JPH0269200A - ウイルス性疾患の診断試験およびその試験に有用な細胞の凍結法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明はウィルス性疾患の診断試験およびこの診断試験
のための細胞を保存するのに有用な羽ｕ胞の凍結法に関
する。

感染症の診断と、信頼できる薬剤の同定は、現在、速や
かで正確に応答し、適当な医薬で疾病を治療しまたは特
定の医学的方法を決定することができるようにする必要
がある。ウィルス性疾患の場合には、治療が現在可能な
ウィルス（単純ヘルペスウィルスまたはＨ３Ｖ）または
精確な同定が重要なウィルス（巨細胞ウィルス、呼吸性
シンシチウムウイルス等）について迅速に診断を行う必
要がある。

実験室でのウィルスの診断は２種類の方法によっており
、一方は特異抗原の直接的検出であり、他方は受容細胞
株でのウィルスの培養による方法である。第一の方法は
、種に特徴的な１種類または数種類のウィルス性抗原を
認識し且つ免疫螢光法、免疫ペルオキシダーゼ、ＥＬＩ
ＳＡおよび更に近年ではＤＮＡまたはＲＮＡプローブに
よって検出される抗体（モノクローン性ま°たはポリク
ローン性）を用いることから成っている。このｈ゛法の
利点は、ウィルス（抗原）を特異的に同定し、生きてい
るウィルス粒子を必要としないことである。この方法の
主な欠点は、感受性を欠除しており、良質な標本と、陰
性試料の陽性標本を識別することができる技術的変数を
必要とすることである（シュミット（Ｓｃｈｍｌｄｔ）
ら、１９８３年、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

６３１　．６３３　　）　　。

ウィルスの診断の第二の方法では、実験室で連続的に培
養を継続してきた細胞株を用いる。これらの細胞によっ
て、試料から同定されるウィルスを増幅することができ
、細胞溶解面積の観察によって２４時間後に検出可能に
し、ウィルス性抗原を特異抗体またはＤ　Ｎ　Ａプロー
ブの使用によって同定する。この方法は、感度が高く巨
つ精確な診断のために必要な生きている物質を増幅する
ことによって参ぢ一技術として残っている。

しかしながら、これらの診断技法によって必要とされる
細胞を連続培養しなければならないことが、それらの使
用にとって主要な欠点となる。

これか、２４時間以内にウィルスの診断に使用すること
かできる凍結−融解細胞の方法を提（共することが本発
明の目的である所以である。

発明の詳細な説明 本発明の目的は、同定されるウィルスを試料がら増幅す
ることができ、培養後にその検出を可能にする細胞を使
用することから成るウィルス性疾患の診断試験において
、凍結細胞であって融解して試験を行う細胞を用いるこ
とを特徴とする診断試験を提供することである。

本発明の診断試験によれば、特異抗体、Ｄ　Ｎ　Ａプロ
ーブまたは更に簡単には細胞溶解部分を観察してウィル
ス性抗原を同定することによって、ウィルスを検出する
ことができる。

純粋に例示のためであり且っ何んら制限を含むことなし
に、単純ヘルペスウィルス、巨細胞ウィルスまたは呼吸
性シンシチウムウイルスを検出することかできる試験を
挙げることかできる。

本発明によれば、感染性ウィルスの標本を、融解後の細
胞と混合して、特殊な方法によって２４時間インキュベ
ーションした後ウィルス性因子を同定することができる
（抗原、ＤＮＡ）。

細胞の保存および融解後に、特に本発明による診断試験
において使用することができる特に多カッププレートま
たはチューブから成る支持容器中で細胞を凍結する方法
を提供することも本発明の目的である。本発明の凍結−
融解法の開発によって、細胞の最適生育力に加えて、ウ
ィルス性因子に対する感受性を融解後にも保持する必要
があるといった程度の困難さを生じる。

この方法の本質的な特徴によれば、 一方では、生育可能で機能性の細胞の数、すなわちウィ
ルス性因子に対する感受性の保持が、融解の後に最適、
詳細には８０％より高くなるように選択された凍結保存
剤を用い、 他方では、支持容器中に導入される凍結する細胞の数を
選択して、融解から２４時間後に培養細胞か完全な細胞
の＋１を層を形成するようにする。

