JPH025890A - ニワトリのβ−アクチンプロモーターを用いたヒトファクター８Ｃの製造方法 - Google Patents
ニワトリのβ−アクチンプロモーターを用いたヒトファクター８Ｃの製造方法Info
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- JPH025890A JPH025890A JP63157570A JP15757088A JPH025890A JP H025890 A JPH025890 A JP H025890A JP 63157570 A JP63157570 A JP 63157570A JP 15757088 A JP15757088 A JP 15757088A JP H025890 A JPH025890 A JP H025890A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な発現ベクターを用いたヒト血液凝固因
子ファクターＶＩＩＩＣの製造方法、これに用いられる
ファクター１０発現プラスミド並びに形質転換体に関す
る。さらに詳しくは、ニワトリのβ−アクチンプロモー
ターの下流にヒトファクターＶＩＩＩＣ遺伝子を組み込
んだ発現ベクター、これを導入することにより得られた
形質転換体およびこれらを用いることを特徴とするヒト
ファクターＶＩＩＩＣの効果的な製造方法に関する。
子ファクターＶＩＩＩＣの製造方法、これに用いられる
ファクター１０発現プラスミド並びに形質転換体に関す
る。さらに詳しくは、ニワトリのβ−アクチンプロモー
ターの下流にヒトファクターＶＩＩＩＣ遺伝子を組み込
んだ発現ベクター、これを導入することにより得られた
形質転換体およびこれらを用いることを特徴とするヒト
ファクターＶＩＩＩＣの効果的な製造方法に関する。
ヒト血液凝固第■因子（ファクターＶＩＩＩＣ）は、血
液凝固の内因系経路に関する血漿蛋白質であり、機能的
には、ファクター■のコファクターとして、活性化ファ
クター■によるファクターＸの活性化を促進する補助因
子である。ファクターＶＩＩＩＣは、生体中ではフォノ
・ビルプラント因子と複合体を形成し血液中を循環して
いる。
液凝固の内因系経路に関する血漿蛋白質であり、機能的
には、ファクター■のコファクターとして、活性化ファ
クター■によるファクターＸの活性化を促進する補助因
子である。ファクターＶＩＩＩＣは、生体中ではフォノ
・ビルプラント因子と複合体を形成し血液中を循環して
いる。
血友病Ａ患者においては、このファクターＶＩＩＩＣが
遺伝的に欠陥をもつために血液中に活性を持ったファク
ターＶＩＩＩＣが存在せず、血液凝固の機序が正常に機
能しないため番こ、血液凝固不全となる。
遺伝的に欠陥をもつために血液中に活性を持ったファク
ターＶＩＩＩＣが存在せず、血液凝固の機序が正常に機
能しないため番こ、血液凝固不全となる。
このため血友病Ａ患者の止血療法のため、ファクター■
を補充する療法がとられている。
を補充する療法がとられている。
このファクター■補充療法には、新鮮凍結人血漿、さら
には、この凍結血漿をゆるやかに融解したときに生じる
沈澱であるクリオプレシピテートを製剤として用いる方
法がとられ、近年ではファクターＶＩＩＩＣを高力価に
含むファクター■濃縮製剤が使用されている。
には、この凍結血漿をゆるやかに融解したときに生じる
沈澱であるクリオプレシピテートを製剤として用いる方
法がとられ、近年ではファクターＶＩＩＩＣを高力価に
含むファクター■濃縮製剤が使用されている。
しかしながら、このファクター■濃縮製剤は高力価では
あるものの、フィブリノーゲン、フィブロネクチン等の
夾雑物が多量に含まれ、さらに原料がヒト血漿より供給
されるため、エイズ（ＡＩＤＳ）、肝炎等のウィルス感
染に対する危惧が排除できない、また、ファクターＶＩ
ＩＩＣは、血漿中に極微量にしか存在しないので、高度
に精製したファクターＶＩＩＩＣを得るためには、多大
な労力を必要とする。
あるものの、フィブリノーゲン、フィブロネクチン等の
夾雑物が多量に含まれ、さらに原料がヒト血漿より供給
されるため、エイズ（ＡＩＤＳ）、肝炎等のウィルス感
染に対する危惧が排除できない、また、ファクターＶＩ
ＩＩＣは、血漿中に極微量にしか存在しないので、高度
に精製したファクターＶＩＩＩＣを得るためには、多大
な労力を必要とする。
この為、ヒト血漿に由来せず、夾雑ウィルス混入のない
、安価で安全な高純度のファクターＶＩＩＩＣ製剤を供
給するため、現在では遺伝子操作の技術を用い、ヒトフ
ァクターＶＩＩＩＣをコードする遺伝子をクローニング
し、培養動物細胞等で遺伝子を発現させファクターＶＩ
ＩＩＣを生産させる試みがなされている。
、安価で安全な高純度のファクターＶＩＩＩＣ製剤を供
給するため、現在では遺伝子操作の技術を用い、ヒトフ
ァクターＶＩＩＩＣをコードする遺伝子をクローニング
し、培養動物細胞等で遺伝子を発現させファクターＶＩ
ＩＩＣを生産させる試みがなされている。
ヒトファクターＶＩＩＩＣは、Ｊ、Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ
らによりＤＮＡがクローニングされ（Ｎａｔｕｒｅ ｌ
ｕ２．３２６−３３０゜１９８４ ）、Ｗ、 １． Ｗ
ｏｏｄらによりハムスター腎臓細胞でのｃＤＮＡの発現
が報告されている（Ｎａｔｕｒｅ ３Ｍ。
らによりＤＮＡがクローニングされ（Ｎａｔｕｒｅ ｌ
ｕ２．３２６−３３０゜１９８４ ）、Ｗ、 １． Ｗ
ｏｏｄらによりハムスター腎臓細胞でのｃＤＮＡの発現
が報告されている（Ｎａｔｕｒｅ ３Ｍ。
３３０−３３７．１９８４）、 その後Ｊ、 Ｊ、
Ｔｏｏｌｅら（Ｎａｔｕｒｅ３ｆｉ、 ３４２−３４
７． １９８４＞、間、Ａ、Ｔｒｕｅｔｔら（ＤＮＡ４
゜３３３−３４９．１９８５）及び＾、Ｐａｖｉｒａｎ
ｉら（Ｂｉｏ／ ｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ ！１．３８
９−３９２．１９８７）によって、それぞれヒトファク
ターＶＩＩＩＣのｃＤＮＡがクローニングされ、哺乳類
動物細胞での発現が報告されている。しかし、これらは
いずれも一過的な遺伝子発現であり、ヒトファクターＶ
ＩＩＩＣは巨大な分子量の糖蛋白質である為発現量も低
く、ヒトファクターＶＩＩＩＣの工業的生産の観点から
は溝足できる結果ではない。
Ｔｏｏｌｅら（Ｎａｔｕｒｅ３ｆｉ、 ３４２−３４
７． １９８４＞、間、Ａ、Ｔｒｕｅｔｔら（ＤＮＡ４
゜３３３−３４９．１９８５）及び＾、Ｐａｖｉｒａｎ
ｉら（Ｂｉｏ／ ｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ ！１．３８
９−３９２．１９８７）によって、それぞれヒトファク
ターＶＩＩＩＣのｃＤＮＡがクローニングされ、哺乳類
動物細胞での発現が報告されている。しかし、これらは
いずれも一過的な遺伝子発現であり、ヒトファクターＶ
ＩＩＩＣは巨大な分子量の糖蛋白質である為発現量も低
く、ヒトファクターＶＩＩＩＣの工業的生産の観点から
は溝足できる結果ではない。
ヒトファクターＶＩＩＩＣのｃＤＮＡは、およそ７００
０〜８０００塩基のＤＮＡ配列からなり、このうち７０
５３塩基がファクターＶＩＩＩＣをコードしており、２
３５１アミノ酸から構成される蛋白である。
０〜８０００塩基のＤＮＡ配列からなり、このうち７０
５３塩基がファクターＶＩＩＩＣをコードしており、２
３５１アミノ酸から構成される蛋白である。
このうちアミノ末端の１９アミノ酸はシグナルペプチド
であり、膜透過時にシグナルペプチダーゼにより切り離
され、２３３２アミノ酸からなるポリペプチドとなる。
であり、膜透過時にシグナルペプチダーゼにより切り離
され、２３３２アミノ酸からなるポリペプチドとなる。
このようにファクターＶＩＩＩＣは、生体内蛋白の中で
も非常に分子量が大きい蛋白であり、このような蛋白分
子を遺伝子組換え技術を応用して発現させる場合は、他
の低分子蛋白質を発現させる場合に較べて様々な障壁が
ある。
も非常に分子量が大きい蛋白であり、このような蛋白分
子を遺伝子組換え技術を応用して発現させる場合は、他
の低分子蛋白質を発現させる場合に較べて様々な障壁が
ある。
このような問題点を解決するひとつの手段として、ファ
クターＶＩＩＩＣ遺伝子を一部改変する下記のような方
法が試みられている。
クターＶＩＩＩＣ遺伝子を一部改変する下記のような方
法が試みられている。
すなわち、ファクターＶＩＩＩＣはそのアミノ酸−次配
列の解析により、Ａｌ−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２か
らなるドメイン構造を有していると考えられ（Ｇ、Ａ、
Ｖｅｈａｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３Ｊユ、 ３３７−３
４２．１９８４）。
列の解析により、Ａｌ−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２か
らなるドメイン構造を有していると考えられ（Ｇ、Ａ、
Ｖｅｈａｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３Ｊユ、 ３３７−３
４２．１９８４）。
ヒト活性化天然型ファクターＶＩＩＩＣ分子種には、Ｂ
ドメインの一部あるいはその大部分は不要と考えられて
いる。遺伝子発現量を増加させる為、可能な限り天然型
ファクターＶＩＩＩＣの分子を低分子量化し、なおかつ
生物学的に活性のあるファクターＶＩＩＩＣ分子種を作
成する目的で、このＢドメインの一部あるいは全てを除
去した活性化天然型ファクター１０分子の調製がいくつ
か報告されている。
ドメインの一部あるいはその大部分は不要と考えられて
いる。遺伝子発現量を増加させる為、可能な限り天然型
ファクターＶＩＩＩＣの分子を低分子量化し、なおかつ
生物学的に活性のあるファクターＶＩＩＩＣ分子種を作
成する目的で、このＢドメインの一部あるいは全てを除
去した活性化天然型ファクター１０分子の調製がいくつ
か報告されている。
Ｊ、 Ｊ、 Ｔｏｏｌｅらは、アミノ酸残基番号１位の
アラニンから９８１位プロリンからなるポリペプチド断
片（Ｈ鎖）と、１５６３位アスパラギン酸から２３３２
位チロシンからなるポリペプチド断片（Ｌ鎖）が直接酸
アミド結合した活性化天然型ファクターＶＩＩＩＣ（９
８１Ｐｒｏ−１５６３ＡｓｐフアクターＶＩＩＩＣと略
す）及び７５９Ｔｈｒ（６４０ＰｒｏフアクターＶＩＩ
ＩＣを、アデノウィルス主要後期プロモーターを用いて
ＣＯ８細胞（Ｐｒｏｃ、 Ｎ。
アラニンから９８１位プロリンからなるポリペプチド断
片（Ｈ鎖）と、１５６３位アスパラギン酸から２３３２
