JPH0272199A - 融合タンパク質およびその用途 - Google Patents
融合タンパク質およびその用途Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、タンパク質加水分解作用を有するタンパク質
フラグメントとＣＤ４結合性フラグメントから成る融合
タンパク質に関する。本発明はま念このような融合タン
パク質に対して誘導された抗体、融合タンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列、それを保有するシラスミントまたは
ベクター さらに抗体ま六はＣＤ４の存在を検出する方
法、並びに融合タンパク質の精製方法を包含する。
フラグメントとＣＤ４結合性フラグメントから成る融合
タンパク質に関する。本発明はま念このような融合タン
パク質に対して誘導された抗体、融合タンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列、それを保有するシラスミントまたは
ベクター さらに抗体ま六はＣＤ４の存在を検出する方
法、並びに融合タンパク質の精製方法を包含する。
後天性免疫不全症候群（エイズ）は重症の細菌およびウ
ィルス感染症、悪性＠瘍、および痴呆状態へ導く中枢神
経系（ＣＮＳ）の神経学的衰退を含む数多くの様々な診
断を伴う合併症を表す（１，２）。
ィルス感染症、悪性＠瘍、および痴呆状態へ導く中枢神
経系（ＣＮＳ）の神経学的衰退を含む数多くの様々な診
断を伴う合併症を表す（１，２）。
エイズの原因物質はヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩ Ｖ
％以前はＩ（ＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＹ、ＡＲＶ 、！：
呼ばしていた）である（３．４）。このウィルスはレト
ロウィルス属のレンチウィルス群に属する。ＨＩＶウィ
ルスは少なくとも２種類の株、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ
−２から成っており、いくつかの単離物が報告されてい
る（５）。これらの単離物間には、特にｇｐ１６０タン
パク質をコードする遺伝子中に、高度の変異性が存在す
る。ｇｐ１６０タンパク質は、合成後に、膜を貫通する
（トランスメンブラン）タンパク質ｇｐ４１とウィルス
の外膜に局在化するｇｐ１２０に切断される。このウィ
ルスは遺伝情報をＲＮＡの形で含み、従って複製周期を
完成させるために逆転写酵素を必要とする。感染周期は
ウィルスがｇｐ１２０％ｅｎｖ （エンベロープ）、
糖りンパク質を介して感染可能な細胞（ｅの外膜にある
対応する細胞受容体ＣＤ４へ結合することにより開始さ
れる。ＣＤ４タンパク質は主に１ヘルパー”型のヒ）Ｔ
リンパ球のサブ集団、単球／マクロファージ、脳誘導細
胞に存在し、Ｂ ＩＪンパ球にも少量存在することが分
かつている（２．７）。その後ウィルスは１被覆小胞（
ｃｏａｔｅｄ ｖｅｓｉｅｌｅ）’″を伴う機構によっ
て細胞の外膜から侵入し、感染はＲＮＡ／ＤＮＡ重複、
それに続く細胞宿主ゲノムへのプロウィルスの組み込み
により進行する。組み込み後、ウィルスは全体としてま
だ未解決のメカニズムによって活性化され、新しいウィ
ルス粒子が生産されて、感染細胞の細胞表面でのｇｐ１
２０の発現、続いて合胞体（シンシチウム）の形成、ウ
ィルスの出芽および細胞の死滅へと導く（７）。従って
、この病気の進行は、免疫系およびＣＮＳに含まれる細
胞の選択的かつ継続的な排除によって起とシ、免疫無防
備状態とＣＮＳ内部の損傷の両方をもたらすと考えられ
る。
％以前はＩ（ＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＹ、ＡＲＶ 、！：
呼ばしていた）である（３．４）。このウィルスはレト
