりＰｆ　−Ｃ
ＳＡのＮ−終端アミノ酸配列構造が正確に得られるよう
になっている。多連鎖形体断片は、Ｎｒｕ　ＩおよびＫ
ｐｎＩ制限位置に続＜：Ｐｆ−Ｃ３Ａでの最初の５個の
アミノ酸コドンからなっている。

Ｐｆ−Ｃ３Ａに対するクローニング手法は第２図および
第３図に示すようである。第２図は、組換えベクトルｐ
　３６９１の構造を示す。プラスミドの地図は、プラス
ミドｐｆ５から得られた１２４８の基盤対であるＡ１ｕ
Ｉ／ＲｓａＩ断片として分にされたＣ８蛋白遺伝子を示
す、先細りにならない形状（平坦端面）の端部を持つ断
片は、ベクトルｐＭＧｓ３＋１のＳｍａＩの位置にクロ
ーニングされて組換え組成物ｐ　３６９１を生ずる。こ
こでは、ポリヘトリン促進因子（Ｐ）からの転写方向は
Ｃ８蛋白遺伝子を介して配列構造内で読み取れる。

各矢印により転写の方向がそれぞれ指示されている。

前述の第３図は、組換えベクトルｐ４１４８の構造を示
す。これに係るプラスミド地図は、プラスミドｐｆ５か
ら得られた１２４８の基盤対であるＡ１ｕＩ／ＲｓａＩ
断片として分離されたＣ８蛋白遺伝子を示す。先細りに
ならない形状の端部を持つ断片は、ベクトルｐＭＧｓ−
ｍａ１のＮｒｕ　Ｉの位置にクローニングされて組換え
組成物ｐ４１４８を生ずる。ここでは、ポリヘトリン促
進因子（Ｐ）からの転写方向はＣ８蛋白遺伝子を介して
配列構造内で読み取れる。各矢印により転写のそれぞれ
の方向が指示されている。これらのプラスミド構造に関
する配列順序は第４図に示されている。

第４図によれば、記号ＡでＥｃｏＲＶ位置からＡＴＧ隣
接基盤に向かう配列順序を備えたポリヘトリン（ｐｎ　
）促進因子が示されている。この配列順序は、正規には
ポリヘトリン遺伝子から上流に存する配列順序に合致し
ている。このことは、ポリヘトリン促進因子の活動性が
この１０３基盤対断片以内にあることを立証している。

この配列順序によりＭＧＳベクトルが合成された。第４
図のＢでは、ベクトルｐＭＧｓ３＋１が示され、これは
ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、Ｂｇｉの制限位置および万能停止
コドン断片を含んだ多連錯形体に続くポリヘトリン遺伝
子内に見出されたと同一位置にＡ’ｌ”Ｇ翻訳開始コド
ンを備えている。制限位置は、配列順序に下線を付して
示してあり、各矢印により開裂点がそれぞれ指示されて
いる。アミノ酸コドンは、ＡＴＧコドンにより形成され
たものとして示す。

第４図のＣには、ベクトルｐＭＧＳ−ｍａｌがＡＴＧ翻
訳開始コドンを多連錯形体に続くポリヘトリン遺伝子内
に見出されたのと同一の位置に含む。この多連錯形体は
、本物のＣ３Ａ遺伝子の最初の６個のアミノ酸の配列を
決める構造を含むが、ポリヘトリン遺伝子により特定さ
れるに好都合なコドン使用法で使われる。この配列には
、Ｃ３Ａ遺伝子断片のＡ１ｕＩ端部に繋がらせるために
意図されたＮｒｕＴ制限位置が含まれる。これに続いて
、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＭの制限位置および万能停止コドン
断片が形成される。制限位置は、配列順序に下線を付し
て示してあり、各矢印により開裂点がそれぞれ指示され
ている。アミノ酸コドンは、Ａ　’Ｉ”　Ｇコドンによ
り形成されたものとして示す。

さらに、・第４図のＤでは、ＡＴＧ翻訳開始コドンとＡ
ＩｕＩ制限酵素を含んだＮ−終端部のＣ８Ａ′ｉｉ伝子
配列順序、ならびに翻訳終了コドンとＲｓａＩ制限位置
を含むＣ−終端部をそれぞれ示している。第４図の記号
Ｅで示すところによれば、組換えベクトル４１４８を示
し、これはＣ３Ａ　　ＡｌｕＩ／ＲｓａＩ断片のｐＭＧ
Ｓ−ｍａｌのＮｒｕＩ位置に対する結紮により得られた
ものである。