位チロシンからなるポリペプチド断片（Ｌ鎖）が直接酸
アミド結合した活性化天然型ファクターＶＩＩＩＣ（９
８１Ｐｒｏ−１５６３ＡｓｐフアクターＶＩＩＩＣと略
す）及び７５９Ｔｈｒ（６４０ＰｒｏフアクターＶＩＩ
ＩＣを、アデノウィルス主要後期プロモーターを用いて
ＣＯ８細胞（Ｐｒｏｃ、 Ｎ。
Ａ、 Ｓ、 ＵＳＡ ８３．５９３９−５９４２．１
９８６＞およびＣＨＯ細胞（ＰＣＴ出願ｗｏ８６１０６
１０１）発現させている。また、Ｄ、 Ｌ、 Ｅａｔｏ
ｎらは、 ７９６Ｇ Ｉ ｎ−１５６３Ａｓ ｎファク
ターＶＩＩＩＣをＳＶ４０初期プロモーターを用いＣＯ
８細胞で発現させている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２５．８３４３−８３４７．１９８６）。
９８６＞およびＣＨＯ細胞（ＰＣＴ出願ｗｏ８６１０６
１０１）発現させている。また、Ｄ、 Ｌ、 Ｅａｔｏ
ｎらは、 ７９６Ｇ Ｉ ｎ−１５６３Ａｓ ｎファク
ターＶＩＩＩＣをＳＶ４０初期プロモーターを用いＣＯ
８細胞で発現させている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２５．８３４３−８３４７．１９８６）。
このようにファクターＶＩＩＩＣ遺伝子のうちＢドメイ
ンをコードする領域を予め削除することにより改変した
ファクターＶＩＩＩＣ遺伝子を発現させることで発現量
の向上は見られたものの、いずれも工業的レベルでのフ
ァクターＶＩＩＩＣの生産においてはまだ満足できるも
のではなかった。このような状況において、活性を有す
るファクターＶＩＩＩＣの産生を飛躍的に向上させる技
術の開発が望まれていた。
ンをコードする領域を予め削除することにより改変した
ファクターＶＩＩＩＣ遺伝子を発現させることで発現量
の向上は見られたものの、いずれも工業的レベルでのフ
ァクターＶＩＩＩＣの生産においてはまだ満足できるも
のではなかった。このような状況において、活性を有す
るファクターＶＩＩＩＣの産生を飛躍的に向上させる技
術の開発が望まれていた。
１肌ム旦刀
本発明者らは、ヒトファクターＶＩＩＩＣを高発現する
ことが可能な動物細胞による新規な発現系に関し、鋭意
研究を行ってきた結果、ニワトリのβ−アクチンプロモ
ータτを用いることによりヒトファクターＶＩＩＩＣを
極めて高発現させることができることを見いだし本発明
を完成するに至った０本発明によれば、従来のプロモー
ターおよび宿主細胞を用いる方法と較べて飛躍的にヒト
ファクターＶＩＩＩＣを高発現させることができる。
ことが可能な動物細胞による新規な発現系に関し、鋭意
研究を行ってきた結果、ニワトリのβ−アクチンプロモ
ータτを用いることによりヒトファクターＶＩＩＩＣを
極めて高発現させることができることを見いだし本発明
を完成するに至った０本発明によれば、従来のプロモー
ターおよび宿主細胞を用いる方法と較べて飛躍的にヒト
ファクターＶＩＩＩＣを高発現させることができる。
すなわち、本発明は、ヒトファクターＶＩＩＩＣを遺伝
子組換えにより生産するに際して、ニワトリのβ−アク
チンプロモーターを用いた新規な動物細胞の発現系を提
供するものであり、工業的レベルにおいても十分利用可
能なヒトファクターＶＩＩＩＣの製造方法を提供するも
のである。
子組換えにより生産するに際して、ニワトリのβ−アク
チンプロモーターを用いた新規な動物細胞の発現系を提
供するものであり、工業的レベルにおいても十分利用可
能なヒトファクターＶＩＩＩＣの製造方法を提供するも
のである。
本発明の製造方法においては、ニワトリのβ−アクチン
プロモーターが用いられる。このようなニワトリのβ−
アクチンプロモーターは、第１図に示した塩基配列を有
する遺伝子断片である。
プロモーターが用いられる。このようなニワトリのβ−
アクチンプロモーターは、第１図に示した塩基配列を有
する遺伝子断片である。
β−アクチンは、あらゆる細胞に存在し多種の細胞機能
に閏年している、プロトシアからヒトに至る真核生物の
主要構成蛋白のひとつである０本発明におけるニワトリ
のβ−アクチン遺伝子とよく似た遺伝子組換え技術とし
て、ヒトのβ−アクチンプロモーターを利用した外来遺
伝子の発現系が報告されている（Ｐ、 ＧＵＮＮＩＮＧ
ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎ、 Ａ。
に閏年している、プロトシアからヒトに至る真核生物の
主要構成蛋白のひとつである０本発明におけるニワトリ
のβ−アクチン遺伝子とよく似た遺伝子組換え技術とし
て、ヒトのβ−アクチンプロモーターを利用した外来遺
伝子の発現系が報告されている（Ｐ、 ＧＵＮＮＩＮＧ
ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎ、 Ａ。
Ｓ、 ＵＳＡ、 ８４．４８３１−４８３５．１９８７
および特開昭６２−２６２９９５号）、この技術によれ
ば、従来からよく用いられていたＳＶ４０プロモーター
と比較すると発現効率において進歩が認められるものの
、そのプロモーター活性の強さはＳＶ４０初期プロモー
ターと比較して約１．７倍程度であり、工業的生産を考
慮した場合には決して満足できるものではない。
および特開昭６２−２６２９９５号）、この技術によれ
ば、従来からよく用いられていたＳＶ４０プロモーター
と比較すると発現効率において進歩が認められるものの
、そのプロモーター活性の強さはＳＶ４０初期プロモー
ターと比較して約１．７倍程度であり、工業的生産を考
慮した場合には決して満足できるものではない。
本発明において用いられるニワトリのβ−アクチンとヒ
トのβ−アクチン遺伝子とを比較してみると、アミノ酸
レベルでは９９．５％が一致しているが（３７６個のア
ミノ酸のうち２個だけ異なる）、プロモーター領域のＤ
ＮＡレベルでの相関関係では、５０．７％のホモロジー
があるのみであった。
トのβ−アクチン遺伝子とを比較してみると、アミノ酸
レベルでは９９．５％が一致しているが（３７６個のア
ミノ酸のうち２個だけ異なる）、プロモーター領域のＤ
ＮＡレベルでの相関関係では、５０．７％のホモロジー
があるのみであった。
本発明に従えば、その好ましい態様として、用いるプロ
モーターとして第１図に示された遺伝子のうち、−１２
７５位から一５位のシトシン（Ｃ）までの１２７０塩基
の遺伝子台、む遺伝子断片を用いることにより目的のフ
ァクター■を非常に効率よく発現させることが可能とな
る０通常、プロモーターの性状として、本来のＡＴＧ上
流（５°端側）４０塩基くらいは、削除してもそのプロ
モーター活性にはほとんど影響ないとされているが、本
発明者らの研究成果によれば、ニワトリのβ−アクチン
プロモーターの場合には、プロモーターの３′端側は、
本来のβ−アクチン構造遺伝子翻訳開始コドンＡＴＧの
上流５塩基のシトシン（Ｃ）までを含む遺伝子断片を用
いることが好ましく、第１図に示した一５位のシトシン
＜Ｃ＞より上流（３’側）を除去するとプロモーター活
性が低下することが確認された。これは、メツセンジャ
ーＲＮＡが転写された後のスプライシングに関係するた
めと考えられた。
モーターとして第１図に示された遺伝子のうち、−１２
７５位から一５位のシトシン（Ｃ）までの１２７０塩基
の遺伝子台、む遺伝子断片を用いることにより目的のフ
ァクター■を非常に効率よく発現させることが可能とな
る０通常、プロモーターの性状として、本来のＡＴＧ上
流（５°端側）４０塩基くらいは、削除してもそのプロ
モーター活性にはほとんど影響ないとされているが、本
発明者らの研究成果によれば、ニワトリのβ−アクチン
プロモーターの場合には、プロモーターの３′端側は、
本来のβ−アクチン構造遺伝子翻訳開始コドンＡＴＧの
上流５塩基のシトシン（Ｃ）までを含む遺伝子断片を用
いることが好ましく、第１図に示した一５位のシトシン
＜Ｃ＞より上流（３’側）を除去するとプロモーター活
性が低下することが確認された。これは、メツセンジャ
ーＲＮＡが転写された後のスプライシングに関係するた
めと考えられた。
発現ベクターのニワトリのβ−アクチンプロモーター下
流に組み込むファクターＶＩＩＩＣ遺伝子は、既に前述
したような２３３２個のアミノ酸からなるファクター１
０分子をコードする遺伝子である。しかしながら、前に
述べたようなファクターＶＩＩＩＣのＢドメインの一部
または全部をコードする遺伝子領域を予め除去したファ
クターＶＩＩＩＣ遺伝子を用いることによりさらにファ
クターＶＩＩＩＣの発現効率を上げることが可能となる
。
流に組み込むファクターＶＩＩＩＣ遺伝子は、既に前述
したような２３３２個のアミノ酸からなるファクター１
０分子をコードする遺伝子である。しかしながら、前に
述べたようなファクターＶＩＩＩＣのＢドメインの一部
または全部をコードする遺伝子領域を予め除去したファ
クターＶＩＩＩＣ遺伝子を用いることによりさらにファ
クターＶＩＩＩＣの発現効率を上げることが可能となる
。
本発明においては、２３３２個のアミノ酸からなるファ
クターＶＩＩＩＣを天然型ファクターＶＩＩＩＣ１また
、Ｂドメインの一部または全部が欠損されたファクター
ＶＩＩＩＣを活性化天然型ファクターＶＩＩＩＣと呼ぶ
。
クターＶＩＩＩＣを天然型ファクターＶＩＩＩＣ１また
、Ｂドメインの一部または全部が欠損されたファクター
ＶＩＩＩＣを活性化天然型ファクターＶＩＩＩＣと呼ぶ
。
本発明に用いられる好ましい態様のファクターＶＩＩＩ
Ｃ３ｌｔ伝子の一例として、ヒトファクターＶＩＩＩＣ
のアミノ末端よりなるＨ鎖の７４０位のアルギニンと、
ヒト天然型ファクターＶＩＩＩＣのカルボキシ末端より
なるし鎖の１６４９位のグルタミン酸が、直接結合した
ものより成る蛋白質をコードする遺伝子、すなわち、フ
ァクターＶＩＩＩＣのアミノ酸残基番号１位（アラニン
）から７４０位（アルギニン）からなるポリペプチド断
片（Ｈ鎖）と、１６４９位（グルタミン酸）から２３３
２位（チロシン）からなるポリペプチド断片（Ｌ鎖）が
、直接アミド結合した活性化天然型７７クターＶＩＩＩ
Ｃ［７４０Ａｒｇ−１６４９０１ｕ、本発明ではＲＥと
略すコをコードする遺伝子に、ファクター１０本来のシ
グナルペプチドをコードする遺伝子が接続された遺伝子
が挙げられる。尚、このような活性化天然型ファクター
ＶＩＩＩＣ（ＲＥ）をコードする遺伝子が組み込まれた
プラスミド＾ｄ、 ＲＥ、 ｎｅｏは、形質転換体ＩＥ
、ｃｏｌｉ ＩＩＢＩＱＩ（ＲＥ）としてＡＴＣＣに
寄託されている（寄託番号５３５１７）。
Ｃ３ｌｔ伝子の一例として、ヒトファクターＶＩＩＩＣ
のアミノ末端よりなるＨ鎖の７４０位のアルギニンと、
ヒト天然型ファクターＶＩＩＩＣのカルボキシ末端より
なるし鎖の１６４９位のグルタミン酸が、直接結合した
ものより成る蛋白質をコードする遺伝子、すなわち、フ
