JPH026753A - 酵素免疫分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、医学の分野における治療上あるいは診断上重
要なハプテンの測定のための極めて有用且つ簡便な酵素
免疫分析法に関する。

〔従来の技術〕

従来、検体中の生化学物質を定量する方法として酵素免
疫分析法が知られている。この方法は、遊離の標識物を
測定系内から分離させる操作を必要とした。この煩雑さ
を解決するために分離操作を必要としない所謂均一酵素
免疫分析法が開発された。殊に、特開昭６１−８００４
９号に記載の酵素免疫分析法は、本発明と同様に、検体
中のハプテンを測定の対象とした発明で、酵素抗体結合
物に対してハプテンと同一のリガンドを有する高分子化
合物と検体中のハプテンとを競争反応させ、酵素の作用
する高分子物質を基質として用いて、酵素活性を測定す
ることによりハプテンを測定するものである。

〔発明が解決しようとする課題〕

特開昭６１−８００４９号に記載の方法は、従来の酵素
免疫分析法に比べはるかに簡便な方法を当業者に提供し
たものである。しかし、ハプテンを測定するにあたって
はハプテンと同一リガン１゛を有する高分子化合物の使
用が必須であるため、その化合物を得たすせねばならず
、より簡便な方法の開発が望まれていた。

〔課題を解決するだめの手段〕

本発明者らは、従来の欠点を克服すべく鋭意研究した結
果、ハプテンと同一リガントを有する高分子化合物を使
用することなく、直接ハプテンを測定できる方法を見出
し本発明を完成したものである。

本発明は、ハプテンと反応する抗体と酵素との結合物で
ある酵素抗体結合物及び酵素が作用しうる高分子物質を
用いて、検体中のハプテンを測定するための酵素免疫分
析法である。

即ち本発明は、検体中のハプテンを、ハプテンと反応す
る抗体と酵素との酵素抗体結合物と反応させ、高分子物
質を該結合物に作用させることにより酵素活性を測定す
る酵素免疫分析法である。

本発明の酵素免疫分析法の測定対象は検体に含まれる抗
原決定基を有するハプテンである。抹体の種類は限定さ
れないが、例えば血液（血漿、血清）、リンパ液、尿な
どである。血漿、血清、尿などの場合には、通常特別な
前処理を必要とせず、検体そのままについて測定を行う
ことができる。

ハプテンは抗原決定基を１又は２以上有しているもので
あり、例としてはジゴキシン、テオフィリン、フエノハ
ルビクール、フエニ１ヘイン、ペニシリン、アミカシン
等の薬物、プロスタグランジン、テストステロン、プロ
ゲステロン、チロキシン等のホルモンを挙げることかで
きる。本発明で用いる「ハプテン」なる用語は低分子量
の化合物で前記した如く分子量約１万以下のものを表わ
すものである。

本発明で使用する酵素抗体結合物を構成している抗体は
ハプテンの抗原決定基と反応するものである。この抗体
はＦ（ａｂ’）ｚ、Ｆａｂ、　Ｆａｂ’　などのフラグ
メントであってもよい。

抗体の製造方法としてはハプテン又はその誘導体と蛋白
との結合物を兎、山羊、馬、モルモット、ニワトリなど
の温血動物に体重１ｋｇあたり０゜３〜２ＩＴ１ｇを１
〜数回背中皮下、フントパット、大腿筋等アジュバント
とともに注射して当該動物の体内に形成させる。この抗
体は血清をそのまま用いててもよく、血清から抗体すな
わち免疫グロブリンを採取する公知の方法によって精製
してから用いてもよい。

一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得するこ
ともできる。その場合にはマウスに前記のいずれかの抗
原をアジュバントとともに数回腹腔等に注射し膵臓細胞
を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマウス
ミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細胞の
なかから等該抗体を産生ずるものをクローニングによっ
てモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中で増
殖させることによって単一抗体、すなわちモノクローナ
ル抗体を大量に製造することができる。