ロウィルス属のレンチウィルス群に属する。ＨＩＶウィ
ルスは少なくとも２種類の株、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ
−２から成っており、いくつかの単離物が報告されてい
る（５）。これらの単離物間には、特にｇｐ１６０タン
パク質をコードする遺伝子中に、高度の変異性が存在す
る。ｇｐ１６０タンパク質は、合成後に、膜を貫通する
（トランスメンブラン）タンパク質ｇｐ４１とウィルス
の外膜に局在化するｇｐ１２０に切断される。このウィ
ルスは遺伝情報をＲＮＡの形で含み、従って複製周期を
完成させるために逆転写酵素を必要とする。感染周期は
ウィルスがｇｐ１２０％ｅｎｖ （エンベロープ）、
糖りンパク質を介して感染可能な細胞（ｅの外膜にある
対応する細胞受容体ＣＤ４へ結合することにより開始さ
れる。ＣＤ４タンパク質は主に１ヘルパー”型のヒ）Ｔ
リンパ球のサブ集団、単球／マクロファージ、脳誘導細
胞に存在し、Ｂ ＩＪンパ球にも少量存在することが分
かつている（２．７）。その後ウィルスは１被覆小胞（
ｃｏａｔｅｄ ｖｅｓｉｅｌｅ）’″を伴う機構によっ
て細胞の外膜から侵入し、感染はＲＮＡ／ＤＮＡ重複、
それに続く細胞宿主ゲノムへのプロウィルスの組み込み
により進行する。組み込み後、ウィルスは全体としてま
だ未解決のメカニズムによって活性化され、新しいウィ
ルス粒子が生産されて、感染細胞の細胞表面でのｇｐ１
２０の発現、続いて合胞体（シンシチウム）の形成、ウ
ィルスの出芽および細胞の死滅へと導く（７）。従って
、この病気の進行は、免疫系およびＣＮＳに含まれる細
胞の選択的かつ継続的な排除によって起とシ、免疫無防
備状態とＣＮＳ内部の損傷の両方をもたらすと考えられ
る。
現在、この病気は患者から採取した血清中の可溶性ＨＩ
Ｖ抗原またはＨＩＶＫ対する抗体の検出によυ診断が行
われている。これは可溶化ＨＩＶ抗原、１ｆＣは抗体検
出用の合成ペプチド、もしくは可溶性抗原検出用の捕獲
抗ＨＩＶ抗体に対する血清反応に基づいて、慣用の固相
ＥＬＩＳＡ法によシ実施される。これらの試験において
発生する問題は主として、Ｈ工ｖウィルス料内の株間お
よび枕内変異体に対する抗体を検出できないことである
。、！、た、これらの試験はこの病気の予後や経過に関
係のある抗体も検出できない。現存するいくつかの証拠
は、患者に見られる全部の抗体が実際の病気に相互に関
連しており、現にこれらがこの病気に対して生体を防御
するのに重要な役割を演じていることを示唆している。
Ｖ抗原またはＨＩＶＫ対する抗体の検出によυ診断が行
われている。これは可溶化ＨＩＶ抗原、１ｆＣは抗体検
出用の合成ペプチド、もしくは可溶性抗原検出用の捕獲
抗ＨＩＶ抗体に対する血清反応に基づいて、慣用の固相
ＥＬＩＳＡ法によシ実施される。これらの試験において
発生する問題は主として、Ｈ工ｖウィルス料内の株間お
よび枕内変異体に対する抗体を検出できないことである
。、！、た、これらの試験はこの病気の予後や経過に関
係のある抗体も検出できない。現存するいくつかの証拠
は、患者に見られる全部の抗体が実際の病気に相互に関
連しており、現にこれらがこの病気に対して生体を防御
するのに重要な役割を演じていることを示唆している。
本発明の主な目的は新しい融合タンパク質を提供するこ
とであり、このタンパク質を用いると、先に概説した従
来技術に伴う欠点（例えばエイズの診断に関連したもの
）を排除できるか、または少なくとも大いに軽減できる
。
とであり、このタンパク質を用いると、先に概説した従
来技術に伴う欠点（例えばエイズの診断に関連したもの
）を排除できるか、または少なくとも大いに軽減できる
。
本発明の他の目的は、このような融合タンパク質の発現
を可能にするＤＮＡ配列を提供することである。
を可能にするＤＮＡ配列を提供することである。
さらに他の目的は、ＨＩＶに対する抗体の存在、または
溶解状態のＣＤ４もしくは咽乳動物細胞の表面で発現さ
