JPH0265784A - 新規な誘導性調節システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ベプヂドの大規模生産をコントロールできる新規な誘導
性の正の調節システムに係る。本発明は、調節システム
又はその成分を含有してなる組換えベクター、皮び該ベ
クターによって形質転換された微生物にも係る。

遺伝子工学における最近の発達の結果として、組換えＤ
ＮＡ技術によ−て形質転換された微生物を使用する発酵
法により、治療、食品又は農業の分野で使用される公知
又は新規な分子を生成することが可能になった。

このような技術は、通常、（ａ）目的のタンパク質をコ
ード付ける遺伝子を含有するＤＮＡ遺伝子又はフラグメ
ントの単離、（ｂ）該遺伝子のクローニングベクターへ
の挿入及びクローン化遺伝子を発現しうる組換えベクタ
ーの単離、（ｃ）！ｔｌ換えベクターによる宿主微生物
の形質転換、及び（ｄ）クローン化遺伝子によってコー
ド付けられたポリペプチドを生成するに適する環境にお
ける形質転換微生物の培養の各工程を包含してなる。

かかる技術の応用において重要なファクターの１つはク
ローニングベクターであり、該ベクターはプラスミド、
ファージ又はフスミブドの中から選ばれる。中でも、独
自に増殖可能であり、抗生物質に対する耐性を示す遺伝
子を含有する環状ＤＮＡであるプラスミドの使用が好適
である。これにより、プラスミドによって形質転換され
た細胞の認識が容易になり、これらの細胞は抗生物質を
ｎ　ｈ　”ｔ”る選択培地中で生育する。

さらに、プラスミドは各種の制限酵素（プラスミドＤＮ
Ａにお１トる６種の異なる部位を認識する）によって特
異的に切断される。

従って、異種遺伝子又はこれら遺伝子を含ａするＤＮＡ
フラグメントは切断部位においてプラスミドに挿入され
る。

「異種」とは、正常にはプラスミド内に存在しない遺伝
子、又はこれによって形質転換された微生物によって正
常には生産されないポリペプチドの場合をいう。

得られた組換え又はハイブリッドプラスミドは、形質転
換又は接合の技術によって宿主微生物に挿入される。

遺伝子が転写及び翻訳をコントロールする領域において
適正な状態でプラスミド内に挿入される際には、；４ら
れたハイブリッドプラスミドは、遺伝子によ、ってコー
ド付けられるペプチドを生産又は発現するよう使用され
る。

、「転写」は、遺伝情報かＤＮＡからメツセンジャーＲ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）に伝達されるメカニズムとして定義さ
れ、一方、翻訳は遺伝暗号の原則に従って遺伝情報がｍ
ＲＮＡからタンパク質に移ることを意味する。

従って、「発現」はＤＮＡに含まれる遺伝情報がタンパ
ク質の生成に使用される方法をいう。

転写は細胞内に存在するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー
ゼによって引起こされ、認識部位及び酵素付着部位を含
有する領域（プロモーターとして知られている）で開始
する。

付着部位を離れ、徐々に二重ら線を解放するＲＮＡポリ
メラーゼはマトリックスら線の３′→５′方向に移動し
、一方、リボヌクレオチドのポリメラゼージヨンは５’
−３’の方向で持続する。ポリメラーゼが前進している
間に、転写されたＤＮＡは二重ら線構造に戻る。

得られたＲＮＡの分子（ｍＲＮＡ）（リボゾーム付着部
位（ＲＢＳ）及びタンパク質翻訳開始配列ＡＴＧをコー
ド付けるヌクレオチドを包含する）はりボゾームによっ
て結合される。

このようにして、ｍＲＮＡ内の情報はタンパク質を合成
するために細胞によって使用される。

発現されたタンパク質は形質転換細胞又は培養基から回
収される。このようなタンパク質は、成熟タンパク質形
又は融合タンパク質形、すなわち目的のタンパク質のア
ミノ酸配列を包含するもの又はアミノ末端に異質配列を
包含するものである。

遺伝子工学は、形質転換された微生物細胞による各種の
源のタンパク質を工業的に生産する際にｌ要な役割を果
たす。

たとえば、ヒトインシュリン、インターフェロン、生長
ホルモン陵びワクチンの調製に使用される生成物（たと
えば百日咳毒素）の如き物質を生産する場合であろう しかしながら、組換えＤＮＡによって形質転換させた微
生物を使用する方法は、主として生産速度が低いことに
よって制限され、その結果、工業的にはあまり興味のな
いものとなっている。

これは、プロモーターの非能率性、又は発現されたポリ
ペプチドが微生物にとって致命的又は有害なものである
場合において、微生物細胞の未熟な形成によるらのと考
えられる。従って、当分野では、組換えＤＮＡの形成に
使用され、これによって遺伝子の発現を改博して、遺伝
子によってコード付けられたポリペプチドを高収率で生
産できる調節システムが提案されている。

公知のように、遺伝子調節メカニズムは負又は正の意味
において作用する。

現時点では、正の調節メカニズム及び細胞によって使用
されるコントロールシステムに関してはほとんど知られ
ていないが、負の調節システムについては多数知られて
おり、そのうちのいくつかは異種タンパク質の発現によ
る組換えプラスミドの構成に使用されている。

しかしながら、公知のシステムも、弱いプロモーターが
存在すること又は培養基においてインダクター（ｉｎｄ
ｕｃｔｏｒ）を高レベルで使用する必要があることによ
る欠点を有している。

発明者らは、培養基及び生育条件を適切に選択すること
によって容易に誘導され、しかし異種タンパク質の高収
率生産に使用される正の調節の技能を県たす断層なシス
テムを見出し、本発明に至った。

従って、本発明の目的の１つは、発現によって増殖され
、しから形質転換微生物による胃種タンパク質の生産に
使用されるベクターを構成するために使用される新規な
誘導性の正の調節システムにある。

発現によって増殖可能なベクターにおいて、調節システ
ム又はその領域は、目的のタンパク質をコード付ける異
種遺伝子に好適に結合される。

本発明は、発現によって増殖されかつ調節システムを含
有してなるベクター、及び該ベクターによって形質転換
された微生物にも係る。

本発明は、さらに、上述のシステムを有する微生物を使
用することにより、目的のポリペプチドを高収率でコン
トロール可能に生産する方法に係る。本発明は、異種タ
ンパク製造用の発現による増殖可能なベクターを構成す
るに当たり、上記調節システム及び／又はその構成成分
を使用する該調節システムの使用法にも係る。

本発明によれば、誘導可能な正の調節システムは、調節
因子をコード付ける遺伝子ＢｖｇＡ、　ＢｖｇＢ及びＢ
ｖｇＣを含有するボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）
染色体のＥｃｏＲ１部位とＸｈｏ　１部位との間に位置
する約４５ｋｂの領域であるｖｉｒ領域、及び前記調節
因子によってトランス形で（ｉｎ　ｔｒａｎｓ）活性化
又は抑制されるボルデテラタンパク質をコード付ける遺
伝子の面に位置する末端５′領域を包含してなる。

さらに詳しくは、調節因子によってトランス活性化され
る（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａＬｅｄ）末端５′領域は、
ボルデテラによって生産されるビルレントなタンパク質
の１つをコード付ける遺伝子（ｉ）の前に位置するもの
である。

さらに詳述すれば、末端５′領域が百日咳毒素（ＰＴ）
のコード化オペロンのプロモーターよりち」１流に位置
する配列である場合、上記ボルデテラは百日咳菌（Ｂｏ
ｒｄｅＬｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｉｓ）である。

調節因子によって阻害される末端領域は、非ビルレント
なタンパク質をコード付ける遺伝子よりも」１流に位置
する配列である。

たとえば、非コード化末端５′領域は、ＦＨＡのアミノ
末端部用のコード化ヌクレオチド配列を含ａするボルデ
テラの染色体ＤＮＡフラグメント内に含有される（実施
例７参照）。

本発明によれば、ボルデテラの■ｉｒ領域（以下、「調
節領域」と称する）は、温度３５℃又は約３５℃及び／
又はＭｇ５ＯいＮａＣ（！又はニコチン酸の如き変調物
質（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ）を含
膏しない培養基を使用することによって完全に誘導され
る。