一方、酵素抗体結合物を構成している酵素は例えばアミ
ラーゼ、デキストラナーゼ、セルラーゼ、コラ−ゲナー
ゼ、マンナーゼ、プロテアーゼ、エラスターゼ、リパー
ゼ、グルコアミラーゼなどである。これらの酵素のうち
、活性の測定が容易な点でアミラーゼ、デキストラナー
ゼ、セルラーゼ、マンナーゼ及びグルコアミラーゼの使
用が好ましい。

これらの酵素の作用する高分子物質としては酵素の基質
をあげることができる。例えば澱粉、アミロース、アミ
ロペクチン、デキストラン等をあげることができ、詳し
くは丸尾、田宮監修［酵素ハンドブックｊ（朝倉書店、
１９８２年）、日本生化学会編集［生化学ハンドブック
１（丸善、１９８０年）に記載されているのでそれを参
照し、適宜選択するとよい。

また、上記高分子物質には直接または間接的に検出でき
る官能基又は化合物がついていてもよい。

酵素と抗体との結合方法は双方の官能基を考慮して決定
すればよい。官能基は、アミノ基、イミダゾール基、フ
ェニル基などを利用することができ、例えばアミノ基相
互間を結合させる方法としては、ジイソシアネート法、
グルタルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾ
キノン決算数多く知られている。また、アミノ基とカル
ボキシル基との間を結合させる方法としては、カルボジ
イミド法、ウッドワード試薬法等が知られており、アミ
ノ基とＩｌ！鎖を架橋する方法としては、過ヨウ素酸酸
化法（Ｎａｋａｎｅ法）が知られている。架橋のために
チオール基を利用する方法としては、例えばもう一方の
側のカルボキシル基にカルボジイミド法によりシスティ
ンを反応させてチオール栽を導入し、チオール基反応性
二価架橋試薬を用いて双方を結合する方法が知られてい
る。同様にフェニル基を利用する方法としてはジアゾ化
法、アルキル化法などが知られている。結合方法はこれ
らの例示に限られるものではなく、このほか例えば、ｒ
Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」あるいは石川、河合
、宮井編「酵素免疫測定法」（医学書院、１９７８年発
行）等の底置に記載されている方法のなかから適宜選択
して利用することができる。酵素と抗体の結合比は１：
１に限らず、目的に応じて任意の比率をとることができ
ることは言うまでもない。得られた酵素抗体結合物は反
応後、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィーアフ
ィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて
精製を行い、必要により凍結乾燥法等で乾燥することに
より得ることができる。

尚、本発明を実施するにあたって、必ずしも必要ではな
く又、本発明を規定するものではないが、酵素抗体結合
物の酵素と同種の酵素が検体に含まれている場合には、
この検体中の酵素を阻害する程度が前記の結合物に結合
されている酵素の活性を阻害する程度より大きい酵素阻
害物質を接触させるのがよい。

この酵素阻害物質は検体に含まれている酵素を完全に失
活させ且つ結合物に結合されている酵素を全く阻害しな
いものが最も望ましいことはいうまでもないが、実用上
の単に測定時においてブランク値を上昇させなげればよ
く、測定後に酵素阻害物質が失活するなどしてこの酵素
活性を回復してもよい。また遊離状態では酵素阻害物に
よって失活するものであってもよい。この酵素阻害物質
にはこのような特異性を有する公知の酵素阻害物質を利
用すればよいが、そのほか、検体に含まれている酵素を
温血動物に投与してその抗体を取得し、これを酵素阻害
物質として用いることもできる。抗体の取得方法は前述
のハプテンに対する抗体の取得方法と同様の方法を用い
ることができる。

