JPH0262820B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は生体から採取した体液中のプテリジ
ン含量を体外に於いて測定して、人体または動物
体の悪性腫瘍及びビールス性疾患を、殊に早期検
出する診断薬に関する。

現在悪性腫瘍の診断は専ら臨床的、放射線学
的、内視鏡的、解剖学的又は生化学的調査によつ
て行われている。悪性腫瘍についての確実な予見
を可能ならしめる様な臨床学的又は生化学的な知
見は今日までなお存在していない。ただ内分泌学
的に作用しホルモン分泌を増大する潰瘍の場合に
ついては、成る程、血清や尿中のホルモン定量的
に測定することにより重要な診断的示唆が得られ
る。しかしホルモン値の増大は必ずしも悪性の新
生物（Neoplasm）と関連しておらず、別の病気
の場合にでも出現する。

近時、例えば癌胎生的（carcinoembryonal）
な抗原（CEA）又はα−フエトプロテインの様
な腫瘍と関連する抗原の測定もまた、ある程度の
価値を持つて来ている。これら抗原は一方では腫
瘍次第で、腫瘍患者の精々僅かに30〜90％の範囲
で高まるものであり、他方他の疾病患者の場合に
も値が高まるから、この試験法の実用価値は極め
て限られている。

体液中の特定のプテリジン含量を測定すること
による腫瘍検診は、未だ実際には使用されていな
いけれども将来役に立ちそうに思われる。ココリ
スやチーグラーは腫瘍患者の血清にテトラヒドロ
ビオプテリン値の増大を見出した（KoKolis，
Ｎ、及びZiegler J.，Cancer Biophys.1977，
Vol.2.pp.79−85）。ハルペルン等の研究によると
悪性細胞の組織培養中に、前以つて葉酸を与入す
ると、その後、６−ヒドロキシメチルプテリンが
増量する（Cancer Research 38，237−2384，
1978）。

今、驚くべきことにビールス性疾病の場合にも
特定のプテリジンが増量しており、それが体外で
証明できることが見出された。

ビールス性疾病の臨床的な試験室診断法は現在
では、本質的に３つの原則によつている。

１ 病人のビールスを分離し、培養し且つ確認す
ること（試験期間約６週間）。

２ 病人の血清又は体液のビールス特異抗体を証
明すること（試験期間約３週間）。

３ 病人の細菌を培養し確認すること。その結果
がマイナスに出た場合は、細菌による疾病では
なく、ビールス性疾患であると推定すること
（間接証明、試験期間２〜３日、反復試験の要
あり）。

１項の方法は「マジヨールビールス診断」とも
呼ばれるが、金がかかるし骨も折れる。その方法
は臨床にとつて必ずしも満足なものではない。即
ち、例えば上気道の羅患や骨膜大脳炎徴候群を明
らかにしなければならないときなどが、その例で
ある。分離や確認はその様な状況では個々の場合
にとつて決して診断の助けにはならない。という
のは、その結果が余りにもおそくなつて得られる
からである。

２）項の方法は、より簡単に実施できるので、
臨床活動にとつて、より有意義である。そして次
の３工程からなつている、即ち、 ａ 中和テスト ｂ 血球凝集反応抑制テスト（ヒルスト−テス
ト） ｃ 捕体結合反応（KBR） それらすべての調査にとつては、同じ病人の血
清試料２つにつき同時に定量的な調査を行う必要
がある。

最初の試料は臨床的徴候の出現直後採取すべき
であり、第２回目の血清試料は約14日後の採取さ
れる。それら試料は採取後直ちに送附され試験室
中で凍結される。この一対の血清の調査は同じ日
に行われるのが常である。この「ビールスマイナ
ー診断」の場合も時間的なフアクターが存在し、
診断上及び経済的な浪費が著しい。

３）項の方法の場合は、すべてのこの種の方法
に付随する欠陥を伴う様な除外方法によつてい
る。

この発明の課題は、従来知られていた方法に対
比して改善された、人体や動物体の悪性腫瘍及
び／又はビールス性疾患の臨床化学的な実務で使
用できる殊に早期診断並びにそれら疾患の進行状
態を診断する試薬を提供するに存する。