「完全な誘導」とは、活性化され得る末端５′領域をト
ランス活性化させることによって異種タンパク質の生産
を誘発する調節因子を生成する上記領域の能力をいう。

本発明によれば、調節領域は、上記変調物質を含ｆＴす
る培養基及び／又は室温（２ｆｌ−２５℃）を使用する
ことによって容易に抑制される。

これらの条件下では、システムは非活性形であり、調節
因子を生成せず、従って、これら因子によって阻害され
ていた末端５′領域は、直後に位置するプロモーターが
コントロール下での遺伝子の発現をガイドすることを可
能にする。

本発明によれば、ｖｉｒ＠域は、店主組織のゲノム内に
唯一のコピーとして存在する場合又はエキストラ染色体
エレメントとして多数のコピーに組込まれている場合に
、それぞれ誘導又は抑制される。

従って、本発明による調節システムは、該システムを使
用する組換えベクターによって形質転換された微生物を
使用することによりポリペプチドをコントロール下に高
収率で生産する際に特にａ用である。

さらに詳述すれば、組換えベクターは、当分野で一般的
に使用されているものの中から選ばれるクローニングベ
クターに、末端５′領域又はそのフラグメントを単独で
又はｖｉｒ領域を含有するＤＮＡフラグメントと組合せ
て挿入することによって好適に構成される。

ボルデテラ属菌の中から選ばれる宿主微生物を使用する
場合、組換えベクターとして末ｆｉｉ５′領域のみを含
有するものを使用することが好ましい。

従−）で、本発明の具体例では、末端５′領域（該領域
はｖｉｒ領域と組合された又は組合されていない調節因
ｆによってトランス活性化され得る）をクロー二〉グベ
クターに好適に挿入すると共に、該領域の後に、目的の
タンパク質をコード付ける遺伝子を位置せしめることに
よって凋製さイする。

かかる場合、異種タンパク質は、ベクターによって形質
転換された微生物を培養基中、変調剤の不存在下、温度
３５℃又は約３５℃で培養することによって発現される
。

本発明の他の具体例によれば、組換えベクターは、ボル
デテラｖｉｒ領域を含有する配列と組合された又は組合
されていない調節因子によって阻害される末端５′領域
を使用することによって構成される。

かかる場合、末端５′領域の後に位置する異種遺伝子は
、ベクターによって形質転換された微生物を変調化合物
の存在下、室温（２０−２５℃）で培養することによ−
・て発現される。

発現によってベクターを構成するために使用される方法
は、ベクター内でンステムをクローン化し、所望のタン
パク質をコード付ける遺伝子を末端５′領域の後に配置
せしめることでなる。

本発明によれば、異種遺伝子は、調節を受けないが、本
発明による調節配列が組込まれることによって応答性と
なった同種又は異種のプロモーターのコントロール下に
置かれる。

ついで、得られた組換えベクターを使用して宿主微生物
を形質転換する。

本発明のンステムにより異種タンパク質を発現させるた
めに使用できる微生物は、大腸菌（Ｅｃｏｌｉ）、枯草
菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）及びボルデテラの中から
選ばれる。本発明の好適な具体例は、大腸菌及びボルデ
テラを参照して記載している。

本発明は、ｖｉｒＱ節領域によってトランス活性化され
、かつ該領域の後に挿入された構造遺伝子の転写をシミ
ュレートし得る百日咳菌の百日咳毒素（ＰＴ）のオペロ
ンのプロモーターの上流に位置するプロモーター領域の
末端５′領域の発見及び解説を含む。

百日咳ｉ　木（ＰＴ）は５つの冗なったサブユニットで
構成されるタンパク質であり、これらのサブユニットは
、ビルレント相又は相Ｉにおいて、百日咳菌（ヒトに百
日咳を起させる細菌）によってのみ生産される。

他の２つの種類「バラ百日咳菌（Ｂ、　ｐａｒａｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ）及び気百支敗血症菌（Ｂ、　ｂｒｏｎｃ
ｈｉｓｃｐｔｉｃａ）］は、機能的に活性なＰＴをコー
ド付ける遺伝子を含有するが、遺伝子を発現させ得ない
［Ｂ、　Ａｒ１ｃｏ及びＲ，Ｒａｐｐｕｏｌｉ　ｒツヤ
−ナル・才ブ・バクテリオロジー（Ｊ、　　ＢａｃｔＱ
ｒｉｏｌｉ、）Ｊ　　１６９．　２８４７−２８５３（
１９８７）コ。

特開昭６２−２２１！２８６号には、百日咳菌のＰＴを
コード付ける遺伝子のクローニング及び配ダリ決定が開
示されており、ＰＴの各サブユニットをコード付ける遺
伝子が１つのソングルオペロン内に結合されていること
が示されている。

上述のオペロンの配列に関する分析の結果から、該プロ
モーターも、転写開始点から約４ｏｂｐ離れ、しかも大
腸菌のプロモーターの配ダリに非常に類似し１こコンセ
ンサス配列−３５漫び−１０を合資する領域として定義
されている。

しかしながら、ＰＴオペロンを含ａするプラスミドＰＴ
ＩＯＩによって形質転換された大腸菌の細胞は、極めて
少量の百日咳菌を生産することが見出された。かかるプ
ラスミドＰＴＩＯＩはアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションに１９８８年ＩＯ月１０日付けで寄託さ
れており、寄託番号はＡＴＣＣ６７８５４である。

これは、発明者らによって定義されたプロモーターが、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識される配
列を存してはいるが、この微生物の場合には不十分であ
ったことを表している。

本発明に従い、ＰＴの発現に必要な領域を特定するため
、ＰＴプロモーター及びその末端５′領域を含有するＤ
ＮＡ　ＥｃｏＲｌ　−ＨｉｎｄＩＩ［５３９ｂｐ７ラグ
メントをプラスミドＰＴＩＯＩ（ＡＴＣＣ６７８５４）
から単離した。

ついで、Ｂａ　１３１エキソヌクレアーゼ［Ｒ，Ｊ。

Ｌｅｇｅｒｓｋｉら「ヌクレイツク・アンッズ・リサー
チ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）Ｊ　５．１４
４５　（１９７８）］によって前記フラグメントを部分
的に消化して、ＰＴブロモ−ターの上流の領域から特定
の配列を除去４−ることによって欠失変霞体を調製した
。

具体的には、公知の方法により、予め好適な制限酵素に
よって消化したクローニングベクターに、精製したフラ
グメントを導入した。

制限酵素ＥｃｏＲｌ及び旧ｎｄＤＩによって消化したｂ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）を使用した。

得られたプラスミドを、緩衝液中において、そのＥｃｏ
Ｒ１部位で線状化し、溶液の一部をＢａ　１３１で部分
的に消化した。消化〆昆合物をＤＮＡポリメラーゼのＫ
ｌｅｎｏｗフラグメントで処理して末端を平坦にした後
、ＤＮＡを旧ｎｄｌｌＪで切断した。

得られた制限フラグメントを公知の方法に従ってゲルか
ら分離し、塩基５０ないし２５０個を含ａするしのをエ
レクトロ溶出し、配列を分析するためヘクター内で再ク
ローン化した。

このようにして、以下の欠失を有するＤＮＡフラグメン
トが同定された。

削除された　　プロモーターＰＴ　　　削除されたフラ
グメント　　　　　　　　　　　　領域Δ　２　　　　
−４８３−　＋１　　　　　　なしΔ１４　　　　　　
−１８３−　＋１　　　　　５’　　３００ｂｐΔ２５
　　　　　　−１７１　−　＋ｌ　　　　　　ｓＪ　　
３１２ｈｐΔ２０　　　　　　−１５８−　＋１　　　
　　５’　　３２５ｂｐ△２４　　　　　　−１４９　
〜　＋１　　　　　５’　　３３４ｂｐΔ４６　　　　
　　−１３０　−　＋１　　　　　５’　　３５３ｂｐ
Δ２８　　　　　　−１２３−　↓Ｉ　　　　　　５’
　　３６（ｌｂｐΔ７２　　　　　　−９７　−　・１
　　　　　５’　　３８６ｂｐΔ３３　　　　　　　−
８０　−　　＋１　　　　　５’　　４０３ｂｐΔ　Ｉ
　　　　　　　　−６２−＋１　　　　　５’　　４２
１ｂｐΔ２２　　　　　　−３７　−　＋１　　　　　
５’　　４４６ｂｐ表中、＋１は転写認識部位を示す。

