JPH0266444A - レドックス試薬処理による界面動電位の制御方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は界面動電現象に関し、特に電気泳動及びクロマ
トグラフィーに使用される固体相及び固体成分に関する
。

（従来の技術） 固体要素は種々の理由から電気泳動及びクロマトグラフ
ィーシステムに含まれるが、その用途には溶質分配用の
部位として及び分離媒質収容用の保持壁としての用途が
含まれる。固体要素は従って粒子、多孔性もしくはその
他の毛細管、スラブを保持するためのプレート及びその
他の形状などの形をとることができる。固体要素を使用
するクロマトグラフィーシステムの例はアフィニティー
クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーイオン交
換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー
があり、電気泳動にはゲル電気泳動、開管電気泳動、等
速泳動（ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（置換電
気泳動とも呼ばれる）及び等電点電気泳動などが含まれ
る。ある場合には固体要素は分配において能動的役割を
果し、他の場合には受動的役割を果す。ある場合には固
体要素は電気浸透（ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｄｏｓｍｏｓｉ
ｓ）　（これはまたここで用いるように電気浸透流（ｅ
ｌｅｃｔｒｏｏｓｍｏｔｉｃ　ｆｌｏｗ）と呼ばれる）
によって分離媒質中の溶質の塊法（ｂｕｌｋｆｌｏｗ）
に寄与し、一方他の場合にはそのような流れは干渉流妨
害であると考えられる。

各種の分離システムはおのおの独自の効用を有している
。例えば、毛細管電気泳動には種々の形式があるが、多
（の利点を提供することにより電気泳動システムの中で
は一般的に重要なものである。特に、高速、高効率が重
要とされる操作において有用である。これはその狭い口
径カラムのためカラム内部から周囲への急速な熱逸散が
促進されるからである。このため過度のジュール熱を生
じさせることな（高電圧をかけることができる。

従って、高電圧下でのみ分離する成分を有する試料はこ
のような管内で分配することができる。そのうえ、他の
電気泳動システムに比較して少量の分離媒質が使用され
るので非常に少量の試料でよい。毛細管電気泳動で最も
一般的なタイプはゲル電気泳動、等電点電気泳動、等速
電気泳動（置換電気泳動とも呼ばれる）及び電気浸透塊
法有無の遊離ゾーン電気泳動である。

毛細管電気泳動においてもクロマトグラフィーの場合と
同様壁効果が主要な考察事項となる。毛細管電気泳動に
おいては、壁表面積の分離媒質容量に対する比率が大き
く、分配される成分の壁への接近度が高い。

ある毛細管システムにおいては、界面動電位の存在に依
存して分離機構の絶対必要な部分としての電気浸透塊法
を生じさせている。他のシステムでは主として電気泳動
移動性に依存している。このようなシステムにおいては
電気浸透流は分配を阻害するものであり、その存在は抑
制又は排除されねばならない。多くの分離法では電気泳
動移動と電気浸透流の組み合わせが用いられ、その比率
は最も純度高く効率的な分離が得られるよう経験的に求
められる。

どの電気泳動システムにおいても、界面動電位の程度、
すなわち、電気浸透流の程度は固体要素の表面特性に依
存しているが、その特性はそれぞれの分離操作中に接触
する種々の物質によって損なわれ易い。これらの物質と
しては流体、緩衝液、担体に保持された分配剤及び分離
されるべき溶質が含まれる。これら物質と固体要素の壁
との化学反応は壁によるこれら物質の取り込みないし保
持とともに壁の電気特性を変え、こうして界面動電位に
影響を及ぼす。壁に対するこれらの望ましくない相互作
用はまた分離媒質の大部分の中で生じる分配効果を阻害
する。この変化は運転の反復によって蓄積され、再現性
が低下し、ある場合には分配効果そのものが損なわれる
結果となる。