ァクターＶＩＩＩＣのアミノ酸残基番号１位（アラニン
）から７４０位（アルギニン）からなるポリペプチド断
片（Ｈ鎖）と、１６４９位（グルタミン酸）から２３３
２位（チロシン）からなるポリペプチド断片（Ｌ鎖）が
、直接アミド結合した活性化天然型７７クターＶＩＩＩ
Ｃ［７４０Ａｒｇ−１６４９０１ｕ、本発明ではＲＥと
略すコをコードする遺伝子に、ファクター１０本来のシ
グナルペプチドをコードする遺伝子が接続された遺伝子
が挙げられる。尚、このような活性化天然型ファクター
ＶＩＩＩＣ（ＲＥ）をコードする遺伝子が組み込まれた
プラスミド＾ｄ、 ＲＥ、 ｎｅｏは、形質転換体ＩＥ
、ｃｏｌｉ ＩＩＢＩＱＩ（ＲＥ）としてＡＴＣＣに
寄託されている（寄託番号５３５１７）。
本発明の好ましいヒトファクター１０発現ベクターは真
核細胞内で機能する複製開始点（ｏｒｉ）及び前記のニ
ワトリβ−アクチンプロモーターの制御の下、分泌のた
め必要なシグナルペプチド遺伝子を含む、ヒトファクタ
ーＶＩＩＩＣをコードする遺伝子とその下流にポリアゾ
ニレ−ジョンシグナルが置かれた遺伝子配列、さらに大
腸菌での複製開始点と薬剤耐性遺伝子とからなる遺伝子
配列を結合したものである０ｇ４えば、ｐＳＡｃ−２（
第２図）のようなベクターのニワトリβ−アクチンプロ
モーターの下流にヒトファクターＶＩＩＩＣをコードす
る３１ｉ伝子を組み込むことによりヒトファクターＶＩ
ＩＩＣを大量に得ることが可能となる。
核細胞内で機能する複製開始点（ｏｒｉ）及び前記のニ
ワトリβ−アクチンプロモーターの制御の下、分泌のた
め必要なシグナルペプチド遺伝子を含む、ヒトファクタ
ーＶＩＩＩＣをコードする遺伝子とその下流にポリアゾ
ニレ−ジョンシグナルが置かれた遺伝子配列、さらに大
腸菌での複製開始点と薬剤耐性遺伝子とからなる遺伝子
配列を結合したものである０ｇ４えば、ｐＳＡｃ−２（
第２図）のようなベクターのニワトリβ−アクチンプロ
モーターの下流にヒトファクターＶＩＩＩＣをコードす
る３１ｉ伝子を組み込むことによりヒトファクターＶＩ
ＩＩＣを大量に得ることが可能となる。
このようなヒトファクター１０発現ベクターを導入する
宿主細胞としては、ヒトファクターＶＩＩＩＣを発現す
ることができる動物細胞であればいかなるものでもよい
が、好ましくは目的とする形質転換体を容易に分離する
ことが可能な動物細胞、例えばチャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯＬ４Ｂ胞が用いられる。
宿主細胞としては、ヒトファクターＶＩＩＩＣを発現す
ることができる動物細胞であればいかなるものでもよい
が、好ましくは目的とする形質転換体を容易に分離する
ことが可能な動物細胞、例えばチャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯＬ４Ｂ胞が用いられる。
形質転換用遺伝子断片の宿主細胞への導入は、既知の方
法、例えばリン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。
法、例えばリン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。
５２． ４５６． １９７３） 、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴ
ＲＡＮ法（ＤＮＡ ｃｌｏｎｊｎｇｖｏｌ、 ［１１Ｒ
Ｌｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、 １４３−１９０．１９
８５）、エレクトロポレーション法（Ｐｒｏ、 Ｎ、Ａ
、Ｓ、 ８１．７１６１−７１６５、１９８４）等によ
り行うことができる。この際に、薬剤遺伝子等の特定遺
伝子欠損動物細胞、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（
ＤＩＩＦＲ）遺伝子欠損ＣＨＯ細胞を用い、ＤＨＰＲ遺
伝子含有プラスミド例えばｐｓＶ２−ｄｈｆｒ （Ｍｏ
１． Ｃｅ１ｌ ｌ１ｉｏ１．１．８５４−８６４゜１
９８１＞と共にヒトファクター１０発現ベクターを共形
質転換（Ｃｅｌｌ １６．７７７−７８５．１９７９）
Ｌ、これをヌクレオシドを欠く選択培地で選択するこ
とにより、ＤＩを峰遺伝子が導入され、ＤＨＰＲ遺伝子
が発現しているＣＨＯ細胞を得ることができるが、同時
にヒトファクターＶＩＩＩＣ遺伝子も導入された可能性
が高いＣＨＯ！胞を選択・分離することが可能である。
ＲＡＮ法（ＤＮＡ ｃｌｏｎｊｎｇｖｏｌ、 ［１１Ｒ
Ｌｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、 １４３−１９０．１９
８５）、エレクトロポレーション法（Ｐｒｏ、 Ｎ、Ａ
、Ｓ、 ８１．７１６１−７１６５、１９８４）等によ
り行うことができる。この際に、薬剤遺伝子等の特定遺
伝子欠損動物細胞、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（
ＤＩＩＦＲ）遺伝子欠損ＣＨＯ細胞を用い、ＤＨＰＲ遺
伝子含有プラスミド例えばｐｓＶ２−ｄｈｆｒ （Ｍｏ
１． Ｃｅ１ｌ ｌ１ｉｏ１．１．８５４−８６４゜１
９８１＞と共にヒトファクター１０発現ベクターを共形
質転換（Ｃｅｌｌ １６．７７７−７８５．１９７９）
Ｌ、これをヌクレオシドを欠く選択培地で選択するこ
とにより、ＤＩを峰遺伝子が導入され、ＤＨＰＲ遺伝子
が発現しているＣＨＯ細胞を得ることができるが、同時
にヒトファクターＶＩＩＩＣ遺伝子も導入された可能性
が高いＣＨＯ！胞を選択・分離することが可能である。
また、この共形質転換時にヒトファクター■発現ベクタ
ーに対しＤＩｉＦＲ発現遺伝子含有プラスミドの量を少
なくする（例えばヒトファクター１０発現プラスミドの
量をＤＩ（ＰＲ発現プラスミドの５０分の１量とする〉
ことにより双方の遺伝子が導入されたＣＨＯ細胞を選択
・分離できる可能性がさらに高くなる。さらに好ましく
は、ヒトファクター１０発現ベクターにあらかじめＤＨ
ＰＲ遺伝子を組み込むことでヒトファクターＶＩＩＩＣ
−ＤＨＦＲ共発現ベクターとし、これを宿主細胞に組み
込めば、ヒトファクター１０発現遺伝子とＤＩＩＰＲ遺
伝子とを同時に効率よく宿主細胞の染色体遺伝子上に近
接して組み込むことが可能となる。しかも、このように
して得られた形質転換体は、後に述べる遺伝子増幅の効
果をファクターＶＩＩＩＣの発現に非常に効果的に作用
させることが可能となり、その結果としてヒトファクタ
ーＶＩＩＩＣを高発現する形質転換体を得ることができ
る。
ーに対しＤＩｉＦＲ発現遺伝子含有プラスミドの量を少
なくする（例えばヒトファクター１０発現プラスミドの
量をＤＩ（ＰＲ発現プラスミドの５０分の１量とする〉
ことにより双方の遺伝子が導入されたＣＨＯ細胞を選択
・分離できる可能性がさらに高くなる。さらに好ましく
は、ヒトファクター１０発現ベクターにあらかじめＤＨ
ＰＲ遺伝子を組み込むことでヒトファクターＶＩＩＩＣ
−ＤＨＦＲ共発現ベクターとし、これを宿主細胞に組み
込めば、ヒトファクター１０発現遺伝子とＤＩＩＰＲ遺
伝子とを同時に効率よく宿主細胞の染色体遺伝子上に近
接して組み込むことが可能となる。しかも、このように
して得られた形質転換体は、後に述べる遺伝子増幅の効
果をファクターＶＩＩＩＣの発現に非常に効果的に作用
させることが可能となり、その結果としてヒトファクタ
ーＶＩＩＩＣを高発現する形質転換体を得ることができ
る。
また、上記のＤＩＩＰＲ等の遺伝子増幅遺伝子を用いた
場合には、適当な遺伝子増幅条件下、例えばＤＨＦＲ遺
伝子の場合にはメトトレキセート存在下で培養すること
により、ＤＩＩＦＲ遺伝子と同時に形質転換体に組み込
まれたファクターＶＩＩＩＣ遺伝子も増幅することがで
きる。その結果、細胞あたりのファクターＶＩＩＩＣ産
生量が高くなり、大量のヒトファクターＶＩＩＩＣを培
養液中に産生させることが可能となる。
場合には、適当な遺伝子増幅条件下、例えばＤＨＦＲ遺
伝子の場合にはメトトレキセート存在下で培養すること
により、ＤＩＩＦＲ遺伝子と同時に形質転換体に組み込
まれたファクターＶＩＩＩＣ遺伝子も増幅することがで
きる。その結果、細胞あたりのファクターＶＩＩＩＣ産
生量が高くなり、大量のヒトファクターＶＩＩＩＣを培
養液中に産生させることが可能となる。
本発明においては、さらにヒトファクターＶＩＩＩＣ発
現形質転喚細胞を無血清培地を用いて培養することも可
能であり、通常の血清培地を用いた場合と同様にヒトフ
ァクターＶＩＩＩＣを産生することができる。
現形質転喚細胞を無血清培地を用いて培養することも可
能であり、通常の血清培地を用いた場合と同様にヒトフ
ァクターＶＩＩＩＣを産生することができる。
また、形質転換体の培養に際しては、各種の添加剤等を
培養中に添加することにより、形質転換体によるヒトフ
ァクターＶＩＩＩＣの生産効率を、大きく向上させるこ
とが可能である。このような添加剤としては、ア！レブ
ミンや〕オンビルプラントファクター（ヒト血液成分の
ひとつ）等が最も好ましい生体由来の蛋白因子として挙
げられる。さらに、その他の添加剤として、ポリエチレ
ングリコール、亜セレン酸ナトリウム並びにシクロデキ
ストリン、蛋白分解酵素阻止因子であるε−アミノカプ
ロン酸、アプロチニン並びにＰＭＳＦ（フェニルメタン
スルホニルフルオリド）等がその好ましい例として挙げ
られる。
培養中に添加することにより、形質転換体によるヒトフ
ァクターＶＩＩＩＣの生産効率を、大きく向上させるこ
とが可能である。このような添加剤としては、ア！レブ
ミンや〕オンビルプラントファクター（ヒト血液成分の
ひとつ）等が最も好ましい生体由来の蛋白因子として挙
げられる。さらに、その他の添加剤として、ポリエチレ
ングリコール、亜セレン酸ナトリウム並びにシクロデキ
ストリン、蛋白分解酵素阻止因子であるε−アミノカプ
ロン酸、アプロチニン並びにＰＭＳＦ（フェニルメタン
スルホニルフルオリド）等がその好ましい例として挙げ
られる。
培養液中に生成蓄積したヒトファクターＶＩＩＩＣ蛋白
質は、細胞を除去したのち、培養液をそのまま濃縮して
、それ自体公知の分離方法を適当に組み合わせて、培養
上清より目的蛋白質を分離精製することができる。
質は、細胞を除去したのち、培養液をそのまま濃縮して
、それ自体公知の分離方法を適当に組み合わせて、培養
上清より目的蛋白質を分離精製することができる。
これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱
法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、