）いで、ＢａｍＨＩ−旧ｎｄｌｌｌフラグメントを単離
し、該フラグメントの下流に異種遺伝子（該遺伝子はそ
れ自体のプロモーターを有していな（ｉ）を挿入するこ
とによって、当分野で公知のらのの中から選ばれるクロ
ーニングベクターに導入した。

本発明に従い、ベクターｐＬＡＦＲ２［Ａ、Ｍ、　Ｆｒ
ｉｅｄｍａｎ「ジーン（Ｇｅｎｅ）Ｊ　１ｇ、　２８９
−２９６　（１９ｇ２）コ及びクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコード付ける遺
伝子を使用した。

上述の欠失を存する組換えプラスミド（ｐＢＰ　１２、
＋４．２０．２２．２４．２５．２ｇ、　３３．４６及
び７２）を単離し、各種のボルデテラ属菌に接合させた
。

さらに詳しくは、百日咳菌ＢＰ　３５６　（ｐｔｘ：Ｔ
ｎ　５）ｖｉｒ＋及び百日咳菌ＢＰ　３４７　（ｖｉｒ
：Ｔｎ　５）ｖｉｒ−［＾、＾ｒｅｉｓｓ及びＳ、　Ｆ
ａｌｋｏｖ　ｒｌｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、Ｊ　４２
．３３−４１　（１９８３）］を使用した。

供与菌株として上述の組換えプラスミドによって形質転
換させた大腸菌５Ｍｌ０を使用し、Ｊ、　Ｂｏｒｄｅｔ
及びＯ，Ｇｅｎｇｏｕにより開示された方法［ｒ／ｖｍ
ｌｎｓｔ、　Ｐａ５ｔｅｕｒ　（Ｐａｒｉｓ月２３．４
ｔ５−４１９　（１９０９）］に従い、接合によって上
記菌株を形質転換させた。

ついで、得られた接合完了体を適当な培地、好ましくは
５ｔａｉｎｅｒ−Ｓｅｈｏｌｔｅ培地［ＤＪ、　５ｔａ
ｉｎｅｒ及びＬＪ、　５ｃｈｏｌｔｅｒＪ、　Ｇｅｎ、
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｊ　６３．２１１−２２０（１
９７１）１において十分な時間培養して、細胞を最高ａ
変で得た。

細胞を常法によって溶解し、つづいてＬ記形質転換菌株
によって発現されたＣＡＴの定噴及び定性分析を行い、
その活性を測定したＦＣ，Ｍ、　ＧｏｒｍａｎらｒＭｏ
ｌ、　Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏｌ、Ｊ　２．　１０４４−
１０５１　　（１９８２）；　ＡＮｉｃｏｓｉａ及びＲ
，Ｒａｐｐｕｏｌｉ　ｒＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ヨ
１６９２８４３−２８４６　（１９８７）］。

ＰＴプロモーターの上流の領域が少なくとら１７０ｂｐ
を含有するものであるプラスミドを含有するＢＰ３５６
（ｖｉｒ”）菌株においてのみＣＡＴの大規模生産か観
察されたとの結果を示した（第２図及び第４図に示す）
。

ハイブリッドプラスミドｐＢｒｔのようにこの領域か存
在しないこと又はボルデテラＢＰ３４７におけるように
ｖｉｒ領域が活性であることは、ＣＡＴの発現をかなり
低減させることになる。

これは、異種遺伝子の十分な転写には、少なくとも２つ
の条件、すなわち、（１）転写開始位置の上流に少なく
とも１７０ｂｐの末端５′領域が存在すること、及び（
２）ｖｉｒ領域によってコード付けられるトランス活性
化因子（１）が存在することが必要であることを表して
いる。

実際、−７０ないし−１５８の間の配列が失われた場合
には、ＣＡＴの活性は４５％低下することが観察された
。

＋４９ないし−１３０の間の領域が除去された場合には
、さらにＣＡＴの活性の低下（初期活性の約１０％）か
μられた。

最後に、プロモーターの一３５配列か８Ｉ壊された場合
には、活性は１％以下の値まで低下した。

末端５′領域の配列に関する分析でも、他の遺伝子につ
いて開示されている調節タンパク質の付着部位を代表す
る構造［Ｔ、　Ｍｉｚｕｎｏ及びＳ。

ｖｌｉｚｕｓｈｉｍａ　ｒジャーナル・オブ・バクテリ
オ口）−（Ｊ、　ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、）Ｊ　１６８．
８６−９５　（１９８６）；　０Ｒａｉｂａｕｄ　Ｅｃ
びＭ、　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　ｒＡｎｎ、　Ｒｅｖ、、　
ＧｅｎｅＬ、＋１８、１７３−２０６　（１９８４）ｌ
を該領域が含有していることを示（７た。

さらに詳述すれば、−１８２から−１７０までの領域に
含有される再発性（ｐａｌ　１ｎｄｒｏＩＩＩｉｃ）配
列（第３図）伎び−１５７から−１３７までの位置にお
ける２ｉｂｐ配列（ＤＮＡら線の２回転後に繰返される
）（第３図及び第６図）が検知された。

かかる結果を、ＤＮＡ配列の構造特性を存する各種欠失
変異体に関するＣＡＴ活性を相関させるために使用でき
、４つのレベル（Ａ、　Ｂ、　Ｃ及びＤ）に分けられる
（第４図）。

レベルＡ ＰＴプロモーターの末端５′領域の少なくとも１７０ｂ
ｐが存在する場合には、活性は最大である（ｐＢＰ２、
ｐＢＰ２５、ｐＢＰ１４）。

レベルＢ 第１の繰返し配列（ｐＢＰ２４）の一部又はその直ぐ上
流の領域（ｐＢＰ２０）の一部の除去は、ＣＡＴ活性を
４５％低下させる。

レベルＣ 第２の繰返し配列が部分的に又は完全に除去された場合
（ｐＢＰ４６、ｐＢＰ２８、ｐＢＰ７２、ｐＢＰ３３及
びｐＢＰＩ）、末端５′領域はトランス活性化される能
力を失う。

これは、繰返し配列（第６図）が真にトランス活性化因
子（ｉ）の付着部位であることを示している。

レベルＤ プロモーターの一３５配列が除去された場合（ｐＢＰ２
２）、ＣＡＴ活性！；ｔ”ｖｉｒ及びｖｉｒ−菌株のい
ずれにおいても１％以下の値に低下する。再発性配列を
含有する−１８２から−１７１までの配列を除去すると
、ＣＡＴ活性が明らかに増大することも注目すべきであ
る。これは、この配列が異種遺伝子の転写の調節におい
て重要な役割を果たすことを示唆している。

本発明に従い、結果をチエツクするため、２つのプラス
ミドを構成した。１つ（プラスミドｐＬＡＰＲＣＡＴ）
はＰＴプロモーター湊びその末端５′領域をａしていな
いものであり、他のもの（ｐＢＰ２５５）では、Ｋｐｎ
ｌ（＝６２）制限部位の上流の領域が、プロモーターの
ないＰＴのＳｌサブユニットをコード付ける６００ｂｐ
　Ｂａｗｌ　ｌ　−ＨｉｎｄｌｌＩフラグメントで互換
されている。

プラスミドｐＬＡＦＲ−ＣＡＴによって形質転換された
ボルデテラｖｉｒ＋及びｖｉｒ−ではＣＡＴ活性か全く
観察されず、一方、ｐＢＰ２５５を含ａするｖｉｒ”細
胞はｐＢＰｌ欠失変異体の場合に観察されたものと同じ
活性を示した。

これらの結果は、ＰＴプロモーターの上流の特殊な配列
がそのトランス活性化には必要であることを示した。

本発明によれば、ビルレントなパラ百日咳菌及び気管支
敗血症菌に導入される場合、上述の組換えプラスミドは
、これら微生物が百日咳菌ＢＰ３５７（ｖｉｒ”）の場
合に測定されるものと同一の飛でＣＡＴ遺伝子を発現さ
仕ることを可能にすることが見出された。

