JPH0258914B2 - - Google Patents
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- JPH0258914B2 JPH0258914B2 JP56194324A JP19432481A JPH0258914B2 JP H0258914 B2 JPH0258914 B2 JP H0258914B2 JP 56194324 A JP56194324 A JP 56194324A JP 19432481 A JP19432481 A JP 19432481A JP H0258914 B2 JPH0258914 B2 JP H0258914B2
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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Description
本発明はアリール アシルアミダーゼ酵素の生
産と、この酵素を生産しうる微生物に係る。 本文中で言及するアリール アシルアミダーゼ
酵素は、生化学国際連盟（酵素命名法1978年、ア
カデミツクプレス、ニユーヨーク、1979年）によ
つて、アニリド類のアニリン類と脂肪酸アニオン
への加水分解の触媒作用をする酵素として定義さ
れている。これらの酵素は生化学国際連盟
（IUB）によつて番号EC3.5.1.13を与えられてい
る。 アニリド類（Ｎ−アシルアニリン類）の酵素脱
アシル化は長い間哺乳動物組織中に存在すること
が判つていた。初期の研究は、兎から取り出した
肝臓と腎臓の抽出物によるアセトアニリドとフエ
ナセチンの加水分解並に、ひよこの腎臓の組織粉
末懸濁液によるアセチルスルフアニルアミドの急
速な脱アシル化を報告した。 類似の酵素反応が植物組織中で起ることが判明
した。例えばアリール アシルアミダーゼが稲植
物体から単離され、一方プロパニル（propanil）、
即ち３，４−ジクロロプロピオンアニリドがセイ
ヨウタンポポの根の抽出物によつて加水分解され
た。 微生物はそのような酵素のソースとしてそれ程
広範には研究されなかつた。微生物アミダーゼに
関する研究の大部分は、脂肪族基質、特にホルム
アミド（HynesとPatemanのJ.Gen.Microbiol.、
1970年、63巻、317頁）アセタミド（Jakobyと
FredericksのJ.Biol.Chem.、1964年、234巻、
1978頁）及びプロピオンアミド（KellyとClarke
のJ.Gen.Microbiol.、1962年、27巻、305頁）に
関するものであつた。プソイドモナス エアルギ
ノーサ（Pseudmonos aeruginosa）からの後者
のアミダーゼは短鎖脂肪族アミドの連鎖を加水分
解する。然しながらこの微生物を更に研究した結
果、この菌株の突然変異株がアミダーゼを生産
し、このアミダーゼはバクテリアにＮ−アシルア
ニリン基質を利用させることが判つた（Brown
とclarkeのJ.Gen.Microbiol.、1972年、70巻、
287頁）。 芳香族基質に特異な微出物アシルアミダーゼの
存在は比較的狭い範囲で研究された。そのような
報告の大部分は除草剤の変換に関する研究の結果
として示された。このようなアリール アシルア
ミダーゼはイソプロピルＮ−（３−クロロフエニ
ル）カーバメート上で生長させたプソイドモナス
ストリアタ（Pseudomonas striata）（Kearney、
J.Agric.Food Chem.、1965年、13巻、561頁）、
カルシル（Karsil）、即ちＮ−（３，４−ジクロロ
フエニル）−２−メチルペンタンアミド上で生長
させたペニシリウム（Penicillium）（Sharabiと
Bordeleau、App.Microbiol.、1969年、18巻、
369頁）、リニユロン（Linuron）、即ち３−（３，
４−ジクロロフエニル−１−メトキシ−１−メチ
ルユレア）上で生長させたバシラス スフアエリ
カス（Bacillus sphaericus）（Engelhardt等の
App.Microbiol.、1973年、26巻、709頁）、及び
アラクロール（Alachlor）、即ち２−クロロ−Ｎ
−（２，６−ジエチルフエニル）−Ｎ−メトキシメ
チル アセタミド上で生長させたカエトミウムグ
ロボサム（Chaetomium globosum）（Tiedje等
のJ.Agric.Food Chem.、1975年、23巻、77頁）
に属するものとして説明された。 Ｎ−アシルアニリン基質上での微生物の生長も
報告された。例えば、土壌から単離されたプソイ
ドモナス アシドボランス（Pseudomonas
acidovorans）の菌株は、フエナセチン（Ｎ−ア
セチル−４−エトキシアニリン）とアセトアニリ
ド上で生長することを示した（Alt等のJ.Gen.
Microbiol.、1975年、87巻、260頁）。同様に、プ
ソイドモナスストリアタ（Pseudomonas
striata）の培養はアセトアニリド上で生育した
（Hsiung等のBiochem.Biophys.Res.Commun.、
1975年、66巻、1225頁）。この場合、培養がアリ
ール アシルアミダーゼを生産することを示し
た。 本発明はアリール アシルアミダーゼ酵素を生
産する新規な方法を提供するものである。この方
法は新規なアリール アシルアミダーゼ産生微生
物を用いるのみならず、初めて高収率で大量に高
い活性を有するアリール アシルアミダーゼを生
産する。 本発明によれば、1980年10月８日にスコツトラ
ンド、アバーデーン（Aberdeen）のThe
National Collection of Industrial Bactevia
（NCIB）に寄託された菌株プソイドモナス フ
ルオレツセンス（Pseudomonas fluoresceus）
NCIB11615〔1981年11月19日に米国マリーランド
（Maryland）のThe American Type Cultuve
Collection（ATCC）に寄託されたプソイドモナ
スフルオレツセンス（Pseudomonas
fluoresceus）ATCC39005と同一である〕又はそ
れらのアリール アシルアミダーゼ生産突然変異
株又は変異株、もしくは1980年10月８日にスコツ
トランド、アバーデーンのNCIBに寄託されたプ
ソイドモナス プチダ（Pseudomonas putida）
NCIB11616〔1981年11月19日に米国マリーランド
のATCCに寄託されたプソイドモナス プチダ
（Pseudomonas putida）ATCC39004と同一であ
る〕又はそれらのアリール アシルアミダーゼ産
生突然変異株又は変異株の一つのバクテリアを培
地中で培養することからなるアリール アシルア
ミダーゼ酵素の生産方法が提供される。この培地
中では前記バクテリア菌株は、アリール アシル
アミダーゼを生産し得、且つアリール アシルア
ミダーゼ酵素含有物質を収集しうる。この酵素含
有物質は細胞物質、細胞上澄液又はこの両者であ
つてもよい。酵素含有物質が細胞物質である場合
は、この方法は、更にバクテリア菌株の細胞物質
を破砕しアリール アシルアミダーゼ酵素を放出
させるステツプからなつてもよい。それぞれの場
合に、この方法は更に、他の不必要な物質、例え
ば細胞砕片及び他の細胞構成蛋白質から酵素を分
離するステツプを含んでもよい。 培地は、本発明のバクテリア菌株にアリール
アシルアミダーゼ酵素を生産させるいかなる成分
を含有していてもよい。然しながら、この培地
は、酵素合成のための誘導物として作用する一種
以上のＮ−アシルアニリン（アニリド）を含有す
るのが好ましい。この一種以上のＮ−アシルアニ
リンは、例えば３−又は４−ヒドロキシアニリン
のＮ−アセチル誘導体、４−エトキシアニリン、
又は２−、３−又は４−メチルアニリンから選択
されうる。然しながら、本発明の好しい具体例に
於いては、この一種以上のＮ−アシルアニリンは
Ｎ−アセチルアニリン（アセトアニリド）であ
る。 この一種以上のＮ−アシルアニリンはペプト
ン、イースト水解物等の天然起源の栄養素源を含
有する複合培地、もしくは無機及び／又は単一の
有機栄養素源を含有する限定された塩類培地のい
ずれかの一部分を形成してもよい。 本発明の微生物の生長はバツチ又は連続培養に
於て生起する。バツチ培養に於いては、通常培地
は一種以上のＮ−アシルアニリンを約0.01〜0.25
％（重量／容量）、好ましくは約0.05〜0.15％
（重量／容量）含有する。連続培養に於ては、一
種以上のＮ−アシルアニリンのレベルを0.001〜
0.2％（重量／容量）のＮ−アシルアニリンに維
持するようにかかる割合で培地を加え且つ取り除
く。（これらの％値のすべてはバクテリアによつ
て利用されうるＮ−アシルアニリン量に関するも
のである）。 培養は好ましくは約10℃〜45℃の温度、更に好
ましくは約20℃〜30℃の温度、及び好ましくは約
６〜９のPH、更に好ましくは６〜7.5のPHで行わ
れる。培養は好気性又は嫌気性の条件下で行ない
うるけれども、好気性の条件は比較的多くの細胞
収量を与えるので好ましい。 細胞の破砕は超音波処理、ホモジニゼエシヨン
又は酵素による処理等の従来技術によつて行いう
る。本発明方法の一つの好ましい具体例に於いて
は、DNアーゼ（DNase）とRNアーゼ
（RNase）の存在下でのリゾチーム−EDTAを用
いる酵素処理によつて細胞を粉砕する。 次に、他の不必要な物質、例えば細胞砕片及び
存在する他の細胞構成蛋白質を酵素から分離する
には、従来の酵素単離技術及び酵素精製技術を使
用しうる。これらの分離は、酵素の数種の性質、
特に溶解度、分子の形状、分子の電荷、分子の大
きさ及び疎水性親和力を用いて行いうる。これら
の方法は、沈殿、詳しくは有機溶媒を用いうるけ
