JPH0260312B2 - - Google Patents
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- JPH0260312B2 JPH0260312B2 JP57070598A JP7059882A JPH0260312B2 JP H0260312 B2 JPH0260312 B2 JP H0260312B2 JP 57070598 A JP57070598 A JP 57070598A JP 7059882 A JP7059882 A JP 7059882A JP H0260312 B2 JPH0260312 B2 JP H0260312B2
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- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
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- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
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Description
本発明は酵素の新規な精製法に関するものであ
る。さらに詳細には本発明は、酵素を含有する溶
液、例えば微生物培養液、細胞抽出液等をハイポ
ーラス型の強酸性陽イオン交換樹脂またはパイポ
ーラス型の強塩基性陰イオン交換樹脂に接触させ
て、酵素を選択的に吸着させ、必要ならばイオン
交換樹脂を水および緩衝液等で十分洗浄し、不純
物を除いた後に、イオン交換樹脂に吸着している
酵素を溶出剤により溶出し、その活性区分を集め
て精製酵素溶液を得る方法に関する。 従来酵素の精製法としては、数多くの方法が考
案されており弱塩基性陰イオン交換樹脂および弱
酸性陽イオン交換樹脂合成吸着剤、セルロース、
セフアデツクス、カーボン等の吸着剤を用いる方
法が知られている。しかしながら、これらの酵素
の精製法は工業的に酵素を精製しようとする場合
に、いずれも以下で述べるような理由でその使用
が難しい例が多い。例えば合成吸着剤であるアン
バーライトXAD系樹脂（ロームアンドハース社
製、商品名）およびダイヤイオンHP系樹脂（三
菱化成工業社製：商品名）などを用いた酵素精製
法では、酵素液を樹脂と接触させても酵素は樹脂
へほとんど吸着しないかまたは吸着するが、溶出
剤で溶出してもほとんど溶出されない場合が多
い。またこの方法を適用できる酵素はプロテアー
ゼ、アミラーゼなどに限定される。またイオン交
換樹脂を有するセフアデツクスなどを用いた酵素
精製法ではクロマト分離法などの点で優れた面が
あるがカラム操作を行う場合、十分な流速が得ら
れず工業的方法としては問題がある。さらにイオ
ン交換樹脂を用いる例としては、弱酸性陽イオン
交換樹脂のアンバーライトIRC−50、CG−50（ロ
ームアンドハース社製：商品名）および弱塩基性
陰イオン交換樹脂のデユオライトＡ−７（ダイヤ
モンドシヤロツク社製：商品名）などが知られて
いる。しかしこれらのイオン交換樹脂は中性塩分
解能がないこと、比表面積が小さいことなどの理
由から不純物の多い粗酵素溶液やイオン強度の高
い塩類、緩衝液などに酵素が溶解している酵素溶
液では、イオン交換樹脂に酵素が吸着しないか、
または吸着してもその量は極めて低く実用的でな
い。また強酸性陽イオン交換樹脂では巨大網目構
造型のAGMP−50（バイオラツド・ラボラトリー
社製：商品名）等が酵素を吸着溶出できるといわ
れているが、吸着量等明らかでなく実用的な適用
は不明である。 一方強塩基製陰イオン交換樹脂では巨大網目構
造型のアンバーライトIRA−904、IRA−938（ロ
ームアンドハース社製：商品名）を用いて、ペプ