これは、上述の細菌には効果的なりｉｒ領領域存在して
おり、本発明の目的に使用されることを示している。

本発明に従い、末端５′領域に存在する変異のプロモー
ターの活性及びその転写の効率に対する効果を研究した
。

この目的のため、プラスミドｐＢＰ２のＥｃｏＲ１部位
（−４８３）とＫｐｎ　１部位（−６２）との間の領域
を、−１７０と−６２との間の配列の変異を有する気管
支敗血症菌の相当する領域で交換した。

ついで、得られたプラスミド（ｐＢＰ２と称する）を使
用して、パラ百日咳菌及び気管支敗血症菌のビルレント
な細胞を形質転換させた。

分析の結果、ＣＡＴ活性はプラスミドｐＢＰ２について
、制定された活性の約４０％であることか明らかになっ
た。

この結果は、末端５′領域の欠失に関する分叶結県と一
致した。

本を明に従い、後述の実施例５で報告するビルレントな
気管支敗血症菌７８６５の細胞を使用して、タンパク買
の発現に対するｄｇＳ０４及び温度の変調効果をテスト
した。

さらに、ボルデテラ以外の店主における本発明による誘
導システムの効力をチエツクするため、プラスミドｐ１
、Ａ−１４−ｖｉｒを構成し、後述の実施例６に報告す
るように大腸菌の細胞を形質転換さけた。

得られた結果（第１１図）は、この誘導可能なシステム
は大腸菌においても活性であることを示した。

従−て、この誘導システムが高収率で異種タンパク買を
生産するために使用されるベクターの構成に特に適する
ものであることは明らかである。

次に、添付図面について説明する。

第１図は、ベクターｐＬＡＦＲ２におけるＣＡＴ遺伝子
のＡＦｊの各種ＰＴプロモーターフラグメントのクロー
ニングを示す図である。

第２図は、それぞれ組換えプラスミドＰＢＰＩ及びｐＢ
Ｐ２を含有するボルデテラｖｉｒ＋（ＢＰ３５６）及び
ｖｉｒ−（ＢＰ３４７）の菌株から得られたＣＡＴを分
析した薄層クロマトグラフィーを示す図である。

結果をさらに明確に示すため、希釈抽出物について分析
を行った。

バンドＡクロラムフェニコール；　Ｂ、　Ｃ：クロラム
フェニコールモノアセチレート：Ｄクロラムフェニコー
ルジアセヂレート 第３図は、百日咳菌１５５（ＢＰ）、バラ百日咳菌９３
０５（ＢＰＰ）及び気管支敗血症菌４６１７（１３Ｂ）
から得られんＰＴのプロモーター領域のヌクレオチド配
列を比較する図である。ＢＰＰ及びＢＢにおいて相ａす
る塩塙をＢＰ配列の下に示した。ＰＴプロモーターの−
３５及び−１０領域を矩形で囲って示す。転写開始部位
（矢印で示す）を＋１とし、他のヌクレオチドをこれに
関連して番号付けした。各種欠失の位置を配列の上方部
分にΔクローン数によって示す。

この図は、さらに、クローニング操作において使用した
制限部位を示す。

ベクターｐＥＭＢＬ１８のポリリンカー由来の塩基を小
文字で表示している。

配列の而の矢印は繰返し領域を示す。

第４図は、ＰＴの末端５′領域の長さに関連する各種欠
失変異体のＣＡＴ活性（アセチル化％として表示する）
を示す図である。

黒の棒グラフは菌株ＢＰ３５６ｖｉｒ＋におけるＣＡＴ
活性を示し、一方、白の棒グラフは菌株ＢＰ３４７ｖｉ
ｒ−におけるＣＡＴ活性を示す。鎖線は説明のために選
択された４つのＣＡＴ活性レベルを限定する。標準偏差
はレベルＡではＩＯないし７％、レベルＢでは７ないし
５％であり、レベルＣでは５％以下である。

第５図は、バラ百日咳菌Ｐ１４（Ａ）及び気管支敗血症
菌７８６５（Ｂ）におけるＰＴのプロモーター領域の各
種変異体によるＣＡＴの分析結果を表わす薄層クロマト
グラフィーを示す図である。

結果をさらに明確に示すため、非希釈抽出物についてら
分析を行った。クロラムフェニコールのｈ積形体は第２
図の乙のと同じである。

第６図はプロモーター領域の上流の繰返し配列を比較す
る図である。バーは同種のヌクレオチドであることを示
す。

第７図は、８ＰＰ及びＢＢに共通な変異の分布を示すＰ
Ｔオペロンの構造を表わす図である（垂直のバーは直配
と同意義である）。

第８Ａ図及び第８Ｂ図は、ＰＴオペロンの末端５′領域
に各種の欠失を有するｐＢＰプラスミドによって形質転
換されたビルレントな気管支敗血症菌に対するＭｇ５Ｏ
，による変調を示す写真である。

２□）ｐＢＰ２２ ↓皮び−は培養基中におけろ！ｄｇｓＯ＋の存在及び不
１＃　ｔＥを示１−６ 第９図はプライマーの拡張の分析によるＲＮＡの同定を
示す写真である。

図中、■は対照配列、２はＭｇ５Ｏ＋の不存在下３５℃
で生育させたｐＢＰ２．３はＭｇ５Ｏ＊の存在下３５℃
で生育させたｐＢＰ２．４はＭｇ５Ｏｈの不存在下２５
℃で生育させたｐＢＰ２及び５はＭｇ５Ｏ＋の存在下２
５℃で生育させたｐＢＰ２に係る。

第１Ｏ図はｐＢＰ２で形質転換させた気管支敗血症菌に
ついて、温度による変調を示す写真である。図中、Ｉは
Ｍｇ５０ｍの不存在下３５℃で生育させた場合、２はＭ
　ｇ　Ｓ　Ｏ４の存在下３５℃で生育させた場合、３は
ＭｇＳＯ４の不存在下２５℃で生育させた場合に係る。

第１１図はｐＢＰ１４及びｐＬＡ−１４−ｖｉｒで形質
転換させた大腸閑旧４４３、大腸菌ＫＹ２５６２ｏｍｐ
Ｒ及び大腸菌ＦＮＩ０２ｏ１１ｐＲにおけるＰＴプロモ
ーターの発現及び変調を示す写真である。

第１２図はプラスミドｐＦＨＡによって形質転換させた
ビルレント及び非ビルレントな気管支敗血症菌における
ＭｇＳＯ４による変調を示す写真である。図中、Ｉはｐ
Ｂ８７８６５（ｖｉｒ＋）−１２はｐＢＢ７８６５（ｖ
ｉｒ＋）　＋、３はｐＢＢ（ｖｉｒ→−５４はｐＢＢ（
ｖｉｒ−）十に係る。なお、末尾の十及び−は培＃基に
おけるＭｇ５Ｏ＊の存在及び不存在を示す。

実施例１ 失を存する組換えプラスミドの構成 プラスミドｐＡ１０−　ＣＡＴ２［Ｃ，Ｄ’０ｎｏｆｒ
ｉｏら「）、　ＥＭＢＯＪ４、１９８１−１９８９　（
１９８５）］２０μ９を緩衝液中、酵素の供給者によっ
て指示された条件下において、制限酵素旧ｎｄｌＩｌ及
びＸｂａ　Ｉ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）各６０単位（
ＩＪ）で消化した。

酵素を６５℃、１５分間で不活性化し、消化混合物を０
．８％アガロースゲル上に置き、＋ＯＯＶで２時間泳動
させた。

ついで、プロモーターを存しないＣＡＴ遺伝子を含有す
る１６３６ｂｐ　ＨｉｎｄｌＩ［−Ｘｂａ　Ｉフラグメ
ントをＭａｎｉａＬｉｓの方法（［モレキュラー・クロ
ーニングア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　
ｍａｎｕａｌ）Ｊ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒ
ｂｏｒ。

１９８２）によってエレクトロ溶出した。

Ｂａ　１３１（ＢＲＬ）エキソヌクレアーゼを使用し、
Ｒ６」４１６ｇｅｒｓｋｉらの方法［ｒＮｕｃｌ、　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、Ｊ　５．１４４５（１９７８）］に
従ってＰＴプロモーターの末端５′領域における欠失を
行った。

具体的には、プラスミドＰＴＩＯＩ（ＡＴＣＣ６７８５
４）１０μ９をＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌｌＩ　（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ）３０Ｕで消化した。