れども硫酸アンモニウムによる沈殿、デキストラ
ン、アガロース又はアガロース−ポリアクリルア
ミド上でのゲル濾過、例えばアルキルアガロース
又は好ましくはアリール アガロースマトリツク
ス上での疎水クロマトグラフイ、例えばDEAE架
橋デキストラン（DEAE cross−linked
dextrans）上でのイオン交換クロマトグラフイ、
超遠心分離、及び／又はヌクレオチド誘導マトリ
ツクス（nucleotide derivativised matrices）、
又はスルホン酸置換モノ−及びジ−クロロトリア
ジニル〔プロシオン（Procion）−商標〕染料上
でのアフイニテイクロマトグラフイを含みうる。
本発明方法の好ましい具体例では、遠心分離ステ
ツプによつて酵素は細胞砕片から分離される。次
の段階は、好ましくは硫酸アンモニウムを用いる
沈殿ステツプであり、これに続いて、好ましくは
フエニル置換架橋アガロース（phenyl
substituted cross−linked agarose）〔フエニル
セフアロース（phenyl sepharose）−商標〕マト
リツクス上での疎水クロマトグラフイからなるク
ロマトグラフイステツプ及び好ましくはDEAE架
橋デキストラン上でのイオン交換クロマトグラフ
イである。疎水クロマトグラフイ及びイオン交換
クロマトグラフイはいかなる順序で行つてもよく
又所望の酵素の純度を生成させるに必要な多くの
回数実施してもよい。 イオン交換、DEAE架橋デキストランクロマト
グラフイは、5.5〜8.0のPHで10〜1000mMの間で
イオン強度の増加勾配、好ましくは約7.6のPHで
約50mM〜400mMの間での増加勾配を用いて実
施しうる。 疎水性アフイニテイクロマトグラフイは5.5〜
8.0のPHで100mM未満のイオン強度の緩衝液を用
い、好ましくは約7.2のPHで約10mM〜80mMの
間のイオン強度を有するトリス／HCl（Tris／
HCl）を用いて溶出することによつて実施しう
る。 このクロマトグラフイは5.5〜8.0の間のPHで
500mM〜5mM、然しながら、好ましくは約7.6
のPHで約250mM〜10mMのイオン強度間の減少
直線勾配を用いて実施することもできる。 本発明方法のもう一つの具体例に於いては、酵
素分離はゲル濾過ステツプをも含みうる。この濾
過は、他のゲル濾過マトリツクスを用いることが
できるけれども、アガロース−アクリルアミドマ
トリツクス上での他のクロマトグラフイステツプ
の後に実施するのが好ましい。 本発明方法によつて生産されるアリール アシ
ルアミド酵素は通常約48000〜60000、特に約
52000の分子量の一つのポリペプチツド鎖からな
る。 プソイドモナス フルオレツセンス
NCIB11615（ATCC39005）又はプソイドモナス
プチダNCIB11616（ATCC39004）の突然変異
株又は変異株は環境淘汰圧技術（environmental
selection pressuve techniques）（優良種養殖）、
uv照射又は突然変異を起させる薬品等によつて
得られうる。 これらの突然変異株と変異株は遺伝子操作技
術、例えばプラスミドDNAをマルチコピーホス
ト（multicopy host）に移すことにより、又は
アリール アシルアミダーゼ生産バクテリアの細
胞からアリール アシルアミダーゼを規定
（Code）する染色体の遺伝子を切除し、次にこの
遺伝子を適当なベクトル分子にクローニングする
ことによつても生産されうる。本発明はアリール
アシルアミダーゼを生産するための、保有さ
れ、改変され、又は高められた能力を有するこの
ような突然変異株又は変異株を包含する。 本発明方法によつて生産される酵素は多くの用
途を有する；然しながらこれらの酵素は、特にＮ
−アシル化された第１級芳香族アミンの分析法に
有用である。特に、これらの酵素は同時係属中の
英国特許出願第8038634号に開示される分析法に
有利に使用しうる。 本発明の各種の態様の中で特定の具体例は単に
実施例として説明される。これらの実施例中で、
用いられる培地は下記の如きものであつた。 鉱物性培地 ｇ／脱イオン水１ KH2PO4 3.0 K2HPO4 1.0 KCl 3.0 NaCl 5.4 NH4Cl 1.1 CaCl2・2H2O 0.01 MgCl2・6H2O 0.1 Na2SO4 0.02 FeCl3・6H2O 0.0002 培地のPHはKOH又はHClのいずれかを添加し
て要求通りに調節された。 複合培地 ｇ／脱イオン水１ トリプトン大豆流体培養基 20 プソイドモナス フルオレツセンス
NCIB11615（ATCC39005）及びプソイドモナス
プチダNCIB11616（ATCC39004）は下記の如
き土壌試料から得られた： Ｎ−アセチル−４−ヒドロキシアニリン（１
ｇ）と寒天（15ｇ）を混合して上記鉱物性培地
（１リツター）から寒天プレートを調製した。こ
の混合物のPHは、オートクレーブに入れる前に、
5Mの可性カリ水溶液を用いて6.8に調節された。 土壌試料（１ｇ）を純水（５ml）中に懸濁し、
激しく撹拌した。この懸濁物を５分間放置した
後、この懸濁液を分取して上記の寒天プレートを
薄く覆つた。次にこのプレートは72時間まで培養
して生長を調べた。 バクテリア生長の兆候（即ちコロニーの外観）
を示すこれらのプレートを新しい培地に二次培養
した。〔この段階で、分離培養物（isolate）が接
種物からの“飛び出し”物（“carry−over”
material）上ではなく、与えられた炭素源（Ｎ−
アセチル−４−ヒドロキシアニリン）上で生長し
ていることを示す必要がある。〕 プソイドモナス フルオレツセンス
NCIB11615（ATCC39005）とプソイドモナス
プチダNCIB11616（ATCC39004）は、トリプト
フアン大豆流体培養基（TSB）培地上のバツチ
培養で生長させた場合には、これらの形態学上の
特徴、培養上の特徴、及び染色特性により、又い
くつかの生化学的性質によつて同定された。この
結果を表１〜７に示す。
産と、この酵素を生産しうる微生物に係る。 本文中で言及するアリール アシルアミダーゼ
酵素は、生化学国際連盟（酵素命名法1978年、ア
カデミツクプレス、ニユーヨーク、1979年）によ
つて、アニリド類のアニリン類と脂肪酸アニオン
への加水分解の触媒作用をする酵素として定義さ
れている。これらの酵素は生化学国際連盟
（IUB）によつて番号EC3.5.1.13を与えられてい
る。 アニリド類（Ｎ−アシルアニリン類）の酵素脱
アシル化は長い間哺乳動物組織中に存在すること
が判つていた。初期の研究は、兎から取り出した
肝臓と腎臓の抽出物によるアセトアニリドとフエ
ナセチンの加水分解並に、ひよこの腎臓の組織粉
末懸濁液によるアセチルスルフアニルアミドの急
速な脱アシル化を報告した。 類似の酵素反応が植物組織中で起ることが判明
した。例えばアリール アシルアミダーゼが稲植
物体から単離され、一方プロパニル（propanil）、
即ち３，４−ジクロロプロピオンアニリドがセイ
ヨウタンポポの根の抽出物によつて加水分解され
た。 微生物はそのような酵素のソースとしてそれ程
広範には研究されなかつた。微生物アミダーゼに
関する研究の大部分は、脂肪族基質、特にホルム
アミド（HynesとPatemanのJ.Gen.Microbiol.、
1970年、63巻、317頁）アセタミド（Jakobyと
FredericksのJ.Biol.Chem.、1964年、234巻、
1978頁）及びプロピオンアミド（KellyとClarke
のJ.Gen.Microbiol.、1962年、27巻、305頁）に
関するものであつた。プソイドモナス エアルギ
ノーサ（Pseudmonos aeruginosa）からの後者
のアミダーゼは短鎖脂肪族アミドの連鎖を加水分
解する。然しながらこの微生物を更に研究した結
果、この菌株の突然変異株がアミダーゼを生産
し、このアミダーゼはバクテリアにＮ−アシルア
ニリン基質を利用させることが判つた（Brown
とclarkeのJ.Gen.Microbiol.、1972年、70巻、
287頁）。 芳香族基質に特異な微出物アシルアミダーゼの
存在は比較的狭い範囲で研究された。そのような
報告の大部分は除草剤の変換に関する研究の結果
として示された。このようなアリール アシルア
ミダーゼはイソプロピルＮ−（３−クロロフエニ
ル）カーバメート上で生長させたプソイドモナス
ストリアタ（Pseudomonas striata）（Kearney、
J.Agric.Food Chem.、1965年、13巻、561頁）、
カルシル（Karsil）、即ちＮ−（３，４−ジクロロ
フエニル）−２−メチルペンタンアミド上で生長
させたペニシリウム（Penicillium）（Sharabiと
Bordeleau、App.Microbiol.、1969年、18巻、
369頁）、リニユロン（Linuron）、即ち３−（３，
４−ジクロロフエニル−１−メトキシ−１−メチ
ルユレア）上で生長させたバシラス スフアエリ
カス（Bacillus sphaericus）（Engelhardt等の
App.Microbiol.、1973年、26巻、709頁）、及び
アラクロール（Alachlor）、即ち２−クロロ−Ｎ
−（２，６−ジエチルフエニル）−Ｎ−メトキシメ
チル アセタミド上で生長させたカエトミウムグ
ロボサム（Chaetomium globosum）（Tiedje等
のJ.Agric.Food Chem.、1975年、23巻、77頁）
に属するものとして説明された。 Ｎ−アシルアニリン基質上での微生物の生長も
報告された。例えば、土壌から単離されたプソイ
ドモナス アシドボランス（Pseudomonas
acidovorans）の菌株は、フエナセチン（Ｎ−ア
セチル−４−エトキシアニリン）とアセトアニリ
ド上で生長することを示した（Alt等のJ.Gen.