再現性の低下は、一連の試料が自動的に順次注入され分
配される自動計測システムでは重大な問題である。

（発明が解決しようとする課題） 従って、本発明の目的はクロマトグラフィー及び特に電
気泳動で使用される毛細管、固体支持体等の固体相の表
面の分離の再現性及び効率が維持され回復されるよう処
理する方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） ここに毛細管表面をレドックス試薬、すなわち、その表
面に接触してくる物質に酸化又は還元のいずれかを促進
させる試薬で処理することによって界面動電位を維持し
、そのシステムの再現性かを回復できることが発見され
た。酸化、還元のどちらを選択するかは求められる効果
、すなわち、回復すべき表面の電気特性に依存する。

例えば、シリカの場合、酸化剤では界面動電位は減少し
、一方還元剤では界面動電位が増大することが発見され
た。この効果は恐ら（表面の５ｉＯＨ基の変性に伴うも
のであろう。電気泳動の場合、酸化剤は所望される駆動
力が電気泳動移動力のみである時に用いられ、還元剤は
電気浸透力がそのシステムで所望される駆動力（ポンプ
）である時に用いられよう。酸化剤又は還元剤はそれが
運転と運転の間での処理として使用されるが又は実際の
分離操作中にシステム成分として添加されるかに応じて
回復機能のため又は保全機能のためのいずれにも作用さ
せることができる。

本発明のその他の利点及び実施態様は以下の説明により
さらに明らかになるであろう。

本発明のレドックス試薬処理を適用する表面は電解質の
極性溶液に接触しておかれた時界面動電位を形成し、そ
の結果電気二重層が形成されるどのような物質の表面で
あってもよい。本発明はまた通常は電気的に中性である
が電気泳動分離に使用する間に管中を通過する物質によ
って酸化又は還元され易い物質にも適用される。シリカ
含有材から製造された毛細管は電気泳動分離に特に重要
であり、とりわけガラス、石英及び溶融シリカが重要で
ある。毛Ｋａ管のサイズは臨界的なものではな（、広く
変えることができる。電気浸透流は直径数ミクロンから
数千ミクロンの範囲の管において発生させることができ
る。本発明の目的に最も関係深い範囲は一般的に直径約
２ミクロンから約５００ミクロンの範囲内にある。

本発明によって使用することができる酸化剤は分析化学
、有機合成及び生物工学などの当業者に公知の多数の剤
のうちのどれもが含まれるが、好ましくは水のような極
性溶媒に可溶性のものである。その例には過酸化物、過
マンガン酸塩及びクロム酸塩が含まれる。これらの群に
含まれる例として特にベンジルトリエチルアンモニウム
過マンガン酸塩およびビス（ベンジルトリエチルアンモ
ニウム）重クロム酸塩のような第四級アンモニウム化合
物、過酸化水素及び過酸化ナトリウムがあげられる。同
様に、広範囲の還元剤を使用することができる。それら
の例にはジチオトレイトール及びジチオエリトリトール
のような生化学的還元剤とともに金属水素化物、ボリル
ハイドライド及び尿酸塩が含まれる。

処理は固体要素を極性溶液中の試薬に接触させることに
より最も都合よく行われ、その接触は溶液で浸すか実際
の分離操作に使用される緩衝液又はその他の溶液に試薬
を添加するかあるいはその両方で行われる。溶媒中の濃
度は多くの場合的２５ｍＭから約２５０ｍＭの濃度で最
上の結果が得られるが、濃度は臨界的なものではなく、
幅広（変えることができる。同じ濃度が試薬を分離中で
の添加剤として使用する場合に用いられる。

処理の持続時間は一般に固体表面を所望の状態にまで回
復させるのに必要な程度によって決められる。これは処
理の頻度、及び処理溶液中の酸化剤、還元剤の濃度、処
理が行われる温度などの予期し得るパラメーターに左右
される。例えば、毛細管について運転の間にフラッシン
グにより処理する場合、毛細管容積の約５倍から約５０
倍量の液を用いるのが効果的である。フラッシング方法
又はその他の接触方法など所定のシステムで最も適切な
処理程度は当業者にとっては明白であろう。