６５℃、１５分間で酵素を不活性化した後、消化混合物
を１３％アガロースゲル上に置き、１００ｖで２時間泳
動させた。

ついで、末端５′領域を有するＰＴプロモーターを含有
する５３９ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−ＨｉｎｄｌＩｒフラグ
メントをゲルからエレクトロ溶出した。つづいて、該フ
ラグメント２００ｎｇを、予め制限酵素ＥｃｏＲ［及び
旧ｎｄ■により、これら酵素の供給者（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ）の指示する方法に従って消化したｂｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ　ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に結
合させた。

リゲーンヨンを、緩衝溶液［６６＋＋＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＱ、　ｐＨ７，６、ｌｄ　ＡＴＰ、　１０ｍＭ　Ｍ
ｇＣ（Ｉｔ及び２０ｍＭジチオスレイ）　−ル（ＤＴＴ
）］３０　ｔｔ　Ｑ中、Ｔ４ＤｌｆＡＩ、ｌガーゼｉｏ
ノ存在下、１４℃、１８時間で実施した。

終了後、全混合物を使用して、Ｍｅｓｓｉｎｇによって
開示された方法［［−メソッズ・イン・エンザイモロノ
ー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）Ｊ
　ｖｏｌ、１０１２０１８　（１９８３）］により、Ｃ
ａＣＱ、でコンピテントとした大腸菌ＪＭＩＯＩ（ＢＲ
Ｌ）を形質転換させた。

ついで、アンビンリン１００μ９／ＬＸ（ｌを添加した
１、Ｂ寒天培地（ＤＩＦＣＯ）のプレート上において３
７℃で１８時間培養して形質転換体を選別した。

得られた陽性のクローンの１つからプラスミドを単離し
た。このプラスミドは所望の特性を有していた。

該プラスミド４０μ２をεｃｏＲＩ　　２００υにより
３７℃、１２時間で切断し、ついでＢａ　１３１（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ）６０により３７℃で部分的に消化し
、３０秒毎に２，５μＱをザンブル抽出した。

このように消化した各ザンプルにＤＮＡポリメラーゼ（
１）Ｋｌｅｎｏｖフラグメント２Ｕを添加して末端を平
坦にし、ついで制限酵素旧ｎｄｌＩ１５Ｕで消化した。

混合物を３７℃に５時間維持し、酵素を不活性化した後
、４％ポリアクリルアミドゲル上に置き、２５０ｖで２
時間泳動させた。塩基５０ないし２５０個を含有するＤ
ＮＡフラグメントをエレクトロ溶出し、予め制限酵素Ｓ
ｍａ　Ｉ及びＨｉｎｄ［［Ｉで消化したｂｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ　ＳＫベクターにおいて、上述のものと同じ方法
に従ってクローン化し、Ｓａｎｇｅらの開示［ｒＰＮＡ
ｓ　ＬＩＳＡＪ　？４．５４６３　（１９７７）］に従
って配列決定した。

末端５′領域に欠失を有するＢａｍＨＩ　−１ｉｉｎｄ
ｌフラグメント（第３図）をｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ
Ｋベクターから単離し、プラスミドルＬへＦＲ２［Ａ、
Ｍ、　ＦｒｉｅｄｍａｎらｒＧｅｎｅＪ　１８．２８９
−２９６　（１９８２）］（第１図）においてクローン
化した。

プラスミドｐＬＡＦＲ２１０μ９を制限酵素ＢａｍＨＩ
及びＸｂａ　Ｉ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）各５０ｔｌ
で消化した。

酵素を不活性化した後、混合物を０．５％アガロースゲ
ル上に置き、ｔｏｎで２時間泳動させた。

ＤＮＡ　ＢａｍＨＩ　−Ｘｂａ　Ｉの２６０ｋｂ　ｂｐ
フラグメントをエレクトロ溶出した。

ついで、ＢａＩＩＩＩ　Ｉ　−Ｘｂａ　ｌフラグメント
０５μ９及び上述の工程Ａに記載の如くして得られた旧
ｎｄｎｌＸｂａ　ｌフラグメント０３μ２を各種の欠失
を有するＢａｍＨｌ　−１１ｉｎｄＯＩフラグメント各
０．０８μｆに添加し、リガーゼｌ昆合物３０μρ中、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２Ｕの存在下、１４℃で一夜リガー
ゼ処理した。

リガーゼ混合物を使用して大腸菌５Ｍｌ０のコンピテン
ト細胞［Ｒ，Ｓｉｍｏｎら［バイオ／テクノロジー（Ｂ
ｉｏ／ＴｅｃｈｎｏｌｏｇＹ）Ｊ　Ｉ　、　７８４−７
９１　（１９８３）］を形質転換させ、ついで、テトラ
サイクリン１２．５μ７／１シを添加したＬＢ寒天培地
上、３７℃で一夜培養して形質転換体を選別した。

得られたクローンから、所望の特性を有する組換えプラ
スミドを含有するものを単離した。

末端５′領域に各種の欠失を何するＰＴプロモーターの
前にＣＡＴ遺伝子を含有するプラスミドを、ｐＢＰ２２
、ｐｓｐｔ、ｐＢＰ３３、ｐＢＰ７２、ｐＢＰ２ｇ、ｐ
ＢＰ４９、ｐＢｐ２４、ｐＢＰ２Ｑ、ｐＢＰ２５、ｐＢ
ｐ口及びｐＢＰ２とラベル付けした（第４図）。

第３図は、各組換えプラスミドについての３種欠失の位
置（Δで表示する）を示す。

実施例２ ＰＴオペロンのプロモーター領域 実施例１に記載の如くして得られたハイブリッドプラス
ミドを、接合技術を使用して、百日咳菌ＢＰ３５６（ｐ
ｔｘ　：Ｔｎ　５　）ｖｉｒ＋及び百日咳菌ＢＰ３４７
（ｖｉｒ：Ｔｎ５）ｖｉｒ−［＾、＾、　Ｗｅｉｓｓら
ｒｌｎｆｅｃ、　　１ｍｍｕｎ、Ｊ　４２．　３３４１
（１９８３）］の菌株に導入した。

具体的には、Ｊ、　ＢｏｒｄｅＬ及び０．　Ｇｅｎｇｏ
ｕによって開示された方法［［＾ｎｎ、　Ｉｎｓ、　Ｐ
ａ５ｔｅｕｒ　（Ｐａｒｉｓ）Ｊ２３、４１５−４１９
（１９０９）］に従い、Ｂｏｒｄｅｔ　−Ｇｅｎｇｏｕ
プレート上において少なくとも６時間培養した受容菌（
ボルデテラ）及び供与閑の新鮮な培養物を使用すること
によって接合を行った。

ついで、テトラサイタリンＩＯμｇ／峠、ストレプトマ
イシン２００μｇ／ｒ＆及びナリディック酸（ｎａｌｉ
ｄｉｘｉｃ　ａｃｉｄ）２０ｔｔ９／ｘＱを添加したＢ
ｏｒｄｅｔ　−ＧｅｎｇＯＵプレート上、３５℃で１５
時間培養して、エキソ接合体を選別した。

このようにして選別した後、ボルデテラｖｉｒ＋及びｖ
ｉｒ−の菌株を、テトラサイクリンｌＯμｇ／　ｗ（ｌ
を含ａオる５ｔａｉｎｅｒ　−５ｃｈｏｌＬｅ培地ＣＤ
、　Ｗ、　５ｔａｉｎｅｒ及びＭ、　Ｊ、　５ｃｈｏｌ
ｔｅ　ｒＪ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｊ　６
３．２１＋２２０　（１９７１）ｌｌＯｍＱ中、３５℃
において、光学密度（５８０ｎ！Ｑで測定）が０８とな
るまで生育させた。

ついで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機を使用して、凸
培地１　、５ｘｆ２を５０００ｒｐｍで５分間遠心分離
した。

このようにして回収した後、細胞を０．２５ｉ１　Ｔｒ
ｉｓＨＣρ緩衝液（ｐＨ７，８）３００μ＋！に＠濁化
し、Ｃｅ１ｌＤｉｓｒｕｐＬｅｒ　（Ｂｒｏｎｓｏｎ　
５ｏｎｉｅ　Ｐａｒｏｖ）での音波処理によって破壊し
、再度遠心分離した。