例えば、特に細胞溶解部分を観察することによって検出
するときには、最良条件を組み合わせてウィルスの診断
試験を続けるのである。

容器−支持体は　支持容器を、特にコラーゲン、フィブ
ロネクチン、ポリリジン、コンカナバリンおよびこれら
の混合物から選択されるコーティング剤で予め処理した
プラスチック材料であるのか有利であり、支持体をコラ
ーゲンとフィブロネクチンとの混合物で処理するのか特
に−ａ利である。

このようにして処理された支持体は、 一方では、良好な拡散物、すなわち均質に拡散した細胞
と、 他方では、良好な細胞の支持体への付着物を生産するこ
とができ、 診断試験を行うだめの理想的条件でもある。

本発明による凍結保存剤は、稀薄な凍結保護剤から成っ
ている。

本発明の凍結保護剤としては、Ｄ　Ｍ　Ｓ　Ｏ、グリセ
ロール、トレハロース、ジメチルアセトアミド、ポリエ
チレングリセロールおよびポリビニルピロリドンが挙げ
られる。

希釈剤は培地単独であってもよいか、好ましくはウシ胎
児血清（ＦＣＳ）、特に５〜１０９６、またはウシアル
ブミン血清、特に２〜５９６を添加した培地または純粋
なＦＣＳである。

細胞の懸濁液は、支持容器ともなり得る容器中でまたは
支持容器中の単層培養物中で凍結させてもよい。

細胞としては、例えば 線維芽ＭＲＣ−５型のヒト胚性肺細胞、および線維芽ベ
ロ型のサル腎臓細胞が挙げられる。

本発明による凍結法を用いることは、ウィルスを同定す
るため増幅するのに特に６利であるか、この用途は限定
的ではない。

本発明の他の利点および特徴は、下記の実施例から明ら
かになるであろう。

好ましい態様の説明 細胞ラインＭＲＣ−５（線維芽型のヒトの肺臓の胚細胞
）およびＶＥＲＯライン（線維芽型のサル腎臓細胞）を
例として選択した。これらの２種類のラインは、ヘルペ
スウィルス、巨細胞ウィルスおよび呼吸性シンシチウム
ウイルスに感受性をＨし、現在最も広く用いられている
。他のウィルス株の開発のために、他の細胞ラインを考
えてもよい。

細胞を、１７５ｃシのプラスチック製の組織項五フラス
コ（Ｔ１．７５）中でＣＯ２／空気（７：９３、容量／
容量）の比率の水で飽和した雰囲気中で３７℃で培養す
る。培地は、Ｎ　ａ　）（ＣＯ３１０ｍＭ、ヘベス２０
１Ｍ、グルタミン２１Ｍ　、ストレプトマイシン５０ｇ
／ｍｌ、ペニシリン５００／ｍ　ｌを含むＩ？Ｐ旧−１
６４０から成り、非必須アミノ酸の溶液１９６と熱によ
って不活性化したウシ胎児血？１９１０％を添加したも
のである。この培地は、１週間に２回取り替えなければ
ならない。これらの培養物は、細胞の種類によって細胞
の集密したものから再播種する。再播種した培養物は、
トリプシン０．０５９ｉｉ　（重量／容量）とＥＤＴＡ
ｏ、０２％（重量／容量）から成るトリプシン−ＥＤＴ
Ａ混合物を用いる細胞１１′Ｌ層のトリプシン処理によ
って製造される。これを行うために、古い培地を取り除
き、細胞を緩衝した食塩溶液で洗浄し、３７℃でトリプ
シン−ＥＤＴＡ溶液で数分間インキュベーションする。

細胞を培地に再懸濁させて、ｌ：５の再播種比率で新し
い皿に移す。

実施例２：　評価のパラメーターとウィルス感染感受性 （１）凍結および融解の工程の後、培養している細胞を
評価するため、各種の基準を検討した。用いたパラメー
ターは、次の通りであった。