本発明の実施を具体的に説明すると例えば、検体である
一定量の血漿、血清、リンパ液、尿等の水性液体試料を
酵素抗体結合物と混合し、一定の時間でインキュベーシ
ョンした後これに高分子物質を加えて一定の温度で、好
ましくは３７°Ｃ近傍の実質的に一定の温度で一定の時
間インキュベーションし、酵素反応停止液を加えて、反
応液内の呈色を可視光又は紫外光の吸収極大波長または
その近傍の波長の光を用いて測定し、予め作成した検量
線を用いて比色測定法の原理により液体試料中のハプテ
ンの含有量を求めることができる。あるいは、反応液内
の蛍光の強度を測定し、予め作成した検量線を用いて液
体試料中のハプテン含有量を求めることができる。使用
する液体試料の量、インキュベーション時間及び温度を
一定にすることによりハプテンの定量分析を高精度で実
施できるものである。

本発明の実施に当たっては、通常この種の分析法と同様
に緩衝溶液を用いて行うものであって、使用できる緩衝
溶液としては、例えば、グリセロリン酸、酢酸、マレイ
ン酸、リン酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｐ　Ｉ　ＰＥＳ、Ｂ
１５−Ｔｒｉｓ等を挙げることができる。本発明にあっ
ては、酵素活性は使用する緩衝溶液によっても異なるが
ある特定のｐｌ＋以下に設定すると、ハプテン量が増加
するとともに酵素活性が増大され、逆にその特定のｐｌ
＋以上に設定すると、ハプテン量が増加するとともに酵
素活性が低下されるものであって、測定の際に如何なる
測定結果を所望するかによって測定者が適宜選択するこ
とができる。

尚、本発明は以上の如くして容易に実施することができ
るが、この方法は前記説明したように、いわゆる溶液法
に限られるものではなく、通常の多層分析要素中に組も
込むことも可能である。

本発明の酵素免疫分析法に用いられる酵素抗体結合物及
び酵素が作用しうる高分子物質を乾式分析要素に組のこ
む場合には公知の多種の乾式分析要素と同様の層構成と
することができる。乾式免疫分析要素は後述する免疫反
応試薬層のほか、支持体、多孔性展開層、検出層、光遮
蔽層、接着層、濾過層、吸水層、下塗り層その他の層を
含む多重層の構成を有してもよい。かような分析要素と
して、米国特許筒３，９９２，１５８号、同４，０４２
，３３５号及び特開昭５５−１６４３５６号各明細書に
開示されたものがある。

光透過性水不透過性支持体を用いる場合、本発明の乾式
免疫分析要素は、実用的に次のような構成を採りうる。

もちろん本発明はこれに限定されるわけではない。

（１）支持体上に試薬層、その」二に展開層を有するも
の。

（２）支持体上に検出層、免疫反応試薬層、展開層をこ
の順に有するもの。

（３）支持体上に免疫反応試薬層、光反射層、展開層を
この順に有するもの。

（４）支持体上に検出層、免疫反応試薬層、光反射層、
展開層をこの順に有するもの。

（５）支持体上に検出層、光反射層、免疫反応試薬層、
展開層をこの順に有するもの。

（６）支持体上に検出層、免疫反応試薬含有展開層をこ
の順に有するもの。

（７）支持体−ヒに検出層、光反射層、免疫反応試薬含
有展開層をこの順に有するもの。

支持体と免疫反応試薬層又は検出層との間には親水性ポ
リマーを主成分とする吸水層を設けてもよい。また免疫
反応試薬層、検出層は多孔性の層であってもよい。免疫
反応試薬以外の試薬（例、呈色試薬組成物）を含有する
第２の試薬層をさらに設けることもできる。

支持体としては、光透過性（透明）で水不透過性で平滑
表面を有するポリマーシー１〜が好ましい。

好ましい支持体の例として、ポリエチレンテレフタレー
ト、ポリスチレンがある。支持体の表面には、検出層、
吸水層、免疫反応試薬層、又は第２の試薬層等の親水性
の層を強固に接着させるためにゼラチン等の親水性ポリ
マーからなる下塗り層を設けるか、紫外線照射処理、グ
ロー放電処理等の親水化処理を施すことが好ましい。な
お、支持体としては光反射性又は不透明なものも用いる
ことができる。