上澄液を回収しく３００μＱ）、６５℃で１０分間イン
キュベートし、遠心分離し、活性の分析によるクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼの存在皮び濃
度の測定に供した［Ａ、　Ｎ１ｃｏｓｉａ及びＲＲａｐ
ｐｕｏｌｉ　ｌ”Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｊ　１６
９．２８４３−２８４６（１９８７）；　Ｃ，Ｍ、　Ｇ
ｏｒｍａｎらｒＭｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、Ｊ　
２１０４４−１０５１　（１９８２）］。

実際には、上澄液１５μシを０．２５Ｍ　Ｔｒｉｓ　−
ＪＩＢ　緩衝液（ｐＨ７、８）て希釈して１５０１１ｃ
とし、［”Ｃ］ケロラムフェニコールｌμＣｉを添加し
た。

３７℃で５分間インキュベートした後、各溶液に４ｍＭ
アセチルコエンザイムＡ　２０μＱを添加し、得られた
混合物を３７℃で１時間インキュベートした。

この時間の終了後、クロラムフェニコール及びその誘導
性を冷たい（０℃）酢酸エチル２ｒｘＱで抽出すること
によって酵素反応を停止させた。

蒸発によって有機相を除去し、シリカゲルプレートを使
用し、クロロホルム／メタノール混合物（９５／　５　
、　ｖ／　ｖ）で１時間展開して、各種形状のクロラム
フェニコールを薄層クロマトグラフィーによって分離し
た。

ついで、結果を表示するため、該プレートを室温におい
て一夜Ｘ線感光板（Ｋｏｄａｋ　Ｘ−軸ａｔ　ＡＲ）と
接触させた（第２図）。

発現されたＣＡＴを定量分析するため、サンプルを１：
１ないしＩ　：３００に希釈し、上述の如くして分析し
た。

オートラジオグラフィー後、非アセチル化クロラムフェ
ニコール及びモノアセチル化クロラムフェニコールをカ
ットし、計量した。第２図及び第４図に示す結果から得
られた結論は下記のとおりである。

（１）プロモーターの効果的な活性、従って該領域の後
に位置する異種遺伝子の転写のためには、転写開始部位
（便宜的に＋１と表示する）の上流に少なくとら一１７
０ｂｐの領域が必要である。

（２）プロモーター領域を活性化し、遺伝子を転写する
ためには、ｖｉｒ領域が必要である。

（３）−１８２位と一１７１位との間の領域が欠失する
場合には、ＣＡＴの発現が明らかに増大することになる
。これは、該領域における再発性配列の欠失によるもの
である。

上述の結果を確認するため、それぞれ負及び正のコント
ロールとして使用される２種のプラスミドｐＬＡＦＲ−
ＣＡＴ及びｐＢ２５５を構成した。

さらに詳述すれば、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａ　１
で消化したベクターｐ＋、＾ＦＲ２において、ｐＥＭＢ
ＬｌｇのＢａｍＨＩ　−Ｈｉｎｄｌｌｌリンカ−［Ｌ、
　ＤｅｎｔｅらｒＮｕｃ　ｌ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、ｊ　
１１．１６４５−１６５５　（＋９８３）］を使用して
遺伝子（遺伝子は自前のプロモーターを有していな（ｉ
）をクローン化することによってプラスミドｐＬＡＦＲ
−ＣＡＴを得た。

一方、プロモーターが除去されたＰＴの８１サブユニツ
トをコード付けるプラスミドｐＴ１０１（ＡＴＣＣ６７
８５４）［Ａ、　　Ｎ１ｃｏｓｉａら　ｒｌｎｆｅｃｔ
、　　Ｉｍｍｕｎ、Ｊ　５５．　９６３９６７　（１９
８７）］から得られた６００ｂｐ　ＢａｍＨＩ　−Ｈｉ
ｎｄ■フラグメントをＫｐｎｌ（−６２）部位（第３図
）の上流に挿入することによってプラスミドｐＢＰ２５
５を構成した。

ついで、これらのプラスミドを接合によってＢＰ３５６
（ｖｉｒ＋）及びＢＰ３４７（ｖｉｒ→に導入し、培養
し、溶菌処理した後、上述の如くしてＣＡＴ活性を測定
した。

プラスミドｐｉ、ＡＰＲ−ＣＡＴで形質転換させる場合
、ボルデテラのいずれの菌株においてもＣＡＴ活性が存
在せず、一方、ｐＢＰ２５５を含有する菌株ＢＰ３５６
（ｖｉｒ＋）はプラスミドｐＢＰ　Ｉについて測定され
たものと同じ活性を有するとの結果が得られた。

これは、トランス活性化にはＰＴプロモーターの玉流の
特殊な配列が必要であることを示している。

実施例３ ビルレント相にあるパラ百日咳菌Ｐ１４（ＳＣＬＡＶＯ
）及び気管支敗血症菌７８６５（ＳＣＬＡＶＯ）の細胞
に、５′領域に各種の欠失を有するプラスミド及びプラ
スミドｐＬＡＦＲ−ＣＡＴを接合させた。

ついで、実施例２と同様にして、エキソ接合体を５Ｌａ
ｉｎｅｒ　−５ｃｈｏｌｔｅ培地で培養した。

最後に、ＣＡＴの活性を測定することによりＣＡＴの発
現を検知するため培養物を分析した。

結果（第５図）は、百日咳菌ＢＰ３５６（ｖｉｒ＋）に
ついて得られたものと同一であった。

実施例４ 上記実施例３に記載した操作法に従い、ビルレント相に
ある気管支敗血症菌７８６５に、ｐＢＰ２のＦ、ｃｏＲ
Ｉ　（−４８３）部位とＫｐｎｌ（−６２）部位との間
の領域を気管支敗血症菌の相当する領域によって交換し
て得られたプラスミドｐＢＰ２を接合させた。

気管支敗血症菌の相当する領域は、−１７０℃と６２と
の間の配列に変異を有しており、これら変異は百日咳菌
にも共通する（第７図）。

実施例２の如くして測定されたＣＡＴ活性は、ｐＢＰ２
で形質転換された場合の該菌株によって測定されたもの
の約４０％であり、ｐＢＰ４６で形質転換させた気管支
敗血症菌について得られたものと同一であった。

実施例５ ｖｉｒ領域の変調 ビルレントな気管支負血症菌７８６５の細胞を、ＰＴオ
ペロンの５′領域に各種の欠点を有するプラスミドｐＢ
Ｐと接合させた。

得られたエキソ接合体を、５Ｌａｉｎｅｒ−３ｃｈｏｌ
ｔｅ培地１ＯＲＱを収容する三角フラスコ１５０１９で
別々にインキュベートし、３５℃で一夜培養した。

Ａ、Ｍｇ５Ｏａの変調効果 ついで、各々の予培養物ｌＯμＱを２個１組で三角フラ
スコに再接種した。フラスコの一部は、７０ｍＭ　Ｍｇ
５Ｏ＋を添加した５ｔａｉｎｅｒ−３ｃｈｏｌｔｅ培地
３０峠を収容し、残りのフラスコは培地のみを収容する
。

ゆるやかに撹拌しながら、５８０ｎｒｒｒにおける光学
密度が０．８になるまでフラスコを３５℃に維持した。

最後に、各フラスコから採取した培養物１．５峠ずつを
分析して、活性を測定することによりＣＡＴの発現を確
認した。同時に、各培養物２０ｘＱを、ＲＮＡの存在又
は不存在を確認するため分析に供した。

Ｃ，Ｄ’０ｎｏｆｒｉｏらの方法［ｒＥＭＢＯＪ　Ｉ　
４．１９８］１９８４　（１９８５）］によってＲＮＡ
を定量分析した。

Ｍｇ５Ｏ＊の存在下で培養した菌株の場合には、ＣＡＴ
活性が存在しないとの結果を示した（第８Ａ図及び第８
Ｂ図）。これは、この塩が調節領域を阻害することを表
している。