シンの吸着溶出やクレアチニンキナーゼの分析へ
の応用などが知られている。 本発明者らは幅広い酵素の工業的精製方法を
種々検討した。その結果イオン交換樹脂の中でハ
イポーラス型の強酸性陽イオン交換樹脂またはハ
イポーラス型の強塩基性陰イオン交換樹脂と各種
酵素溶液とを接触させることにより酵素をイオン
交換樹脂に高い吸着量で吸着させることができ、
適当な溶出剤で溶出すると、溶出液中に収率良く
しかも酵素比活性を高めて、酵素を溶出できるこ
とを見出し本発明を完成するに至つた。 本発明で使用されるハイポーラス型の強塩基性
陰イオン交換樹脂−巨大網目構造型樹脂に属する
−によればある種の酵素の吸脱着に適用できるこ
とが知られている巨大網目構造型の強塩基性陰イ
オン交換樹脂であるアンバーライトIRA−904、
IRA−938と比較して吸着量で２倍以上、酵素比
活性上昇で１〜３倍の効果をあげることができ
る。一方、本発明で使用するハイポーラス型の強
酸性陽イオン交換樹脂−巨大網目構造型樹脂に属
する−は酵素を吸着溶出できるといわれている巨
大網目構造型の強酸性陽イオン交換樹脂である
AGMP−50、デユオライトＣ−10（ダイヤモンド
シヤムロツク社製：商品名）に比べ２−３倍の吸
着量を有する。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明で用いられる巨大網目構造のイオン交換
樹脂としては、巨大網目構造を持つスチレン−ジ
ビニルベンゼン重合体の母核に４級アンモニウム
基またはスルホ基を交換基として導入したものが
あげられる。具体的には、例えばハイポーラス型
の強塩基性陰イオン交換樹脂では、ダイヤイオン
HPA−25、HPA−75（三菱化成工業社製：商品
名）などがあげられる。パイポーラス型強酸性陽
イオン交換樹脂では、ダイヤイオンHPK−16、
HPK−25、HPK−30、HPK−40（三菱化成工業
社製：商品名）などがあげられる。 これらのハイポーラス型イオン交換樹脂は第１
表に示されるように150Å以上の大きな平均細孔
半径５m2／ｇ−乾燥樹脂以上の広い比表面積さら
に0.2cm2／ｇ−乾燥樹脂以上の大きな細孔容積を
持つているので分子量の大きな酵素分子でもかな
りの量がマクロポアーに出入りできる。これがこ
れら樹脂で高い吸着量および高い溶出率が得られ
る原因と考えられる。
る。さらに詳細には本発明は、酵素を含有する溶
液、例えば微生物培養液、細胞抽出液等をハイポ
ーラス型の強酸性陽イオン交換樹脂またはパイポ
ーラス型の強塩基性陰イオン交換樹脂に接触させ
て、酵素を選択的に吸着させ、必要ならばイオン
交換樹脂を水および緩衝液等で十分洗浄し、不純
物を除いた後に、イオン交換樹脂に吸着している
酵素を溶出剤により溶出し、その活性区分を集め
て精製酵素溶液を得る方法に関する。 従来酵素の精製法としては、数多くの方法が考
案されており弱塩基性陰イオン交換樹脂および弱
酸性陽イオン交換樹脂合成吸着剤、セルロース、
セフアデツクス、カーボン等の吸着剤を用いる方
法が知られている。しかしながら、これらの酵素
の精製法は工業的に酵素を精製しようとする場合
に、いずれも以下で述べるような理由でその使用
が難しい例が多い。例えば合成吸着剤であるアン
バーライトXAD系樹脂（ロームアンドハース社
製、商品名）およびダイヤイオンHP系樹脂（三
菱化成工業社製：商品名）などを用いた酵素精製
法では、酵素液を樹脂と接触させても酵素は樹脂
へほとんど吸着しないかまたは吸着するが、溶出
剤で溶出してもほとんど溶出されない場合が多
い。またこの方法を適用できる酵素はプロテアー
ゼ、アミラーゼなどに限定される。またイオン交
換樹脂を有するセフアデツクスなどを用いた酵素
精製法ではクロマト分離法などの点で優れた面が
あるがカラム操作を行う場合、十分な流速が得ら
れず工業的方法としては問題がある。さらにイオ