検出層又は吸水層に用いられる親水性ポリマーとして例
えば、ゼラチン及びこれらの誘導体（例えばフタル化ゼ
ラチン）、セルロース誘導体（例えばヒドロキシメチル
セルロース）、アガロース、アクリルアミド共重体、メ
タアクリルアミド共重体、アクリルアミドまたはメタア
クリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重合体等が
利用できる。

多孔性展開層を構成する材料としては、例えば濾紙、不
織布、織物布地（例えば平織布地）、編物生地（例えば
、トリコツ）［布地）、ガラス繊維濾紙等を用いること
ができる。展開層としては、これらのうち織物、編物等
が好ましい。織物等は特開昭５７−６６３５９号に記載
されたようなグロー放電処理をしてもよい、展開層には
、展開面積、展開速度等を調節するため、特開昭６０−
２２２７７０号、特願昭６１−１２２８７５号、同６１
−１２２８７６号、同６１−１４３７５４号に記載した
ような親水性高分子あるいは界面活性剤を含有してもよ
い。

免疫反応試薬層は、ハブテンと反応する抗体と酵素との
結合物である酵素抗体結合物、及び酵素が作用しうる高
分子物質を含有する水浸透性の層である。好ましい態様
として、前記の２成分が多孔性展開層に含有されている
態様（展開層が免疫反応試薬層をかねる態様）と前記２
成分が（展開層と異なる）多孔性層に含有されている態
様がある。免疫反応試薬層が多孔性層の場合には、展開
層と同様な多孔性材料を用いることができる。免疫反応
試薬層又は展開層には、前述のｐｌ＋緩衝剤、及び界面
活性剤（好ましくはノニオン性界面活性剤）を含有させ
ることが好ましい。

展開層を接着し積層するための接着層を試薬層、光反射
層、濾過層、吸水層、検出層等の層の上に設けてもよい
。接着層は水で膨潤したときに多孔性層を接着すること
ができるような親水性ポリマ、例えばゼラチン、セラチ
ン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等からなることが
好ましい。

光反射層は、検出層、試薬層等に生じた検出可能な変化
（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反
射測定する際に、展開層に点着供給された被検液の色、
特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等を遮
蔽するとともに背景層としても機能する。光反射層は、
親水性ポリマーをバインダーとして、二酸化チタン、硫
酸バリウム等の光反射性微粒子が分散された水浸透性の
層であることが好ましい。バインダーとしてはゼラチン
、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミＦ、＃粉等からな
ることが好ましい。

乾式免疫分析要素には、光反射層を設ける代わりに、ま
たはそれと同時に、展開層、試薬層、検出層等に二酸化
チタン等の光反射粒子を含有させてもよい。

乾式免疫分析要素は前述の諸特許明細書に記載の公知の
方法により調製することができる。

乾式免疫分析要素は一辺約１５ｍｍから約３ＯＮＩｌの
正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特
公昭５７−２８３３１号、実開昭５６−１４２４５４号
、特開昭５７−６３４５２号、実開昭５８−３２３５０
号、特表昭５８−５０１１４４号等に記載のスライド枠
に収めて免疫スライドとして用いることが、製造、包装
、輸送、保存、測定操作等諸種の観点で好ましい。使用
目的によってば、長いテープ状でカセットまたはマガジ
ンに収めて用いること、または小片を開口のあるカード
に添付または収めて用いることなどもできる。

乾式免疫分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の操作
により液体試料中のアナライトであるハプテンの分析を
実施できる。例えば、約５μｒから約３０μｅ、好まし
くは約８μ２から約１５μｅの範囲の全血、血漿、血清
、リンパ液、尿等の水性液体試料滴を展開層に点着し１
分から１０分の範囲で、約２０°Ｃから約４０°Ｃの範
囲の実質的に一定の温度で、好ましくは３７°Ｃ近傍の
実質的に一定の温度でインクヘーションし、要素内の発
色又は変色を可視光又は紫外光の吸収極大波長またはそ
の近傍の波長の光を用いて光透過性支持体から反射測光
し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理によ
り液体量中のハプテンの含有量を求めることができる。