そうして、この課題は、本発明により、体液中
へのビオプテリンを除く、特定のプテリジンノ排
出を利用することにより解決せられた。

即ち、本発明によると、体液中の７，８ジヒド
ロプテリジン、若くはその酸化生成物又は還元生
成物又はそれらの誘導体（ビオプテリン及び還元
生成物を除く）を定性的に証明し及び／又は半定
量的、若くは定量的に測定することにより達成さ
れる。

７，８−ジヒドロプテリジンは次式を有する。

ジヒドロプテリジンの例としては下記のものが
ある。

７，８−ジヒドロプテリン ７，８−ジヒドロルマジン ７，８−ジヒドロキサントプテリン の外、７，８−ジヒドロ−７−キサントプテリン
カルボン酸、７，８−ジヒドロ−イソキサントプ
テリン、７，８−ジヒドロ−６−イソキサントプ
テリンカルボン酸等が挙げられる。

基本的な物質代謝反応のコ因子としてのテトラ
ヒドロビオプテリンの前述の公知の意義からする
と、その他のプテリジンが腫瘍生育について、よ
り大きな予見を与えうるなどとは期待できなかつ
た。

ところで実際の動物実験によつて以下のことが
判つたのである。即ち例えば、エールリツヒ−ア
ツシテス−腫瘍を有するマウスやビールス感染マ
ウスの尿中には７，８−ジヒドロ−６−ヒドロキ
シルマジン（一種の７，８−ジヒドロプテリジ
ン）の分泌が極めて高くなるが、それは早期に証
明できるし、また、モデル動物の腫瘍発育とか感
染の重篤性に極めて良好に相関連しているのであ
る。

人体でも、体外体液中での殊にネオプテリジン
の増大は悪性腫瘍生育の確実な証拠であることが
証明された。７，８−ジヒドロプテリジンがビー
ルス疾患の場合にも体外体液中に増量しており、
それ故、その測定がビールス診断に使用できると
いう知見は、誠に、驚くべきことであつた。

この発明の方法は、その上、体液殊に尿中で、
殊にネオプテリン（６−エリスロ−１，２，３ト
リヒドロキシプロピル−プテリン）、若しくはそ
の水素化（還元）又は酸化生成物又は置換生成物
を定性的の証明及び／又は半定量的、若しくは定
量的に測定することにより人の場合の特殊条件に
よりよく適合させることができる。

この発明で証明すべきネオプテリンはＤ−ネオ
プテリン、Ｌ−ネオプテリン、若しくはそのラセ
ミ体として存在する。

この発明で証明すべきジヒドロプテリジン、殊
に、ネオプテリンは、例えばOH、NH2、CH3、
CH2OH、COOH、CHO、アルコール、リン酸
又は糖類の様な基により種々の方法で、置換され
ていることができる。従つて、この発明の特別の
構成は、糖類やリン酸と結合したネオプテリン、
若しくはその還元又は酸化生成物又は置換生成物
を尿中で定量的に証明及び／又は半定量的、若し
くは定量的に測定する。

ジヒドロプテリジン、ネオプテリン、若しくは
その水素化又は酸化生成物又は置換生成物は各種
体液、例えば血液、血清、尿、だ液等に証明でき
る。

この発明による方法は調査すべき体液を採取す
べき生体に前以つてプテリジン誘導体、若しくは
プテリジン代謝に関与する製剤を投与することを
必ずしも必要としない。むしろ、本発明にとつて
特徴的な点は、それが前もつてプテリジン誘導
体、若しくはプテリジン物質代謝に関与する製剤
を投与することなしに実施できる点にある。本発
明によると、従つて、人体又は動物体そのものの
中に生成した、殊に天然のプテリジン、若しくは
その誘導体を測定するのである。

７，８−ジヒドロプテリジン又はネオプテリ
ン、若しくはその酸化生成物、還元生成物、若し
くは置換生成物の定性的証明は、若し悪性の腫瘍
やビールス性疾患の存在しない当該健康体が調査
すべき体液中に７，８−ジヒドロプテリジンを排
出しない場合は、充分である。そうでない場合は
７，８−ジヒドロプテリジン又はネオプテリン、
若しくは酸化生成物、還元生成物又は置換生成物
の定量的、若しくは半定量的測定が必要となる。
そしてその場合、その値はそれぞれ体液の特別の
測定法に応じて、（健康人の）通常値と比較され
るべきである。プテリジン誘導体又はネオプテリ
ン（酸化、還元又は置換生成物を含む）の証明又
は定量的な測定には下記の普通の分析法が適して
いる。