ン交換樹脂を用いる例としては、弱酸性陽イオン
交換樹脂のアンバーライトIRC−50、CG−50（ロ
ームアンドハース社製：商品名）および弱塩基性
陰イオン交換樹脂のデユオライトＡ−７（ダイヤ
モンドシヤロツク社製：商品名）などが知られて
いる。しかしこれらのイオン交換樹脂は中性塩分
解能がないこと、比表面積が小さいことなどの理
由から不純物の多い粗酵素溶液やイオン強度の高
い塩類、緩衝液などに酵素が溶解している酵素溶
液では、イオン交換樹脂に酵素が吸着しないか、
または吸着してもその量は極めて低く実用的でな
い。また強酸性陽イオン交換樹脂では巨大網目構
造型のAGMP−50（バイオラツド・ラボラトリー
社製：商品名）等が酵素を吸着溶出できるといわ
れているが、吸着量等明らかでなく実用的な適用
は不明である。 一方強塩基製陰イオン交換樹脂では巨大網目構
造型のアンバーライトIRA−904、IRA−938（ロ
ームアンドハース社製：商品名）を用いて、ペプ
シンの吸着溶出やクレアチニンキナーゼの分析へ
の応用などが知られている。 本発明者らは幅広い酵素の工業的精製方法を
種々検討した。その結果イオン交換樹脂の中でハ
イポーラス型の強酸性陽イオン交換樹脂またはハ
イポーラス型の強塩基性陰イオン交換樹脂と各種
酵素溶液とを接触させることにより酵素をイオン
交換樹脂に高い吸着量で吸着させることができ、
適当な溶出剤で溶出すると、溶出液中に収率良く
しかも酵素比活性を高めて、酵素を溶出できるこ
とを見出し本発明を完成するに至つた。 本発明で使用されるハイポーラス型の強塩基性
陰イオン交換樹脂−巨大網目構造型樹脂に属する
−によればある種の酵素の吸脱着に適用できるこ
とが知られている巨大網目構造型の強塩基性陰イ
オン交換樹脂であるアンバーライトIRA−904、
IRA−938と比較して吸着量で２倍以上、酵素比
活性上昇で１〜３倍の効果をあげることができ
る。一方、本発明で使用するハイポーラス型の強
酸性陽イオン交換樹脂−巨大網目構造型樹脂に属
する−は酵素を吸着溶出できるといわれている巨
大網目構造型の強酸性陽イオン交換樹脂である
AGMP−50、デユオライトＣ−10（ダイヤモンド
シヤムロツク社製：商品名）に比べ２−３倍の吸
着量を有する。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明で用いられる巨大網目構造のイオン交換
樹脂としては、巨大網目構造を持つスチレン−ジ
ビニルベンゼン重合体の母核に４級アンモニウム
基またはスルホ基を交換基として導入したものが
あげられる。具体的には、例えばハイポーラス型
の強塩基性陰イオン交換樹脂では、ダイヤイオン
HPA−25、HPA−75（三菱化成工業社製：商品
名）などがあげられる。パイポーラス型強酸性陽
イオン交換樹脂では、ダイヤイオンHPK−16、
HPK−25、HPK−30、HPK−40（三菱化成工業
社製：商品名）などがあげられる。 これらのハイポーラス型イオン交換樹脂は第１
表に示されるように150Å以上の大きな平均細孔
半径５m2／ｇ−乾燥樹脂以上の広い比表面積さら
に0.2cm2／ｇ−乾燥樹脂以上の大きな細孔容積を
持つているので分子量の大きな酵素分子でもかな
りの量がマクロポアーに出入りできる。これがこ
れら樹脂で高い吸着量および高い溶出率が得られ
る原因と考えられる。
【表】
本発明で用いるイオン交換樹脂の交換基は強塩
基および強酸であることから強いイオン交換作用
を示すため塩類高濃度溶液、高濃度緩衝液および
不純物の多い溶液中に存在する酵素と樹脂とを接
触させても酵素を吸着することができることが特
徴である。各種酵素を用いて吸着、溶出実験を行
ない、その時の吸着量および溶出率を第２表に示
したが、本発明で使用できる酵素は極めて巾広
く、効果的に精製できる。 特に本発明で用いるイオン交換樹脂は酵素の吸
着および溶出に適用できることが知られている巨