処理溶液には酸化剤又は還元剤の効果に加えて脱着剤を
含むことができる。これは特に表面汚染又は変性が電気
泳動運転中に可動性の物質の取り込み又は析出によって
生じる場合に有用である。

その析出又は取り込まれる物質は運転中に分離されるべ
き溶質又は溶液中に存在する他の汚染物のどちらかであ
る。適切な脱着剤は汚染物質を変性したり、その物質を
それ自体から又は表面から解離したり又は一般に非特異
的結合を防止するなどの機能において活性なものである
。ある所定の環境下での適切な脱着剤の選択は試料及び
分離すべき物質の性質及び中性又は荷電した試薬のよう
な特殊な形の脱着剤の存在下での安定性又は反応性に依
存するであろう。適当な脱着剤の例はそのシステムに依
存するが尿素及びグアニジンである。

本発明は特に上述したように毛細管内で行われる種々の
形式の電気泳動分離に関係している。第一の例にはゲル
電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動及び遊離ゾー
ン電気泳動が含まれる。全体的な分配効果に寄与するそ
の他の成分にはその技術に応じて当業者に公知のものが
含まれる。例えば、ドデシル硫酸ナトリウムを用いるミ
セルの形成は分配効果を助長するのに使用される。

（実施例） 以下に述べる例は説明を目的とするもので、本発明を何
等特定又は限定するためのものではない。

実施例 核酸成分混合物からの試料を事前フラッシング及び電解
質への添加物を変えながら繰り返し溶融シリカ毛細管へ
注入し、電気泳動処理に付した。

溶融シリカは電気浸透効果に関与する表面水酸基を含有
している。個々の成分濃度が５　ｘ　１０−’Ｍである
混合物の組成は次の通りであった：ウリジン ウラシル シチジン シトシン チミジン チミン ２−アジドシチジン アデノシン チミジン　モノフォスフェート デオキシシチジン　モノフォスフェートシチジン　モノ
フォスフェート ３−アジドチミジン 使用システムのパラメーターは次の通りであった： 毛細管　　　溶融シリカ、７７ミクロン径、長さ　６９
　ｍｍ。

検出器まで５５ｃｍ 検出　　　　２６０ｎｍ、毛細管直接光学路電圧　　　
　２２，５００　　Ｖ 電流　　　　１３８μＡ 温度　　　　１５℃ 電解質　　　０．０２５Ｍ　　リン酸塩、ｐＨ６，８６
，０，２Ｍ５ＤＳ 試料注入　　５〜１０　ナノリットル 運転から運転への変数は次の通りであった：運転 Ｎｏ。

運転前フラッシング。

添加電解質 Ｎ２；水；Ｎ２ ０．０２５＋、＋　　　ＤＴＥ” 水 １１１１　　尿素 ０．０２５Ｍ　　　ＤＴＥ 水 ０．０５　　Ｍ　　Ｉ（２０□ ０．０２５Ｍ　　ＤＴＥ Ｏ，０５Ｍ　　ＤＴＥ Ｏ，０５Ｍ　　ＤＴＥ Ｃ１，０２５Ｍ　　ＤＴＥ なし ０．０２５Ｍ　　ＤＴＥ なし なし なし なし なし なし なし なし なし なし なし なし ０．０５Ｍ　　ＤＴＥ ０．１０Ｍ　　ＤＴＥ ０．０５Ｍ　　ＤＴＥ Ｏ，０５Ｍ　　ＤＴＥ Ｏ，０５Ｍ　　ＤＴＥ Ｏ，０５Ｍ　　ＤＴＥ ０．０５Ｍ　　ＤＴＥ 注　＊　運転前フラッシングはカラム容積の１０〜２０
倍量で行った ＊＊　　ＤＴＥニジチオエリトリトールこれらの運転の
検出器追跡図を第１〜１６図に示す。図の目盛りの指示
として、第１図の最初（最も左）のピークは保持時間１
３．３５分のシチジンを表わし、最後のピークは保持時
間４３．３６分のアジドチミジン（ＡＺＴ）を表わす。