融解の後の細胞の生育力を、ジエルリエ（Ｇｃｒｌｌｃ
ｒ）とツマセット（Ｔｈｏｍａｓｓｃｔ）（Ｊ、　Ｉｏ
＋ｌｌ１ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１９８Ｂ、　
９４．５７−６３）によって記載された技法によるテト
ラゾリウム塩試験によってトリパン・ブルー（リン酸緩
衝液の食塩溶液中０，５重量％溶液）の排除試験によっ
て定量する。この試験によって、細胞の生化学的機能に
基づく細胞の生育力を評価する。培地に可溶性で無色の
化合物を、ミトコンドリア酵素（デヒドロゲナーゼ）に
よってホルマザンの着色、不溶性の結晶に交換する。こ
の沈澱を０．０４Ｎ塩酸を含むイソプロパツール溶液に
可溶化し、その濃度を５７０Ｂｍおよびｔｉ３０ｒ＋＋
ｎの波長で分光光度計によって測定する。多カッププレ
ートに対するＥＬ　Ｉ　ＳＡ型のリーダー中で自動読取
りを行うことができる。

細胞ラインのそれぞれについての変換した生成物の濃度
と細胞の数との間に線形回帰か確立され、検討したｍ’
Ａ物のそれぞれの生育可能な（機能的）細胞の数を評価
することができる。

細胞の総数を、細胞核を未希釈トゥルク・ブルーで染色
した後または培養している細胞を固定し、核をヘマトキ
シリンで染色した後、血球計て細胞を計数することによ
って計測する。これを行うため、細胞を氷酢酸−メタノ
ール溶液（１：３、容量：容量）によって培地１容当た
り固定液１容の割合で用いて固定する。５分後に、培地
を吸引して、細胞を同し固定液で２分間ずつ２回洗浄す
る。

水で濯いで残っている固定液を除去した後、細胞を風乾
し、次いでヘマトキシリン（市販溶液）で５分間染色す
る。次いで、細胞を水道水で２、′３回濯いだ後、再度
乾燥する。

この試験によって、５７０ｒ＋ｍの波長でＥＬＩＳＡリ
ーダーによって自動的に読取りを行うことか−Ｃきる。

４ｐ１定した吸光度と細胞の総数との間にも直線回帰が
確立され、これは２種類の細胞ラインのそれぞれについ
て確立される。

位相差顕微鏡観察によって、細胞の形態学的外観、細胞
の拡散物、細胞の（均質または均質でない）支持体上で
の分布および細胞の集密時における細胞単層の外観を定
義することができる。完全に集密した細胞層を得るのに
ザする時間も、顕微鏡観察によって計測される。

（２）本発明によって導入される方法は、ウィルス性疾
患の診断に用いられる細胞を保存できるようにして、適
時に診断試験を行うことかてさ、るようにするためのも
のである。

したかって、凍結と融解の工程を行った細胞がウィルス
性因子に対して感受性を保存したかどうかおよびどの程
度保存したかを決定するのに重要である。

１型および２型の単純ヘルペスウィルスを検討した。こ
れらの２種類のウィルス株は、ＶＲ−７３３（Ｈ８Ｖ−
１）およびＶＲ−７３４（Ｈ８Ｖ−２）のコード番号で
ＡＴＣＣから得られた。これらのウィルスを、１０９６
ＦＣ３を系加したＭＥＭ培地中でＨＥ　　２細胞上で培
養し、それぞれｌｌ５Ｖ−１およびｌｌ５Ｖ−２につい
て完全培地１ｍｌ当たり２．３　・ＩＯおよび７　・１
０７個のウィルス粒子の割合で一７０℃で保存した。

１回の診断試験は、２４個のカップを有するプレートに
おいて集密細胞（ＭＲＣ−５およびベロ（Ｖｅｒｏ戸を
培地中でウィルス性接種物の漸次笛択液（１０ｘ対１０
ｘ）で感染させることから成っている。このためには、
培１也を吸引して、カップ当なり１００μｍ　（その後
乾燥させないよう細胞を覆う最少容積）の割合のウィル
ス懸濁液で置き換えた。