Microbiol.、1975年、87巻、260頁）。同様に、プ
ソイドモナスストリアタ（Pseudomonas
striata）の培養はアセトアニリド上で生育した
（Hsiung等のBiochem.Biophys.Res.Commun.、
1975年、66巻、1225頁）。この場合、培養がアリ
ール アシルアミダーゼを生産することを示し
た。 本発明はアリール アシルアミダーゼ酵素を生
産する新規な方法を提供するものである。この方
法は新規なアリール アシルアミダーゼ産生微生
物を用いるのみならず、初めて高収率で大量に高
い活性を有するアリール アシルアミダーゼを生
産する。 本発明によれば、1980年10月８日にスコツトラ
ンド、アバーデーン（Aberdeen）のThe
National Collection of Industrial Bactevia
（NCIB）に寄託された菌株プソイドモナス フ
ルオレツセンス（Pseudomonas fluoresceus）
NCIB11615〔1981年11月19日に米国マリーランド
（Maryland）のThe American Type Cultuve
Collection（ATCC）に寄託されたプソイドモナ
スフルオレツセンス（Pseudomonas
fluoresceus）ATCC39005と同一である〕又はそ
れらのアリール アシルアミダーゼ生産突然変異
株又は変異株、もしくは1980年10月８日にスコツ
トランド、アバーデーンのNCIBに寄託されたプ
ソイドモナス プチダ（Pseudomonas putida）
NCIB11616〔1981年11月19日に米国マリーランド
のATCCに寄託されたプソイドモナス プチダ
（Pseudomonas putida）ATCC39004と同一であ
る〕又はそれらのアリール アシルアミダーゼ産
生突然変異株又は変異株の一つのバクテリアを培
地中で培養することからなるアリール アシルア
ミダーゼ酵素の生産方法が提供される。この培地
中では前記バクテリア菌株は、アリール アシル
アミダーゼを生産し得、且つアリール アシルア
ミダーゼ酵素含有物質を収集しうる。この酵素含
有物質は細胞物質、細胞上澄液又はこの両者であ
つてもよい。酵素含有物質が細胞物質である場合
は、この方法は、更にバクテリア菌株の細胞物質
を破砕しアリール アシルアミダーゼ酵素を放出
させるステツプからなつてもよい。それぞれの場
合に、この方法は更に、他の不必要な物質、例え
ば細胞砕片及び他の細胞構成蛋白質から酵素を分
離するステツプを含んでもよい。 培地は、本発明のバクテリア菌株にアリール
アシルアミダーゼ酵素を生産させるいかなる成分
を含有していてもよい。然しながら、この培地
は、酵素合成のための誘導物として作用する一種
以上のＮ−アシルアニリン（アニリド）を含有す
るのが好ましい。この一種以上のＮ−アシルアニ
リンは、例えば３−又は４−ヒドロキシアニリン
のＮ−アセチル誘導体、４−エトキシアニリン、
又は２−、３−又は４−メチルアニリンから選択
されうる。然しながら、本発明の好しい具体例に
於いては、この一種以上のＮ−アシルアニリンは
Ｎ−アセチルアニリン（アセトアニリド）であ
る。 この一種以上のＮ−アシルアニリンはペプト
ン、イースト水解物等の天然起源の栄養素源を含
有する複合培地、もしくは無機及び／又は単一の
有機栄養素源を含有する限定された塩類培地のい
ずれかの一部分を形成してもよい。 本発明の微生物の生長はバツチ又は連続培養に
於て生起する。バツチ培養に於いては、通常培地
は一種以上のＮ−アシルアニリンを約0.01〜0.25
％（重量／容量）、好ましくは約0.05〜0.15％
（重量／容量）含有する。連続培養に於ては、一
種以上のＮ−アシルアニリンのレベルを0.001〜
0.2％（重量／容量）のＮ−アシルアニリンに維
持するようにかかる割合で培地を加え且つ取り除
く。（これらの％値のすべてはバクテリアによつ
て利用されうるＮ−アシルアニリン量に関するも
のである）。 培養は好ましくは約10℃〜45℃の温度、更に好
ましくは約20℃〜30℃の温度、及び好ましくは約
６〜９のPH、更に好ましくは６〜7.5のPHで行わ
れる。培養は好気性又は嫌気性の条件下で行ない
うるけれども、好気性の条件は比較的多くの細胞
収量を与えるので好ましい。 細胞の破砕は超音波処理、ホモジニゼエシヨン
又は酵素による処理等の従来技術によつて行いう
る。本発明方法の一つの好ましい具体例に於いて
は、DNアーゼ（DNase）とRNアーゼ
（RNase）の存在下でのリゾチーム−EDTAを用
いる酵素処理によつて細胞を粉砕する。 次に、他の不必要な物質、例えば細胞砕片及び
存在する他の細胞構成蛋白質を酵素から分離する
には、従来の酵素単離技術及び酵素精製技術を使
用しうる。これらの分離は、酵素の数種の性質、
特に溶解度、分子の形状、分子の電荷、分子の大
きさ及び疎水性親和力を用いて行いうる。これら
の方法は、沈殿、詳しくは有機溶媒を用いうるけ
れども硫酸アンモニウムによる沈殿、デキストラ
ン、アガロース又はアガロース−ポリアクリルア
ミド上でのゲル濾過、例えばアルキルアガロース
又は好ましくはアリール アガロースマトリツク
ス上での疎水クロマトグラフイ、例えばDEAE架
橋デキストラン（DEAE cross−linked
dextrans）上でのイオン交換クロマトグラフイ、
超遠心分離、及び／又はヌクレオチド誘導マトリ
ツクス（nucleotide derivativised matrices）、
又はスルホン酸置換モノ−及びジ−クロロトリア
ジニル〔プロシオン（Procion）−商標〕染料上
でのアフイニテイクロマトグラフイを含みうる。
本発明方法の好ましい具体例では、遠心分離ステ
ツプによつて酵素は細胞砕片から分離される。次
の段階は、好ましくは硫酸アンモニウムを用いる
沈殿ステツプであり、これに続いて、好ましくは
フエニル置換架橋アガロース（phenyl
substituted cross−linked agarose）〔フエニル
セフアロース（phenyl sepharose）−商標〕マト
リツクス上での疎水クロマトグラフイからなるク
ロマトグラフイステツプ及び好ましくはDEAE架
橋デキストラン上でのイオン交換クロマトグラフ
イである。疎水クロマトグラフイ及びイオン交換
クロマトグラフイはいかなる順序で行つてもよく
又所望の酵素の純度を生成させるに必要な多くの
回数実施してもよい。 イオン交換、DEAE架橋デキストランクロマト
グラフイは、5.5〜8.0のPHで10〜1000mMの間で
イオン強度の増加勾配、好ましくは約7.6のPHで
約50mM〜400mMの間での増加勾配を用いて実
施しうる。 疎水性アフイニテイクロマトグラフイは5.5〜
8.0のPHで100mM未満のイオン強度の緩衝液を用
い、好ましくは約7.2のPHで約10mM〜80mMの
間のイオン強度を有するトリス／HCl（Tris／
HCl）を用いて溶出することによつて実施しう
る。 このクロマトグラフイは5.5〜8.0の間のPHで
500mM〜5mM、然しながら、好ましくは約7.6
のPHで約250mM〜10mMのイオン強度間の減少
直線勾配を用いて実施することもできる。 本発明方法のもう一つの具体例に於いては、酵
素分離はゲル濾過ステツプをも含みうる。この濾
過は、他のゲル濾過マトリツクスを用いることが
できるけれども、アガロース−アクリルアミドマ
トリツクス上での他のクロマトグラフイステツプ
の後に実施するのが好ましい。 本発明方法によつて生産されるアリール アシ
ルアミド酵素は通常約48000〜60000、特に約
52000の分子量の一つのポリペプチツド鎖からな
る。 プソイドモナス フルオレツセンス
NCIB11615（ATCC39005）又はプソイドモナス
プチダNCIB11616（ATCC39004）の突然変異
株又は変異株は環境淘汰圧技術（environmental
selection pressuve techniques）（優良種養殖）、
uv照射又は突然変異を起させる薬品等によつて
得られうる。 これらの突然変異株と変異株は遺伝子操作技
術、例えばプラスミドDNAをマルチコピーホス
ト（multicopy host）に移すことにより、又は
アリール アシルアミダーゼ生産バクテリアの細
胞からアリール アシルアミダーゼを規定
（Code）する染色体の遺伝子を切除し、次にこの
遺伝子を適当なベクトル分子にクローニングする
ことによつても生産されうる。本発明はアリール
アシルアミダーゼを生産するための、保有さ
れ、改変され、又は高められた能力を有するこの
ような突然変異株又は変異株を包含する。 本発明方法によつて生産される酵素は多くの用
途を有する；然しながらこれらの酵素は、特にＮ
−アシル化された第１級芳香族アミンの分析法に
有用である。特に、これらの酵素は同時係属中の
英国特許出願第8038634号に開示される分析法に
有利に使用しうる。 本発明の各種の態様の中で特定の具体例は単に
実施例として説明される。これらの実施例中で、
用いられる培地は下記の如きものであつた。 鉱物性培地 ｇ／脱イオン水１ KH2PO4 3.0 K2HPO4 1.0 KCl 3.0 NaCl 5.4 NH4Cl 1.1 CaCl2・2H2O 0.01 MgCl2・6H2O 0.1 Na2SO4 0.02 FeCl3・6H2O 0.0002 培地のPHはKOH又はHClのいずれかを添加し
て要求通りに調節された。 複合培地 ｇ／脱イオン水１ トリプトン大豆流体培養基 20 プソイドモナス フルオレツセンス
NCIB11615（ATCC39005）及びプソイドモナス