− 蛍光分析、若くは紫外線領域、若くは着色後
可視領域でのレミツシヨン測定（remission
measurement）との組み合わせで担体上でか
又は担体なしでの低圧−又は高圧電気泳動法 − 蛍光分析又は紫外線領域、若くは着色後可視
領域でのレミツシヨン測定と組み合わせた薄層
クロマトグラフイー − 蛍光分析又は紫外線領域、若くは着色後可視
領域でのレミツシヨン測定と組み合わせたペー
パークロマトグラフイー −ガスクロマトグラフイー − 質量分析との組み合わせでのガスクロマトグ
ラフイー − フイールド脱着質量分析（field desorption
mass specrometry） − 化学反応又は電気化学検出の後高圧液体クロ
マトグラフイー−及び蛍光的測定又は紫外領域
或いは可視領域における測定 −高圧液体クロマトグラフイー及び質量分析 −イオン交換剤による液体クロマトグラフイー −分光法 −蛍光分析 −分析検査法（UV−、IR、核磁共鳴法、質量分
析） − 免疫学的方法（ラジオイムノアツセイ
（RIA）、酵素結合イムノソ−ベントアツセイ
（ELISA）、酵素イムノアツセイ（EMIT）、免
沿電気泳動法等） −アイソトープ稀釈法 −例えばキサンチンオキシダーゼによる酵素試験 −染色テスト −生物学的テストト（クリシジア生長試験等） −イソエレクトリツクホーカス化法 −動的比濁法（Kinetic nephelometry） 例えばRIA、ELISA及びEMITの様な免疫学
的方法は一方では極めて特異的であり、他方では
ルーチンな方法で比較的簡単な材料を用いて実施
できるから臨床的に適している。

この場合、例えばキサントプテリン、又はネオ
プテリンなど測定すべきプテリジンに対する抗体
を得ることが必要である。この抗体は自体公知の
方法で実験動物、殊に家兎を適当なプテリジン複
合体で免疫することによつて得られる。プテリジ
ンの免疫担体、例えば血清アルプミンへの結合は
自体公知の方法で行われる。それぞれ測定すべき
プテリジン用の必要な抗体特異性は結合に使用さ
れるプテリジン誘導体の選択により得られる。

一般的に６−位で側鎖により帯換されたプテリ
ジンの抗体はハプテンの免疫担体への結合をその
６−位を介して行うことによつて得られる。

その際、例えばキサントプテリンを酸性触媒の
存在下エチレングリコールと反応させ、次いで末
端のOH−基をカルボキシル基に酸化する。この
反応性ヘプトン誘導体を自体公知の方法でカルボ
ジイミドを使用して、例えば牛の血清アルブミン
に結合させる。ネエプテリンに特異な抗体ではネ
オプテリンのトリヒドロキシプロピル側鎖は決定
基として免疫担体にハプテンが結合する場合にそ
のまま残存しなければならない。従つて場合によ
り附加的に保護された別の反応基を有するアルキ
ルハロゲニドによる主としてその分子の３の位置
で進行するアルキル化が最も簡単な反応として実
施せられるのである。

例えばネオプテリンとω−ブロムバレリアン酸
メチルエステルとの反応によりネオプテリル−ω
−バレリアン酸メチルエステルが得られ、このも
のはメチルエステル保護基を酸性加水分解した後
カルボジイミド法によつて例えば牛血清アルブミ
ンに複合される。

同様にして、例えばω−ブロムバレロニトリル
はネオプテリンと反応して３−（４−シアノブチ
ル−）ネオプテリンになり、このものが純メタノ
ール中で塩化水素と反応して対応するイミドエス
テルを生じる。このものは直接牛血清アルブミン
と反応させることができる。

ネオプテリンにはこの場合その所望の抗体次第
でＤ−エリスロ−ネオプテリン、Ｌ−エリスロ−
ネオプテリン又はＤ−スレオ−ネオプテリンが用
いられる。

特異キサントプテリン−抗体は、免疫担体に３
−位を介してハプテンを結合することによつて得
られる。さもなければ有利な５位や６位の反応を
排除するため、その位置、例えば６位の酸素をメ
チル化して、一時的に前以つて保護することが普
通必要である。