さらに、第９図に示す結果（１？ｌｌＡが存在しないこ
とを示す）は、萌述の観察結果（すなわち、ＣＡＴをコ
ード付ける遺伝子の発現が見られないこと）を追認した
。

Ｂ、温度の変調効果 ビルレントな気管支負血症菌７８６５の細胞をプラスミ
ドｐＢＰと接合させ、３５℃で一夜培養した。

予培養物ＬＯｘＱを使用して、５ｔａｉｎｅｒ−３ｃｈ
ｏｌＬｅ培地３０ｘ（！を収容する三角フラスコに接種
した。

ついで、フラスコのいくつかを５８０ｎｍにおける光学
密度が０．８となるまで３５℃で培養し、他を室温（２
０−２５℃）で培養した。

最後に、各培養物について分析して、ＣＡＴの活性を測
定した。

室温で培養した菌株についてはＣＡＴ活性が存在しない
との結果を示した（第１０図）。

実施例６ ｖｉｒ領域の単離 パラ百日咳菌９３０５　（ｖｉｒ＋）を５ｔａｉｎｅｒ
−３ｃｈｏｌｔｅ培地５００ｘｆ２中、３７℃で２日間
培養した。

最後に、遠心分離機５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−５Ｂにおい
て４℃で遠心分離（５０００ｒｐｍで１０分間）してブ
イヨン培地から細胞を分離し、２５％サブ力ロース、Ｉ
（１（ｌｄＮａＣＱ及び５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｃ
　ｐＨ７，５の溶液で洗浄しく２ＸＩ２０ＪＩジ）、直
配の如く再度遠心分離した。

リゾチーム（Ｓｉｇｍａ）　　Ｉ　ｍｇ７ｘ（ｌを含存
する緩衝溶液（ｌｏｏｍＭ　ＥＤＴＡ及び５０ｍＭ　Ｎ
ａＣ（ｌ　　ｐＨ６，９）　１０ｘＱに細胞を再度懸濁
化させた。

ついで、得られた懸澗液を緩やかに撹拌しなから０℃に
３０分間維持した。

懸澗液に５ＤＳ（ナトリウムドデシルスルフェート）Ｉ
ＲＱを添加し、つづいて６０℃に１０分間維持した後、
Ｉ　ｘｓｓｃ　ｃｓｓｃ＝　１．１５Ｍ　ＮａＣＱ、　
１５ｍＭクエン酸ナトリウム）中、３７℃で３０分間ブ
レインキュベートしたプロナーゼＩ　ｍｇ／Ｑを添加し
た。得られた混合物を３７℃に２時間維持した。

ＮａＣＱを添加して最終濃度をＩＭとした後、冷たい（
−２０℃）エタノール２−３容でＤＮＡを沈殿させ、ガ
ラス棒で集め、ｏ、１ｘｓｓｃ　１ｏＲＱ中に再度懸濁
化させた。

ゆるやかに撹拌しながら溶液を室温（２０−２５℃）に
−夜維持し、ＲＮＡ５ｅ　（１０７／ｘ（りを添加した
後、３７℃に３０分間維持した。

溶液の塩濃度をｔｘｓｓｃとし、フェノール（■容）で
抽出した後、イソプロパツールを滴加してＤＮＡを沈殿
させた。

得られた染色体ＤＮＡ６０μ９を、反応混合物５００μ
ρ中、ＢａｍＨＩ　　１５０ＬＩにより１２時間消化し
た。

ついで、消化混合物を、Ｉ　ｍＭ　ＮａＣＱ、　ｌＯｄ
　ＴｒｉｓＨＣρｐＨ７，５及び］　ｍｌＪ　ＥＤＴＡ
を自存する緩衝液３５峠中、サッカロース勾配（ＩＬ−
４０％）に負荷し、ローターＢｅｃｋＩＩｌａｎ　！１
４２−８において、２６０００ｒｐｍ、　２０℃で１６
時間遠心分離した。

最後に、勾配をフラクションに分割し、各フラクション
の一部を０．７％アガロースゲル上、２０Ｖで一夜泳動
して、約１４０００ｂｐのフラグメントを含有するフラ
クションを同定した。

ついで、フラクションを合せ、エタノールでの沈殿（−
２０℃）によりＤＮＡを凝集させた。

１２００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離した後、ＢａｍＨ
Ｉで適当に消化したプラスミドｐし八ＦＲ２（第１図）
においてＤＮＡをクローン化した。

得られたハイブリッドプラスミドを百日咳菌ｖｉｒ＋に
おいて接合し、Ｂｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕ培地上に展
開した。

３５℃で一夜維持した後、ｖｉｒ＋菌株の代表的なハロ
を示すりσ−ンを選別した。

この菌株からプラスミドを単離し、制限酵素ＢａｍＨＩ
　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）により、酵素供給者の指示
する方法に従って消化した。

ｖｉｒ領域を含有する約４　、７ｋｂのフラグメントを
単離し、予めＢｇｌ　１１　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）
で消化したプラスミドｐＢＰ１４に対してリガーゼ処理
した。

上述の如くして、リゲーソヨンを１４℃、１８時間で実
施した。

ついで、混合物を使用して、大腸菌ＪＭ１０９のコンピ
テント細胞を形質転換させた。

テトラサイクリン１２．５μ９７峠を添加したＬＢ寒天
（ＤＩＦＣＯ）培地において３７℃で一夜培僕して形質
転換を選別した。所望の特性を何するプラスミドを陽性
のクローンの１つから単離し、ｐＬＡ川４用ｖｉｒと命
名した。

入腸菌旧４４３、大腸菌ＫＹ２５６２　ｏｍｐＲ及び大
腸菌ＦＮ１０２　ｏｍｐＲの細胞をプラスミドｐ１．Ａ
−１４−ｖｉｒｐＢＰ１４によって形質転換させ、テト
ラサイクリン１２．５μ９／ｘＱを添加したＬＢ培地１
０峠中で、光学密度（５８０ｎｏ＋で測定）が０．０５
となるまで３７℃で培養した。

ついで、各培養物５μｅを、テトラサイクリン（１２，
５μ９／峠）を添加したＬＢ培地ＩＯ峠に２個１組で再
接種し、ＭｇＳＯ４（７０ｍＭ）の存在下又は不存在下
、光学密度（５８０ｎｍで測定）が０．８となるまで３
５℃で培養した。

最後に、各培養物１．５１をＣＡＴ活性の測定に供した
。

得られた結果（第１１図）は、プラスミドｐＢＰ１４と
接合させた気管支負血症菌について得られたものと同一
であった。大腸菌の各菌株間では差異が観察されなかっ
た。

実施例７ プラスミドｐＦＨＡの構成 Ｍａｎｉａｔｉｓの開示の如くして抽出、精製した百日
咳ＢＰ１６５　（ＳＣＬＡＹＯ）の染色体ＤＮＡを制限
酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ　　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ）で消化した。消化混合物を０．８％アガロースゲ
ル上に置き、１００　Ｖで３時間泳動させた。

最後に、塩居４０００ないし２０００個を含有するフラ
グメントをゲルからエレクトロ溶出した。

これらのフラグメントのｆつ（約３５００ヌクレオチド
で構成される）は、５′における非コード付け領域及び
ＦＨＡのアミノ末端配列に相当する配列を有する領域を
含ａすることを示した。

ｐＵｃ１８のポリリンカーを使用して、ベクターｐＬＡ
ＲＦ２において、フラグメントを構造ＣＡＴ遺伝子の前
でクローン化した。

具体的には、３５００ｂｐ　ＥｃｏＲｌ　／ＢａｍＨｌ
フラグメント、ｐＵｃ１ｇポリリンカー、ＣＡＴ遺伝子
を含有する１６３６ｂｐの旧ｎｄ　ＩＩＩ　／Ｘｂａ　
ｌフラグメント及びＢａｍＨＩ及びＸｂａ　Ｉで消化し
たプラスミドｐＬＡＲＦ２を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存
在下、１４℃で一夜結合させた。

ついで、リゲーシクン混合物をしようして、コンピテン
トとした大腸菌５Ｍ１０の細胞を形質転換させ、実施例
１に記載の如くして形質転換体を選別した。

陽性のクローンから単離した組換えプラスミドを制限地
図によって特定した。

実施例２と同様に操作して、プラスミドの１つ（ｐＦ［
ＩＡ）を気管支敗血症菌ｖｉどに接合させた。

ついで、エキソ接合体を、５ｔａｉｎｅｒ−３ｃｈｏｌ
ｔｅ培地中、ＭｇＳＯ４の存在下及び不存在下、３５℃
及び２５℃で培養した。

各培養物についてＣＡＴ活性を測定した。

調節システム及びＣＡＴの発現に対するＭｇ５Ｏ＋及び
温度の変調効果は、百日咳のＰＴプロモーターの上流の
５′領域を使用する際に観察されたものと逆方向である
旨の結果が得られた（第１２図）。