プチダNCIB11616（ATCC39004）は下記の如
き土壌試料から得られた： Ｎ−アセチル−４−ヒドロキシアニリン（１
ｇ）と寒天（15ｇ）を混合して上記鉱物性培地
（１リツター）から寒天プレートを調製した。こ
の混合物のPHは、オートクレーブに入れる前に、
5Mの可性カリ水溶液を用いて6.8に調節された。 土壌試料（１ｇ）を純水（５ml）中に懸濁し、
激しく撹拌した。この懸濁物を５分間放置した
後、この懸濁液を分取して上記の寒天プレートを
薄く覆つた。次にこのプレートは72時間まで培養
して生長を調べた。 バクテリア生長の兆候（即ちコロニーの外観）
を示すこれらのプレートを新しい培地に二次培養
した。〔この段階で、分離培養物（isolate）が接
種物からの“飛び出し”物（“carry−over”
material）上ではなく、与えられた炭素源（Ｎ−
アセチル−４−ヒドロキシアニリン）上で生長し
ていることを示す必要がある。〕 プソイドモナス フルオレツセンス
NCIB11615（ATCC39005）とプソイドモナス
プチダNCIB11616（ATCC39004）は、トリプト
フアン大豆流体培養基（TSB）培地上のバツチ
培養で生長させた場合には、これらの形態学上の
特徴、培養上の特徴、及び染色特性により、又い
くつかの生化学的性質によつて同定された。この
結果を表１〜７に示す。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
ゼ
【表】
ゼ
N−アセチル−β − −
−グルコサミニダ
ーゼ
α−マンノシダー − −
ゼ
α−フコシダーゼ − −
注：1) ゼラチン液化テスト
N−アセチル−β − −
−グルコサミニダ
ーゼ
α−マンノシダー − −
ゼ
α−フコシダーゼ − −
注：1) ゼラチン液化テスト
【表】
クエン酸塩 ＋ ＋
【表】
【表】
リトマスミルク − −
メチルレツド − −
メチルレツド − −
【表】
上記の結果は、双方の分離培養物はプソイドモ
ナス属（Genus Pseudomonas）の構成員である
ことを示す。然しながら、この２つの分離培養物
を完全に区別し、属のレベルを越えてこれらを同
定するためには、各種の化合物を全炭素源として
利用するこれらの能力に関する生化学的輪郭を研
究する必要がある。その結果を表８に示す。
ナス属（Genus Pseudomonas）の構成員である
ことを示す。然しながら、この２つの分離培養物
を完全に区別し、属のレベルを越えてこれらを同
定するためには、各種の化合物を全炭素源として
利用するこれらの能力に関する生化学的輪郭を研
究する必要がある。その結果を表８に示す。
【表】
【表】
７mmの含浸デイスク（impregnated discs）を
使用して標準帯域阻止技術（standard zone
inhibition techniques）を用いて、各種の抗性物
質に対するそれぞれの分離培養物の感度を測定し
た。結果を表９に示す。
使用して標準帯域阻止技術（standard zone
inhibition techniques）を用いて、各種の抗性物
質に対するそれぞれの分離培養物の感度を測定し
た。結果を表９に示す。
【表】
ントイン
【表】
下記実施例に於ては、酵素活性度は単位
（Units）で示される。10-4M4−ニトロアセトア
ニリド0.5ml、100mMトリス／HCl緩衝液（PH
8.6）0.4ml及び試料溶液0.1mlを含有する反応混合
物１ml中で、30℃で１分間当り４−ニトロアセト
アニリド（Ｎ−アセチル−４−ニトロ−アニリ
ン）の１モルが脱アシル化させる場合に１単位と
定義する。 プソイドモナス フルオレツセンスNCIB11615
（ATCC39005）及びプソイドモナス プチダ
NCIB11616（ATCC39004）からアリールアシル
アミダーゼの生産 実施例 １ アセトアニリド１ｇ/を含み且つPHを6.5に調
節した鉱物性培地（上述の如き）100mlを250mlの
バツフル付フラスコ中に置き、オートクレーブに
入れて115℃、10psiで15分間殺菌した。この培地
にプソイドモナス フルオレツセンス
NCIB11615（ATCC39005）をループ接種（loop
inoculate）し、この培地を120rpmで振盪される
オービタル定温器（orbital incubator）中で48
時間25℃で培養した。得られる物質を捕集し、ア
リール アシルアミダーゼ活性について評価し
た。酵素収率は389単位／ｇ乾燥細胞であつた。 実施例 ２ プソイドモナスフルオレツセンスNCIB11615
（ATCC39005）をプソイドモナスプチダ
NCIB11616（ATCC39004）で置き替える以外は
実施例１の方法を繰返した。酵素の収率は183単
位／ｇ乾燥細胞であつた。 実施例 ３ 鉱物性培地を複合培地（上述の如き）で置き替
える以外は実施例１の方法を繰返した。酵素の収
率は476単位／ｇ乾燥細胞であつた。 実施例 ４ プソイドモナスフルオレツセンスNCIB11615
（ATCC39005）をプソイドモナスプチダ
NCIB11616（ATCC39004）で置き替える以外は
実施例３の方法を繰返した。酵素収率は130単
位／ｇ乾燥細胞であつた。 アリールアシルアミダーゼの大規模生産 実施例 ５ (i) シード調整（Seed Preparation） １ｇ/のアセトアニリドを含有し且つPH
を6.5に調節した鉱物性培地（上述の如き）１
を２のバツフル付きフラスコに置き、オー
トクレーブに入れて115℃、10psiで15分間殺菌
した。この培地はプソイドモナスフルオレツセ
ンスNCIB11615（ATCC39005）でループ接種
され、この培地を、120rpmで振盪されるオー
ビタル定温器中で、25℃で41時間培養した。 １ｇ/のアセトアニリドを含有するPH6.5
の鉱物性培地から15を分取し、20のガラス
容器中で調製した。アンチホーム（antifoam）
（ポリプロピレングリコール、分子量約2000）
５mlを加え、この培地をオートクレーブに入れ
115℃、10psiで20分間殺菌した。この殺菌され
た培地は１振盪フラスコ培地の無菌添加によ
り接種され、１分間当り12の空気を底部に吹
込む通気速度で25℃、36時間培養された。 (ii) 大規模培地の調製 トリプトン大豆流体培養基（8000ｇ）とアセ
トアニリド（400ｇ）をポルトン設計（Porton
design）〔C.G.T.Evans等のMethodsin
Microbiology、第２巻、13章、277頁〜323頁、
著者J.R.Norris及びD.Ribbons、ロンドン
Academic Press発行〕のステンレススチル醗
酵容器（500）中の純水（400）中に加え
た。この培地を、その場で121℃、10psiで30分
間殺菌した。 (iii) 培 養 複合培地は15のシード培地の無菌添加によ
り接種された。この400の培地は300／分の
割合で予め殺菌した空気を底部に吹込むことに
よつて通気された。この培地の温度は25℃に維
持され、培地を250rpmで機械的に撹拌した。
泡立ちを、必要な場合には、予め殺菌したポリ
プロピレングリコール（分子量2000）の無菌添
加によつて抑制した、又排出ガスをCO2の％含
有量について監視した。成熟培地（maturing
culture）のPHが7.6のレベルに達するまでは、
培地のPHは自然に変動させた。次にこの培地
のPHを、20％H3PO4の添加により、PH7.6の
値に制御した。 (iv) 採 取 20時間の培養後、培養器への空気を止め培地
の温度を15℃まで低下させた。次に培地を、殺
菌してないけれども化学的な清浄な条件下で、
冷板交換器（chilled plate exchanger）を介
して平行に回転するドラバル遠心分離機（流量
50〜60／hr）で遠心分離した。培地のレベル
がインペラのレベル以下に低下するまでは撹拌
とPH制御を継続した。遠心分離中は、容器は
頂部に空気が存在する状態に維持し、培地中に
嫌気性状態を有効に生ぜしめた。上澄液はポン
プでホールドタンクに送られ、次に処理する前
に上澄液がホルマライジング（formalising）
と加熱によつて破壊される場合には、破壊タン
クに送られる。バクテリア細胞を捕集し計量し
た。アリールアシルアミダーゼ370000単位を含
有する湿潤細胞ペースト7.21Kgが得られた。 実施例 ６ 実施例５の方法で得られたバクテリア細胞１ｇ
（湿潤重量）を、PH7.6、イオン強度0.1Mの燐酸
カリウム緩衝液５ml中に懸濁させた。デオキシリ
ボヌクレアーゼ（DNase）とリボヌクレアーゼ
（RNase）（それぞれ約１mg）を加え、この混合
した調製物を穏かに撹拌した。EDTA（0.2M溶液
1.0ml）を加え、次にリゾチーム（10mg/ml）１ml
を加えた。更に５分間の間、もしくは粘度増加が
認められ溶解を示すまで混合を継続した。溶解
（lysis）が完了した時に0.5MのMgCl2・6H2O1ml
を加えてヌクレアーゼ活性を活性化し粘度を減少
させた。 実施例 ７ 細胞懸濁液を実施例６の如く調製し、DNアー
ゼ、RNアーゼ、EDTA及びリゾチームを加え
た。この調製物を穏かに撹拌した後、４℃で10時
間放置した。10％ソジウムドデシルサルフエート
（SDS）0.5mlを加え、この調製物を37℃で更に10
分間放置した。溶解が完了した時に、実施例６の
ようにしてMgCl2を加えた。 実施例 ８ 細胞懸濁液を実施例６の如く調製した。
5MNaCl1mlと0.2MEDTA1mlを加え、次にリゾ
チーム（濃度10mg/ml）１mlを加えた。この調製