あるいは、要素内の蛍光の強度を測定し、予め作成した
検量線を用いて液体試料中のハプテン含有量を求めるこ
とができる。点着する液体試料の量、インキュベーショ
ン時間及び温度を一定にすることによりハプテンの定量
分析を高精度で実施できる。光反射性又は不透明支持体
を用いる態様においては、分析要素内の発色又は変色を
支持体と反対側の最外層側から反射測定する。

測定操作は特開昭６０−１２５５４３号、特開昭６０−
２２０８６２号、特開昭６１−２９４３６７号、特開昭
５８−１６１８６７号等に記載の化学分析装置により極
めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。

〔実施例〕 実施例１ ■ＣＨＭ化アミラーゼの作製 バチルス・サブチリスアミラーゼ５ｍｇをｐＨ６，３の
０．１Ｍグリセロリン酸１　ｍｌに？容かし、ＣＨＭ　
５２ｍｇ／ｍｇ、のＤＭＦ溶液１００ｐｌ！を加えて室
温で１時間放置して反応させた。この反応液をセファデ
ックスＧ−２５カラムに入れ、ｐ）１７．０の０．１Ｍ
グリセロリン酸を流してゲル濾過を行い、素通り分画を
分取した。

■抗テオフィリンマウスＩ　ｇＧ　Ｆ　（ａｂ”）２の
作製抗テオフィリンマウスＩｇＧ１０■を含む０．１Ｍ
酢酸緩衝液（ｐｔ１５．５）　２　ｍｌにパパイン３０
０μｇを加え、３７°Ｃで１８時間撹拌した。０．Ｉ　
Ｎ−ＮａＯＨを加えてｐＨを６゜０に調節した。この反
応液を予め０，１Ｍリン酸緩衝１ｍＭＥＤＴＡｉ液（ｐ
ｌ＋６．３）で緩衝化したＡｃＡ−４４ゲルカラムに入
れ、上記リン酸緩衝液で溶出した。

分子量約１０万付近に溶出されたピーク部分を集めて１
雌に濃縮し、目的の抗テオフィリンマウスＩｇＧ　Ｆ（
ａｂ’）ｚを得た。

■α−アミラーゼー抗テオフィリンマウスＩｇＧ　Ｆａ
ｂ”結合物の作製 ■で調製した抗−テオフィリンマウスＴｇＧＦ　（ａｂ
’　）ｚ　６　ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝１ｍＭＥ
ＤＴＡ？容液（ｐＨ６，０）　ｌ　ｍｌに１０　ｍｇ　
／　ｍｌの２−メルカプトエチルアミン 分間撹拌した。この反応液を予め０．１Ｍグリセロリン
酸緩衝液（ｐＨ　７　、　０）で緩衝化したセファデッ
クスＧ−２５カラムでゲル濾過して未反応の２−メルカ
プトメチルアミンを除去し、ＨＳ−Ｆａｂ’　を得た。

これに■で調製したＣＨＭ化α−アミラーゼ１　ｍｇを
加え、３７°Ｃで９０分間反応させた。次にこの反応液
を２０繭グリセロリン酸緩衝５１塩化カルシウム溶液（
ｐＨ７，０）で緩衝化したＡｃＡ−３４ゲルカラムでゲ
ル濾過して分子量２０万以上の分画を集め、これを濃縮
して目的の酵素抗体結合物を得た。

