JPH0262237B2

JPH0262237B2 -

Info

Publication number: JPH0262237B2
Application number: JP14766685A
Authority: JP
Inventors: Etsuo Minagawa; Shuichi Uenogawa; Kunio Yamauchi
Original assignee: YOTSUBA NYUGYO KK
Current assignee: YOTSUBA NYUGYO KK
Priority date: 1985-07-06
Filing date: 1985-07-06
Publication date: 1990-12-25
Also published as: JPS6211092A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は耐熱性の新規アミノペプチダーゼ及
びその精造方法に関するものである。

〔発明が解決しようとする問題点〕アミノペプチダーゼはチーズをはじめとした食
品の製造において、呈味アミノ酸の生成、苦味ペ
プチドの分解などのプロセスにおいて重要な役割
りを果している。このようなプロセスにおいてバ
イオリアクターとしてアミノペプチダーゼを利用
するには、熱などの環境要因に対して安定である
ことが必要であるが、公知のアミノペプチダーゼ
は熱的安定性が不十分である。

〔問題点を解決するための手段〕

そこでこの出願の発明者は熱的安定性が優れ、
食品の製造プロセスに有利に用いることができる
新規アミノペプチダーゼを検索すべく研究を重ね
た結果、高度好熱性細菌、サーマス・アクアテイ
カス（Thermus aquaticus）YT−１（ATCC
25104）の菌体から耐熱性に優れるアミノペプチ
ダーゼを製造することを見い出し、この知見に基
づいてこの発明を完成した。

この発明は、第１に、サーマス・アクアテイカ
ス（Thermus aquaticus）YT−１（ATCC
25104）の菌体から取り出され、下記の性質を有
する新規アミノペプチダーゼに関する。

(a) この酵素の活性の至適PHは8.5〜9.0である。

(b) この酵素の活性の至適温度は75℃〜80℃であ
る。

(c) この酵素の熱安定性は、Ala−２−NAを基
質として、80℃で酵素濃度20μｇ／ml、PH7.2で
は、５時間後で約90％、20時間後で約60％の残
存活性を示す。

(d) この酵素は、精製工程中の粗酵素では更に高
い熱安定性を有する。

(e) この酵素は、金属キレート剤によつて完全に
失活し、SH阻害剤によつてかなり阻害される。

(f) この酵素は、EDTAで処理した後、Co²⁺に
より賦活する。

(g) この酵素の分子量はゲル過法で約10万８千
であり、SDS電気泳動法で約４万８千のサブユ
ニツトからなる二量体酵素である。

(h) この酵素は広い基質特異性を示す。

この発明は、第２に、サーマス・アクアテイカ
ス（Thermus aquaticus）YT−１（ATCC
25104）を超音波処理で粉砕抽出し、その後、80
％飽和硫安による塩析、DEAEセフアセル及びハ
イドロキシアパタイトクロマトグラフイ、ゲル
過、デイスク電気泳動など適宜既知の手法を組み
合わせることにより上述の(a)〜(h)の性質を有する
新規アミノペプチダーゼを製造する方法に関す
る。

〔実施例〕

次にこの発明を実施例により詳しく説明する。

Ａ最初に高度好熱性細菌、サーマス・アクアテ
イカス（Thermus aquaticus）YT−１の菌体
より新規アミノペプチダーゼを製造する過程に
ついて説明する。

(1) 菌の培養及び保存：サーマス・アクアテイ
カスYT−１の培養は、グルコース、ポリペ
プトン、イーストエキストラクトの混合培地
PH7.6を用いて70〜80℃で行い。定常期の菌
体を凍結保存した。

(2) 菌体抽出粗酵素の調製：培養後、凍結保存
してある菌体を0.05Mリン酸緩衝液をPH7.0
に懸濁（10％Ｗ／Ｖ）した後、超音波処理を
行なつた。その後、遠心分離（35000×ｇ、
20分）で得られた上清液を、同上緩衝液で透
析し、粗酵素液とした。

(3) 硫安塩析：上記粗酵素液に硫安を80％飽和
となるように加え、30分放置後、遠心分離
（10000×ｇ、30分）を行い、沈殿を0.01Mリ
ン酸緩衝液PH7.0に懸濁し、同緩衝液で透析
を行なつた。