物を周囲温度で15分間穏かに撹拌した。この後、
非イオン界面活性剤、トライトンＸ−100
（Triton Ｘ−100）（商標）0.5mlを加えた。更に
５分間混合を継続し、次にこの調製物を４時間、
もしくは溶解（lysis）が起るまで放置した。次
に実施例６のようにしてMgCl2を加えた。 実施例 ９ 実施例５の方法で調製したバクテリア細胞１ｇ
（湿潤重量）を燐酸カリウム緩衝液（PH7.6）10
ml中に懸濁し、０℃に冷却した。7532B型ソニプ
ロブ（Soniprobe type 7532B）〔ダウエインスト
ルーメント社（Dawe lnstruments Ltd）製〕を
用いて、5A、20kc／secで５分までの間この調製
物を超音波処理した。分離培養物を30秒の期間づ
つ超音波処理し、それぞれの超音波処理の後約２
分間冷却した。この温度は約10℃以上に上げるこ
とは許されなかつた。 酵素の分離 実施例 10 バクテリア細胞を実施例５の方法によつて調製
した。この細胞（100ｇ）をリゾチーム−EDTA
を用いる酵素処理によつて破砕し（実施例６の方
法）、細胞砕片を遠心分離によつて除去して0.64
単位／mg蛋白質を含有する細胞抽出物を得た。 次にこの細胞抽出物を順次硫酸アンモニウム沈
殿、PH7.6の50mM燐酸塩緩衝液中の架橋デキス
トラン（セフアデツクスＧ−25、商標）上での脱
塩、PH7.6の50mM燐酸塩と400mM燐酸塩の間
の41増加直線勾配を用いるDEAE架橋デキストラ
ン（DEAEセフアデツクス、商標）上でのクロマ
トグラフイ、及びPH7.6の50mM燐酸塩中のアガ
ロース−アクリルアミド上でのゲル過によつて
精製した。 セル抽出物に基ずいて得られた収率と比活性度
を表10に示す。
（Units）で示される。10-4M4−ニトロアセトア
ニリド0.5ml、100mMトリス／HCl緩衝液（PH
8.6）0.4ml及び試料溶液0.1mlを含有する反応混合
物１ml中で、30℃で１分間当り４−ニトロアセト
アニリド（Ｎ−アセチル−４−ニトロ−アニリ
ン）の１モルが脱アシル化させる場合に１単位と
定義する。 プソイドモナス フルオレツセンスNCIB11615
（ATCC39005）及びプソイドモナス プチダ
NCIB11616（ATCC39004）からアリールアシル
アミダーゼの生産 実施例 １ アセトアニリド１ｇ/を含み且つPHを6.5に調
節した鉱物性培地（上述の如き）100mlを250mlの
バツフル付フラスコ中に置き、オートクレーブに
入れて115℃、10psiで15分間殺菌した。この培地
にプソイドモナス フルオレツセンス
NCIB11615（ATCC39005）をループ接種（loop
inoculate）し、この培地を120rpmで振盪される
オービタル定温器（orbital incubator）中で48
時間25℃で培養した。得られる物質を捕集し、ア
リール アシルアミダーゼ活性について評価し
た。酵素収率は389単位／ｇ乾燥細胞であつた。 実施例 ２ プソイドモナスフルオレツセンスNCIB11615
（ATCC39005）をプソイドモナスプチダ
NCIB11616（ATCC39004）で置き替える以外は
実施例１の方法を繰返した。酵素の収率は183単
位／ｇ乾燥細胞であつた。 実施例 ３ 鉱物性培地を複合培地（上述の如き）で置き替
える以外は実施例１の方法を繰返した。酵素の収
率は476単位／ｇ乾燥細胞であつた。 実施例 ４ プソイドモナスフルオレツセンスNCIB11615
（ATCC39005）をプソイドモナスプチダ
NCIB11616（ATCC39004）で置き替える以外は
実施例３の方法を繰返した。酵素収率は130単
位／ｇ乾燥細胞であつた。 アリールアシルアミダーゼの大規模生産 実施例 ５ (i) シード調整（Seed Preparation） １ｇ/のアセトアニリドを含有し且つPH
を6.5に調節した鉱物性培地（上述の如き）１
を２のバツフル付きフラスコに置き、オー
トクレーブに入れて115℃、10psiで15分間殺菌
した。この培地はプソイドモナスフルオレツセ
ンスNCIB11615（ATCC39005）でループ接種
され、この培地を、120rpmで振盪されるオー
ビタル定温器中で、25℃で41時間培養した。 １ｇ/のアセトアニリドを含有するPH6.5
の鉱物性培地から15を分取し、20のガラス
容器中で調製した。アンチホーム（antifoam）
（ポリプロピレングリコール、分子量約2000）
５mlを加え、この培地をオートクレーブに入れ
115℃、10psiで20分間殺菌した。この殺菌され
た培地は１振盪フラスコ培地の無菌添加によ
り接種され、１分間当り12の空気を底部に吹
込む通気速度で25℃、36時間培養された。 (ii) 大規模培地の調製 トリプトン大豆流体培養基（8000ｇ）とアセ
トアニリド（400ｇ）をポルトン設計（Porton
design）〔C.G.T.Evans等のMethodsin
Microbiology、第２巻、13章、277頁〜323頁、
著者J.R.Norris及びD.Ribbons、ロンドン
Academic Press発行〕のステンレススチル醗
酵容器（500）中の純水（400）中に加え
た。この培地を、その場で121℃、10psiで30分
間殺菌した。 (iii) 培 養 複合培地は15のシード培地の無菌添加によ
り接種された。この400の培地は300／分の
割合で予め殺菌した空気を底部に吹込むことに
よつて通気された。この培地の温度は25℃に維
持され、培地を250rpmで機械的に撹拌した。
泡立ちを、必要な場合には、予め殺菌したポリ
プロピレングリコール（分子量2000）の無菌添
加によつて抑制した、又排出ガスをCO2の％含
有量について監視した。成熟培地（maturing
culture）のPHが7.6のレベルに達するまでは、
培地のPHは自然に変動させた。次にこの培地
のPHを、20％H3PO4の添加により、PH7.6の
値に制御した。 (iv) 採 取 20時間の培養後、培養器への空気を止め培地
の温度を15℃まで低下させた。次に培地を、殺
菌してないけれども化学的な清浄な条件下で、
冷板交換器（chilled plate exchanger）を介
して平行に回転するドラバル遠心分離機（流量
50〜60／hr）で遠心分離した。培地のレベル
がインペラのレベル以下に低下するまでは撹拌
とPH制御を継続した。遠心分離中は、容器は
頂部に空気が存在する状態に維持し、培地中に
嫌気性状態を有効に生ぜしめた。上澄液はポン
プでホールドタンクに送られ、次に処理する前
に上澄液がホルマライジング（formalising）
と加熱によつて破壊される場合には、破壊タン
クに送られる。バクテリア細胞を捕集し計量し
た。アリールアシルアミダーゼ370000単位を含
有する湿潤細胞ペースト7.21Kgが得られた。 実施例 ６ 実施例５の方法で得られたバクテリア細胞１ｇ
（湿潤重量）を、PH7.6、イオン強度0.1Mの燐酸
カリウム緩衝液５ml中に懸濁させた。デオキシリ
ボヌクレアーゼ（DNase）とリボヌクレアーゼ
（RNase）（それぞれ約１mg）を加え、この混合
した調製物を穏かに撹拌した。EDTA（0.2M溶液
1.0ml）を加え、次にリゾチーム（10mg/ml）１ml
を加えた。更に５分間の間、もしくは粘度増加が
認められ溶解を示すまで混合を継続した。溶解
（lysis）が完了した時に0.5MのMgCl2・6H2O1ml
を加えてヌクレアーゼ活性を活性化し粘度を減少
させた。 実施例 ７ 細胞懸濁液を実施例６の如く調製し、DNアー
ゼ、RNアーゼ、EDTA及びリゾチームを加え
た。この調製物を穏かに撹拌した後、４℃で10時
間放置した。10％ソジウムドデシルサルフエート
（SDS）0.5mlを加え、この調製物を37℃で更に10
分間放置した。溶解が完了した時に、実施例６の
ようにしてMgCl2を加えた。 実施例 ８ 細胞懸濁液を実施例６の如く調製した。
5MNaCl1mlと0.2MEDTA1mlを加え、次にリゾ
チーム（濃度10mg/ml）１mlを加えた。この調製
物を周囲温度で15分間穏かに撹拌した。この後、
非イオン界面活性剤、トライトンＸ−100
（Triton Ｘ−100）（商標）0.5mlを加えた。更に
５分間混合を継続し、次にこの調製物を４時間、
もしくは溶解（lysis）が起るまで放置した。次
に実施例６のようにしてMgCl2を加えた。 実施例 ９ 実施例５の方法で調製したバクテリア細胞１ｇ
（湿潤重量）を燐酸カリウム緩衝液（PH7.6）10
ml中に懸濁し、０℃に冷却した。7532B型ソニプ
ロブ（Soniprobe type 7532B）〔ダウエインスト
ルーメント社（Dawe lnstruments Ltd）製〕を
用いて、5A、20kc／secで５分までの間この調製
物を超音波処理した。分離培養物を30秒の期間づ
つ超音波処理し、それぞれの超音波処理の後約２
分間冷却した。この温度は約10℃以上に上げるこ
とは許されなかつた。 酵素の分離 実施例 10 バクテリア細胞を実施例５の方法によつて調製
した。この細胞（100ｇ）をリゾチーム−EDTA
を用いる酵素処理によつて破砕し（実施例６の方
法）、細胞砕片を遠心分離によつて除去して0.64
単位／mg蛋白質を含有する細胞抽出物を得た。 次にこの細胞抽出物を順次硫酸アンモニウム沈
殿、PH7.6の50mM燐酸塩緩衝液中の架橋デキス
トラン（セフアデツクスＧ−25、商標）上での脱
塩、PH7.6の50mM燐酸塩と400mM燐酸塩の間
の41増加直線勾配を用いるDEAE架橋デキストラ
ン（DEAEセフアデツクス、商標）上でのクロマ