大網目構造のイオン交換樹脂に比べ吸着量や溶出
率等に優れている。さらに酵素蛋白の等電点によ
り強酸性陽イオン交換および強塩基性陰イオン交
換樹脂を使い分けることができる。 一般的に酵素はPHが中性付近で安定性が良いの
で、中性付近で操作を行なうことが、収率を高め
るために重要である。酸性側に等電点を持つ酵素
蛋白は中性付近では負に帯電しているため、強塩
基性陰イオン交換樹脂に吸着させるのが適してい
る。一方アルカリ側に等電点を持つ酵素蛋白は中
性付近では正に帯電しているため、強酸性陽イオ
ン交換樹脂に吸着させるのが適している。 本発明に適用できる酵素としてはあらゆる種類
の酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リア
ーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどがあげられる
が、具体的には第２表および実施例に記載したも
のが好適なものとしてあげられる。
基および強酸であることから強いイオン交換作用
を示すため塩類高濃度溶液、高濃度緩衝液および
不純物の多い溶液中に存在する酵素と樹脂とを接
触させても酵素を吸着することができることが特
徴である。各種酵素を用いて吸着、溶出実験を行
ない、その時の吸着量および溶出率を第２表に示
したが、本発明で使用できる酵素は極めて巾広
く、効果的に精製できる。 特に本発明で用いるイオン交換樹脂は酵素の吸
着および溶出に適用できることが知られている巨
大網目構造のイオン交換樹脂に比べ吸着量や溶出
率等に優れている。さらに酵素蛋白の等電点によ
り強酸性陽イオン交換および強塩基性陰イオン交
換樹脂を使い分けることができる。 一般的に酵素はPHが中性付近で安定性が良いの
で、中性付近で操作を行なうことが、収率を高め
るために重要である。酸性側に等電点を持つ酵素
蛋白は中性付近では負に帯電しているため、強塩
基性陰イオン交換樹脂に吸着させるのが適してい
る。一方アルカリ側に等電点を持つ酵素蛋白は中
性付近では正に帯電しているため、強酸性陽イオ
ン交換樹脂に吸着させるのが適している。 本発明に適用できる酵素としてはあらゆる種類
の酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リア
ーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどがあげられる
が、具体的には第２表および実施例に記載したも
のが好適なものとしてあげられる。
【表】
【表】
＊１ 溶出液の酵素比活性と樹脂処理前の発酵液の酵
素比活性との比
＊２ IUは国際単位
本発明の方法において、培養液または細胞抽出
液のごとき粗酵素液に在る酵素を吸着せしめる場
合、イオン交換樹脂を粗酵素液と混合して回分式
に撹拌する方法、若しくはイオン交換樹脂をカラ
ム・クロマトグラフイーの手法を用いてもよい。
回分法では、粗酵素液を適当なPHに調節し、該液
に対し1/5〜1/10量のイオン交換樹脂を加え、ゆ
るやかに30〜60分間撹拌する。温度は酵素の安定
性にもよるが、一般的には低温が望ましい。 カラムクロマトグラフイーの手法では、PHを適
当に調節した粗酵素液を樹脂カラムに通し、処理
温度は回分法の場合と同様である。吸着された酵
素を溶出するには、緩衝液、塩類、界面活性剤、
例えば0.1〜0.5Mリン酸緩衝液、0.1〜1M硫酸ア
ンモニウム、0.5％トリトンＸ−100を含む緩衝液
等の如き通常の溶出剤を用いることができる。溶
出剤の選択は、酵素の種類、夾雑物の量と種類、
使用されたイオン交換樹脂の種類等に合せてなさ
れるべきであるが、特定の酵素を純度よく分画す
るためには、酵素の安定性を加味し、硫酸アンモ
ニウムと緩衝液の混合系が一般に優れている。溶
出剤によつては夾雑している酵素とクロマト分離