このベクトルにより得られた配列順序は、下線を施して
あり、第４図のＦには組換え構造３６９１が示され、こ
れはＣＳＡ　　Ａｌｕ／ＲｓａＩ断片のｐＭＧｓ３＋１
のＳｍａＩ位置に対する結紮により得られたものである
。ベクトルによる配列順序は下線が付しである。

組換えベクトルｖ３６９１は、ＡｌｕＩ−ＲｓａＩ断片
（Ｎ−終端部の６番目のコドンがら遺伝子配列の終端部
にわたる１２３３基盤対）として分離され、ベクトルｐ
ＭＧｓＢ＋１により供給されたポリヘトリン促進因子の
下流に挿入したＣ３Ａ遺伝子をなしている。最終的組換
え構造は、アミノ酸　Ｍ　ｅ　ｔ　／　Ｐ　ｒ　ｏ　／
　Ｐ　ｒ　ｏから得られたベクトルを有すると予想する
。このアミノ酸　Ｍｅｔ／Ｐｒｏ／Ｐｒｏは、本物のＣ
Ｓ抗原の第７番目のアミノ酸（Ｉ　ｌｅ）に読み込まれ
たＮ−終端部に位置する。

組換えベクトルｖ４１４８は、ベクトルｐＭＧｓｍａｌ
のＰｎ促進因子から下流に挿入された同一のＣ８Ａ遺伝
子を含有する断片からなる。これは特異なベクトルで、
これは本物のＮ−終端形アミノ酸を供給するようになっ
ていた。

兄現藍釆 住血胞子虫ファルシパルムのＣ８蛋白楕遺は、第５図に
示され、これは住血胞子虫ファルシパルムのサーカムス
ポロゾイトの蛋白質構造でもある。

この図は、ダーメ他（１９８４）、ニュセンツバイグお
よびニュセンツバイグ（１９８５）から引用した。ヌク
レオヂド配列（ダーメ他　１９８４）から予想されるよ
うに、各アミノ酸は点部として示しである。生理学的ｐ
Ｈを示すように荷電したアミノ酸は各点部の上の位置に
、ＡｓｐあるいはＧｌｕを（−）で、Ａｒｇあるいは■
、ｙｓを（＋）として示している。Ｉ　ｌｅ、Ｌｅｕ、
Ｐｈｃ、Ｔｒｐ、’ｌ’ｙｒあるいはＶａｌといった疎
水性アミノ酸は、各点の下の位置に記号で示す。Ｐｒｏ
あるいはＣｙｓは、ＰあるいはＣといった記号により示
す。領域■あるいは■では、住血胞子虫ファルシパルム
のＣ３Ａ蛋白と住血胞子虫ノーレシイ（Ｐ、ｋｎｏｗｌ
ｅｓｉ）との間に保存されたアミノ酸連鎖を示す。ＣＳ
ポリベペプチド先駆体（ブレカーサ）および成熟形態の
概算寸法を示す。

本物のＣ３蛋白の発現によれば、二つの先駆体（細胞内
）の形態を経ており、二つの小さな基本的ペプチドを連
続的に除去することにより成熟したＣ８蛋白分子に発展
する（コクラン他　１９８２；　サントロ他　１９８３
．　　ペルゲラ他　１９８５）。ＣＳ分子の成熟膜形態
は、５０がら１００個のアミノ酸を有し、先駆体よりも
短い、裂開箇所は、現在特定はできないが、Ｎ−終端部
、Ｃ−終端部あるいはＮ−１Ｃ−の両路端部が考えられ
る。

感染昆虫細胞内の組換えベクトルｖ４１４８およびｖ　
３６９１は、高分子量の先駆体を発生し、連続的に裂開
を起こして、成熟組換えＣ８蛋白を大量に生産する。

このように、本発明の方法によりｍ！した組換え発現ベ
クトルｖ４１４８およびｖ３６９１は、ヒトのマラリア
病原となる寄生形住血胞子虫ファルシパルムの組換えサ
ーカムボロゾイト抗原の製造に既述の如く有用である。