３位の窒素原子のω−ブロムバレリアン酸メチ
ルエステルでのアルキル化は、前以つてヘキサメ
チルジシラザンと反応させＯ−４−トリメチルシ
リル誘導体にすることによつて容易にすることが
できる。さもなければＯ−４−アルキル誘導体も
生成する。酸の中で加温することにつて６−メト
キシ−及びメチルエステル保護基は再び除去され
る。

別の可能性は２位のアミノ基を介して免疫担体
とキサントプテリンとを結合するに存する。加温
下での無水こはく酸との反応によりキサントプテ
リンのヘミサクシネートが得られ、このものは常
法でカルボジイミドにより牛血清アルブミンに複
合させられる。

プテリジンの還元形のもの、例えば７，８−ジ
ヒドロキサントプテリンの測定用に同様に抗体を
作ることができる。そのためには既述の複合体を
プテリジン化学の普通の方法による還元に付する
か、ここに説明した反応性のあるプテリジン誘導
体を免疫担体に結合させる前に所望程度水素化す
る。しかし乍ら、その際還元されたプテリジン、
殊に５，６，７，８−テトラヒドロ誘導体は酵素
に過敏であり酸化型のものよりも光に感受度が高
いということは注目に値する。

これら反応性プテリジン誘導体は免疫担体との
結合用の外に免疫学的方法の場合に必要な（放射
活性的又は酵素により標識された）トレーサーを
つくるためにも使用できる。

その際、例えば３−（４−カルボキシブチル−）
Ｄ−エリスロ−ネオプテリンを殊に125Iを用いる
カルボジイミド法によつて３−ラジオヨードチラ
ミンと反応させる。このトレーサーはネオプテリ
ンの放射免疫学的測定に適している。

酵素複合体を製造する場合もやり方は同じであ
る。例えばパーオキシダーゼ（例えば３−（４−
カルボキシブチル−）Ｄ−エリスロ−ネオプテリ
ンとをカルボジイミド法で反応させると酵素複合
体が得られ、そのものがネオプテリンの酵素免疫
学適な測定に使用される。

以下本発明の方法を例によつて詳細に説明す
る。

実施例１ （参考例） 人体の悪性腫瘍及びビールス性疾患を証明する
ためには生尿の薄層クロマトグラフイー分離によ
る尿中７，８−ジヒドロキシサントプテリンの定
量測定が適当である。薄層板を乾燥した後、定量
的な蛍光計による直接評価を行う。

5μlの人尿を熱風で中間的に乾燥し乍ら、セル
ロース薄層板上に少しずつ適用する。薄層室中で
展開剤ｎ−ブタノール／氷酢／水（20／３／
７／）は12cm移動する。

熱風で乾燥した後薄層板をクロマトグラフ分光
蛍光計で走査し、蛍光シグナルをミリボルト記録
計で記録する。励起波長はこの場合378nmであ
り、測定波長は484nmである。この場合、酸化生
成物即ちキサンブテリンの蛍光が測定される。
Rt＝27での蛍光斑のバンドの面積は尿中に排出
した７，８−ジヒドロキサントブテリンと比例し
ている。

実施例２ （参考例） マウスでのエーリツヒ−アツシテス−腫瘍及び
ビールス性感染を証明するためには、生の尿を変
電圧電気泳動法にかけて尿中の７，８−ジヒドロ
−６−ヒドロキシルマヂンを分離し、次いで蛍光
計で直接評価することによつて定量的に測定する
のが適当である。10μlのマウス尿をミハエリスバ
ツフアー（PH＝８，６，イオン強度0.75）に浸漬
した紙に線状に３cmの長さ適用する。展開は市販
の高電圧電気泳動室中で2700ボルトで45分間行
う。空乾後電気泳動紙シートを16cm離してクロマ
トグラム蛍光スペクトル写真計中で走査する。そ
の際蛍光信号をミリボトル記録計に記する。励起
波長はその場合372nm、測定波長は456nmであ
る。この場合７，８−ジヒドロキシルマジヂンの
酸化生成物、即ち６−ヒドロキシルマヂンの酸化
生成物の蛍光を測定した。相対的電気泳動移動度
（４−ヒドロキヒプール酸＝100に対し）hrM＝55
でのバンド面は尿中に排出した７，８−ジヒドロ
−６−ヒドロキシマジンに比例している。