をすることも可能である。 巨大網目構造を有する強塩基性陰イオン交換樹
脂および強酸性陽イオン交換樹脂を酵素精製に用
いる特徴的利点は、大きな吸着容量を持つこと、
夾雑物の多い粗酵素液に直接応用できること、分
画能が高く、他の夾雑する酵素とのクロマト分離
も可能で酵素比活性を大巾に高めることができる
こと、工業的スケールがカラムクロマトグラフイ
ーを行う場合に早い流速が確保できること等があ
げられる。 本発明の方法に従つて得られる精製酵素は種々
の条件下に保存してもその保存安定性、熱安定性
に関し、悪影響を受けることがない。 本発明の精製法は、沈澱化、透析法またはクロ
マトグラフイー的手法などの酵素精製法を併用す
ることももちろん可能である。 次に本発明の態様を実施例により説明する。 実施例 １ ラクテートデヒドロゲナーゼ生産菌、ラクトバ
シルス・ブリガリカス（Lactobacillus
bulgaricus）IAM1120菌株の培養液（１）を
遠心分離して得た菌体を、50ｍＭ燐酸緩衝液（PH
7.0）50mlで洗浄後、50ｍＭ燐酸緩衝液（PH7.0）
250mlに懸濁し、ガラスビーズ（φ0.25〜0.5mm）
を加え、ダイノミル（Dyno mill）で菌体を破砕
した。 得られた菌体破砕物懸濁液を遠心分離し、抽出
液250mlを得た。この抽出液には、約20000IUの
ラクテートデヒドロゲナーが含まれていた。この
抽出液を50mlのダイヤイオンHPA−25（OHタイ
プ）を充填したカラムに流速50ml／時間で通し、
抽出液中のラクテートデヒドロゲナーゼをイオン
交換樹脂に吸着せしめた。イオン交換樹脂を50ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（PH7.0）500mlで洗浄後、0.5M硫
酸アンモニウムを含む50ｍＭ燐酸緩衝液（PH7.0）
200mlをイオン交換樹脂カラムに流速50ml／時間
で通して、10ml分画で酵素の溶出を行なつた。ラ
クテートデヒドロゲナーゼ活性が5IU／ml以上を
示すフラクシヨン100mlを集めた。この溶出中の
ラクテートデヒドロゲナーゼは1750IU、収率は
87.5％、酵素の比活性の上昇率は15倍であつた。 実施例 ２ リポプロテイン リパーゼ（Lipoprotein
Lipase）生産菌リゾプス・ジヤポニクス
（Rhizopus japonicus KY521 FERM−P3651）
菌株の培養液を遠心分離して得たリポプロテイン
リバーゼ含有の上澄液（培養液）１（リポプ
ロテインリパーゼ活性600IU）を100mlのダイヤ
イオンHPA−25（Clタイプ）を充填したカラムに
流速100ml／時間で通塔し、培養液中のリポプ
ロテインリパーゼをイオン交換樹脂に吸着せしめ
る。イオン交換樹脂を10ｍＭ燐酸緩衝液（PH6.5）
１で洗浄後、1M塩化ナトリウムを含む、50ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（PH6.5）300mlをイオン交換樹脂カ
ラムに流速100ml／時間で通して10ml分画で酵素
の溶出を行なつた。リポプロテインリパーゼ活性
0.5IU／ml以上を示すフラクシヨン180mlを集め
た。この溶出液中のリポプロテインリパーゼは
380IU、収率は63.3％、酵素の比活性の上昇率は
11倍であつた。 実施例 ３ グルタミナーゼ生産菌シユードモナス属の一種
でＰ−210（ATCC−21025）菌株の培養液５を
遠心分離して得た菌体を10ｍＭ燐酸緩衝液（PH
6.0）２で洗浄後、10ｍＭアスパラギン酸ナト
リウムを含む10ｍＭ燐酸緩衝液（PH6.0）500mlに
懸濁し、ガラスビーズ（φ0.5〜0.75mm）を加え、
ダイノミルで菌体を破砕した。得られた菌体破砕
懸濁液を遠心分離し、抽出液550mlを得た。この
抽出液には約20000IUのグルタミナーゼが含まれ