(4) DEAEセフアセルクロマトグラフイによる
分画：硫安沈殿画分を、0.01Mリン酸緩衝液
PH7.0で平衡化したDEAEセフアセルカラム
（20×500mm）に吸着させた。0.1〜0.6Mの
NaCl濃度勾配で１の同緩衝液で溶出した。
その結果を第１図に示す。なお第１図におい
て、溶出速度50ml／Ｈ、10ml／画分、反応条
件は0.05Mトリス塩酸緩衝液PH9.0を使用し、
80℃、30分である。第１図より、Al₂−２−
NAとVal−Gly−Glyとの活性画分は一致し
ていることが分かる。No.33〜46を活性画分と
した。

(5) ハイドロキシアパタイトクロマトグラフイ
による分画：(4)の画分の1/2を同上緩衝液で
透析した後、カラム（15×150mm）に吸着さ
せ、0.01〜0.4Mのリン酸緩衝液PH7.0、400ml
で溶出した結果を第２図に示す。なお第２図
において、溶出速度10ml／Ｈ、５ml／画分、
反応条件は第１図と同一、No.28〜39を活性画
分とした。

(6) セフアデツクス．G150ゲル過による分
画：(5)の活性画分を濃縮後、0.05Mリン酸緩
衝液PH7.0で平衡化を行なつた。試料をカラ
ム（φ20×550mm）にのせ、先の緩衝液で溶
出した。その結果を第３図に示す。なお第３
図において、溶出速度10ml、５ml画分、反応
条件は第１図と同一であり、No.19〜25を活性
画分とした。

(7) DEAEセフアセルによる再クロマトグラフ
イー：セフアデツクス．G150における活性
画分を0.01Mリン酸緩衝液PHで7.0で透析後、
カラム（15×120mm）に吸着させ、同上緩衝
液で0.1M〜0.4MのNaCl 400mlで溶出させ
た。その結果を第４図に示す。なお第４図に
おいて、溶出速度20ml／Ｈ、５ml／画分、反
応条件は第１図と同一であり、画分No.36〜39
を集め、活性画分とした。

(8) デイスク電気泳動による分画及び精製の確
認：(7)の活性画分を濃縮した後、7.5％ポリ
アクリルアミドゲル（PH8.0）を用い、１本
のゲル当り、たん白質200μｇをのせ、２ｍ
Ａ／１本で約２時、泳動を行い、１本は染色
し、他は２mmごとにスライスし、0.05Mリン
酸緩衝液PH7.0で抽出を行つた。染色したゲ
ルは第５図のバンドを示し、第５図の↓の部
分と酵素活性が一致した。この活性画分を集
め、さらに泳動を行ない、酵素の精製を確認
した。第６図は精製した酵素の活性を示す。
この画分を酵素標品とした。酵素の製造過程
を第７図の図表に示す。新規アミノペプチダ
ーゼは粗酵素液と比較して比活性において
Al₂−２−NAでは約600倍、Val−Gly−Gly
では約150培に精製され、収率は各々、34.5
％、7.9％であつた。

Ｂこうして製造された新規アミノペプチダーゼ
の性質を調べた実験結果について次に説明す
る。

(1) 第８図は酵素活性と温度との関係について
示している。この酵素は高い温度で活性があ
り、至適活性温度は75℃〜80℃である。反応
条件は、Al₂−２−NA及びVal−Gly−Gly
を基質としてPH9.0で30分行なつた。

(2) 第９図は、酵素標品及び粗酵素に対する温
度の影響結果を示している。酵素標品を80℃
の温度で保持した場合、酵素濃度20μｇ／ml
PH7.2では、20時間で約60％、40時間でも約
20％の残存活性を有する。また粗酵素では、
先と同一の条件で20時間約70％、40時間でも
約50％の残存活性を示す。非常に熱に安定で
ある。反応条件は、Leu−４−NAを基質と
して70℃で30分行なつた。

(3) 第１０図は酵素活性とPHの関係について示
している。酵素の至適活性とPHは8.5〜9.0で
ある。反応条件はAla−２−NA及びVal−
Gly−Glyを基質として70℃で30分行なつた。

(4) 第１１図、第１２図及び第１３図は酵素活
性に対する金属イオン及び試薬の影響結果を
示す図表である。この酵素は、EDTAで処
理した後に透析で除去した場合、Co²⁺によ
つて賦活化する。金属キレート剤によつて完
全に失活し、SH阻害剤によつてかなり阻害
される。また有機溶媒、各種変性剤によつて
も阻害される。反応条件は、Ala−２−NA
及びVal−Gly−Glyを基質としてPH8.5、70
℃で30分行つた。