実施例３ （参考例） ７，８−ジヒトロ−６−ヒドロキシマヂンを測
定するための別の分析方法は展開剤n.ブタノー
ル／氷酢／水（20／３／７）を用いるセルロース
上での薄層クロマトグラフイーである。７，８−
ジヒドロ−６−ヒドロキシルマヂンのhRf−値は
このシステムでは25にある。この場合も７，８−
ジヒドロ−６−ヒドロキシマヂンの定量測定を
372nm励起、456nm測定でクロマトグラム分光蛍
光計での直接蛍光法によつて行う。356nmで励起
し440nmで測定を行うとhRf−値37での直接−蛍
光法によりネオプテリンを定量的に検知できる。

実施例４ （参考例） ７，８−ジヒドロ−６−ヒドロキシルマヂン及
びその酸化生成物、６−ヒドロキシルマヂンを同
時の定量的に液体クロマトグラフイーで測定す
る、この場合（reversed−phase material）
materialボンダパタC18'粒子の大きさ37−75μm、
を入れた長さ82cm内径６mmの低圧柱に１mlの予め
精製した試料液を入れる。次いでPH4.5の25mμア
ンモニウムアセタート溶液を用い100ml／時の流
速でインクラツチに溶出する。

７，８−ジヒドロ−６−ヒドロキシマヂンは47
−53mlの保持容積を有し254nmでのUV−吸吸に
より測定される。

54−60mlの６−ヒドロキシルマヂンが溶出され
366nm励起400nm以上の測定波長で蛍光で測定さ
れる。

実施例５ （参考例） 人体の悪性腫瘍及びビールス性疾患を証明する
ために、例えば尿中のネオプテリンを生尿を定量
的にクロマトグラフイー（HPLC）で分離し蛍光
計測定法で定量的に測定する。

場合によりクロマトグラフイー分離を行う前に
前柱等により予備分離を行うことができる。

5mμに人尿、若くは予備精製後の相当量を
HPLC−システムに付する。HPCL−システムは
イソクラチツクに操作する。バツフアーとしては
アンモニアセテート／酢酸（30mモル／立、PH＝
6.0）に５％メタノールを加えたものを使用する。
充填剤としては逆層剤を有する30cm−柱が使用さ
れる。流速は２ml／分であつた。

HPCL−システムによつてネオプテリンを他の
物から明らかに分離できるのでネオプテリンは蛍
光検知器及び附属記録計によつて測定出来る。励
起波長はこの場合380nmであり測定波長は450nm
である。

ネオプテリンの測定と同時に尿中に排出するク
レアチニンが定量的に測定されるので、クレアチ
ニンmg当たりのネオプテリンngが記載される。
一日の全尿でなくて普通の尿試料だけが提供され
るときは常にクレアチニンへの関連付けが適当で
ある。

ネオプテリン測定のための別の分析方法は展開
剤５％酢酸を用いるセルローズでの薄層クロマト
グラフイーである。このシステムではネオプテリ
ンのhRf−値は65である。ネオプテリンの定量測
定は364nm励起及び456nm測定波長でクロマトグ
ラム分光蛍光計を用いる直接蛍光測定で行われ
る。

実施例 ６ ６−（２−カルボキシ−）エトキシプテリン。

暗所か又は薄明りで1gのキサントプテリンを
攪拌し乍ら60mlの純プロパンジオールー（1.3）
中で70℃で油浴で加熱する。次いで乾燥塩化水素
を約３時間導入する。濃縮すると塩酸塩が得ら
れ、この塩酸塩は水と15分間加熱することにによ
り６−（３−ヒドロキシ）プロピルオキシプテリ
ンを生ずる。

このものの0.5gを20mlの0.1NNaOH中で
KMnO4溶援と処理する。析出した沈殿を吸引ろ
過する。ろ液から酸性にすると６−（２−カルボ
キシ−）エトキシプテリンが得られる。

実施例 ７ ３−（４−カルボキシブチル−）Ｄ−エリスロ
−ネオプテリン。

48mgのＤ−エリスロ−ネオプテリンを20mlの純
DMF中で湿気を遮断して室温で50mgの無水の
K₂CO₃及び0.2mlのω−ブロムバレリアン酸メチ
ルエステルを加え更に50h攪拌する。次いで５ml
の2NHCLを酸性反応を呈するまで（PHca1〜２）
加える。５時間後に高真空で濃縮し残渣を水と混
和し吸引ろ過し乾燥する。