さらに、最終的に得られた組換えサーカムボロゾイト抗
原蛋白は、この発明を実施に移す際にはマラリアのワク
チン、ならびにマラリア診断のための有用成分として効
果的に適用される。ワクチンとして適用した場合には、
桿状ヴイールス昆虫細胞系で産した組換えサーカムポロ
ゾイト抗原蛋白質は、適宜量の助剤あるはキャリヤーと
ともに精製してワクチン組成物とする。これによりマラ
リア感染に対して保護機能あるいは免疫機能を発揮する
。

また、サーカムポロゾイト抗原を含む成分を接種により
ヒトに投与すると、マラリア病の治療に有用となる。

さらには、最終的精製物の組換えサーカムボロゾイト抗
原蛋白質は、ヒトのマラリア病の診断に用いる診断的成
分としても用いられる。

加えて、共同で譲渡して現在係属中で、発明の名称を「
ヒト免疫不全症形ヴイールス１の展開遺伝子から得られ
たポリペプチドを含むワクチン」として１９８８年２月
３日に米国特許商標片に出願したものの明細書によれば
、桿状ヴィールス−昆虫細胞系を用いてポリペプチドを
産し、ＡＩＤＳの抗原として適用したり、発現後に桿状
ヴィールス−昆虫細胞系からポリペプチドを回収したり
精製したりする技術を記載している。これらの記載事項
は、ワクチン成分の精製といったところなど本発明を実
施するに適用可能な限りで本発明に組み込み、本発明の
一部となす。

また、共同で譲渡して現在係属中で、発明の名称をＩ’
ＨＩＶ　　ｇｐ１６０　　エイズ（＾１ｄｓ）ヴイール
ス展開蛋白質含有細片およびそのエイズ抗体の検出法」
として１９８７年１月２７日に出願し、米国特許出願番
号第００６．８８０号とするものの明細書によれば、抗
原蛋白質あるいは診断成分を使用する組成物や技術を記
載している。この技術によれば、本発明の実施にサーカ
ムポロゾイト抗原蛋白質をヒトのマラリア病の診断に使
用する点において適用できる。

したがって、米国特許出願番号第００６．８８０号のも
のは、本発明に組み込まれて発明の一部をなす。

最後に、共同で譲渡して現在係属中で、発明の名称を「
組換え桿状ヴイールス感染形昆虫細胞内のヒト免疫不全
症ヴイールスの展開遺伝子から得られたポリペプチド」
として１９８６年１０月１６日に出願し、米国特許出願
番号第９２０．１９７号とするものの明細書によれば、
桿状ヴイールス昆虫細胞ベクトル系を使用して、抗原な
どとして有用なポリペプチドを生産する桿状ヴイールス
遺伝子およびＡＩＤＳヴイールス遺伝子に関する記載が
ある。この米国特許出願番号第９２０，１９７号とする
ものは、本発明を実施する上に関係し、本発明に組み込
まれて発明の一部をなす。

以上述べたように、本発明の技術は抗原物質の製造に有
用なばかりでなく、ヒトのマラリア病のワクチン製造に
も有用で診断薬としてマラリア抗体の検出にも役立つ。

さ−らには、本発明による組換えサーカムスポロゾイト
抗原蛋白質はワクチンや診断手段として有用なばかりで
なく、人体内でマラリア抗体の力価を増やして活性度を
上げれば、マラリア病の治療にも貢献する。

なお、下記に示す出版参考文献は、本発明に組み込まれ
て本発明の一部をなす。

下記の文献が上記の引用文献に対応する。

バロー、Ｗ、Ｒ，、Ｊ、ロスバード、Ｒ，Ａ。

ヴイルツ他　１９８５゜「住血胞子虫ファルシパルムの
サーカムスポロゾイト蛋白質からの合成ペプチド」　サ
イエンス　２２８　：９９６−９９９゜バロー、Ｗ、Ｒ
，、Ｊ、Ａ、シャーウッド、Ｆ。

Ａ、ネヴア他　１９８７゜「組換えＤＮＡ住血胞子虫フ
γルシパルム　スポロゾイト　ワクチンの効能と安全性
」　ランセット　１　：１２７７−１２８１゜コクラン
、Ａ、Ｈ，、Ｆ、サン１〜口、■、ニュセンツバイグ、
Ｒ，Ｗ、ガッツおよびＲ，Ｓ、ニュセンツバイグ　１９
８２゜ナショナルアカデミ−サイエンスＵ、　Ｓ、　Ａ
、会報　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　１７３＾）　７９：５６５１−５６５５゜ダ
ース、Ｊ、Ｂ、、Ｊ、Ｌ、ウィリアムス、Ｔ。