れたＣＤ４の存在を検出する方法を提供することである
。
溶解状態のＣＤ４もしくは咽乳動物細胞の表面で発現さ
れたＣＤ４の存在を検出する方法を提供することである
。
さらに他の目的は、本発明融合タンパク質の簡便な精製
法を提供することである。
法を提供することである。
本発明は、その基本的な面において、タンパク質加水分
解作用を有するタンパク質フラグメントと、ＨＩＶ由来
のＣＤ４結合性グリフシル化フラグメントと、から成る
融合タンパク質に関する。
解作用を有するタンパク質フラグメントと、ＨＩＶ由来
のＣＤ４結合性グリフシル化フラグメントと、から成る
融合タンパク質に関する。
そのタンパク質分解作用を有するタンパク質フラグメ／
トは、好ましくはｔ−ＰＡフラグメントである。この種
の融合タンパク質は適当には真核細胞内での発現によっ
て生産され、従って適切なプロセツシング（例えばグリ
コシル化および折シたたみ）が起こる。融合タンパク質
のフラグメントの生産Ｈ，ＤＮＡレベルでの対像のベグ
チドフラグメントと組織グラスミノーゲン活性化因子（
１−ＰＡと略記する）から誘導される既知配列との融合
によって大いに促進され、その後真核細胞発現系（特Ｋ
［乳動物由来のもの）により発現される。
トは、好ましくはｔ−ＰＡフラグメントである。この種
の融合タンパク質は適当には真核細胞内での発現によっ
て生産され、従って適切なプロセツシング（例えばグリ
コシル化および折シたたみ）が起こる。融合タンパク質
のフラグメントの生産Ｈ，ＤＮＡレベルでの対像のベグ
チドフラグメントと組織グラスミノーゲン活性化因子（
１−ＰＡと略記する）から誘導される既知配列との融合
によって大いに促進され、その後真核細胞発現系（特Ｋ
［乳動物由来のもの）により発現される。
従って、本発明は主にグリコシル化されたペプチドの生
産をもたらす。本発明は、その基本的な面において、以
下でさらに概説するようにいろいろな事に適用される。
産をもたらす。本発明は、その基本的な面において、以
下でさらに概説するようにいろいろな事に適用される。
本発明融合タンパク質の好適な実施態様では、ｔ−ＰＡ
フラグメ／トがｔ−ＰＡ分子のクリングル２とタンパク
質加水分解部分を含む。ｔ−ＰＡフラグメントハグリコ
シル化されうるが、その用途に応じてグリコシル化され
なくてもよい。非グリコシル化ｔ−ＰＡフラグメントは
、ＣＤ４結合性フラグメントのグリコシル化との非相互
作用が望まれる場合に有用であるだろう。
フラグメ／トがｔ−ＰＡ分子のクリングル２とタンパク
質加水分解部分を含む。ｔ−ＰＡフラグメントハグリコ
シル化されうるが、その用途に応じてグリコシル化され
なくてもよい。非グリコシル化ｔ−ＰＡフラグメントは
、ＣＤ４結合性フラグメントのグリコシル化との非相互
作用が望まれる場合に有用であるだろう。
本発明によれば、融合タンパク質のＣＤ４結合性フラグ
メ／トはＨＩＶ−エンベロープ（例えばＨＩＶ−ｇ１２
０）Ｋ由来するのが好適である。
メ／トはＨＩＶ−エンベロープ（例えばＨＩＶ−ｇ１２
０）Ｋ由来するのが好適である。
本発明はまた上記のような融合タンパク質をコードする
ＤＮＡ配列を包含し、そのＤＮＡ配列は好ましくはｔ−
ＰＡのシグナル配列と恐ら＜ｔ−ＰＡのリーダー配列を
も含む。
ＤＮＡ配列を包含し、そのＤＮＡ配列は好ましくはｔ−
ＰＡのシグナル配列と恐ら＜ｔ−ＰＡのリーダー配列を
も含む。
本発明の範囲内には、上記の融合タンパク質に対して誘
導された抗体、または融合タンパク質のＣＤ４結合性フ
ラグメントに対して誘導された抗体も含まれる。
導された抗体、または融合タンパク質のＣＤ４結合性フ
ラグメントに対して誘導された抗体も含まれる。
さらに、本発明はこのようなりＮＡ配列を保有するプラ
スミドまたはベクター、並びにこのよりなプラスミドま
たはベクターを含む宿主細胞を包含する。宿主細胞は哺
乳動物細胞のような真核細胞が好ましい。