この生成物は牛の血清アルブミンへの複合にそ
のまま用いることが出来る。操作は以下の例に於
いても暗所か又は薄明りの中で行われる。

実施例 ８ ３−（４−メトキシイミノカルボニルブチル−）
Ｄ−エリスロ−ネオプテリン。

48mg−Ｄ−エリスロ−ネオプテリンを10mlの純
DMF中で湿気を遮断して40℃（浴）で40mlの無
水K₂CO₃及び0.4mlのω−ブロムバレロニトリル
と攪拌する。２日の後高真空で回転蒸発機で濃縮
し、残渣を少量のメタノール性NH₃に溶解硅酸
で層クロマトグラムで分離する。３−（４−シア
ノブチル−）Ｄ−エリス−ネオプテリンに対応す
る層を溶出し回転式蒸発機で濃縮する。30mgの生
成物を10mlのHCL−飽和メタノール中に冷却下
懸濁し乾燥HCLを更に導入し徐々に10℃に加温
する。混合物を次いで24時間放置する。20mlの純
ジメチルエーテルを加え生成物を吸引、洗滌そし
て乾燥する。

実施例 ９ ３−（４カルボキシルブチル−）キサントプテ
リン 360mgの６−メトキシプテリンを50mlのヘキサ
メチルジシラザン中で湿気を遮断して還流加熱
（20h）し、次いで真空で濃縮する。残渣を40ml
の純DMF中で１mlのω−ブロムバレリアン酸メ
チルエステルと40℃で30時間反応させる。溶液を
高真空で吸引する。残渣を層クロマトグラフで硅
酸ゲルで精製する。３−（４−カルボメトキシブ
チル−）６−メトキシブテリンに対応する層を溶
出する。

保護基を離脱するために100mgのこの生成物を
30mlの6NHVLと４時間70℃に加熱する。次いで
真空で回転式蒸発機で濃縮し残渣をエタノール／
水から再結晶する。

実施例 10 キサントプテリン−N²−ヘミサクシネート。

200mgのキサントプテリン50mlの純ピリヂン中
で250mgの無水くえん酸と70℃に加温する。16時
間後氷に注ぎ沈殿を吸引し水で洗う。生成物はそ
のまま複合に使用することができる。

実施例 11 ３−（ブチル−４−カルボン酸−［3′−125ヨー
ド−］チラミド）−Ｄ−エリスロ−ネオプテリン。

約1mのCi3−125ヨードチラミンを例２の３−
（４−カルボキシブチル−）Ｄ−エリスロ−ネオ
プテリン0.1mgと200μlの純DMF中で50μlの純ジオ
キサン中の80μgジシクロヘキシルカルボジイミ
ドと混合する。一夜放置し室温に加温したのちペ
イパークロマトグラフイーによつて（展開剤ｎ−
プロパノール1/3水性アンモニア１，ｖ／ｖ）所
望の125ヨード−ネオプテリン誘導体を分離し、
メタノール性NH₃で溶出する。

実施例 12 N₂−［3H］アセチルキサントプテリン 0.1mgキサントプテリン（0.5μモル）を密閉反
応容器中で６時間5mのCi［³H］無水酢酸酸と
200μlの純DMF中で100℃に加熱する。反応混合
物をペーパークロマトグラフイー（展開剤ｎ−ブ
タノール2/5Ｍ酢酸１，ｖ／ｖ）で精製する。標
識化合物をメタノール性NH3で溶出する。

実施例 13 キサントプテリンヘミサクシネート−β−ガラ
クトシダーゼ複合体。

実施例７のキサントプテリン−N²−ヘキサク
シネート14mgと9.2mgのトリ−ｎ−ブチルアミン
とを500mlの純DMF中で氷浴で冷却し、6.6mgの
クロルぎ酸イソブチルエステルを加えて30分攪拌
する。次いで５mgのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを
５mlの水に加える。この反応は0.1N NaOHを加
えることによりPH９で10℃以下に保持される。５
時間の反応時間ののち一夜冷蔵庫に置く。この酵
素複合体をセフアデツクスG25でクロマトグラフ
イーにかけて精製する。

実施例 14 ３−（４−カルボキシブチル−）Ｄ−エリスロ
−ネオプテリン−パーオキシダーゼ複合体。

例２の３−（４−カルボキシブチル−）Ｄ−エ
リスロ−ネオプテリン17mgを「混合無水物法」に
より純DMF中でクロルぎ酸イソブチルエステル
と混合する。20mgのパーオキシダーゼ（HRP）
への複合はDMF／0.5％NaHCO3（１：５）中６
時間10℃以下で行う。この複合体はセフアデツク
スＧ−25でクロマトグラフイーにより精製でき
る。