細胞を３７℃で１時間インキュベーションした。次に、
新鮮な培地をそれぞれのカップに加えて、１１１胞ヲ３
７℃でインキュベーションした。２種類のヘルペス株に
特徴的な細胞溶解部分の形成を、２４および４８時間後
に位Ｆ目差顕微鏡で観察した。

この試験を、培養している細胞および下記の開発した方
法による凍結および融解した細胞について行った。

実施例３：ｆｌｉ層培養における細胞の凍結３．１　　
培養条件 前記の培地中で培養したＭ　ＲＣ−５およびベロ細胞を
２４カツプを有するプレート（リンプロ、フロー・ラボ
ラトリーズ（！、１ｎｂｒｏ、　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒ
ａＬｏ−ｒｌｅｓ）　）またはジエンセル・チューブ（
ジーナス・ダイアグノスティックス（ＧＨＮＵＳ　ＤＩ
ＡＧＮＯＳＴＩＣ３）　）に、カップ当たりまたはチュ
ーブ当たり５ｘｌ口４個の細胞の割合で入れた。細胞を
、完全な単層が生成されるまで（２４から４８時間後）
、３７″　に保持した。

３．２　凍結および融解の方法 前記の各種因子を、それぞれの細胞の種類および条件に
ついて検討した。ジエンセル・チューブ中での単層項五
物中のＭＲＣ−５細胞の凍結−融解について定義された
最良の条件は、次の通りである。細胞の集密時に、凍結
保存剤であるウシ胎児血清中トレハロースの１０％溶液
を細胞に適用する。チューブを１０分間２０°に保持し
た後、直ちに一７０°に冷凍する（−５℃／分）。チュ
ーブをこの温度で保存した。融解するときには、チュー
ブを２０’に保持して、凍結保存剤を溶解させた。この
凍結保存剤を抜き取り、室温で完全培地で慎重に置き換
えた。細胞をこの温度で１０から１５分間保持した後、
３７″で空気中７９６ＣＯってインキュベーションした
。培地は２４時間後に取り替えた。

同じ方法は、２４カツププレート中で培養したＭＲＣ−
５細胞およびベロ細胞に適用できるが、ベロ細胞の場合
には、凍結保存剤はＦＣ５中７，５％ＤＭＳＯである。

細胞支持体を、培養前にコラーゲンとフィブロネクチン
で処理した。この被覆は、皿またはチューブをリン酸緩
衝液中コラーゲン（１００μｇ　、、／　ｍｌ　）およ
びフィブロネクチン（５０μｆ／ｍｌ）１ｍｌでインキ
ュベーションした後、同じ緩衝液で洗浄することによっ
て得られた。支持体をそのまま用い、または予め２０°
で乾燥した。

３．３　　結果 ジエンセル・チューブ支持体に対するＭＲＣ５細胞の細
胞生育力および併行に対する３１４類の凍結保存剤の効
果を表−１に示す。７．５９６ＤＭＳＯおよび５９６グ
リセロール／ＦＣ３は、保持される支持体へ細胞を付着
させることができない。１０？ｏグリセロールは２４時
間後に保持される支持体へ細胞の３７％を付着させるこ
とができるか、細胞の分布は不均一であり、成長は正常
に培養されている細胞よりも遅い。ＩＯ％トレハロース
／ＦＣ３では、最良の結果が得られ、２４時間後に細胞
の６２９６が付着され、生育力も良好である。細胞は均
一に分布し、それらの成長は一層速やか一〇ある。

表−２では、ｌＯ％トレハロース／ＦＣ５が凍結保存剤
として用いられるとき、融解から２４時間後には、利用
可能な表面積（ジエンセル・チューブ）の７５％（±１
３％）がＭＲＣ−５細胞によって占められると思われる
。４８時間後には、細胞は表面積の４５％（±３４％）
より多くを占めない。これらの結果は、２４時間と４８
時間との間には著しい細胞の脱否があることを示してお
り、１シリーズから別のシリーズまでには、かなりの変
動も観察される。