スミドまたはベクター、並びにこのよりなプラスミドま
たはベクターを含む宿主細胞を包含する。宿主細胞は哺
乳動物細胞のような真核細胞が好ましい。
本発明の別の面によれば、試料中のＨＩＶに対する抗体
の存在を調べる方法が提供され、さらにまた溶解状態の
ＣＤ４または哺乳動物細胞の表面で発現されｆｃＣＤ４
の存在を検出する方法も提供される。この種の方法は、
）（ＩＶ含有試料または検査しようとする哺乳動物細胞
含有試料を、タンパク質分解作用のあるｔ−ＦＡフラグ
メントとＨＩＶ由来のＣＤ４結合性グリコシル化フラグ
メントから成る融合タンパク質と接触きせることを含む
。
の存在を調べる方法が提供され、さらにまた溶解状態の
ＣＤ４または哺乳動物細胞の表面で発現されｆｃＣＤ４
の存在を検出する方法も提供される。この種の方法は、
）（ＩＶ含有試料または検査しようとする哺乳動物細胞
含有試料を、タンパク質分解作用のあるｔ−ＦＡフラグ
メントとＨＩＶ由来のＣＤ４結合性グリコシル化フラグ
メントから成る融合タンパク質と接触きせることを含む
。
このような接触は抗体または上記細胞のＣＤ４と融合タ
ンパク質との相互作用をもたらす。この相互作用によシ
生ずる産物はその後相互作用の産物のタンパク質分解作
用を用いて分析される。この方法は抗体台ｉ−または分
析しようとする細胞のＣＤ４含量の定量的評価を可能に
する。
ンパク質との相互作用をもたらす。この相互作用によシ
生ずる産物はその後相互作用の産物のタンパク質分解作
用を用いて分析される。この方法は抗体台ｉ−または分
析しようとする細胞のＣＤ４含量の定量的評価を可能に
する。
本発明のさらに別の面によれば、上記のよりな融合タン
パク質の精製方法が提供される。この方法は次の工程か
ら成る： ａ）先に概説した抗体を不溶性担体に固定化する工程： ｂ）上記の融合タンパク質を含む物質を上記の固定化抗
体と接触させて、それらを相互作用させる工程：および Ｃ）担体から融合タンパク質を溶出する工程。
パク質の精製方法が提供される。この方法は次の工程か
ら成る： ａ）先に概説した抗体を不溶性担体に固定化する工程： ｂ）上記の融合タンパク質を含む物質を上記の固定化抗
体と接触させて、それらを相互作用させる工程：および Ｃ）担体から融合タンパク質を溶出する工程。
溶出は好ましくはｐＨを下げることによって行われる。
次に述べることは本発明の融合タンパク質を用いるいろ
いろな適用法の概要である。
いろな適用法の概要である。
ａ）ヒト免疫不全症（ＨＩｖ）ウィルスのエンベロープ
タンパク質（ｇｐｘｚｏ）に対する血清結合抗体の検出
法。
タンパク質（ｇｐｘｚｏ）に対する血清結合抗体の検出
法。
この検出法は、ＨＩＶウィルスの細胞受容体ＣＤ４への
結合特性を保持しているｇｐ１２０からの活性タンパク
質フラグメントと、ｔ−ＰＡのタンパク質分解活性フラ
グメントとの相互作用に基づいている。ｇｐ１２０フラ
グメン。トとマトリックスに固定されたＣＤ４との結合
は、結合ｇｐ１２０フラグメントの量を測定することに
よシ評価できる。
結合特性を保持しているｇｐ１２０からの活性タンパク
質フラグメントと、ｔ−ＰＡのタンパク質分解活性フラ
グメントとの相互作用に基づいている。ｇｐ１２０フラ
グメン。トとマトリックスに固定されたＣＤ４との結合
は、結合ｇｐ１２０フラグメントの量を測定することに
よシ評価できる。
このよりな測定は融合／生産成分ｔ−ＰＡを測定するか
、又はｇＰ１２０のＣＤ４結合性フラグメントに結合さ
れた他のマーカー／指示薬を測定することによ）なし得
る。
、又はｇＰ１２０のＣＤ４結合性フラグメントに結合さ
れた他のマーカー／指示薬を測定することによ）なし得
る。
もしもｇｌ）１２０からのＣＤ４結合性フラグメントに
対する抗体が存在するならば、この種の抗体はそのフラ
グメントとＣＤ４との結合を妨げるであろう。このよう
な抗体の存在Ｈ，ＨＩＶによって媒介される病気（エイ
ズ）の存在を明らかに立証するものである。