(5) 第１４図及び第１５図は酵素の分子量を示
す図表である。この酵素はゲル過法では、
分子量は約10万８千である。SDS電気泳動法
では、分子量は約４万８千である。この事よ
り、約４万８千のサブユニツトからなる二量
体酵素である。

(6) 第１６図は、酵素の基質特異性を調べた実
験の結果を示す図表である。非常に広い基質
特異性を持つ酵素である。反応条件は、PH
8.5で70℃ 30分である。

【図面の簡単な説明】

第１図はDEAEセフアセルクロマトグラフイに
よる硫安塩析沈殿フラクシヨンのクロマトグラフ
イの結果を示す図、第２図はDEAEセフアセルク
ロマトグラフイによつて得られた酵素フラクシヨ
ンのハイドロキシアパタイトクロマトグラフイの
結果を示す図、第３図はセフアデツクス、Ｇ−
150ゲル過の結果を示す図、第４図はDEAEセ
フアセルによる再クロマトグラフイの結果を示す
図、第５図はデイスク電気泳動後染色したゲルの
バンドを示す図、第６図はゲルスライスの加水分
解活性画分とデイスク電気泳動パターンが一致す
る事を示す図、第７図は新規アミノ−ペプチダー
ゼの製造過程を表わす図表、第８図はこの酵素の
活性と温度の関係を示す図、第９図は酵素活性へ
の加熱の影響を示す図、第１０図は酵素活性とPH
の関係を示す図、第１１図は酵素活性への金属イ
オンの影響を示す図表、第１２図及び第１図は酵
素活性への種々の試薬の影響を示す図表、第１４
図は、酵素の分子量を示す図、第１５図は、酵素
のサブユニツトの分子量を示す図、第１６図は
種々の合成ペプチドに対するこの酵素の相対活性
を示す図表である。

Claims

【特許請求の範囲】１サーマス・アクアテイカス（Thermus
aquaticus）YT−１（ATCC 25104）の菌体から
取り出され、下記の性質を有する新規アミノペプ
チダーゼ。 (a) この酵素の活性の至適PHは8.5〜9.0である。 (b) この酵素の活性の至適温度は75℃〜80℃であ
る。 (c) この酵素の熱安定性は、Ala−２−NAを基
質として、80℃で酵素濃度20μｇ／ml、PH7.2で
は、５時間後で約90％、20時間後で約60％の残
存活性を示す。 (d) この酵素は、精製工程中の粗酵素では更に高
い熱安定性を有する。 (e) この酵素は、金属キレート剤によつて完全に
失活し、SH阻害剤によつてかなり阻害される。 (f) この酵素は、EDTAで処理した後、Co²⁺に
より賦活する。 (g) この酵素の分子量はゲル過法で約10万８千
であり、SDS電気泳動法で約４万８千のサブユ
ニツトからなる二量体酵素である。 (h) この酵素は広い基質特異性を示す。２サーマス・アクアテイカス（Thermus
aquaticus）YT−１（ATCC 25104）を超音波処
理で破砕抽出し、その後、80％飽和硫安による塩
析、DEAEセフアセル及びハイドロキシアパタイ
トクロマトグラフイ、ゲル過、デイスク電気泳
動などの酵素精製に用いられる通常の操作を適宜
組み合わせることにより下記の性質を有する新規
アミノペプチダーゼを製造する方法。 (a) この酵素の活性の至適PHは8.5〜9.0である。 (b) この酵素の活性の至適温度は75℃〜80℃であ
る。 (c) この酵素の熱安定性は、Ala−２−NAを基
質として、80℃で酵素濃度20μｇ／ml、PH7.2で
は、５時間後で約90％、20時間後で約60％の残
存活性を示す。 (d) この酵素は、精製工程中の粗酵素では更に高
い熱安定性を有する。 (e) この酵素は、金属キレート剤によつて完全に
失活し、SH阻害剤によつてかなり阻害される。 (f) この酵素は、EDTAで処理した後、Co²⁺に
より賦活する。 (g) この酵素の分子量はゲル過法で約10万８千
であり、SDS電気泳動法で約４万８千のサブユ
ニツトからなる二量体酵素である。 (h) この酵素は広い基質特異性を示す。