ゲル濾過法および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン
交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法
、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和
性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーな
どの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の
等電点の差を利用する方法等が挙げられる。
法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、
ゲル濾過法および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン
交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法
、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和
性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーな
どの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の
等電点の差を利用する方法等が挙げられる。
ここで得られるヒトファクターＶＩＩＩＣ蛋白質含有溶
液は、必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすること
ができる。凍結乾燥に際しては、例えばソルビトール、
マンニトール、デキストロース、アミノ酸、マルトース
、グリセロール、ヒト血清アルブミン（Ｈ８Ａ）などの
安定剤を加えることができる。
液は、必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすること
ができる。凍結乾燥に際しては、例えばソルビトール、
マンニトール、デキストロース、アミノ酸、マルトース
、グリセロール、ヒト血清アルブミン（Ｈ８Ａ）などの
安定剤を加えることができる。
このように本発明に従えば、これまで高発現が非常に難
しかった遺伝子組換えによるファクターＶＩＩＩＣの生
産において、その産生効率を飛躍的に上げることが可能
となる０本発明のニワトリのβ−アクチンプロモーター
を用いたファクターＶＩＩＩＣの製造方法は、これまで
に知られている最も強力なプロモーターのひとつとして
知られる５Ｖ４Ｇ初期プロモーターを用いた発現系に比
較して、少なくとも５〜１０倍の高い効率でファクター
ＶＩＩＩＣを生産する技術を提供するものである。高発
現が難しいとされているファクターＶＩＩＩＣの発現に
おいて、このようにニワトリのβ−アクチンプロモータ
ーが極めて有効であるということは本発明者らにより初
めて明らかにされたものである。
しかった遺伝子組換えによるファクターＶＩＩＩＣの生
産において、その産生効率を飛躍的に上げることが可能
となる０本発明のニワトリのβ−アクチンプロモーター
を用いたファクターＶＩＩＩＣの製造方法は、これまで
に知られている最も強力なプロモーターのひとつとして
知られる５Ｖ４Ｇ初期プロモーターを用いた発現系に比
較して、少なくとも５〜１０倍の高い効率でファクター
ＶＩＩＩＣを生産する技術を提供するものである。高発
現が難しいとされているファクターＶＩＩＩＣの発現に
おいて、このようにニワトリのβ−アクチンプロモータ
ーが極めて有効であるということは本発明者らにより初
めて明らかにされたものである。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。
発明はこれらに限定されるものではない。
ヒ −ＶＩＩＩＣ
−ス々′５ＣＲＥ
アデノウィルス−２の主要後期プロモーターを有する活
性化天然型ヒトファクター１０発現プラスミドｐＡｄ、
ＲＥ、 ｎｅｏ （第３図）を制限酵素Ｈｐａ Ｉで
消化し、リン酸化Ｘｈｏ Ｉリンカ−存在下Ｔ４ＤＮ＾
リガーゼにより連結環状化したｐＡｄ、 ＲＥ、 ３Ｘ
を構築した。
性化天然型ヒトファクター１０発現プラスミドｐＡｄ、
ＲＥ、 ｎｅｏ （第３図）を制限酵素Ｈｐａ Ｉで
消化し、リン酸化Ｘｈｏ Ｉリンカ−存在下Ｔ４ＤＮ＾
リガーゼにより連結環状化したｐＡｄ、 ＲＥ、 ３Ｘ
を構築した。
このｐＡｄ、 ＲＥ、 ３Ｘを、制限酵素Ｘｈｏｌテ消
化し、アガロースゲル電気泳動によりファクターＶＩＩ
ＩＣｃＤＮＡを含む、約４．７Ｋｍ基対の断片を抽出し
な。
化し、アガロースゲル電気泳動によりファクターＶＩＩ
ＩＣｃＤＮＡを含む、約４．７Ｋｍ基対の断片を抽出し
な。
また、ニワトリβ−アクチンのプロモーターを有する発
現プラスミドｐｓＡｃ−２（第２図）を制限酵素Ｓａｌ
Ｉで消化した後、修生小腸由来アルカリホスファター
ゼの作用により脱リン酸した。
現プラスミドｐｓＡｃ−２（第２図）を制限酵素Ｓａｌ
Ｉで消化した後、修生小腸由来アルカリホスファター
ゼの作用により脱リン酸した。
これを前述のファクターＶＩＩＩＣｃＤＮ＾フラグメン
トとＴ４ＤＮ＾リガーゼにより連結環状化することによ
り、活性化天然型ヒトファクター１０発現プラスミドｐ
ｓＡｃ、 Ｒｌｉを構築した。 （第４図）ファルコン
社組織培養６穴プレートにＣ０８−１細胞を各穴２ＸＩ
Ｏ’個の細胞数となるようまき、ダルベツコ変法イーグ
ル培地＜ ＩＯＫ牛脂児血清を含む）３−中、５’ＸＣ
（ｈ存在下３７℃にて一晩培養した。
トとＴ４ＤＮ＾リガーゼにより連結環状化することによ
り、活性化天然型ヒトファクター１０発現プラスミドｐ
ｓＡｃ、 Ｒｌｉを構築した。 （第４図）ファルコン
社組織培養６穴プレートにＣ０８−１細胞を各穴２ＸＩ
Ｏ’個の細胞数となるようまき、ダルベツコ変法イーグ
ル培地＜ ＩＯＫ牛脂児血清を含む）３−中、５’ＸＣ
（ｈ存在下３７℃にて一晩培養した。
翌日、このＣＯ８細胞を活性化天然型ヒトファクター１
０発現プラスミドｐｓＡｃ、 Ｒ１！でＤｌｌ：ＡＥ−
デキストラン法により形質転換した。
０発現プラスミドｐｓＡｃ、 Ｒ１！でＤｌｌ：ＡＥ−
デキストラン法により形質転換した。
ファルマシア社製トランスフェクションキット（Ｃｅｌ
ｌ Ｐｈｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｌｏｎ ）［ｉｔ
＃１７−０５９５−０１）のＤＥＡＲ−デキストラン
２Ｂ／−溶液（０，９％ ＮａＣ１） ５０Ｊを０．０
５Ｍ ）−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて２倍に希
釈した。これにｐＳＡｃ、ＲＥを２μり含む０．０５１
トリス塩ＭＭ街液（ｐＨ７，５） １００Δを加えた
。
ｌ Ｐｈｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｌｏｎ ）［ｉｔ
＃１７−０５９５−０１）のＤＥＡＲ−デキストラン
２Ｂ／−溶液（０，９％ ＮａＣ１） ５０Ｊを０．０
５Ｍ ）−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて２倍に希
釈した。これにｐＳＡｃ、ＲＥを２μり含む０．０５１
トリス塩ＭＭ街液（ｐＨ７，５） １００Δを加えた
。
細胞をＰＨ１（−）溶液で２回洗浄した後、上記ＤＮＡ
とＤＩｔＡＨ−デキストラン混合液２００−を適下した
。室温で１５分間放置した後、溶液を細胞から除去し、
０．０５Ｍトリス塩酸！！ｉＩ液（ＰＦ［７，５＞で２
回洗浄し、ダルベツコ変法イーグルＭ１ｉＭ培地（１０
％牛脂児血清を含む）３−を添加し、ＣＯ２インキュベ
ータ中培養した。尚、対照としてアデノウィルス２主後
期プロモーターを持つ活性化天然型ヒトファクター１０
発現プラスミドＰＡｄ、 ＲＥ、 ｎｅｏについて同様
の方法によりＣｕＯＤＧ４４細胞を形質転換した。
とＤＩｔＡＨ−デキストラン混合液２００−を適下した
。室温で１５分間放置した後、溶液を細胞から除去し、
０．０５Ｍトリス塩酸！！ｉＩ液（ＰＦ［７，５＞で２
回洗浄し、ダルベツコ変法イーグルＭ１ｉＭ培地（１０
％牛脂児血清を含む）３−を添加し、ＣＯ２インキュベ
ータ中培養した。尚、対照としてアデノウィルス２主後
期プロモーターを持つ活性化天然型ヒトファクター１０
発現プラスミドＰＡｄ、 ＲＥ、 ｎｅｏについて同様
の方法によりＣｕＯＤＧ４４細胞を形質転換した。
形質転換後５日目、８日目の培養土清中のファクターＶ
ＩＩＩＣ活性をカビ社コアテストキットにより測定した
。結果を表１に示す。
ＩＩＩＣ活性をカビ社コアテストキットにより測定した
。結果を表１に示す。
表 １
ボアテストキット活性（ｍＵ／■１） ５８後
８日後ｐｓＡｃ、Ｒ１ｉ
１４ ４５ｐＡＤ、ＲＥ、ｎ
ｅｏ ３
５チヤイニーズ・ハムスター卵巣（ＣｒｌＯ）細胞
のジしドロ葉酸レダクターゼ欠損株（ＤＩＩＰＲ−株）
、ＤＧ４４（１’ｒｏ、 Ｎ、Ａ、Ｓ、 ＵＳＡ ７７
、４２１６−４２２０．１９８０＞をファルコン細胞培
養６穴プレートに２Ｘ１０５個／穴の細胞数となるよう
にまき、１０％牛脂児血清を含むＨＥＭアルファ培地（
ヌクレオシドを含む）３−中一晩培養した。
８日後ｐｓＡｃ、Ｒ１ｉ
１４ ４５ｐＡＤ、ＲＥ、ｎ
ｅｏ ３
５チヤイニーズ・ハムスター卵巣（ＣｒｌＯ）細胞
のジしドロ葉酸レダクターゼ欠損株（ＤＩＩＰＲ−株）
、ＤＧ４４（１’ｒｏ、 Ｎ、Ａ、Ｓ、 ＵＳＡ ７７
、４２１６−４２２０．１９８０＞をファルコン細胞培
養６穴プレートに２Ｘ１０５個／穴の細胞数となるよう
にまき、１０％牛脂児血清を含むＨＥＭアルファ培地（
ヌクレオシドを含む）３−中一晩培養した。
使用する活性化天然型ヒトファクター１０発現プラスミ
ドｐｓＡｃ、 ＲＥは制限酵素Ｐｖｕ Ｉで、ジヒドロ
葉酸レダクターゼ（ＤＩＩＦＲ）発現プラスミドｐＳｖ
２−ｄｈｆｒ （第５図）は、制限酵素Ｐｖｕ Ｉで消
化することによりリニアーとした。
ドｐｓＡｃ、 ＲＥは制限酵素Ｐｖｕ Ｉで、ジヒドロ
葉酸レダクターゼ（ＤＩＩＦＲ）発現プラスミドｐＳｖ
２−ｄｈｆｒ （第５図）は、制限酵素Ｐｖｕ Ｉで消
化することによりリニアーとした。
この活性化天然型ヒトファクター１０発現プラスミドと
ＤＩ（ＦＲ発現プラスミドとにより ＣＩ（Ｏ細胞ＤＧ
４４をリン酸カルシウム法を用い形質転換した。
ＤＩ（ＦＲ発現プラスミドとにより ＣＩ（Ｏ細胞ＤＧ
４４をリン酸カルシウム法を用い形質転換した。
前記のリニアーとしたｐｓＡｃ、 ＲＥ及びｐＡｄ、
ＲＥ、 ｎｅ。
ＲＥ、 ｎｅ。
１０μ９をｐｓＶ２−ｄｈｆｒ ２００ｎｇと共に０．
２５Ｍ ＣａＣ１ｚ １００＋ｎＱ中でキャリアＤＮＡ
（ここでは修生胸Ｉｌｌ ＤＮＡを用いた）１０μ９