細胞は融解から４８時間後には増殖するか、集密細胞層
を再形成するまでには６〜９日間を要し、４８時間以前
は利用できない。

細胞の付着性を改良するためには、細胞をコラーゲン（
１００μｇ）とフィブロネクチン（Ｉｏｏｌｌｇ）で処
理した支持体上で培養する。ポリリジンとコンカナバリ
ンＡは、細胞の拡散および成長を妨げる。

これらの条件下では（表−２）、２４時間後の細胞の脱
着はかなり減少し、それぞれのシリーズにおける均一性
は増大する。細胞の成長は一層速やかであり、３〜５日
間で集密状態に達する。細胞は、４８時間培養した後に
は診断試験に使用することかできる。

支持体を処理することによって、１０９６グリセロール
／ＦＣ３の効果か更に改良されることに留意すべきであ
る。

現在は、表面をコラーゲンとフィブロネクチンとのそれ
ぞれ１００μｇおよび５０μｇの濃度での混合物で処理
する。

２４カツププレートでの単層培養において細胞を凍結す
るときにも、融解に関して同様な結果が得られる（表−
３）。

表−］　、　ｉＪｉ層におけるＭＲＣ−５の生育力およ
び凍結保存剤の関数としての融解後の細胞の付着の検討 ＤＭＳＯ７，５％　５〇　　　−脱着 グリセロール　　５　　％　　　５〇　　　　−脱着ｌ
Ｏ％　７０８０３７％（３０）　　　不均一　　遅い１
５　　％　５０８０１３％（２４）　　　不均一　　遅
いトレハロース　　５　　％　　　７０７５５０％　（
２０）　　　　　士均−士正常ＩＯ％　７５８５６２％
（２７）　　　士均−士正常８細胞の生育力は融解から
２および２４時間後に評価してジエンセル・チューブに
２時間および２４時間の時点で存在する細胞の数の％と
して表わす。

５融解から２４時間後に細胞によって占められる面積を
総面積の％で表わした面積（平均値±１頂桑；ｒｒ４シ
リーズは１４本のチューブに相当）および２４時間およ
び集密時に存在する細胞の総数から計算した面積（コン
トロール培養物）。

表−２、１３１層でのＭＲＣ−５細胞の付着にに・ｔす
るジエンセル・チューブの支持体の処理の影響「処理さ
れた」支持体上での凍結 １０％　トレハロース ２４時間 ４８時間 集語い １０％　グリセロ−や ２４時間 ４８時間 ７５％（１３）　　　　９４％（９）　　　　　　７７
％（８）４５％　（３４）　　　　８８％（１３）　　
　　　７５％（５）６−Ｌ　　　　　　３−５　　　　
　　　　４−８６２％（１４）　　　　９０％（８）　
　　　　　６８％（９）２０％（０）　　　　　７５％
（１７）　　　　　００％（４）３これらの結果は、融
解後２４時間および４８時間における細胞によって占め
られる表面積を表わす（ロー２シリーズは８チユーブに
相当）。

５集密細胞の単層を得るのに要する口数での時間を表わ
す。

実施例４：　多カッププレートでの懸濁状態の細胞の凍
結 ４．１　方法 Ｍｌ？Ｃ−５およびベロ細胞を、トリプシン−Ｅｌ）Ｔ
Ａ温溶液よって培養皿から脱着させる。脱着の後、細胞
を完全培地に再懸濁させ、遠心分離した後、同じ培養液
に再懸濁させる。計数の後、細胞を再度遠心分難し、次
いで凍結保存剤である７、５９０層ＭＳＯ／ＦＣ３溶液
に再懸濁させ、最終細胞濃度を２．４Ｘ１０５個のＭＲ
Ｃ−５細胞／ｍｌおよび４．４ｘ１０５個のベロ細胞／
ｍｌとする。

懸濁状態の細胞を、２４カツププレート（リンプロ、フ
ロー・ラボラトリ−（Ｌｌｎｂｒｏ、　Ｐｌｏｗ　Ｌａ
ｂ。

ｒａｔｏｒｙ）　）に０．５ｍｌ／カップの割合で分配
した後、直ちに一７０℃で凍結する。それぞれのプレー
トのカップは、実施例１．２に記載したのと同じコラー
ゲンとフィブロネクチンとの混合物でｒめ処理しておく
。