トグラフイ、及びPH7.6の50mM燐酸塩中のアガ
ロース−アクリルアミド上でのゲル過によつて
精製した。 セル抽出物に基ずいて得られた収率と比活性度
を表10に示す。
【表】
ルアミド溶出
実施例 11 バクテリア細胞を実施例５の方法で調製した。
この細胞（300ｇ）をリゾチーム−EDTAによる
酵素処理によつて破砕し（実施例６の方法）、細
胞砕片を遠心分離によつて除却して0.37単位／mg
蛋白質を含有する細胞抽出物を得た。 この細胞抽出物を先づ硫酸アンモニウム沈殿、
次にPH7.6の100mM燐酸塩緩衝液中の架橋デキ
ストラン（セフアデツクスＧ−24、商標）上での
脱塩、によつて順次精製した。この溶出液を
PH7.6の50mM燐酸塩と400mM燐酸塩の間で41
増加直線勾配を用いてDEAE架橋デキストラン
（DEAEセフアデツクス、商標）上でクロマトグ
ラフイにかけ、次にPH7.2の10mMトリス／HCl
中のフエノール置換架橋アガロース（フエニルセ
フアロース、商標）上で疎水性クロマトグラフに
かけた。溶出液をPH7.6の10mM燐酸塩と
400mM燐酸塩の間での500ml増加直線勾配を用い
てDEAE架橋デキストラン（DEAEセフアデツク
ス、商標）上でクロマトグラフにかけ、次に
PH7.2の10mMトリス／HCl中のフエノール置換
架橋アガロース（フエニルセフアロース、商標）
上で疎水性クロマトグラフにかけた。溶出液を、
PH7.6の10mM燐酸塩と400mM燐酸塩の間での
500ml増加直線勾配を用いてDEAE架橋デキスト
ラン（DEAEセフアデツクス、商標）上でクロマ
トグラフイにかけ、次にPH7.6の250mM燐酸塩
とPH7.2の10mMトリス／HCl間の減少直線勾配
によりフエニル置換架橋アガロース（フエニルセ
フアロース、商標）上で疎水クロマトグラフイに
かけて、続いてPH7.2の10mMトリス／HClで溶
出した。 細胞抽出物にもとづいて得られた収率と比活性
度を表11に示す。
実施例 11 バクテリア細胞を実施例５の方法で調製した。
この細胞（300ｇ）をリゾチーム−EDTAによる
酵素処理によつて破砕し（実施例６の方法）、細
胞砕片を遠心分離によつて除却して0.37単位／mg
蛋白質を含有する細胞抽出物を得た。 この細胞抽出物を先づ硫酸アンモニウム沈殿、
次にPH7.6の100mM燐酸塩緩衝液中の架橋デキ
ストラン（セフアデツクスＧ−24、商標）上での
脱塩、によつて順次精製した。この溶出液を
PH7.6の50mM燐酸塩と400mM燐酸塩の間で41
増加直線勾配を用いてDEAE架橋デキストラン
（DEAEセフアデツクス、商標）上でクロマトグ
ラフイにかけ、次にPH7.2の10mMトリス／HCl
中のフエノール置換架橋アガロース（フエニルセ
フアロース、商標）上で疎水性クロマトグラフに
かけた。溶出液をPH7.6の10mM燐酸塩と
400mM燐酸塩の間での500ml増加直線勾配を用い
てDEAE架橋デキストラン（DEAEセフアデツク
ス、商標）上でクロマトグラフにかけ、次に
PH7.2の10mMトリス／HCl中のフエノール置換
架橋アガロース（フエニルセフアロース、商標）
上で疎水性クロマトグラフにかけた。溶出液を、
PH7.6の10mM燐酸塩と400mM燐酸塩の間での
500ml増加直線勾配を用いてDEAE架橋デキスト
ラン（DEAEセフアデツクス、商標）上でクロマ
トグラフイにかけ、次にPH7.6の250mM燐酸塩
とPH7.2の10mMトリス／HCl間の減少直線勾配
によりフエニル置換架橋アガロース（フエニルセ
フアロース、商標）上で疎水クロマトグラフイに
かけて、続いてPH7.2の10mMトリス／HClで溶
出した。 細胞抽出物にもとづいて得られた収率と比活性
度を表11に示す。
【表】
ロース溶出
精製された酵素は均質であり、分子量約52500
の１構成単位からなる単量体であつた。 実施例 12 バクテリヤ細胞を実施例５の方法で調製した。
細胞をリゾチーム−EDTAによる酵素処理によ
つて破砕し（実施例６の方法）、細胞砕片を遠心
分離により除去して、0.29単位／mg蛋白質を含有
する細胞抽出物を得た。 この細胞抽出物を、先づ硫酸アンモニウム沈殿
次にPH7.6の100mM燐酸塩緩衝液中の架橋デキ
ストラン（セフアデツクスＧ−25、商標）上での
脱塩によつて順次精製した。この溶出液をPH7.6
の100mM燐酸塩と400mM燐酸塩の間で３増加
直線勾配を用いてDEAE架橋デキストラン
（DEAEセフアデツクス、商標）上でクロマトグ
ラフイにかけ、次にPH7.6の300mM燐酸塩と
PH7.2の10mMトリス／HCl間の500ml減少直線
勾配を用いてフエニル置換架橋アガロース（フエ
ニルセフアロース、商標）上で疎水性クロマトグ
ラフイにかけた。溶出液をPH7.2の10mMトリ
ス／HCl中のアガロース−アクリルアミド上での
ゲル過によつてクロマトグラフにかけた。 細胞抽出物にもとずいて得られた収率と比活性
度を表12に示す。
精製された酵素は均質であり、分子量約52500
の１構成単位からなる単量体であつた。 実施例 12 バクテリヤ細胞を実施例５の方法で調製した。
細胞をリゾチーム−EDTAによる酵素処理によ
つて破砕し（実施例６の方法）、細胞砕片を遠心
分離により除去して、0.29単位／mg蛋白質を含有
する細胞抽出物を得た。 この細胞抽出物を、先づ硫酸アンモニウム沈殿
次にPH7.6の100mM燐酸塩緩衝液中の架橋デキ
ストラン（セフアデツクスＧ−25、商標）上での
脱塩によつて順次精製した。この溶出液をPH7.6
の100mM燐酸塩と400mM燐酸塩の間で３増加
直線勾配を用いてDEAE架橋デキストラン
（DEAEセフアデツクス、商標）上でクロマトグ
ラフイにかけ、次にPH7.6の300mM燐酸塩と
PH7.2の10mMトリス／HCl間の500ml減少直線
勾配を用いてフエニル置換架橋アガロース（フエ
ニルセフアロース、商標）上で疎水性クロマトグ
ラフイにかけた。溶出液をPH7.2の10mMトリ
ス／HCl中のアガロース−アクリルアミド上での
ゲル過によつてクロマトグラフにかけた。 細胞抽出物にもとずいて得られた収率と比活性
度を表12に示す。
【表】
リルアミド溶出
実施例 13 バクテリア細胞を実施例５の方法で調製した。
細胞（２Kg）をPH7.6の100mM燐酸カリウム緩
衝液4dm3中に懸濁させ、DNアーゼ（５mg）、RN
アーゼ（５mg）及び0.2MEDTA（200ml）の混合
物で処理した。 この調製物を電磁撹拌機上で穏かに撹拌し、次
にリゾチーム水溶液（50mg/ml）20mlを加えて、
粘度が増加して細胞の溶解が現れるまで、この撹
拌を10分間継続する。この時に、反応混合物に
MgCl2・H2O（0.5M、200ml）を加えて、粘度が
減少するまで撹拌を続ける。次に固体硫酸アンモ
ニウムを飽和濃度の15％まで加え、調製物をソー
バルRC3B遠心分離機（Sorval RC3B
Centrifuge）（Ｈ−600モーター）中で4700ｇ、４
℃で５時間遠心分離した。遠心分離が完了した時
に、上澄液を直ちにデカントし、次に引き続いて
硫酸アンモニウム（飽和の15〜25％）で分別し
て、16時間遠心分離した。デカント、分別（飽和
の25〜40％）及び遠心分離（４時間）を繰返し
た。次にこの上澄液をデカントして廃棄し、最終
の遠心分離からの沈殿物を、エマルサースクリー
ン（emulsor screen）を固定したシルバーソン
試験室用ミキサー（silverson laboratory
mixer）を用いて、PH7.6の100mM燐酸カリウム
500ml中に再懸濁させた。 6dm3のセフアデツクスG25（粗い）カラム（94
×9.0cm）をPH7.6の100mM燐酸カリウムで予め
平衡化し、酵素調製物を2dm3／hrの上向きの流
速でこのカラムに装入した。このカラムをPH7.6
の100mM燐酸カリウムにより2dm3／hrで溶出し
た。溶出液の蛋白質含有量を280nmで監視し、溶
出液中の蛋白質レベルが増加し始めた時（特殊な
評価によつて確認した場合、酵素活性度の増加に
よつて達成される）、溶出液を一つの分画として
捕集する。 5dm3のDEAEセフアデツクスA50カラム（33×
14cm）をPH7.6の100mM燐酸カリウムで予め平
衡化し、アミダーゼを含有するセフアデツクス
G25プール（pool）を、900cm3／hrの下向きの流
速でこのカラムに装入した。このカラムをPH7.6
の100mM燐酸カリウム12.5dm3で洗滌し、次に
PH7.6の100mM燐酸カリウムと400mM燐酸カリ
ウム間の20dm3直線増加勾配（10dm3＋10dm3）を
用いて800cm3／hrで溶出して、300cm3の分画を捕集
した。分画40〜50はピーク酵素活性としてプール
された。 500cm3のフエニルセフアロースCL−4Bカラム
（８×9.0cm）をPH7.6の300mM燐酸カリウムで予
め平衡にし、アミダーゼを含有するDEAEセフア
デツクスプールを400cm3／hrの下向きの流速でこ
のカラムに装入した。このカラムを100cm3／hrで
PH7.6の100mMトリス−HCl1500cm3で洗滌し、
次にPH7.6の100mMトリス−HClと10mMトリス
−HCl間の3dm3直線減少勾配（1.5dm3＋1.5dm3）
を用いて300cm3／hrで溶出した。100cm3の分画を捕
集した。次にこのカラムをPH7.6の10mMトリス
−HCl3dm3を用いて200cm3／hrで溶出し、100cm3の
分画を捕集した。分画21〜37はピーク酵素活性と
してプールされた。 アミダーゼを含有するフエニルセフアロースプ