実施例 15 酵素免疫測定法 小型遠心管（Eppendorfj又はSarstedt）中の
100μlの血清を400μlPBS−バツフア（0.05M燐酸
塩PH7.4：0.1M NaCL；0.1％牛血清アルブミン）
100μlキサントプテリン−抗血清（家兎１：1000）
及び100μlキサントプテリン−β−Ｄ−ガラクト
キシダーゼ複合体（約50mg）と５時間室温でイン
キユベートする。100μlの第２抗体（羊、抗家兎）
を加えた後３時間室温（又は一昼夜冷蔵庫中）で
インキユベートする。遠心分離したのち上澄を吸
引しペレツトを１mlのPBS−バツフアー中に再
懸濁させる。遠心分離と吸引ろ過を繰り返したの
ち0.1mlの酵素基質（0.1Mりん酸塩、PH7.0、
2.3mMO−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクスピ
ラノソイド、1mMMgCL2、10mMメルカプトエ
タノール）を加え２時間23℃でインキユベートす
る。標準品及び試料について例えば２時間という
同じ時間の後1.5ml0.2MNaCO3を加え光学濃度を
420nmで測定する。

実施例 16 放射免疫測定法（ラジオイムアツセイ） 小型遠心管（Eppendorf，Sarstedt等）中で
20μlの尿、300mlの0.1Mりん酸塩PH7.4、100μlキ
サントプテリン−抗血清（家兎；１：15007μgの
家兎−γ−グロブリンを加える）及び100μlの２
−［³H−アセチル］キサントプテリン（容器の計
算収率（counted yield）やトレーサー比活性に
合致した量の）を４時間室温でインキユベートす
る。次いで100μlの第２の抗体（抗−家兎−γ−
グロブリン−血清、ひつじ１：25）を加え更に
1.5時間インキユベートする。500μlの水を加え、
遠心分離し上澄を吸引ろ過する。この沈殿を１ml
の水に再懸濁し改めて遠心分離し上澄を吸引ろ過
する。

この沈殿を次いで50μlのソルエンTM100に溶
かし合計10mlのインスターゲル−シンチレイシユ
ン液（両者共packard lnstrument Co.）とシン
チレーシヨン瓶に入れ計数器（packard）中で測
定する。

上述の例並びに実施例及び一般的にいつて本発
明の方法により実施できる検査法は極く僅かの時
間しか必要としない。即ち例１などによると６分
で実施できる。この発明による測定は任意にしば
しば反復が出来、ビールス性疾患の経過制御若く
は悪性腫瘍の治療をも可能ならしめる。

元々のプテリヂンそのもの又はそのものの光や
空気の影響で生じる分解生成物、酸化生成物若く
は還元生成物の何れが測定されるかは体液中に在
るプテリジン若くは使用測定法により決まること
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ２，４，６，７又は８位でOH、NH₂、
   CH₃、CH₂OH、COOH、CHO基、アルコール、
   りん酸または糖残基により置換されてよい、式 で示される７，８−ジヒドロプテリジン又はその
   酸化又は還元生成物又はそれらの誘導体（但しビ
   オプテリン及びその還元生成物は除く）のプテリ
   ジン−複合体に、プテリジンの３位又は６位で免
   疫担体をカツプリングすることによつて得られる
   抗体並びに該プテリジン−複合体に、プテリジン
   の３位又は６位で酵素又は放射活性的に標識した
   基をカツプリングすることによつて得られたトレ
   ーサーを含有することを特徴とする、人体又は動
   物体が免疫反応で応答する疾病の診断薬。 ２ 複合体として、尿又は血清中のグリコシツド
   又はホスフアートと結合した７，８−ジヒドロプ
   テリジン又はその酸化又は還元生成物又はそれら
   の誘導体を使用する、特許請求の範囲第１項記載
   の診断薬。 ３ ７，８−ジヒドロプテリジン誘導体がネオプ
   テリン誘導体である、特許請求の範囲第１項記載
   の診断薬。 ４ ネオプテリンがＤ体又はＬ体又はセラミ体で
   ある、特許請求の範囲第３項記載の診断薬。