■テオフィリンの測定 濃度０〜２０μｇ／戒のテオフィリン溶液（１％ＢＳＡ
含有）５０μｐに■で調製した酵素抗体結合物溶液５０
μｅを加えて２０分間反応させた。次に、第一化学薬品
社製のネオ・アミラーゼテスト［第−Ｊを１錠当り４　
ｍＲの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）に懸濁した懸
濁液１　ｍａｌを加えて３０分間反応させた後、これに
０．５　Ｎ−Ｎａ０ｔ＋の０．５ｍ１．を加えて３００
０ｒｐｍで１分間遠心して上清の波長６２０ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。こうして得られたテオフィリン濃
度と吸光度との関係を第１図に示す。

実施例２ ■抗フェノバルビクールマウスＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）ｚ
の作製 抗フェノハルビタールマウスＴｇＧｉＯｍｇを含む０．
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ１５，５）　２　ｍｆｌＶハパイ
ｙ３００ｔ１ｇを加え、３７°Ｃで１８時間撹拌した。

０．Ｉ　Ｎ−Ｎａ００を加えてｐＨを６．０に調節した
この反応液を予め０．１Ｍリン酸緩衝１ｍＭＥＤＴＡ溶
液（ｐＨ６、３）で緩衝化したＡｃＡ−４４ゲルカラム
に入れ、上記のリン酸緩衝液で溶出した分子量約１０万
付近で溶出されたピーク部分を集めて１ｍρに濃縮し、
目的の抗フェノハルビクールマウスＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’
）ｚを得た。

■α−アミラーゼー抗フェノハルビタールマウスＪｇＧ
Ｆａｂ結合物の作製 ■で調製した抗フェノバルビクールマウスＩｇＧＦ　（
ａｂ’　）ｚ　６　ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝１ｍ
ＭＥＤＴＡ？容液（ｐＨ６，０）　１　ｍｆｔに１０　
ｍｇ　／　ｍＡの２−メルカプトエチルアミン 分間撹拌した。この反応液を予め０．１Ｍグリセロリン
酸緩衝液（ｐＨ　７　、　０）で緩衝化したセファデッ
クスＧ−２５カラムでゲル濾過して未反応の２−メルカ
プトメチルアミンを除去し、ＨＳ−Ｆａｂ’　を得た。

これに実施例１の■と同様に調製したＣＨＭ化αアミラ
ーゼ１＋ｎｇを加え、３７°Ｃで９０分間反応させた。

次にこの反応液を２０ｍＭグリセロリン酸緩衝５ｍＭ塩
化カルシウム溶液（ｐＨ７．０）で緩衝化したＡｃＡ−
３４ゲルカラムでゲル濾過して分子量２０万以上の分画
を集め、これを濃縮して目的の酵素抗体結合物を得た。

■フェノパルビタールの測定 濃度０〜１０００μｇ７ｍｌのフェノバルビタール溶液
（１％ＢＳＡ含有）５０μｅに■で調製した酵素抗体結
合物溶液５０μｅを加えて２０分間反応させた。次に、
第−化学薬品社のネオ−アミラーゼテスト「第一」を１
錠当り４　ｄの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐｌ＋　６　、　
５）に懸濁した懸濁液１ｄを加えて３０分間反応させた
後、これに０　、５　Ｎ−ＮａＯＨの０．５威を加えて
、３０００ｒｐｍで１分間遠心して上清の波長６２０ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。

こうして得られたフェノバルビクール濃度と吸光度との
関係を第２図に示す。

実施例３ セラチン下塗層が設けられている厚さ１８０μｍの無色
透明ポリエチレンテレフタレート（Ｐ　Ｅ　Ｔ）シート
（支持体）の上に下記の被覆量になるように架橋剤含有
吸水吸水層を水溶液を用いて塗布し、乾燥して設けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　　　　６．６ｍｇ／ｒｄノ
ニルフェノキシポリグリシドール （平均１０グリシド一ル単位含有）　　　３３０ｍｇ／
ｙ？ビス〔（ヒニルスルホニルメチルヵルボニル）アミ
ノ〕メタン　　　　　　　　　３８０ｍｇ／ポ架橋剤含
有吸水層の上に下記の被覆量になるようにして検出層を
水分散液を用いて塗布し、乾燥して設けた。