ト混合し、これ４ｍＩＩＥＰＥＳｖｉ街生理食塩水（２
８０ｍＭ ＮａＣ１，１，５ｍＭ ＮａＪＰＯ４１２Ｈ
２０，５０ｄ ＨＥＰＥＳ−ｐｉ！７．１）１００Δを
滴下、攪拌し、生じたＤＮＡ・リン酸カルシウム複合体
を、前記Ｃｌｌ０ ＤＧ４４培養プレートへ滴下するこ
とによりこれを形質転換した。また、対照として実施例
２にあげたｐＡｄ、 Ｒｌｉ、 ｎｅｏを制限酵素Ｐｖ
ｕ Ｉで消化しリニアーとし、ｐｓＡｃ、 ＲＥと同様
の方法によりｐｓＶ２−ｄｈｆｒと共にＣＩ（Ｏ細胞を
形質転換した。
２５Ｍ ＣａＣ１ｚ １００＋ｎＱ中でキャリアＤＮＡ
（ここでは修生胸Ｉｌｌ ＤＮＡを用いた）１０μ９
ト混合し、これ４ｍＩＩＥＰＥＳｖｉ街生理食塩水（２
８０ｍＭ ＮａＣ１，１，５ｍＭ ＮａＪＰＯ４１２Ｈ
２０，５０ｄ ＨＥＰＥＳ−ｐｉ！７．１）１００Δを
滴下、攪拌し、生じたＤＮＡ・リン酸カルシウム複合体
を、前記Ｃｌｌ０ ＤＧ４４培養プレートへ滴下するこ
とによりこれを形質転換した。また、対照として実施例
２にあげたｐＡｄ、 Ｒｌｉ、 ｎｅｏを制限酵素Ｐｖ
ｕ Ｉで消化しリニアーとし、ｐｓＡｃ、 ＲＥと同様
の方法によりｐｓＶ２−ｄｈｆｒと共にＣＩ（Ｏ細胞を
形質転換した。
１５時間培養の後、透析した１０％牛脂児血清を含む、
ヌクレオシド不含ＭＥＮアルファ培地３−と交換し、そ
の後３〜４日毎に培地を交換しながら培養を続けるとｐ
ｓＶ２−ｄｈｆｒによりＤＩ（ＰＲ（＋）となった細胞
のみが生存する様になった。形質転換より３週間後、培
地交換して４８目の培養上清をコアテストキットにより
ファクターＶＩＩＩＣ活性を確認した。結果を表２に示
す。
ヌクレオシド不含ＭＥＮアルファ培地３−と交換し、そ
の後３〜４日毎に培地を交換しながら培養を続けるとｐ
ｓＶ２−ｄｈｆｒによりＤＩ（ＰＲ（＋）となった細胞
のみが生存する様になった。形質転換より３週間後、培
地交換して４８目の培養上清をコアテストキットにより
ファクターＶＩＩＩＣ活性を確認した。結果を表２に示
す。
表 ２
コアテストキット活性（ｍＵ／＋ｗｌ）
４ ８後ｐｓＡｃ、ＲＥ
５０７ｐＡｄ、
ＲＥ、ｎｅｏ
１．４実施例３で得られた活性化天然型ファク
ターＶＩＩＩＣ産生ＣＨθ細胞、ＣＩＯ，ＡｌＢ１２を
、限界希釈法でクローニングした。
４ ８後ｐｓＡｃ、ＲＥ
５０７ｐＡｄ、
ＲＥ、ｎｅｏ
１．４実施例３で得られた活性化天然型ファク
ターＶＩＩＩＣ産生ＣＨθ細胞、ＣＩＯ，ＡｌＢ１２を
、限界希釈法でクローニングした。
クローニング後、細胞を組織培養２４穴プレートにまき
、ヌクレオシド不含ＨＥＭアルファ培地１１中に培養し
、コンフルエントとなった各クローンの細胞培養上清に
ついてコアテストキットにより活性を測定した。主なり
ローンについて結果を表３に示した。
、ヌクレオシド不含ＨＥＭアルファ培地１１中に培養し
、コンフルエントとなった各クローンの細胞培養上清に
ついてコアテストキットにより活性を測定した。主なり
ローンについて結果を表３に示した。
また、これらのクローンについて組織培養６穴プレート
（ファルコン社製）にまき、１０ｎＭメトトレキセート
（ＭＴＸ ）を含む１０％透析済ウシつ児血清／ヌクレ
オシド不含ＨＥＭアルファ培地にて培養した。
（ファルコン社製）にまき、１０ｎＭメトトレキセート
（ＭＴＸ ）を含む１０％透析済ウシつ児血清／ヌクレ
オシド不含ＨＥＭアルファ培地にて培養した。
３〜４日おきに培地を交換しながら、培養を続け、２週
間後の培養上滑中のファクターＶＩＩＩＣ活性をコアテ
ストキットにて測定した（表３）。
間後の培養上滑中のファクターＶＩＩＩＣ活性をコアテ
ストキットにて測定した（表３）。
表 ３
株 クトニンク゛後の活性 ＭＴＸ１０ｎＭ添加
後ＡＲＥ４４−１ ２１０ ５０
０＾ＲＥ４４−３ ２６６ １１８０ＡＲＥ４
４−４ ３５２ １３００−ＶＩＩ
ＩＣごヒ ロ ニワトリβ−アクチンプロモーターを持つ発現プラスミ
ドｐｓＡｃ−２を制限酵素Ｂｉｘ旧で消化し、ｄＸＴＰ
存在下、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とした
。
後ＡＲＥ４４−１ ２１０ ５０
０＾ＲＥ４４−３ ２６６ １１８０ＡＲＥ４
４−４ ３５２ １３００−ＶＩＩ
ＩＣごヒ ロ ニワトリβ−アクチンプロモーターを持つ発現プラスミ
ドｐｓＡｃ−２を制限酵素Ｂｉｘ旧で消化し、ｄＸＴＰ
存在下、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とした
。
またジしドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）発現プラス
ミドｐｓＶ２−ｄｈｆｒを制限酵素Ｐｖｕ ＩＩ、Ｅｃ
ｏＲＩで消化し、同様に７４−ＤＮＡポリメラーゼによ
り平滑末端とした後、ＤＨＰＲ発現部位をコードしてい
る断片をアガロースゲル電気泳動により抽出した。
ミドｐｓＶ２−ｄｈｆｒを制限酵素Ｐｖｕ ＩＩ、Ｅｃ
ｏＲＩで消化し、同様に７４−ＤＮＡポリメラーゼによ
り平滑末端とした後、ＤＨＰＲ発現部位をコードしてい
る断片をアガロースゲル電気泳動により抽出した。
この断片を前述のｐｓＡｃ−２をＴ４ＤＮＡリガーゼに
より連結環状化し、プラスミドｐｓＡｃ、 ｄＭｒを構
築した。
より連結環状化し、プラスミドｐｓＡｃ、 ｄＭｒを構
築した。
ｐｓＡｃ、 ｄｈｆｒは実施例１に示した方法と同様に
制限酵素Ｓａｌ １で消化、脱リン酸化し、これに活性
化天然型ファクターＶＩＩＩＣｃＤＮ＾断片を導入し、
活性化天然型ファクターＶＩＩＩＣとＤＨＰＲとの共発
現プラスミドｐｓＡｃ、 ＲＥ、 ｄｈｆｒ （第６図
）を構築した。
制限酵素Ｓａｌ １で消化、脱リン酸化し、これに活性
化天然型ファクターＶＩＩＩＣｃＤＮ＾断片を導入し、
活性化天然型ファクターＶＩＩＩＣとＤＨＰＲとの共発
現プラスミドｐｓＡｃ、 ＲＥ、 ｄｈｆｒ （第６図
）を構築した。
株１０紘Ｕ換
実施例３と同様に６穴プレートにＣｌｌ０細胞ＤＧ４４
株を準備した。形質転換に使用する共発現プラスミドｐ
ｓＡｃ、 ＲＥ、 ｄｈｆｒは、予め制限酵素Ｐｖｕ
Ｉにて消化しリニアーとした。
株を準備した。形質転換に使用する共発現プラスミドｐ
ｓＡｃ、 ＲＥ、 ｄｈｆｒは、予め制限酵素Ｐｖｕ
Ｉにて消化しリニアーとした。
また、対照としてアデノウィルスプロモーターを持った
活性化天然型ファクターＶＩＩＩＣとＤＨＰＲの共発現
プラスミドｐＡｄ、 ＲＥ、 ｄｈｆｒを同様にＰｖｕ
Ｉ処理によりリニアーとして用いた。
活性化天然型ファクターＶＩＩＩＣとＤＨＰＲの共発現
プラスミドｐＡｄ、 ＲＥ、 ｄｈｆｒを同様にＰｖｕ
Ｉ処理によりリニアーとして用いた。
これらのプラスミドそれぞれ１０μ９を用いて前述同様
、リン酸カルシウム法でＣＨＯＤ０４４株を形質転換し
た。１６時間培養後、１０％透析済牛脂児血清を含むヌ
クレオシド不含ＨＥＭアルファ培地３ｍｌと交換し、３
〜４日毎に培地を交換し、形質転換後２週間径た後に、
カビ社コアテストキットにより培養上滑中のファクター
ＶＩＩＩＣ活性を測定した。その結果を表４に示す。
、リン酸カルシウム法でＣＨＯＤ０４４株を形質転換し
た。１６時間培養後、１０％透析済牛脂児血清を含むヌ
クレオシド不含ＨＥＭアルファ培地３ｍｌと交換し、３
〜４日毎に培地を交換し、形質転換後２週間径た後に、
カビ社コアテストキットにより培養上滑中のファクター
ＶＩＩＩＣ活性を測定した。その結果を表４に示す。
表 ４
プラスミド
ｐｓＡｃ、 ＲＥ、 ｄｈｆｒ
ｐＡｄ、 ＲＥ、 ｄｈｆ ｒ
７アククー■活性（ｄ／ｍｌ＞
アデノウィルス２に主要後期プロモーターを有する天然
型ヒトファクター１０発現プラスミドｐＨ，３１２（第
７図）を制限酵素Ｈｐａ Ｉで消化し、リン酸化Ｘｈｏ
Ｉリンカ−存在下Ｔ４ＤＮ＾リガーゼにより連結環状
化したプラスミドｐＨ，３１２，３Ｘを構築した。
型ヒトファクター１０発現プラスミドｐＨ，３１２（第
７図）を制限酵素Ｈｐａ Ｉで消化し、リン酸化Ｘｈｏ
Ｉリンカ−存在下Ｔ４ＤＮ＾リガーゼにより連結環状
化したプラスミドｐＨ，３１２，３Ｘを構築した。
こノｐＨ，３１２，３Ｘを制限酵素Ｘｈｏ１１？消化し
、アガロースゲル電気泳動によりファクターＶＩＩＩＣ
ｃＤＮＡ断片を含む約７．５Ｋｂｐの遺伝子断片を抽出
した。
、アガロースゲル電気泳動によりファクターＶＩＩＩＣ
ｃＤＮＡ断片を含む約７．５Ｋｂｐの遺伝子断片を抽出
した。
また、ニワトリのβ−アクチンプロモーターを有する発
現プラスミドｐｓＡｃ−２（第２図）を制限酵素５ａ１
１で消化した後、修生小腸由来アルカリフォスファター
ゼの作用により脱リン酸化した。
現プラスミドｐｓＡｃ−２（第２図）を制限酵素５ａ１
１で消化した後、修生小腸由来アルカリフォスファター
ゼの作用により脱リン酸化した。
これを前述のファクターＶＩＩＩＣｃＤＮＡフラグメン
トと、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼにより連結環状化すること
により、天然型ヒトファクター１０発現プラスミドｐｓ
Ａｃ、 １１を構築した（第８図）。
トと、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼにより連結環状化すること
により、天然型ヒトファクター１０発現プラスミドｐｓ
Ａｃ、 １１を構築した（第８図）。
天然型ヒトファクターＶＩＩＩＣのＣＯ８細胞による発
現について、実施例２で述べた活性化天然型ヒトファク
ターＶＩＩＩＣのＣＯ５細胞による発現と同様の方法に
従いニワトリβ−アクチンプロモーターを持つ天然型フ
ァクター１０発現プラスミドｐｓＡｃ、１１をＤＨＡｌ
ｔ−デキストラン法によりＣ０８−１細胞に形質導入し
た。
現について、実施例２で述べた活性化天然型ヒトファク
ターＶＩＩＩＣのＣＯ５細胞による発現と同様の方法に
従いニワトリβ−アクチンプロモーターを持つ天然型フ
ァクター１０発現プラスミドｐｓＡｃ、１１をＤＨＡｌ
ｔ−デキストラン法によりＣ０８−１細胞に形質導入し
た。
尚、対照として、アデノウィルス−２の主要後期プロモ
ーターを持つ天然型ヒトファクター１０発現プラスミド
ｐＨ，３１２についても同じ方法に従って細胞を形質
転換した。その結果を表５に示す。
ーターを持つ天然型ヒトファクター１０発現プラスミド
ｐＨ，３１２についても同じ方法に従って細胞を形質
転換した。その結果を表５に示す。
表 ５
７アククーＶＩＩＩＣ活性（鵬■／ｍｌ） ５日後
８８後ｐｓＡｃｌｌ ０．６
２ｐＨ，３１２００ −ＶＩＩＩＣ−ス 実施例３におけるＣＨＯ細胞の共形質転換の場合と同様
の方法により、天然型ヒトファクター１０発現プラスミ
ドｐｓＡｃ、１１とＤＩＩＦＲ発現プラスミドｐＳＶ２
−ｄｈｆｒにより共形質転換を行った。
８８後ｐｓＡｃｌｌ ０．６