対する抗体が存在するならば、この種の抗体はそのフラ
グメントとＣＤ４との結合を妨げるであろう。このよう
な抗体の存在Ｈ，ＨＩＶによって媒介される病気（エイ
ズ）の存在を明らかに立証するものである。
ｂ）可溶性ＣＤ４結合性タンパク質の検出法。
上記のことから類推して、ＣＤ４に親和性を有するタン
パク質はその後ＣＤ４と反応して、１−ＰＡ／ｇｐｌｚ
ｏ融合タンパク質のＣＤ４への結合を妨げる。従って、
可溶性ＣＤ４の量は測定された融合タンパク質の量と相
関関係があるだろう。
パク質はその後ＣＤ４と反応して、１−ＰＡ／ｇｐｌｚ
ｏ融合タンパク質のＣＤ４への結合を妨げる。従って、
可溶性ＣＤ４の量は測定された融合タンパク質の量と相
関関係があるだろう。
ｃ）ＣＤ４を発現する細胞の検出法。
ＣＤ４タンパク質を発現する細胞は、ｔ−ＰＡ／ｇｐ１
２０融合タンパク質と結合するから、結合された融合タ
ンパク質の量を測定することにより、定性的および定量
的に評価できるであろう。
２０融合タンパク質と結合するから、結合された融合タ
ンパク質の量を測定することにより、定性的および定量
的に評価できるであろう。
ｄ）抗体生成のための抗原。
作製されるフラグメントは、−次アミノ酸配列から誘導
される抗原構造、並びにタンパク質の折シたたみおよび
真核細胞中で起こる翻訳後のグリコシル化によシもたら
される二次および三次抗原エピトープを含む。従って、
この種のフラグメントを用いる免疫法はこれらの構造に
対する抗体を生成させるであろう。ｇｐ１２０のＣＤ４
結合領域に対する抗体の場合、この種の抗体混合物は感
染性細胞へのウィルス結合を妨げるのに効果的であり、
それ故に無菌免疫状態を生じさせるか、または感染の進
行を妨げるであろう。
される抗原構造、並びにタンパク質の折シたたみおよび
真核細胞中で起こる翻訳後のグリコシル化によシもたら
される二次および三次抗原エピトープを含む。従って、
この種のフラグメントを用いる免疫法はこれらの構造に
対する抗体を生成させるであろう。ｇｐ１２０のＣＤ４
結合領域に対する抗体の場合、この種の抗体混合物は感
染性細胞へのウィルス結合を妨げるのに効果的であり、
それ故に無菌免疫状態を生じさせるか、または感染の進
行を妨げるであろう。
糖タンパク質の基本的構造は、問題の糖タンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列中に与えられる情報によって決定さ
れる。−次転写後に、折、２＋たみやグリコシル化を含
む二次および三次修飾が起こる。真核細胞では、このメ
カニズムはあまりよく理解されていないが、このような
二次プロセッシングへ導く情報の一部および分泌シグナ
ルはそのＤＮＡ％ｍＲＮＡおよび合成中のタンパク質分
子の一次配列中に与えられることが明らかである。糖タ
ンパク質の一部分のみを作ろうとする場合、特にこの部
分が明確な生物学的機能を有する場合には、二次プロセ
ッシングに関する重要な情報が不足するであろう。
ードするＤＮＡ配列中に与えられる情報によって決定さ
れる。−次転写後に、折、２＋たみやグリコシル化を含
む二次および三次修飾が起こる。真核細胞では、このメ
カニズムはあまりよく理解されていないが、このような
二次プロセッシングへ導く情報の一部および分泌シグナ
ルはそのＤＮＡ％ｍＲＮＡおよび合成中のタンパク質分
子の一次配列中に与えられることが明らかである。糖タ
ンパク質の一部分のみを作ろうとする場合、特にこの部
分が明確な生物学的機能を有する場合には、二次プロセ
ッシングに関する重要な情報が不足するであろう。
本発明は、ＤＮＡ−ＲＮＡ およびタンパク質レベル
での融合相手として組織プラスミノーゲン活性化因子（
ｔ−ｐＡ）の一部を利用するものであシ、それ故に二次
プロセッシングおよび分泌のため＠シグナルを提供する
。さらに、そのフラグメントは不安定／不溶性であシ得
、またタンパク質分解酵素による認識およびその後の断