酸処理ゼラチン　　　　　　　　　　］Ｏｇ／イ重合体
水性ラテックス（１）　　　　　　　３ｇ／ｒｒｒ（固
形分含有量１０％） ノニルフェノキシポリグリシドール （平均１０グリシド一ル単位含有）　　　２ｇ／ｒｒｒ
検出層の上に下記の被覆量で乾燥層厚７μｍになるよう
にして光遮蔽層を水分散液を用いて塗布し、乾燥して設
けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　　　　　２．９ｇ／ｎ（ル
チル型二酸化チタン微粒子　　　　１３　ｇ　／　ｒ′
ｌ（ノニルフェノキシポリグリシドール （平均１０グリシド一ル単位含有）　　　４００ｍｇ　
／　ｒ＋ｉ光遮蔽層の上に下記の被覆量で乾燥層厚５　
ｐｍになるようにして接着層を水分散液を用いて塗布し
、乾燥して設けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　　　　６．７ｇ／ｍノニル
フェノキシポリグリシドール （平均１０グリシド一ル単位含有）　　　６００ｍｇ／
ｎ？ついで、接着層の表面に水を３０ｇ／　ｒｒｒの割
合でほぼ一様に供給して湿潤させ、その上に５０デニー
ル相当のＰＥＴ紡績糸３６ゲージ編した厚さ約２５０μ
ｍのトリコツ）Ｉ物布地をほぼ一様に軽く圧力をかけて
ラミネート接着して多孔性展開層を設けた。

次に、下記の被覆量になるように基質及び免疫反応試薬
組成物の水分散液を展開層の上から塗布乾燥した。

ダイアミル−Ｌ（商品名）　　　　　　３．５　ｇ　／
ボα−アミラーゼー抗テオフィリンマウスＩｇＧＦａｂ
’結合物（実施例１）　　　　　　　６．２ｍｇ／ｒｒ
ｒノニルフェノキシポリエトキシエタノール（平均４０
オキシ工チレン単位含有）　　５００ｍｇ／ｎ（これを
−辺１５ｍｍの正方形チップに裁断し、特開昭５８−３
２３５０号に記載のスライドの枠に収めて、テオフィリ
ン分析用多層免疫スライドを完成した。

性能評価実験 前記のテオフィリン分析用多層免疫スライドの展開層に
、既知量のテオフィリンを含有するｐＨ７，０の５０ｍ
Ｍグリ七ロリン酸緩衝溶液１０μｅを滴下した。３７°
Ｃで２０分間反応後、支持体側より５４０ｎｍの反射光
学濃度を測定した。結果は第３図に示す。

第３図の検量線より、本発明のテオフィリン分析用乾式
免疫分析要素はテオフィリンの定量が精度よ〈実施でき
ることがあきらかになった。

〔発明の効果〕

本発明は、ハプテンと反応する抗体と酵素との結合物で
ある酵素抗体結合物及び酵素が作用しうる高分子物質の
みでハプテンの測定ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図と第２図はテオフィリンとフェノバルビタールの
濃度と吸光度の関係を示すものである。 第３図は実施例３のテオフィリン分析用乾式免疫分析要
素の検量線を示す図である。 特許出願人　　冨士レビオ株式会社 同　　　　富士写真フィルム株式会社 代　理　人　　弁理士　日中　政情　はか１名＾４− 弔 図 テオフィリン濃度（、ｙｇ／ｍｌ） 第 図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ハプテンと反応する抗体と酵素との結合物である
   酵素抗体結合物及び酵素が作用しうる高分子物質を用い
   て、検体中のハプテンを測定するための酵素免疫分析法
2. （２）酵素がアミラーゼ、デキストラナーゼ、セルラー
   ゼ、マンナーゼ又はグルコアミラーゼである請求項（１
   ）に記載の分析法