融解して、プレートを３７°に置いて、凍結保存剤を完
全に溶解させる。血清なしの新鮮な培地を１．５ｍｌの
容量でそれぞれのカップに加え、プレートを１５００　
ｒｐｍで５分間遠心分離する。次いで、培地を完全培地
に置き換える。細胞を再懸濁させた後、再度５分間遠心
分離する。次いで、細胞を３７°で空気中７％ＣＯ２で
インキュベーションする。培地を２４時間後に新しく取
り替える。

表−３＝２４カツプを有するプレートでの中層培養にお
けるＭＲＣ−５細胞の凍結 未処理　　　８５　（１３）　　４２　（２３）　　２
５　（ｇ）処理済み　　９５　（８）　　　８５　（１
２）　　７８　（＋４）　　　　３−６８未処理支持体
またはコラーゲン（１００ｇ）およびフィブロネクチン
（５０，）で処理したもの。

５生育力は（集密時における）総細胞数までの生育可能
な細胞の数を％で表わしたものである。

０集密細胞の単層を得るのに要する日数での時間を表わ
す。

４．２　結果 これらの条件下では、細胞の生育力は８０から８５９６
の間で変化する。融解の後、処理された支持体上の細胞
はｆｌ用１−＋Ｊ能な表面積の少なくとも８５”６を占
め、２４時間の培養後には完全な単層を形成する。

細胞は処理された支持体上に均一に良好に拡散し、コン
トロール細胞と同じ形態学的な外観を有する。

未処理支持体上での同し条件下では、細胞は表面積の６
５から７０％を占めるのみであり、中１層は４８から７
２時間後に形成される。コントロール細胞（未凍結）は
２４時間で単層を形成し、初期細胞密度は＋ｏＭＲＣ−
５個の細胞／カップおよび２ＸｌＯ”個のベロ細胞／カ
ップであることに留意すべきである。

この場合には、凍結保存剤としてのＤ　ＦｖＩ　Ｓ　Ｏ
のみか最良の結果（生育力および細胞拡散）を生じるこ
とに留意すべきである。

凍結し、次いで融解した細胞を２４時間培養した後に、
（実施例２．２に）記載の方法によってヘルペスウィル
スＨ５Ｖ−１およびＨ５Ｖ−２て感染させる。２４時間
後に、凍結した細胞は、コントロール細胞に関して２種
類のウィルス株に対する感受性は１０分の１程度にまで
低くなるが、２種類のウィルス株に極めて良好な感受性
を示す。

４８時間のインキュベーションの後、凍結した細胞の感
受性はコントロール細胞の感受性に合同する。

処理された支持体上の細胞は融解後２４時間で使用する
ことができるが、第二回目の遠心分離を行い、細胞を培
養した後、感染性ウィルスの試料をこの細胞と混合する
ことによって融解後直ちに使用することもできる。２４
時間インキユベーンヨンした後、ウィルス性因子を特殊
な方法（抗原、ＤＮＡプローブ）によって同定すること
ができる。

５．１　　方法 実施例４．１に記載の方法によって製造した細胞を、５
ｘｌＯ６個の細胞／ｍｌの細胞濃度で７．５９６ＤＭＳ
Ｏ／ＦＣ３溶液に再懸濁させる。ＭＲＣうおよびベロ細
胞の場合には、それぞれ加０６および５ＸｌＯ６個の細
胞／ｍｌ凍結保存剤の細胞密度において最適生育力が得
られることに留意すべきである。

懸濁状態の細胞を、２ｍｌの耐寒チューブまたは１５ｍ
１培篠チユーブ（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、ヘクト
ン（Ｂｅｅｒｏｎ）、ディッキンソン（Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ）　）のいずれかのチューブに、チューブ当たり１
ｍｌの割合で分配する。次に、細胞を直ちに一７０℃に
凍結する。