これらの追跡図の意味することはＤＴＥによる処理に伴
って保持時間の顕著な減少（電気浸透流の増加ないし回
復を表わす）である。保持時間は過酸化水素が使用され
るまでほぼ漸近線的に低下し続ける（第７運転）。過酸
化水素は溶融シリカ表面から水酸基を除去し、電気浸透
流を減少させ、それによってすべての保持時間を増大さ
せる酸化剤である。しかしこれに続いてＤＴＥによる回
復フラッシングは保持時間を本質的に過酸化水素処理前
のレベルと同じ漸近線にまで戻す。データはＤＴＥが運
転中そのものにフラッシング、電解質溶液においても有
効であったことを証明している。

（発明の効果） 本発明によればクロマトグラフィー及び特に電気泳動で
使用される毛細管、固体支持体等の固体相の表面の界面
動電位が維持され、再現性が復元される。

以上に述べたことは第一に説明を目的としたものである
。本発明の精神及び範囲を離れることな（材料、操作段
階及び操作条件に対し変更、変化及び置換などを加える
ことができることは当業者にとっては非常に明白である
。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第１６図は実施例の運転Ｎｏ、１〜１６におい
てそれぞれ同じ混合物試料に対して毛細管電気泳動を行
ったときの光学検知曲線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、界面動電位を形成し易い固体の存在下で被検出体の
   分離中に生じる界面動電位を制御するに当り、該固体を
   その表面上に予め選定された電荷分布を達成する酸化剤
   及び還元剤からなる群から選ばれる試薬を用いて処理す
   ることからなる界面動電位制御方法。 ２、該固体が毛細管壁である請求項１記載の方法。 ３、該固体が固体カラム充填材料である請求項１記載の
   方法。 ４、該固体がシリカ含有固体物質である請求項１記載の
   方法。 ５、該固体がガラス、石英及び溶融シリカからなる群か
   ら選ばれる請求項１記載の方法。６、該固体が溶融シリ
   カであり、該試薬が還元剤である請求項１記載の方法。 ７、該電気泳動を行う前に該固体に該試薬の極性溶液を
   接触させる請求項１記載の方法。８、表面が界面動電位
   を形成し易いものである毛細管中での毛細管電気泳動中
   に発生する電気泳動移動度及び電気浸透流の相対度を該
   表面を予め選定された電荷分布を達成する酸化剤及び還
   元剤からなる群から選ばれる試薬を用いて処理すること
   により制御する方法。９、該毛細管電気泳動の前に行わ
   れる請求項８記載の方法。 １０、該毛細管電気泳動の間に行われる請求項８記載の
   方法。 １１、該毛細管電気泳動の前及びその間に行われる請求
   項８記載の方法。 １２、該毛細管がシリカ含有材料で形成される請求項８
   記載の方法。 １３、該毛細管が溶融シリカで形成される請求項８記載
   の方法。 １４、該試薬が酸化剤である請求項８記載の方法。 １５、該酸化剤が過酸化物、過マンガン酸塩及びクロム
   酸塩から選ばれるメンバーである請求項１４記載の方法
   。 １６、該試薬が還元剤である請求項８記載の方法。 １７、該還元剤が金属水素化物、ホウ水素化物、尿酸塩
   、ジチオトレイトール及びジチオエリトリトールからな
   る群から選ばれるメンバーである請求項１６記載の方法
   。 １８、該試薬が還元剤であり、該方法が該表面を約２５
   ｍＭから約２５０ｍＭの範囲の濃度の該還元剤の極性溶
   液で処理することからなる請求項記載の方法。 １９、該表面をさらに脱着剤で処理し非特異的結合によ
   り該表面に付着する固体の脱着を促進することからなる
   請求項８記載の方法。 ２０、該脱着剤処理が該試薬処理と同時に行われる請求
   項１９記載の方法。 ２１、該脱着剤処理が該試薬処理に続いて行われる請求
   項１９記載の方法。 ２２、該脱着剤が尿素及びグアニジンからなる群から選
   ばれるメンバーである請求項１９記載の方法。 ２３、該脱着剤が尿素である請求項１９記載の方法。