片化のための標的領域を有するので、ｔ−”ＰＡへの物
理的結合は安定性および可溶性をも六らし、しかもその
フラグメントを減成（低分子化）から保護するであろう
Ｏ グリコシル化フラグメント／ペプチドの生産用媒介物と
してｔ”−ＰＡを用いる本発明は、融合分子のｔ＝ＰＡ
部分のタンパク質分解活性を測定することによって、生
産されたタンパク質レベルをその後分析できるようにす
る。その上、融合タンパク質の精製は、特異的なマトリ
ックス結合抗体および従来の免疫吸着法を用いてｔ−Ｐ
Ａ分子の抗原性により達成できるであろう。
での融合相手として組織プラスミノーゲン活性化因子（
ｔ−ｐＡ）の一部を利用するものであシ、それ故に二次
プロセッシングおよび分泌のため＠シグナルを提供する
。さらに、そのフラグメントは不安定／不溶性であシ得
、またタンパク質分解酵素による認識およびその後の断
片化のための標的領域を有するので、ｔ−”ＰＡへの物
理的結合は安定性および可溶性をも六らし、しかもその
フラグメントを減成（低分子化）から保護するであろう
Ｏ グリコシル化フラグメント／ペプチドの生産用媒介物と
してｔ”−ＰＡを用いる本発明は、融合分子のｔ＝ＰＡ
部分のタンパク質分解活性を測定することによって、生
産されたタンパク質レベルをその後分析できるようにす
る。その上、融合タンパク質の精製は、特異的なマトリ
ックス結合抗体および従来の免疫吸着法を用いてｔ−Ｐ
Ａ分子の抗原性により達成できるであろう。
本発明の別の利点は、遺伝学的にコ、−ドされたグリコ
シル化部位を含まない修飾ｔ−ＰＡ遺伝子を融合相手と
して利用し得る点にある。このことは、特定の生物学的
機能（例えば、リガンド−レセプター相互作用、免疫原
性）を調べるべく、タンパク質に結合された炭水化物を
生産し且つその部位および配列を分析するために、この
媒介物を使用できるようにした。
シル化部位を含まない修飾ｔ−ＰＡ遺伝子を融合相手と
して利用し得る点にある。このことは、特定の生物学的
機能（例えば、リガンド−レセプター相互作用、免疫原
性）を調べるべく、タンパク質に結合された炭水化物を
生産し且つその部位および配列を分析するために、この
媒介物を使用できるようにした。
本発明はｇｐ１２０とＣＤ４との相互作用を利用する。
この相互作用は物理的に強いが、ＣＤ４が細胞表面で発
現されるならば、 ｇｐ１２０に対する抗体によって妨
げられるであろり。得られ六データは、この測定方式が
よシ早い検出時期および陽性信号を読み取るのに要する
抗体量の点からよシ高い感度を有することを示唆してい
る。この発見に基づいて、本発明はＣＤ４結合領域に関
与するｇＩ）１２００部分の選択的発現を特徴としてい
る。
現されるならば、 ｇｐ１２０に対する抗体によって妨
げられるであろり。得られ六データは、この測定方式が
よシ早い検出時期および陽性信号を読み取るのに要する
抗体量の点からよシ高い感度を有することを示唆してい
る。この発見に基づいて、本発明はＣＤ４結合領域に関
与するｇＩ）１２００部分の選択的発現を特徴としてい
る。
このフラグメントｔｉＨＩ Ｖ群に保存されているドメ
インを含み（ｉｏ）、非結合性の非保存ドメインの排除
（ＣＤ４結合部位に対して反応する抗体を′ブロック“
しうる）Ｋよシ、全てのＨＩＶウィルスに共通した反応
性をもつ抗体に対して選択される。このフラグメントは
また可能なグリコシル化部位を含み、抗炭水化物抗体の
検出を可能にする。さらに、問題の領域は抗体との反応
が臨床上重要であり５る領域を含むと思われる。ｔ−Ｐ
ＡへのＣＤ４結合性フラグメントの結合によ’ｔ、ｔ−
ＰＡによって発現されるタンパク質分解活性を用いて、
ＣＤ４への結合に関与する融合タンパク質の部分を直接
定量化することができる（１１）。
インを含み（ｉｏ）、非結合性の非保存ドメインの排除
（ＣＤ４結合部位に対して反応する抗体を′ブロック“
しうる）Ｋよシ、全てのＨＩＶウィルスに共通した反応
性をもつ抗体に対して選択される。このフラグメントは