ていた。この抽出液を250mlのダイヤイオンHPK
−30（Naタイプ）を充填したカラムに流速250
ml／時間で通し、抽出液中のグルタミナーゼをイ
オン交換樹脂に吸着せしめた。イオン交換樹脂を
10ｍＭアスパラギン酸ナトリウムを含む10ｍＭ燐
酸緩衝液（PH6.0）2.5で洗浄後、10ｍＭアスパ
ラギン酸ナトリウムおよび0.5M硫酸アンモニウ
ムを含む10ｍＭ燐酸緩衝液（PH8.0）１をイオ
ン交換樹脂カラムに流速250ml／時間で通して、
20ml分画で酵素の溶出を行なつた。グルタミナー
ゼ活性が5IU／ml以上を示すフラクシヨン600ml
を集めた。この溶出液中のグルタミナーゼは
13000IU、収率は65％、酵素の比活性の上昇率は
42倍であつた。 実施例 ４ ピラノースオキシダーゼ生産菌コリオラスペル
シカラー（Corirus versicolor）ATCC20155菌
株の培養液10を過して得た菌体を50ｍＭトリ
ス緩衝液（PH7.0）１に懸濁し、ガラスビーズ
（φ0.5〜0.75mm）を加え、ダイノミルで菌体を破
砕した。得られた菌体破砕物懸濁液を遠心分離
し、抽出液800mlを得た。この抽出液には、
950IUのピラノースオキシダーゼが含まれてい
た。この抽出液を500mlのダイヤイオンHPA−75
（Clタイプ）を充填したカラムに流速250ml／時間
で通し、抽出液中のピラノースオキシダーゼをイ
オン交換樹脂に吸着せしめる。イオン交換樹脂を
0.1Mアンモニウムを含む50ｍＭトリス緩衝液
（PH7.0）2.5で洗浄後、0.25M硫酸アンモニウム
を含む50ｍＭトリス緩衝液（PH7.0）２をイオ
ン交換樹脂カラムに流速500ml／時間で通して、
20ml分画で酵素の溶出を行なつた。ピラノースオ
キシダーゼ活性が0.25IU／ml以上を示すフラクシ
ヨン750mlを集めた。この溶出液中のピラノース
オキシダーゼは732IU、収率77％、酵素の比活性
の上昇率は17.8倍であつた。 実施例 ５ プロテアーゼ生産菌 セラチア属
（Serratiaspb.ATCC21074）菌株の培養液を遠心
分離して得たプロテアーゼ含有の上澄液（培養
液）１（プロテアーゼ600KIU）を50mlのダイ
ヤイオンHPA−75（Clタイプ）を充填したカラム
に流速200ml／時間で通塔し、培養液中のプロ
テアーゼをイオン交換樹脂に吸着せしめた。イオ
ン交換樹脂を10ｍＭ燐酸緩衝液（PH７）150mlで
洗浄後、1M硫酸アンモニウムを含む10mlＭ燐酸
緩衝液（PH７）150mlをイオン交換樹脂カラムに
流速50ml／時間で通して、10ml分画で酵素の溶出
を行なつた。プロテアーゼ活性2000IU／ml以上
を示すフラクシヨン80mlを集めた。この溶出液中
のプロテアーゼは、510KIU、収率は85％、酵素
の比活性の上昇率は８倍であつた。
素比活性との比
＊２ IUは国際単位
本発明の方法において、培養液または細胞抽出
液のごとき粗酵素液に在る酵素を吸着せしめる場
合、イオン交換樹脂を粗酵素液と混合して回分式
に撹拌する方法、若しくはイオン交換樹脂をカラ
ム・クロマトグラフイーの手法を用いてもよい。
回分法では、粗酵素液を適当なPHに調節し、該液
に対し1/5〜1/10量のイオン交換樹脂を加え、ゆ
るやかに30〜60分間撹拌する。温度は酵素の安定
性にもよるが、一般的には低温が望ましい。 カラムクロマトグラフイーの手法では、PHを適
当に調節した粗酵素液を樹脂カラムに通し、処理
温度は回分法の場合と同様である。吸着された酵
素を溶出するには、緩衝液、塩類、界面活性剤、
例えば0.1〜0.5Mリン酸緩衝液、0.1〜1M硫酸ア
ンモニウム、0.5％トリトンＸ−100を含む緩衝液
等の如き通常の溶出剤を用いることができる。溶
出剤の選択は、酵素の種類、夾雑物の量と種類、
使用されたイオン交換樹脂の種類等に合せてなさ
れるべきであるが、特定の酵素を純度よく分画す