細胞を融解するため、チューブを３７°に再加熱して、
凍結保存剤を溶解させる。細胞を、新鮮な無血清培地１
４ｍ１を含むチューブ（耐寒チューブ）に移すか、また
は同容量の培地で直ちに希釈する（培養チューブ）。遠
心分離の後、細胞を完全培地に再懸濁させて、（コラー
ゲンおよびフィブロネクチン）で処理したカップ中に１
．２ｘｌＯ５個のＭＲＣ−５細胞および２．２ｘｌＯ”
個のベロ細胞／カップの割合で再分配する。

細胞を３７℃で空気中７％ＣＯっでインキュベン］ンす
る。培地は２４時間後に取り替える。

５．′２　　結県 これらの条件下ては、Ｉｌｌ胞の生育力は、ｋｉＲｃ＝
５；Ｉｌｌ胞（ｒ＋＝１５）については８４°【】（±
３０６）付近であり、ベロ細胞（ｎ−８）については８
６９６（±５９６）である。ＭＲＣ−５細胞の”、’＝
ｉ文が少なくとも２ｘ１０６細胞／ｍｌ凍結保／ｊ剤て
あり、へ口♀ｉｌ＋胞の密度か５Ｘ１０６細胞／ｍ＋凍
結保（Ｊ：剤であるときには、！１１胞の生育力は最適
になる。

また、処理された支持体の場ａには、細胞の拡散性か最
適になる。培養物を播種するのに用いられる細胞の密度
によって、融解後２４時間で集患’ｌ’細胞層を得るこ
とができる。

この方法は簡ｒａｔで再現性を角゛し、Ｍ　ＲＣ−５お
よびへ口細胞のヘルペスウィルス（Ｈ３Ｖ−１およびＨ
Ｓ　Ｖ　−２）に対する感受性を保存することができる
。実施例４において述べたように、細胞の培養中に、融
解後のウィルス試料を加えることが可能である。

出ｌ軸人代理人　　佐　　藤　　−雄

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、同定されるウィルスを試料から増幅することによっ
   てその検出を可能にすることができる細胞を使用するこ
   とから成るウィルス性疾患の診断試験において、凍結細
   胞であって融解して試験を行う細胞を用いることを特徴
   とする診断試験。 ２、ウィルスを細胞溶解面積の観察によって検出し、ウ
   ィルス性抗原を特異抗体またはＤＮＡプローブの使用に
   よって同定する、請求項１に記載の診断試験。 ３、ウィルスが単純ヘルペスウィルス、巨細胞ウィルス
   または呼吸性シンシチウムウイルスである、前記の請求
   項のいずれか１項に記載の診断試験。 ４、細胞の保存および融解後に詳細には請求項１〜３の
   いずれか１項に記載の診断試験に使用することができる
   特に多カッププレートまたはチューブから成る支持容器
   中で細胞を凍結する方法において、 （１）融解の後に、生育可能で機能性の細胞の数が最適
   、詳細には８０％より高くなるように選択された凍結保
   存剤を用い、 （２）支持容器中に導入される細胞の数を選択して、融
   解から２４時間後に培養細胞が完全な細胞の単層を形成
   するようにすることを特徴とする、方法。 ５、プラスチック材料の支持容器を、特にコラーゲン、
   フィブロネクチン、ポリリジン、コンカナバリンおよび
   これらの混合物、特にコラーゲンとフィブロネクチンと
   の混合物から選択されるコーティング剤で処理する、請
   求項４に記載の方法。 ６、凍結保存剤が、ＤＭＳＯ、グリセロール、トレハロ
   ース、ジメチルアセトアミド、ポリエチレングリセロー
   ルまたはポリビニルピロリドンであって、培地のみで希
   釈しまたは好ましくはウシ胎児血清特に５〜１０％、ま
   たは血清アルブミン特に２〜５％または純粋なウシ胎児
   血清を添加したものから選択される、請求項４または５
   のいずれか一方に記載の方法。 ７、細胞の懸濁液を支持容器でもあり得る容器中で凍結
   させる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 ８、単層培養物中の細胞を支持容器中で凍結させる、請
   求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 ９、細胞が線維芽ＭＲＣ−５型のヒト胚性肺細胞である
   、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。 １０、細胞がベロ（ＶＥＲＯ）線維芽型のサル腎臓細胞
   である、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。