２ｐＨ，３１２００ −ＶＩＩＩＣ−ス 実施例３におけるＣＨＯ細胞の共形質転換の場合と同様
の方法により、天然型ヒトファクター１０発現プラスミ
ドｐｓＡｃ、１１とＤＩＩＦＲ発現プラスミドｐＳＶ２
−ｄｈｆｒにより共形質転換を行った。
使用する天然型ヒトファクター１０発現プラスミドｐ！
１ｉＡｃ、１１およびＤ［ＩＦＲ発現プラスミドｐＳＶ
２−ｄｈｆｒは、おのおの制限酵素Ｐｖｕ Ｉで消化す
ることによりリニアー化した。
１ｉＡｃ、１１およびＤ［ＩＦＲ発現プラスミドｐＳＶ
２−ｄｈｆｒは、おのおの制限酵素Ｐｖｕ Ｉで消化す
ることによりリニアー化した。
対照としてアデノウィルス２の主要後期プロモーターを
持つ天然型ファクターＶＩＩＩＣ発現プラスミドｐＨ，
３１２を制限酵素Ｐｖｕ Ｉで消化しリニアとしたもの
を用いた。
持つ天然型ファクターＶＩＩＩＣ発現プラスミドｐＨ，
３１２を制限酵素Ｐｖｕ Ｉで消化しリニアとしたもの
を用いた。
このリニアーとしたｐｓＡｃ、 １１またはｐＨ，３１
２１０μ９とｐｓＶ２−ｄｈｆｒ ２００ｎｇとを、実
施例３同様に準備したＣＩＯ細胞ＤＧ４４株にリン酸カ
ルシウム法により導入した。
２１０μ９とｐｓＶ２−ｄｈｆｒ ２００ｎｇとを、実
施例３同様に準備したＣＩＯ細胞ＤＧ４４株にリン酸カ
ルシウム法により導入した。
形質転換から３週間後、さらに培地交換して４日日の培
養上清についてコアテストキットによりファクターＶＩ
ＩＩＣ活性を確認した。結果を表６に示した。
養上清についてコアテストキットによりファクターＶＩ
ＩＩＣ活性を確認した。結果を表６に示した。
表 ６
プラス ミ ド ボアテストキット活性
（ｍＵ／ｍ１）ｐｓＡｃ、１１
５０ｐＨ，３１２０ プレート（ファルコン社製）にまき、１０ｎＭメトトレ
キセー）（ＭＴＸ）を含む１０％透析済牛脂児血清−ヌ
クレオシド不含ＭＥＮアルファ培地にて培養した。
（ｍＵ／ｍ１）ｐｓＡｃ、１１
５０ｐＨ，３１２０ プレート（ファルコン社製）にまき、１０ｎＭメトトレ
キセー）（ＭＴＸ）を含む１０％透析済牛脂児血清−ヌ
クレオシド不含ＭＥＮアルファ培地にて培養した。
３〜４日毎に培地交換を行うことにより培養を続け、３
週後の培養上清中のファクターＶＩＩＩＣ活性をコアテ
ストキットにより測定した（表７）。
週後の培養上清中のファクターＶＩＩＩＣ活性をコアテ
ストキットにより測定した（表７）。
表 ７
株 クトニンク゛後の活性 ＭＴＸ１０ｎＭ添加
後実施例４で得られた天然型ファクターＶＩＩＩＣ産生
Ｃｌｌ０細胞、Ｃｌｌ０． ＡＦ４４を既知の方法によ
り限界希釈法でクローニングした０、クローニング後、
細胞を組織培養２４穴プレートにまき、ヌクレオシド不
合ＭＥ間アルファ培地１１中で培養し、コンフルエント
となった各クローンの細胞培養上清についてコアテスト
キットによりファクターＶＩＩＩＣ活性を測定した。
後実施例４で得られた天然型ファクターＶＩＩＩＣ産生
Ｃｌｌ０細胞、Ｃｌｌ０． ＡＦ４４を既知の方法によ
り限界希釈法でクローニングした０、クローニング後、
細胞を組織培養２４穴プレートにまき、ヌクレオシド不
合ＭＥ間アルファ培地１１中で培養し、コンフルエント
となった各クローンの細胞培養上清についてコアテスト
キットによりファクターＶＩＩＩＣ活性を測定した。
主なりローンについて結果を表７に示した。
また、これらのクローンについて組織培養６穴実施例４
に挙げた活性化天然型ファクターＶＩＩＩＣ産生Ｃ［Ｉ
Ｏ細胞ＡＲＩ！、 ４４のクローン３およびクローン４
について、６穴組織培養プレートに５ｘｌＯ’ｃｅｌｌ
ｓ／穴となるよう播種し、ＭＴＸ１０ｎＭ存在下、１１
Ｂ透析済牛脂児血清−ヌクレオシド不合ＨＥＭアルファ
培地３１にて３〜４日培養した。この後、培地を１ｘヒ
ト血清アルブミンを含む無血清培地（味の素（株）製、
ＡＳＦｍｅｄｉｕｓ＋１０４）に交換し、２４時間培養
後、培養上清のファクターＶＩＩＩＣ活性をコアテスト
キットにより測定した（表８）。
に挙げた活性化天然型ファクターＶＩＩＩＣ産生Ｃ［Ｉ
Ｏ細胞ＡＲＩ！、 ４４のクローン３およびクローン４
について、６穴組織培養プレートに５ｘｌＯ’ｃｅｌｌ
ｓ／穴となるよう播種し、ＭＴＸ１０ｎＭ存在下、１１
Ｂ透析済牛脂児血清−ヌクレオシド不合ＨＥＭアルファ
培地３１にて３〜４日培養した。この後、培地を１ｘヒ
ト血清アルブミンを含む無血清培地（味の素（株）製、
ＡＳＦｍｅｄｉｕｓ＋１０４）に交換し、２４時間培養
後、培養上清のファクターＶＩＩＩＣ活性をコアテスト
キットにより測定した（表８）。
表 ８
株 ｌＯχＦＣ３−ＭＵＭアルファ
ＡＳＦ１０４＋１にＨ３ＡＡＲＥ４４−３
５００ ２４００ＡＲＥＡ
４−４ ６００ ４
９００第４図は、活性化天然型ヒトファクター１０発現
プラスミドｐｓＡｃ、 ＲＦｉの構造を示す。
ＡＳＦ１０４＋１にＨ３ＡＡＲＥ４４−３
５００ ２４００ＡＲＥＡ
４−４ ６００ ４
９００第４図は、活性化天然型ヒトファクター１０発現
プラスミドｐｓＡｃ、 ＲＦｉの構造を示す。
第５図は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＩ（ＦＲ）発
現プラスミドｐｓＶ２−ｄｈｆｒの構造を示す。
現プラスミドｐｓＶ２−ｄｈｆｒの構造を示す。
第６図は、活性化天然型ファクターＶＩＩＩＣとＤＨＦ
Ｒとの共発現プラスミドｐｓＡｃ、 ＲＥ、 ｄｈｆｒ
の構造を示す。
Ｒとの共発現プラスミドｐｓＡｃ、 ＲＥ、 ｄｈｆｒ
の構造を示す。
第７図は、天然型ファクター１０発現プラスミドｐＨ，
３１２の構造を示す。
３１２の構造を示す。
第８図は、天然型ヒトファクター１６発現プラスミドｐ
ｓＡｃ、 １１の構造を示す。
ｓＡｃ、 １１の構造を示す。
第１図は、ニワトリのβ−アクチンプロモーターの塩基
配列を示す。 第２図は、プラスミドｐｓＡｃ−２の構造を示す。 第３図は、活性化天然型ヒトファクター１０発現プラス
ミドｐＡｄ、 ＲＥ、 ｎｅｏの構造を示す。 第 図 その１ ＴＣＧＡＧ ＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡ ＣＧＴＴＣＴＧＣ
ＴＴ ＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣ
ＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧ ＴＡＴＴＴＡ
ＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴ ＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡ
ＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧ ＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧ ＧＣＧＧＧＧＣ
ＧＧＧ ＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧ
ＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧ ＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣ
ＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴ
Ｔ ＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧ ＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
ＣＧＧＣＧＧＣＧ ＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡ ＡＡＧＣＧ
ＡＡＧＣＧ ＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＧＣ
Ｔ ＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴ ＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣ
ＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣ
ＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡ ＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴ
ＡＣＴＣＣＣＡＣＡ ＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧ ＣＧＧＧ
ＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡ
Ｔ ＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧ ＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧ Ｇ
ＣＴＣＧＴＴＴＣＴ第 図 その３ ＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧ ＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧ ＣＴＣ
ＧＧＧＧＧＡＧ ＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧ
ＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴ ＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧ
ＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴ
ＧＧＴＡ ＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧ ＡＧＧＧＣＧＣＡＧ
ＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴｒ ＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＧ
ＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧ
ＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧ
ＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡ
ＧＧ ＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧ ＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣ
ＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧ ＴＣＣＣＣ
ＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧ
ＣＣＧＣＡＧＧＧＧＧ ＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴ ＴＣ
ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧ ＣＧＧＧＧＴ
ＴＣＧＧ ＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴ ＧＴＧＡＣＣＧＧＣ
ＧＧＧＧＴＴｒＡＴＡＴ ＣＴＴＣＣＣＴＴＣＴ ＣＴ
ＧＴＴＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣ（ＡＴＧ）第 図 その２ ＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧ ＣＣＴＴ
ＡＡＡＧＧＧ ＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧ
ＴＧ ＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧ ＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧ
ＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧ ＣＧＴＧ
ＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧ ＧＣＣＣＧＣＧＣ
ＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴ ＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧ Ｃ
ＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣ
ＴＣＣＧ ＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧ ＡＧＧＧＧＡＧＣＧ
ＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧ
ＣＧＧＧＧＧ ＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧ ＧＧＡＡＣＡＡ
ＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧ ＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧ
ＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧ ＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧ
ＧＣＧＣＧＧ ＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴ ＧＴＡＡＣＣＣ
ＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧ Ｔ
ＴＧＣＴＧＡＧＣＡ ＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴ ＴＣＧＧ
ＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＣ−ＧＧＧＧＣＧＴＧ
ＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧ ＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧ
ＧＧＧＧＧＴＧＧ ＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧ ＧＧＧＴＧ
ＣＣＧＧＧ ＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧ第 図 Ｖ４０ ポリアゾニレ−ジョン部位 第３図 ＳＶ４０ ポリ７デニレーシ冨ン部位 第 図 ＼Ｓ 第４図 ６−−−−−−−−？ Ｅ 第 図 第７図 第８図
配列を示す。 第２図は、プラスミドｐｓＡｃ−２の構造を示す。 第３図は、活性化天然型ヒトファクター１０発現プラス
ミドｐＡｄ、 ＲＥ、 ｎｅｏの構造を示す。 第 図 その１ ＴＣＧＡＧ ＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡ ＣＧＴＴＣＴＧＣ
ＴＴ ＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣ
ＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧ ＴＡＴＴＴＡ
ＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴ ＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡ
ＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧ ＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧ ＧＣＧＧＧＧＣ
ＧＧＧ ＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧ
ＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧ ＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣ
ＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴ
Ｔ ＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧ ＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
ＣＧＧＣＧＧＣＧ ＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡ ＡＡＧＣＧ
ＡＡＧＣＧ ＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＧＣ
Ｔ ＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴ ＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣ
ＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣ
ＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡ ＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴ
ＡＣＴＣＣＣＡＣＡ ＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧ ＣＧＧＧ
ＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡ
Ｔ ＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧ ＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧ Ｇ
ＣＴＣＧＴＴＴＣＴ第 図 その３ ＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧ ＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧ ＣＴＣ
ＧＧＧＧＧＡＧ ＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧ
ＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴ ＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧ
ＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴ
ＧＧＴＡ ＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧ ＡＧＧＧＣＧＣＡＧ
ＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴｒ ＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＧ
ＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧ
ＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧ
ＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡ
ＧＧ ＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧ ＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣ
ＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧ ＴＣＣＣＣ
ＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧ
ＣＣＧＣＡＧＧＧＧＧ ＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴ ＴＣ
ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧ ＣＧＧＧＧＴ