るためには、酵素の安定性を加味し、硫酸アンモ
ニウムと緩衝液の混合系が一般に優れている。溶
出剤によつては夾雑している酵素とクロマト分離
をすることも可能である。 巨大網目構造を有する強塩基性陰イオン交換樹
脂および強酸性陽イオン交換樹脂を酵素精製に用
いる特徴的利点は、大きな吸着容量を持つこと、
夾雑物の多い粗酵素液に直接応用できること、分
画能が高く、他の夾雑する酵素とのクロマト分離
も可能で酵素比活性を大巾に高めることができる
こと、工業的スケールがカラムクロマトグラフイ
ーを行う場合に早い流速が確保できること等があ
げられる。 本発明の方法に従つて得られる精製酵素は種々
の条件下に保存してもその保存安定性、熱安定性
に関し、悪影響を受けることがない。 本発明の精製法は、沈澱化、透析法またはクロ
マトグラフイー的手法などの酵素精製法を併用す
ることももちろん可能である。 次に本発明の態様を実施例により説明する。 実施例 １ ラクテートデヒドロゲナーゼ生産菌、ラクトバ
シルス・ブリガリカス（Lactobacillus
bulgaricus）IAM1120菌株の培養液（１）を
遠心分離して得た菌体を、50ｍＭ燐酸緩衝液（PH
7.0）50mlで洗浄後、50ｍＭ燐酸緩衝液（PH7.0）
250mlに懸濁し、ガラスビーズ（φ0.25〜0.5mm）
を加え、ダイノミル（Dyno mill）で菌体を破砕
した。 得られた菌体破砕物懸濁液を遠心分離し、抽出
液250mlを得た。この抽出液には、約20000IUの
ラクテートデヒドロゲナーが含まれていた。この
抽出液を50mlのダイヤイオンHPA−25（OHタイ
プ）を充填したカラムに流速50ml／時間で通し、
抽出液中のラクテートデヒドロゲナーゼをイオン
交換樹脂に吸着せしめた。イオン交換樹脂を50ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（PH7.0）500mlで洗浄後、0.5M硫
酸アンモニウムを含む50ｍＭ燐酸緩衝液（PH7.0）
200mlをイオン交換樹脂カラムに流速50ml／時間
で通して、10ml分画で酵素の溶出を行なつた。ラ
クテートデヒドロゲナーゼ活性が5IU／ml以上を
示すフラクシヨン100mlを集めた。この溶出中の
ラクテートデヒドロゲナーゼは1750IU、収率は
87.5％、酵素の比活性の上昇率は15倍であつた。 実施例 ２ リポプロテイン リパーゼ（Lipoprotein
Lipase）生産菌リゾプス・ジヤポニクス
（Rhizopus japonicus KY521 FERM−P3651）
菌株の培養液を遠心分離して得たリポプロテイン
リバーゼ含有の上澄液（培養液）１（リポプ
ロテインリパーゼ活性600IU）を100mlのダイヤ
イオンHPA−25（Clタイプ）を充填したカラムに
流速100ml／時間で通塔し、培養液中のリポプ
ロテインリパーゼをイオン交換樹脂に吸着せしめ
る。イオン交換樹脂を10ｍＭ燐酸緩衝液（PH6.5）
１で洗浄後、1M塩化ナトリウムを含む、50ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（PH6.5）300mlをイオン交換樹脂カ
ラムに流速100ml／時間で通して10ml分画で酵素
の溶出を行なつた。リポプロテインリパーゼ活性
0.5IU／ml以上を示すフラクシヨン180mlを集め
た。この溶出液中のリポプロテインリパーゼは
380IU、収率は63.3％、酵素の比活性の上昇率は
11倍であつた。 実施例 ３ グルタミナーゼ生産菌シユードモナス属の一種
でＰ−210（ATCC−21025）菌株の培養液５を
遠心分離して得た菌体を10ｍＭ燐酸緩衝液（PH
6.0）２で洗浄後、10ｍＭアスパラギン酸ナト
リウムを含む10ｍＭ燐酸緩衝液（PH6.0）500mlに
懸濁し、ガラスビーズ（φ0.5〜0.75mm）を加え、