Ｆ、マツクーチャン他　１９８４゜「ヒトーマラリア寄
生形住血胞子虫ファルシパルムのスポロゾイトにおける
免疫支配形表面抗原を配列する遺伝子構造」　サイエン
ス　２２５　：５９３−５９９゜エニア、Ｖ、　、Ｊ、
エリス、Ｆ、ザアバラ他１９８４゜「寄生形住血胞子虫
フγルシパルムのサーカムスポロゾイト遺伝子のＤＮＡ
クローニング二縁返しエピトープのアミノ酸配列順序」
　サイエンス　２５５：６２８−６３０゜ ガリンスキー　Ｍ、Ｒ，、Ｄ、Ｅ、アーノット、Ａ、Ｈ
，コクラン他　１９８７゜「寄生形住血胞子虫シノモル
ギ複合」　細胞　４８：３１１−３１９゜デル　ガイデ
ィス、Ｇ、　、Ｊ、Ａ、クーパーＪ、メリノ他　１９８
６゜「抗体反応Ｊ　　ＷＨＯ技術レポートシリーズ　Ｎ
ｏ、７３５　１９８６゜マラリアの専門委員会第１８回
レポート。

イーガン、Ｊ、Ｅ、、Ｊ、Ｌ、ウェーバ−１Ｗ。

Ｒ，バロー池　１９８７．ｒネズミ科マラリアスポロゾ
イト　ワクチン：人間のワクチン製造への示唆」　サイ
エンス　２３６：４５３−４５６゜グツド、Ｍ、Ｆ、　
、Ｊ、Ａ、ベルシフスキーＷ、Ｌ、マロイ他　１９８６
゜「ネズミの寄生形住血胞子虫ファルシパルムのスポロ
ゾイト　ワクチンに対する遺伝子的免疫反応制御、高度
反復ワクチン中での単一マラリア下エピトープに対する
広範的無反応性」　実験医学１月号（Ｊ、Ｆ、ｘｐ。

Ｍ　ｅ　ｄ　、　）　１６４：６６５−６０゜グツド、
Ｍ、Ｆ、　、Ｗ、Ｌ、マロイ、Ｍ、Ｗ。

ルンデ他　１９８７゜「合成免疫原の構造：マラリア　
サーカムスポロゾイト蛋白質に関する新規なＴ−ヘルパ
ーエピト−プ」　サイエンス　２３５：１０５９−１０
６２゜ ヘリングトン、Ｄ、Ａ、　、Ｄ、Ｆ、クライト、Ｇ、ロ
ソンスキー他　１９８７．ｒ住血胞子虫ファルシパルム
のスポロゾイトに対する合成マラリア用ペプチド　ワク
チンにおける安全性および免疫性」　ネイチャー　３２
８：２５７−２５９゜実験室　ニューヨーク　ｐｐ　ｉ
−ｓ。

ミラー、Ｌ、Ｈ，、Ｒ，Ｊ、ホワード、Ｒ，カーター他
　１９８６゜［マラリア　ワクチンに対する研究」　サ
イエンス　２３４：１３４９−１３５６゜ニュセンツバ
イグ、■、およびＲ，Ｓ、ニュセンツバイグ　１９８５
゜「マラリア寄生虫のサーカムスポロゾイト蛋白質」　
細胞　４２：４０１−４０３゜メージャー、Ｄ、　、Ｓ
、メローク、Ｒ，Ｌ、ビュードイン他　１９８６゜「フ
ァルシパルムのスポロゾイトに関する試験管外での組換
えおよび合成ペプチドに対すゐ抗体の効果」　サイエン
ス２３１：１５Ｂ−１５９。

ミラー、Ｌ、８．１９８５゜「マラリア　ワクチンに対
する研究：ワクチン８５Ｆ、Ｄの徹底的見直しＪ　Ｒ，
Ａ、ラーナー、Ｒ，Ｍ、チャノックおよびＦ、ブラウン
、コールド　スプリングラヴエッチ、Ｊ、Ｖ、　、Ｊ、
ヤングおよびＧ。