また可能なグリコシル化部位を含み、抗炭水化物抗体の
検出を可能にする。さらに、問題の領域は抗体との反応
が臨床上重要であり５る領域を含むと思われる。ｔ−Ｐ
ＡへのＣＤ４結合性フラグメントの結合によ’ｔ、ｔ−
ＰＡによって発現されるタンパク質分解活性を用いて、
ＣＤ４への結合に関与する融合タンパク質の部分を直接
定量化することができる（１１）。
生体内の細胞は細胞表面に結合されたタンパク質分子を
発現する。いくつかの場合には、細胞表面分子の存在が
、ある細胞型へ、またはある細胞群によって発現される
機能へむすびつけられる。
発現する。いくつかの場合には、細胞表面分子の存在が
、ある細胞型へ、またはある細胞群によって発現される
機能へむすびつけられる。
ＣＤ４マーカーはヘルパー細胞として知られるＴ細胞の
サブ集団（６）、単球／マクロファージの一部（７）、
および若干の脳誘導細胞によって特異的に発現される公
知のマーカーである。ＣＤ４分子の機能はまだ十分に解
明されていないが、それは上記の細胞型に対する重要な
マーカーとして役立つ。
サブ集団（６）、単球／マクロファージの一部（７）、
および若干の脳誘導細胞によって特異的に発現される公
知のマーカーである。ＣＤ４分子の機能はまだ十分に解
明されていないが、それは上記の細胞型に対する重要な
マーカーとして役立つ。
さらに、患者のＣＤ４発現細胞においては、それは予後
を知らせる重要な手段でもある。本発明を用いると、Ｃ
Ｄ４発現細胞の数および１個の細胞上のＣＤ４受容体の
数は、ｔ−ＰＡとｇｐ１２０のＣＯ４結合性彦負域との
融合タンパク質の結合を測定することにより評価できる
。本発明の他の類似面は、同一反応が細胞に結合されて
いない可溶性ＣＤ４を検出するために使用できるという
ことである。
を知らせる重要な手段でもある。本発明を用いると、Ｃ
Ｄ４発現細胞の数および１個の細胞上のＣＤ４受容体の
数は、ｔ−ＰＡとｇｐ１２０のＣＯ４結合性彦負域との
融合タンパク質の結合を測定することにより評価できる
。本発明の他の類似面は、同一反応が細胞に結合されて
いない可溶性ＣＤ４を検出するために使用できるという
ことである。
免疫系は抗原分子に現れた一次、二次および三次構造に
よって決定されるエピトープに対して抗体を生成させる
固有の能力を有する。それぞれの型の抗体（すなわち、
抗体産生細胞の１クローンから得られるもの）は１つの
このよつなエピトープと反応するであろう。タンパク質
のフラグメントが抗体媒介免疫の誘発のために全タンパ
ク質分子の代わりに用いられる場合、そのフラグメント
のもとの性ｇ！（例えばグリコシル化）を維持すること
が大切である。
よって決定されるエピトープに対して抗体を生成させる
固有の能力を有する。それぞれの型の抗体（すなわち、
抗体産生細胞の１クローンから得られるもの）は１つの
このよつなエピトープと反応するであろう。タンパク質
のフラグメントが抗体媒介免疫の誘発のために全タンパ
ク質分子の代わりに用いられる場合、そのフラグメント
のもとの性ｇ！（例えばグリコシル化）を維持すること
が大切である。
本発明は、真核細胞の二次プロセッシングを伴り機構を
介して、もとの抗原分子からのタンパク質フラグメント
の生産を可能にし、こうしてもとの抗原分子と生産され
たそのフラグメントの間には高度の相同性が存在する。
介して、もとの抗原分子からのタンパク質フラグメント
の生産を可能にし、こうしてもとの抗原分子と生産され
たそのフラグメントの間には高度の相同性が存在する。
この穏のフラグメントは、免疫原として用いた場合に、
もとの分子に相同な構造と相互作用する抗体、および立
体障害や他の手段（免疫学的に抑制されたエピトープ（
１２）を含む）によって天然の立体配置のエピトープに
対する抗体形成を妨げる構造と相互作用する抗体の生成
を誘発することができる。
もとの分子に相同な構造と相互作用する抗体、および立