ールを、頂部は窒素圧下にあり且つ62mm直径の
PM10メンブラン〔公称カトオフ分子量（Cut−
off molecular weight）＝10000〕を有するアミ
コンモデル202濃縮器（Amicor model 202
concentrator）を用いて限外過によつて濃縮し
た。このプールを40cm3の容積までで濃縮した。 2dm3のAcA44ウルトロゲルカラム（ultrogel
column）（94×5.2cm）をPH7.6の100mMトリス
−HClで平衡にし、濃縮酵素溶液を60cm3／hrの上
向きの流速でこのカラムに装入した。このカラム
をPH7.6の100mMトリス−HClを用いて60cm3／
hrで溶出して、60cm3の分画を捕集した。分画16〜
18はピーク酵素活性としてプールされた。 100cm3のDEAEのセフアデツクスA50カラム
（12×3.5cm）をPH7.6の100mMトリス−HClで平
衡化し、アミダーゼを含有するAcA44プールを
20cm3／hrの下向きの流速でこのカラムに装入し
た。カラムをPH7.6の100mM燐酸カリウム400cm3
を用いて洗滌し、次にPH7.6の100mM燐酸カリ
ウムと400mMの燐酸カリウムの間の1dm3直線増
加勾配（500cm3＋500cm3）を用いて20cm3／hrで溶出
して、10cm3の分画を捕集し、分画29〜35はピーク
酵素活性としてプールされた。 50cm3のフエニルセフアロースCL−4Bカラム
（6.5×3.2cm）をPH7.6の100mM燐酸カリウムで
平衡化し、第２のDEAEセフアデツクスプールを
150cm3／hrの下向きの流速でこのカラムに装入し
た。カラムをPH7.6の100mM燐酸カリウム100
cm3、PH7.6の100mMトリス−HCl100cm3、及び
PH7.6の80mMトリス−HCl100cm3で洗滌した。
次にPH7.6の80mMトリス−HClと20mMトリス
−HClの間の300cm3直線減少勾配（150cm3＋150cm3）
を用いて150cm3／hrの流速でカラムを溶出した。
次に、PH7.6の20mMトリス−HCl200cm3を用い
てカラムを溶出して、２cm3の分画を捕集した。分
画150〜170はピーク酵素活性としてプールされ
た。 細胞抽出物にもとずいて得られる収率と比活性
度を表13に示す。
実施例 13 バクテリア細胞を実施例５の方法で調製した。
細胞（２Kg）をPH7.6の100mM燐酸カリウム緩
衝液4dm3中に懸濁させ、DNアーゼ（５mg）、RN
アーゼ（５mg）及び0.2MEDTA（200ml）の混合
物で処理した。 この調製物を電磁撹拌機上で穏かに撹拌し、次
にリゾチーム水溶液（50mg/ml）20mlを加えて、
粘度が増加して細胞の溶解が現れるまで、この撹
拌を10分間継続する。この時に、反応混合物に
MgCl2・H2O（0.5M、200ml）を加えて、粘度が
減少するまで撹拌を続ける。次に固体硫酸アンモ
ニウムを飽和濃度の15％まで加え、調製物をソー
バルRC3B遠心分離機（Sorval RC3B
Centrifuge）（Ｈ−600モーター）中で4700ｇ、４
℃で５時間遠心分離した。遠心分離が完了した時
に、上澄液を直ちにデカントし、次に引き続いて
硫酸アンモニウム（飽和の15〜25％）で分別し
て、16時間遠心分離した。デカント、分別（飽和
の25〜40％）及び遠心分離（４時間）を繰返し
た。次にこの上澄液をデカントして廃棄し、最終
の遠心分離からの沈殿物を、エマルサースクリー
ン（emulsor screen）を固定したシルバーソン
試験室用ミキサー（silverson laboratory
mixer）を用いて、PH7.6の100mM燐酸カリウム
500ml中に再懸濁させた。 6dm3のセフアデツクスG25（粗い）カラム（94
×9.0cm）をPH7.6の100mM燐酸カリウムで予め
平衡化し、酵素調製物を2dm3／hrの上向きの流
速でこのカラムに装入した。このカラムをPH7.6
の100mM燐酸カリウムにより2dm3／hrで溶出し
た。溶出液の蛋白質含有量を280nmで監視し、溶
出液中の蛋白質レベルが増加し始めた時（特殊な
評価によつて確認した場合、酵素活性度の増加に
よつて達成される）、溶出液を一つの分画として
捕集する。 5dm3のDEAEセフアデツクスA50カラム（33×
14cm）をPH7.6の100mM燐酸カリウムで予め平
衡化し、アミダーゼを含有するセフアデツクス
G25プール（pool）を、900cm3／hrの下向きの流
速でこのカラムに装入した。このカラムをPH7.6
の100mM燐酸カリウム12.5dm3で洗滌し、次に
PH7.6の100mM燐酸カリウムと400mM燐酸カリ
ウム間の20dm3直線増加勾配（10dm3＋10dm3）を
用いて800cm3／hrで溶出して、300cm3の分画を捕集
した。分画40〜50はピーク酵素活性としてプール
された。 500cm3のフエニルセフアロースCL−4Bカラム
（８×9.0cm）をPH7.6の300mM燐酸カリウムで予
め平衡にし、アミダーゼを含有するDEAEセフア
デツクスプールを400cm3／hrの下向きの流速でこ
のカラムに装入した。このカラムを100cm3／hrで
PH7.6の100mMトリス−HCl1500cm3で洗滌し、
次にPH7.6の100mMトリス−HClと10mMトリス
−HCl間の3dm3直線減少勾配（1.5dm3＋1.5dm3）
を用いて300cm3／hrで溶出した。100cm3の分画を捕
集した。次にこのカラムをPH7.6の10mMトリス
−HCl3dm3を用いて200cm3／hrで溶出し、100cm3の
分画を捕集した。分画21〜37はピーク酵素活性と
してプールされた。 アミダーゼを含有するフエニルセフアロースプ
ールを、頂部は窒素圧下にあり且つ62mm直径の
PM10メンブラン〔公称カトオフ分子量（Cut−
off molecular weight）＝10000〕を有するアミ
コンモデル202濃縮器（Amicor model 202
concentrator）を用いて限外過によつて濃縮し
た。このプールを40cm3の容積までで濃縮した。 2dm3のAcA44ウルトロゲルカラム（ultrogel
column）（94×5.2cm）をPH7.6の100mMトリス
−HClで平衡にし、濃縮酵素溶液を60cm3／hrの上
向きの流速でこのカラムに装入した。このカラム
をPH7.6の100mMトリス−HClを用いて60cm3／
hrで溶出して、60cm3の分画を捕集した。分画16〜
18はピーク酵素活性としてプールされた。 100cm3のDEAEのセフアデツクスA50カラム
（12×3.5cm）をPH7.6の100mMトリス−HClで平
衡化し、アミダーゼを含有するAcA44プールを
20cm3／hrの下向きの流速でこのカラムに装入し
た。カラムをPH7.6の100mM燐酸カリウム400cm3
を用いて洗滌し、次にPH7.6の100mM燐酸カリ
ウムと400mMの燐酸カリウムの間の1dm3直線増
加勾配（500cm3＋500cm3）を用いて20cm3／hrで溶出
して、10cm3の分画を捕集し、分画29〜35はピーク
酵素活性としてプールされた。 50cm3のフエニルセフアロースCL−4Bカラム
（6.5×3.2cm）をPH7.6の100mM燐酸カリウムで
平衡化し、第２のDEAEセフアデツクスプールを
150cm3／hrの下向きの流速でこのカラムに装入し
た。カラムをPH7.6の100mM燐酸カリウム100
cm3、PH7.6の100mMトリス−HCl100cm3、及び
PH7.6の80mMトリス−HCl100cm3で洗滌した。
次にPH7.6の80mMトリス−HClと20mMトリス
−HClの間の300cm3直線減少勾配（150cm3＋150cm3）
を用いて150cm3／hrの流速でカラムを溶出した。
次に、PH7.6の20mMトリス−HCl200cm3を用い
てカラムを溶出して、２cm3の分画を捕集した。分
画150〜170はピーク酵素活性としてプールされ
た。 細胞抽出物にもとずいて得られる収率と比活性
度を表13に示す。
【表】
沈殿
【表】
ース
酵素の固有分子量 実施例13の方法で調製されたアミダーゼの固有
分子量（native molecular weight）はAcA44ウ
ルトロゲル上でのゲル過によるクロマトグラフ
イーにかけた後に測定された。既知の分子量の蛋
白質標品を用いてカラムを較正した。蛋白質のピ
ークが重ならずに溶出容積を決定するために、次
のグループについてクロマトグラフによつて分折
した： グループ１ ウシの血清アルブミン、キモトリプ
シノーゲンＡ、チトクロームＣ； グループ２ オボアルブミン、ミオグロビン； グループ３ アリールアシルアミダーゼ。 カラムの排除容積をブルーデキストラン2000
（blue dextran 2000）を用いて測定し、全容積
をブロモフエノールブルー染料を用いて測定し
た。アミダーゼの分子量は、Kav対log10（分子
量）の標準曲線から決定された。 Kavは下記式を用いてそれぞれの蛋白質につい
て決定された、 Kav＝Ve−Vo／Vt−Vo 但し、Ve＝溶出容積 Vo＝排除容積 Vt＝全容積 アリールアシルアミダーゼの溶出位置は52000
ダルトン（daltons）の固有分子量（native
molecular weight）を表す。 酵素のサブユニツト分子量 実施例13の方法によつて調製されたアリールア
シルアミダーゼのサブユニツト分子量（subunit
molecular weight）はアリールアシルアミダー
ゼの電気泳動移動度を蛋白質標品の電気泳動移動