ボステ　１９８５．ｒマラリア　ワクチンの開発に対す
る分子遺伝子的手法」　バイオテクノロジー　　３ニア
２９−７４０　。

サントロ、Ｆ、、Ａ、Ｈ，コクラン、■、ニュセンツバ
イグ他　１９８３゜「マラリア寄生虫とは異なる種のス
ポロゾイト保護抗原における構造的類似性」　生科学１
月号　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２５８：３３
４１−３３４５゜ ベルゲラ、Ｕ、　、Ｒ，ガッツ、Ｄ、シュレシンガー、
■、ニュセンツバイグおよびＡ、フェライラ　１つ８５
゜ｒｐ、ノーレシイ（Ｐ、ｋｎｏｗｌｅｓｉ、）のサー
カムスボロゾイート蛋白質に関する多数形弁繰返し式エ
ピトープ」分子生化物学的寄生動物（Ｈｏｔ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔ、）　　１４：２８３−２
９２゜（Ｐ、　ｆａｃ　ｉｐａｒｕｍ）のサーカムスポ
ロゾイト蛋白質の構成図である。

健二 ヤング、Ｊ、Ｆ、　、Ｗ、Ｔ、ホックメーヤーＭ、グロ
ス他　「ヒトのマラリア　ワクチンの試験のためのニス
チエリチア　コリイ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａｃｏｌｉ；
大腸菌属）内の住血胞子虫ファルシパルム　サーカムス
ポロゾイト蛋白質の発現」　サイエンス　２２８：９５
８−９６２゜

【図面の簡単な説明】

第１図は野生形（ｗｔ）およびベクトルＤＮＡの制限酵
素断片地図、第２図は組換えベクトルｐ３６９１構造図
、第３図は組換えベクトルＰ４１４８の構造図、第４図
はプラスミドの構造に関する配列図、第５図は住血胞子
虫ファルシパルム手続補正書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトのマラリアの病因となる寄生形住血胞子虫フア
   ルシパルムの組換えによるサーカムスポロゾイト抗原蛋
   白質製造方法。 ２、請求項１記載の寄生形住血胞子虫ファルシパルムの
   組換えによるサーカムスポロゾイト抗原から略構成され
   るワクチン製造方法およびそのキャリアー。 ３、桿状ヴィールス−昆虫細胞ベクトル系で発現され、
   回収されたことを特徴とする請求項１記載の寄生形住血
   胞子虫ファルシパルムの組換えによるサーカムスポロゾ
   イト抗原蛋白質製造方法。 ４、請求項３記載の寄生形住血胞子虫ファルシパルムの
   組換えによるサーカムスポロゾイト抗原から略構成され
   るワクチン製造方法。 ５、組換えサーカムスポロゾイト抗原からなり、ヒトの
   マラリア病診断用に調製された請求項１記載の組成物製
   造方法およびそのキャリアー。 ６、組換えサーカムスポロゾイト抗原蛋白質は、無削除
   の組換えによることを特徴とする請求項１記載の製造方
   法。 ７、ベクトルｐ３６９１による組換方法。 ８、ベクトルｐ４１４８による組換方法。 ９、請求項１に記載の組換えサーカムスポロゾイト抗原
   蛋白質の生産および発現のため桿状ヴィールス−昆虫細
   胞ベクトル系のベクトルｐ３６９１を用いて成ることを
   特徴とする請求項１記載の組換えサーカムスポロゾイト
   抗原蛋白質製造方法。 １０、請求項１に記載の組換えサーカムスポロゾイト抗
   原蛋白質の生産および発現のため、桿状ヴィールス−昆
   虫細胞ベクトル系のベクトルｐ４１４８を用いて成るこ
   とを特徴とする請求項１記載の組換えサーカムスポロゾ
   イト抗原蛋白質製造方法。 １１、桿状ヴィールス−昆虫細胞ベクトル系は、組換え
   発現ベクトルからなることを特徴とする請求項７記載の
   製造方法。 １２、桿状ヴィールス−昆虫細胞ベクトル系は、組換え
   発現ベクトルからなることを特徴とする請求項８記載の
   製造方法。 １３、前記抗原蛋白質を適当量だけ効果的に投与するこ
   とによりヒトのマラリア病を治療することを特徴とする
   請求項１記載の製造方法。 １４、前記抗原蛋白質をヒトの血清に適当量効果的に添
   加することにより精製し、これをヒトのマラリア病の診
   断に適用するようにしたことを特徴とする請求項１記載
   の製造方法。