ＴＣＧＧ ＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴ ＧＴＧＡＣＣＧＧＣ
ＧＧＧＧＴＴｒＡＴＡＴ ＣＴＴＣＣＣＴＴＣＴ ＣＴ
ＧＴＴＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣ（ＡＴＧ）第 図 その２ ＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧ ＣＣＴＴ
ＡＡＡＧＧＧ ＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧ
ＴＧ ＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧ ＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧ
ＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧ ＣＧＴＧ
ＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧ ＧＣＣＣＧＣＧＣ
ＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴ ＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧ Ｃ
ＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣ
ＴＣＣＧ ＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧ ＡＧＧＧＧＡＧＣＧ
ＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧ
ＣＧＧＧＧＧ ＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧ ＧＧＡＡＣＡＡ
ＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧ ＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧ
ＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧ ＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧ
ＧＣＧＣＧＧ ＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴ ＧＴＡＡＣＣＣ
ＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧ Ｔ
ＴＧＣＴＧＡＧＣＡ ＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴ ＴＣＧＧ
ＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＣ−ＧＧＧＧＣＧＴＧ
ＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧ ＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧ
ＧＧＧＧＧＴＧＧ ＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧ ＧＧＧＴＧ
ＣＣＧＧＧ ＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧ第 図 Ｖ４０ ポリアゾニレ−ジョン部位 第３図 ＳＶ４０ ポリ７デニレーシ冨ン部位 第 図 ＼Ｓ 第４図 ６−−−−−−−−？ Ｅ 第 図 第７図 第８図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）ニワトリのβ−アクチンプロモーターの下流にヒ
トファクターVIIIＣをコードする遺伝子を組み込んだ発
現ベクターにより形質転換された動物細胞からなる形質
転換体を培養し、培養物中に、ヒトファクターVIIIＣを
生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするヒト
ファクターVIIIＣの製造方法。 （２）ニワトリのβ−アクチンプロモーターが、第１図
に示された塩基配列の全部、またはプロモーター活性を
保持している一部の遺伝子である前記第（１）項記載の
製造方法。（３）ニワトリのβ−アクチンプロモーター
の３′端（下流）が、少なくとも本来のβ−アクチン構
造遺伝子翻訳開始コドン（ＡＴＧ）より５塩基上流のシ
トシン（Ｃ）までの遺伝子を有する前記第（２）項記載
の製造方法。 （４）発現ベクターがさらに少なくとも１個の複製開始
点（ｏｒｉ）を有する前記第（１）項の製造方法。 （５）複製開始点がＳＶ４０由来のものである前記第（
４）項の製造方法。 （６）ヒトファクターVIIIＣをコードする遺伝子にシグ
ナルペプチド遺伝子が結合している前記第（１）項記載
の製造方法。 （７）ヒトファクターVIIIＣが、ヒト活性化天然型ファ
クターVIIIＣである前記第（１）項記載の製造方法。 （８）ヒト活性化天然型ファクターVIIIＣが、ヒトファ
クターVIIIＣのアミノ末端よりなるＨ鎖の７４０位のア
ルギニンと、ヒト天然型ファクターVIIIＣのカルボキシ
末端よりなるＬ鎖の１６４９位のグルタミン酸が、直接
結合したものより成る蛋白質である前記第（７）項の製
造方法。 （９）発現ベクターが、さらに遺伝子増幅遺伝子を有し
、さらに形質転換体の培養を遺伝子増幅条件下に行う前
記第（１）項の製造方法。 （１０）遺伝子増幅遺伝子が、ジヒドロ葉酸レダクター
ゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子である前記第（９）項の製造方法
。 （１１）ニワトリのβ−アクチンプロモーターを有し、
ニワトリのβ−アクチンプロモーターの下流にヒトファ
クターVIIIＣをコードする遺伝子を組み込んだことを特
徴とするファクターVIIIＣ発現プラスミド。 （１１）ニワトリのβ−アクチンプロモーターが、第１
図に示された塩基配列の全部、またはプロモーター活性
を保持している一部の遺伝子である前記第（１０）項記
載のプラスミド。 （１２）ニワトリのβ−アクチンプロモーターの３′端
が、少なくとも本来のβ−アクチン構造遺伝子翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）より５塩基上流のシトシン（Ｃ）まで
の遺伝子を有する前記第（１１）項記載のプラスミド。 （１３）前記第（１０）項記載のプラスミドを用いて形
質転換された動物細胞であることを特徴とするファクタ
ーVIIIＣ産生形質転換体。 （１４）動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞である前記第（１３）項記載の形質転換体。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63157570A JPH025890A (ja) | 1988-06-24 | 1988-06-24 | ニワトリのβ−アクチンプロモーターを用いたヒトファクター８Ｃの製造方法 |
| CA000603466A CA1335882C (en) | 1988-06-24 | 1989-06-21 | Process for preparing human factor viii:c employing expression vector containing chick _ -actin promoter |
| NZ229662A NZ229662A (en) | 1988-06-24 | 1989-06-22 | Production of recombinant human factor viiic |
| EP89111482A EP0351586B1 (en) | 1988-06-24 | 1989-06-23 | Plasmids containing a chicken beta-actin promoter and a human factor VIII:C gene, transformants and processes for preparing human factor VIII:C |
| DE68920651T DE68920651D1 (de) | 1988-06-24 | 1989-06-23 | Hühner-beta-Actin-Promoter und menschliches Faktor VIII-C-Gen enthaltende Plasmide, Transformanten und Verfahren zur Herstellung des menschlichen Faktors VIII-C. |
| AU36787/89A AU619562B2 (en) | 1988-06-24 | 1989-06-23 | Process for preparing human factor viii:c employing expression vector containing chick beta-actin promoter |
| AT89111482T ATE117374T1 (de) | 1988-06-24 | 1989-06-23 | Hühner-beta-actin-promoter und menschliches faktor viii-c-gen enthaltende plasmide, transformanten und verfahren zur herstellung des menschlichen faktors viii-c. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63157570A JPH025890A (ja) | 1988-06-24 | 1988-06-24 | ニワトリのβ−アクチンプロモーターを用いたヒトファクター８Ｃの製造方法 |
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Non-Patent Citations (1)
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| NUCLEIC ACIDS RESEARCH * |
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