度と比較することによつて決定された。 使用された標品はホスホリラーゼＢ（100000ダ
ルトン）、ウシ血清アルブミン（68000ダルトン）、
オボアルブミン（45000ダルトン）、カルボニツク
アンヒドラーゼ（29000ダルトン）、大豆トリプシ
ン阻害剤（21500ダルトン）及びリゾチーム
（14300ダルトン）であつた。標品の電気泳動移動
度はブロモフエノールブルーマーカー
（bromophenol blue marker）の対応する移動度
に関する百分率として表わされた。log10（分子
量）対電気泳動移動度の較正グラフは、アミダー
ゼの分子量を決定するのに用いられた。 52500ダルトンのサブユニツト分子量が得られ
た。 等電集束 実施例13の方法で調製されたアミダーゼ酵素の
等電点は等電集束（isoelectric focusing）によ
つてPH7.2であることが判明した。
酵素の固有分子量 実施例13の方法で調製されたアミダーゼの固有
分子量（native molecular weight）はAcA44ウ
ルトロゲル上でのゲル過によるクロマトグラフ
イーにかけた後に測定された。既知の分子量の蛋
白質標品を用いてカラムを較正した。蛋白質のピ
ークが重ならずに溶出容積を決定するために、次
のグループについてクロマトグラフによつて分折
した： グループ１ ウシの血清アルブミン、キモトリプ
シノーゲンＡ、チトクロームＣ； グループ２ オボアルブミン、ミオグロビン； グループ３ アリールアシルアミダーゼ。 カラムの排除容積をブルーデキストラン2000
（blue dextran 2000）を用いて測定し、全容積
をブロモフエノールブルー染料を用いて測定し
た。アミダーゼの分子量は、Kav対log10（分子
量）の標準曲線から決定された。 Kavは下記式を用いてそれぞれの蛋白質につい
て決定された、 Kav＝Ve−Vo／Vt−Vo 但し、Ve＝溶出容積 Vo＝排除容積 Vt＝全容積 アリールアシルアミダーゼの溶出位置は52000
ダルトン（daltons）の固有分子量（native
molecular weight）を表す。 酵素のサブユニツト分子量 実施例13の方法によつて調製されたアリールア
シルアミダーゼのサブユニツト分子量（subunit
molecular weight）はアリールアシルアミダー
ゼの電気泳動移動度を蛋白質標品の電気泳動移動
度と比較することによつて決定された。 使用された標品はホスホリラーゼＢ（100000ダ
ルトン）、ウシ血清アルブミン（68000ダルトン）、
オボアルブミン（45000ダルトン）、カルボニツク
アンヒドラーゼ（29000ダルトン）、大豆トリプシ
ン阻害剤（21500ダルトン）及びリゾチーム
（14300ダルトン）であつた。標品の電気泳動移動
度はブロモフエノールブルーマーカー
（bromophenol blue marker）の対応する移動度
に関する百分率として表わされた。log10（分子
量）対電気泳動移動度の較正グラフは、アミダー
ゼの分子量を決定するのに用いられた。 52500ダルトンのサブユニツト分子量が得られ
た。 等電集束 実施例13の方法で調製されたアミダーゼ酵素の
等電点は等電集束（isoelectric focusing）によ
つてPH7.2であることが判明した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ アリールアシルアミダーゼ産生バクテリアが
アリールアシルアミダーゼを産生する培地中でこ
のバクテリアを培養して、アリールアシルアミダ
ーゼとその他の不必要な物質とからなる酵素含有
物質を生産させ、この酵素含有物質を捕集するこ
とからなる方法であつて、このバクテリアが、菌
株プソイドモナスフルオレツセンスATCC 39005
又はそれらのアリールアシルアミダーゼ産生突然
変異株又は変異株の一種、もしくはプソイドモナ
スプチダATCC 39004又はそれらのアリールアシ
ルアミダーゼ産生突然変異株又は変異株の一種で
あることを特徴とするアリールアシルアミダーゼ
酵素の生産方法。 ２ 酵素含有物質が細胞物質であることを特徴と
する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ 更に、捕集した細胞物質を破砕してアリール
アシルアミダーゼ酵素とその他の細胞成分を放出
させることを特徴とする特許請求の範囲第２項に
記載の方法。 ４ 更に、アリールアシルアミダーゼ酵素を他の
不必要な物質、特にその他の細胞成分から分離す
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第３
項のいずれか一項に記載の方法。 ５ 培地が少なくとも１種のＮ−アシルアニリン
を含有することを特徴とする特許請求の範囲第１
項〜第４項のいずれか一項に記載の方法。 ６ この少なくとも１種のＮ−アシルアニリンが
Ｎ−アセチルアニリンからなることを特徴とする
特許請求の範囲第５項に記載の方法。 ７ 少なくとも１種のＮ−アシルアニリンが、Ｎ
−アセチル−３−ヒドロキシアニリン、Ｎ−アセ
チル−４−ヒドロキシアニリン、Ｎ−アセチル−
４−エトキシアニリン、Ｎ−アセチル−２−メチ
ルアニリン、Ｎ−アセチル−３−メチルアニリン
及びＮ−アセチル−４−メチルアニリンからなる
群から選択された少なくとも１種のＮ−アシルア
ニリンからなることを特徴とする特許請求の範囲
第５項又は第６項に記載の方法。 ８ バクテリアがバツチ培養で培養され且つ、こ
の培地が、バクテリアに利用されうる少なくとも
１種のＮ−アシルアニリンを0.01〜0.25％（重
量／容量）、好ましくは0.05〜0.15％（重量／容
量）含有することを特徴とする特許請求の範囲第
５項〜第７項のいずれか一項に記載の方法。 ９ バクテリアが連続培養で培養され、且つこの
培地が、バクテリアに利用されうる少なくとも１
種のＮ−アシルアニリンを、0.001〜0.2％（重
量／容量）含有することを特徴とする特許請求の
範囲第５項〜第７項のいずれか一項に記載の方
法。 １０ 培地が複合培地であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項〜第９項のいずれか一項に記
載の方法。 １１ 培地の温度が10〜45℃、好ましくは20〜30
℃の間にあることを特徴とする特許請求の範囲第
１項〜第１０項のいずれか一項に記載の方法。 １２ 培地のPHが６〜９、好ましくは６〜7.5の
間であることを特徴とする特許請求の範囲第１項
〜第１１項のいずれか一項に記載の方法。 １３ バクテリアが好気性条件下で培養されるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第１２項
のいずれか一項に記載の方法。 １４ デオキシリボヌクレアーゼとリボヌクレア
ーゼの存在下でリゾチームとEDTAの混合物と
捕集された細胞物質を酵素処理することにより、
この細胞物質を破砕することを特徴とする特許請
求の範囲第３項〜第１３項のいずれか一項に記載
の方法。 １５ アリールアシルアミダーゼ酵素の分子の大
きさ、分子の形状、分子の電荷、疎水性親和力又
は溶解度から選択された１種或いはそれ以上の性
質と、分離を達成すべき他の不必要な物質それぞ
れの分子の大きさ、分子の形状、分子の電荷、疎
水性親和力又は溶解度から選択された１種或いは
それ以上の性質との間の差違を利用する分離方法
によつて、他の不必要な物質からアリールアシル
アミダーゼ酵素を分離することを特徴とする特許
請求の範囲第４項〜第１４項のいずれか一項に記
載の方法。 １６ 分離方法が少なくともクロマトグラフ法か
らなることを特徴とする特許請求の範囲第１５項
に記載の方法。 １７ 分離方法が沈澱、疎水性クロマトグラフイ
ー及びイオン交換クロマトグラフイーのステツプ
からなることを特徴とする特許請求の範囲第１６
項に記載の方法。 １８ 10mMと80mMの間のイオン強度を有する
トリス−HCl（約7.2のPH）を用いて、フエニル置
換架橋結合したアガロースマトリツクス上で疎水
性クロマトグラフイーを行うことを特徴とする特
許請求の範囲第１７項に記載の方法。 １９ 約7.6のPHで250mMと10mMの間のイオン
強度をもつ減少直線勾配を用いて、フエニル置換
架橋結合したアガロースマトリツクス上で疎水性
クロマトグラフイーを行うことを特徴とする特許
請求の範囲第１７項に記載の方法。 ２０ 約7.6のPHで50mMと400mMの間のイオン
強度をもつ増加勾配を用いてDEAE架橋結合した
デキストランマトリツクス上でイオン交換クロマ
トグラフイーを行うことを特徴とする特許請求の
範囲第１７項〜第１９項のいずれか一項に記載の
方法。 ２１ 分離方法が更にゲル濾過のステツプを含む
ことを特徴とする特許請求の範囲第１７項〜第２
０項のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| GB8038633 | 1980-12-02 |
Publications (2)
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|---|---|
| JPS57122794A JPS57122794A (en) | 1982-07-30 |
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Family Applications (1)
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