ダイノミルで菌体を破砕した。得られた菌体破砕
懸濁液を遠心分離し、抽出液550mlを得た。この
抽出液には約20000IUのグルタミナーゼが含まれ
ていた。この抽出液を250mlのダイヤイオンHPK
−30（Naタイプ）を充填したカラムに流速250
ml／時間で通し、抽出液中のグルタミナーゼをイ
オン交換樹脂に吸着せしめた。イオン交換樹脂を
10ｍＭアスパラギン酸ナトリウムを含む10ｍＭ燐
酸緩衝液（PH6.0）2.5で洗浄後、10ｍＭアスパ
ラギン酸ナトリウムおよび0.5M硫酸アンモニウ
ムを含む10ｍＭ燐酸緩衝液（PH8.0）１をイオ
ン交換樹脂カラムに流速250ml／時間で通して、
20ml分画で酵素の溶出を行なつた。グルタミナー
ゼ活性が5IU／ml以上を示すフラクシヨン600ml
を集めた。この溶出液中のグルタミナーゼは
13000IU、収率は65％、酵素の比活性の上昇率は
42倍であつた。 実施例 ４ ピラノースオキシダーゼ生産菌コリオラスペル
シカラー（Corirus versicolor）ATCC20155菌
株の培養液10を過して得た菌体を50ｍＭトリ
ス緩衝液（PH7.0）１に懸濁し、ガラスビーズ
（φ0.5〜0.75mm）を加え、ダイノミルで菌体を破
砕した。得られた菌体破砕物懸濁液を遠心分離
し、抽出液800mlを得た。この抽出液には、
950IUのピラノースオキシダーゼが含まれてい
た。この抽出液を500mlのダイヤイオンHPA−75
（Clタイプ）を充填したカラムに流速250ml／時間
で通し、抽出液中のピラノースオキシダーゼをイ
オン交換樹脂に吸着せしめる。イオン交換樹脂を
0.1Mアンモニウムを含む50ｍＭトリス緩衝液
（PH7.0）2.5で洗浄後、0.25M硫酸アンモニウム
を含む50ｍＭトリス緩衝液（PH7.0）２をイオ
ン交換樹脂カラムに流速500ml／時間で通して、
20ml分画で酵素の溶出を行なつた。ピラノースオ
キシダーゼ活性が0.25IU／ml以上を示すフラクシ
ヨン750mlを集めた。この溶出液中のピラノース
オキシダーゼは732IU、収率77％、酵素の比活性
の上昇率は17.8倍であつた。 実施例 ５ プロテアーゼ生産菌 セラチア属
（Serratiaspb.ATCC21074）菌株の培養液を遠心
分離して得たプロテアーゼ含有の上澄液（培養
液）１（プロテアーゼ600KIU）を50mlのダイ
ヤイオンHPA−75（Clタイプ）を充填したカラム
に流速200ml／時間で通塔し、培養液中のプロ
テアーゼをイオン交換樹脂に吸着せしめた。イオ
ン交換樹脂を10ｍＭ燐酸緩衝液（PH７）150mlで
洗浄後、1M硫酸アンモニウムを含む10mlＭ燐酸
緩衝液（PH７）150mlをイオン交換樹脂カラムに
流速50ml／時間で通して、10ml分画で酵素の溶出
を行なつた。プロテアーゼ活性2000IU／ml以上
を示すフラクシヨン80mlを集めた。この溶出液中
のプロテアーゼは、510KIU、収率は85％、酵素
の比活性の上昇率は８倍であつた。
Claims (1)
- １ 酵素を含有する溶液を150Å以上の平均細孔
半径、５m2／ｇ−乾燥樹脂以上の比表面積、およ
び0.2cm2／ｇ−乾燥樹脂以上の細孔容積を有する
強酸性陽イオン交換樹脂または強塩基性陰イオン
交換樹脂に接触させて酵素を吸着させ、該イオン
交換樹脂に吸着した酵素を溶出剤により溶出し、
その活性区分を集めて精製酵素溶液を得ることを
特徴とする酵素の精製法。
Priority Applications (4)
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| JP57070598A JPS58209980A (ja) | 1982-04-27 | 1982-04-27 | 酵素の精製法 |
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