【図面の簡単な説明】

第１図はベクターｐＬＡＦＲ２におけるＣＡＴ遺伝子の
前の各種ＰＴプロモーターフラグメントのクローニング
を示す図、第２図はそれぞれ組換えプラスミドｐＢＰ　
１及びｐＢＰ２を含有するボルデテラｖｉｒ＋（ＢＰ３
５６）及びｖｉｒ−（ＢＰ３４７）の菌株から得られた
ＣＡＴを分析した薄層クロマトグラフィーを示す図、第
３図は百日咳菌１６５（ＢＰ）、バラ百日咳菌９３０５
（ＢＰＰ）及び気管支敗血症菌４６１７（ＢＢ）から得
られたＰＴのプロモーター領域のヌクレオチド配列を比
較する図、第４図はＰＴの末端５′領域の長さに関連す
る各種欠失変異体のＣＡＴ活性（アセチル化％として表
示する）を示す図、第５図はバラ百日咳菌Ｐｉ４（Ａ）
及び気管支敗血症菌７８６５（Ｂ）におけるＰＴのプロ
モーター領域の各種変異体によるＣＡＴの分析結果を表
わす薄層クロマトグラフィーを示す図、第６図はプロモ
ーター領域の上流の繰返し配列を比較する図、第７図は
ＢＰＰ及びＢＢに共通な変異の分布を示すＰＴオペロン
の構造を表わす図、第８Ａ図及び第８Ｂ図はＰＴオペロ
ンの末端５′領域に各種の欠失を有するｐＢＰプラスミ
ドによって形質転換されたビルレントな気管支敗血症菌
に対するＭｇ５Ｏａによる変調を示ず写真、第９図はプ
ライマーの拡張の分析によるＲＮＡの同定を示す写真、
第１０図はｐＢＰ２で形質転換させた気管支敗血症菌に
ついて温度による変調を示す写真、第１１図はｐＢＰ１
４７ＭびｐＬＡｉ４−ｖｉｒで形質転換させた大腸菌１
（１４イ３、大腸菌ＫＹ２５６２０＋１１ＰＲ支び大腸
菌ＦＮ１０２　ｏｍｐＲにおけるＰＴプロモーターの発
現及び変調を示す写真、及び第１２図はプラスミドｐ　
Ｆ　ＨＡによって形質転換させたビルレント支び非ビル
レントな気管支敗血症菌におけるＭｇ５Ｏ，による変調
を示す写真である。 ｌ′？１ 代理人　木　村　　正　巳゛７！ ・・、ｊ （ほか１名） ＦＩＧＩＪＲＥ　　ｉ しｅセ ＦＩＧＵＲＥ３ ＦＩＧＵＲＥ　２ １ｒ− ｖｉｒ” 嚇 ・ ・ Ｐ３４７ ＢＰ１ Ｐ３４７ ＢＰ２ Ｐ３５６ ＢＰ１ Ｐ３５６ ＢＰ２ ＦＩＧＵＲＥ　４ ＦＩＧＵＲε　５ ・・・・ｅ・ ・ｅ 嘲し 噛ｉ 嗜 ・ ・ 鳴 ・ 喝−レ　　・− ８Ｂ・ ＦＩＧＵＲε　７ ＦＩＧＬＩＲＥ　６ Ｆ工ＧＯＲＥ　　８Ａ ２　ろ　４　曳　く　≧　ご　ミン　”（ＪＦＩＧＵＲ
Ｅ　　８Ｂ １−、　　べ、・　１４．１　　・・ｌ　妬　ぜ　坏　
智　グ゛Ｃこゞ　；：、ＩＧＵＲＥ ＦＩＧＵＲＥ　　９ ｒ″Ｎ ＦＩＧＵＲＥ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　微生物の発現による異種タンパク質の製造における
   使用を目的として発現によって増殖可能なベクターを構
   成するために使用される誘導性調節システムにおいて、
   １以上の調節因子をコード付けるボルデテラの￥ｖｉｒ
   ￥領域を包含すると共に、前記因子によってトランス形
   で活性化又は阻害され、しかも下流に位置するプロモー
   タが目的のタンパク質の発現をコントロールすることを
   可能にするボルデテラタンパク質をコード付ける遺伝子
   の前に位置する末端５′領域を包含することを特徴とす
   る、調節システム。 ２　請求項１記載のものにおいて、調節因子によってト
   ランス形で活性化される末端５′領域が、ビルレントな
   ボルデテラタンパク質をコード付ける遺伝子（ｉ）の前
   に位置するものの中から選ばれる、調節システム。 ３　請求項２記載のものにおいて、末端５′領域が、百
   日咳菌によって生産される百日咳毒素をコード付けるオ
   ペロンの転写開始の認識部位の前に位置する４８３塩基
   対の配列である、調節システム。 ４　請求項３記載のものにおいて、前記配列が少なくと
   も６２塩基対を包含するものである、調節システム。 ５　請求項３記載のものにおいて、前記配列が１７０塩
   基対を含有するものである、調節システム。 ６　請求項１記載のものにおいて、前記調節因子によっ
   てトランス形で阻害される末端５′領域が、非ビルレン
   トなボルデテラタンパク質をコード付ける遺伝子の前に
   位置するものの中から選ばれる、調節システム。 ７　請求項６記載のものにおいて、前記末端５′領域が
   、ＦＨＡタンパク質のアミノ末端部をコード付ける染色
   体ＤＮＡのフラグメントに含有される非コード化配列で
   ある、調節システム。 ８　請求項１記載のものにおいて、温度３５℃又は約３
   ５℃及びＭｇＳＯ＿４、ＮａＣｌ又はニコチン酸の如き
   変調物質を含有しない培養基を使用することによって誘
   導が引起される、調節システム。 ９　請求項１記載のものにおいて、室温（２０−２５℃
   ）及びＭｇＳＯ＿４、ＮａＣｌ及びニコチン酸の如き変
   調物質を添加した培養基を使用することによって阻害が
   引起される、調節システム。 １０　発現によって増殖され、かつ異種遺伝子を含有し
   てなり、発現が請求項１−９記載の正の調節システムの
   コントロール下にある、ベクター。 １１　大腸菌及びバシラスのプラスミドの中から選ばれ
   る、請求項１０記載の発現によって増殖可能なベクター
   。 １２　前記プラスミドがｐＬＦＲ２である、請求項１１
   記載の発現によって増殖可能なベクター。 １３　コード付け遺伝子の発現によって異種タンパク質
   を生産可能であって、該発現が請求項１−９記載の調節
   システムのコントロール下にある、請求項１０記載の発
   現によって増殖可能なベクターで形質転換された微生物
   。 １４　大腸菌、ボルデテラ及びバシラスの中から選ばれ
   る、請求項１３記載の形質転換微生物。 １５　請求項１３又は１４記載の形質転換微生物を適切
   な培養基で培養することを特徴とする、異種タンパク質
   を高収率で製造する方法。 １６　請求項１５記載の方法において、形質転換微生物
   を、培養基中、変調物質の存在下又は不存在下、室温（
   ２０−２５℃）又は３５℃又は約３５℃の温度において
   、非活性形の調節システムと共に十分な時間培養して最
   大濃度で細胞を得た後、温度及び培養基を変化させて、
   達成された調節システムによって目的のタンパク質をコ
   ード付ける遺伝子を転写させる、異種タンパク質の製造
   方法。 １７　請求項１５記載の方法によって得られた異種タン
   パク質。 １８　請求項１７記載のものにおいて、ホルモン、酵素
   及び抗原の中から選ばれるものである、異種タンパク質
   。 １９　請求項１８記載のものにおいて、百日咳毒素又は
   そのサブユニットである、異種タンパク質。 ２０　請求項１０記載の発現によって増殖可能なベクタ
   ーを生成するに当たり請求項１記載の調節システムを使
   用することを特徴とする、調節システムの使用法。 ２１　請求項１３記載の形質転換微生物を得るに当たり
   請求項１０記載の発現によって増殖可能なベクターを使
   用することを特徴とする、ベクターの使用法。