体障害や他の手段（免疫学的に抑制されたエピトープ（
１２）を含む）によって天然の立体配置のエピトープに
対する抗体形成を妨げる構造と相互作用する抗体の生成
を誘発することができる。
ｔ、−ＰＡとｇｐ１２０分子のＣＯ４結合領域とから作
られた融合タンパク質が、完全な分子またはｇ ｐ、１
２０の精製フラグメントのいずれかとして、免疫原分子
として用いられる場合に、この種の免疫ぶはもとの分子
に存在する構造に対する抗体および上記の理由のために
通常露出されていないエピトープに対する抗体の形成を
誘発するであろう。
られた融合タンパク質が、完全な分子またはｇ ｐ、１
２０の精製フラグメントのいずれかとして、免疫原分子
として用いられる場合に、この種の免疫ぶはもとの分子
に存在する構造に対する抗体および上記の理由のために
通常露出されていないエピトープに対する抗体の形成を
誘発するであろう。
このような抗体は単独でまたは天然分子に対して生成さ
れた抗体との組合せで、ＣＤ４レセプターを介しての感
染性細胞へのウィルスの結合を妨げ、従ってＨＩＶによ
って媒介される感染を防御するのに重要であるだろう。
れた抗体との組合せで、ＣＤ４レセプターを介しての感
染性細胞へのウィルスの結合を妨げ、従ってＨＩＶによ
って媒介される感染を防御するのに重要であるだろう。
要約すると、本発明は、タンパク質加水分解活性を保持
するｔ−ＰＡ分子の一部と、全タンパク分子内の機能的
なＣＯ４結合領域から誘導されるタンパク質フラグメン
トから成るハイブリッド／融合分子の構築に基づいてい
る。融合は、これらのタンパク質フラグメントからＤＮ
Ａを誘導して、ＤＮＡレベルで行ワれ、二次グロセツシ
ング（折シた六みおよびグリコシル化を含む）を可能に
する発現系での融合遺伝子の発現によシ、生産されたフ
ラグメントはもとの分子から生ずる性質を保持し、いく
りかの場合には、免疫源能力や抗体と反応する能力を含
めた新しい性質を有するであろう。こうして、本発明は
次の系を提供するものである： ａ）ｔ−ＰＡ融合相手のタンパク質加水分解作用に基づ
いた迅速な検出系； ｂ）ｔ−ＰＡタンパク質の性質を用いる免疫吸着法に基
づいた精製系： Ｃ）生理活性タンパク質の炭水化物置換の機能および位
置の測定を可能にする系； ｄ）病気の診断、防護および予防用の抗体の生成ｔｆｃ
は分類のために、ＣＯ２結合性フラグメントをコードす
るＨＩＶ ＤＮＡ配列から得られ念糖タンパク質フラ
グメントの生産を可能にする系。
するｔ−ＰＡ分子の一部と、全タンパク分子内の機能的
なＣＯ４結合領域から誘導されるタンパク質フラグメン
トから成るハイブリッド／融合分子の構築に基づいてい
る。融合は、これらのタンパク質フラグメントからＤＮ
Ａを誘導して、ＤＮＡレベルで行ワれ、二次グロセツシ
ング（折シた六みおよびグリコシル化を含む）を可能に
する発現系での融合遺伝子の発現によシ、生産されたフ
ラグメントはもとの分子から生ずる性質を保持し、いく
りかの場合には、免疫源能力や抗体と反応する能力を含
めた新しい性質を有するであろう。こうして、本発明は
次の系を提供するものである： ａ）ｔ−ＰＡ融合相手のタンパク質加水分解作用に基づ
いた迅速な検出系； ｂ）ｔ−ＰＡタンパク質の性質を用いる免疫吸着法に基
づいた精製系： Ｃ）生理活性タンパク質の炭水化物置換の機能および位
置の測定を可能にする系； ｄ）病気の診断、防護および予防用の抗体の生成ｔｆｃ
は分類のために、ＣＯ２結合性フラグメントをコードす
るＨＩＶ ＤＮＡ配列から得られ念糖タンパク質フラ
グメントの生産を可能にする系。
実施例１
ｇｐ１２０のＣＯ４結合領域、ｇｐ１２０とｇｐ４１の
間の切断部位、５個のＮ末端ｇｐ４１アミノ酸、および
ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のクリイグル２と
プロテアーゼ領域から成る融合タンパク質遺伝子の構築 ＨＩｖウィルスゲノムの塩基５８２０−８９２６を含む
プラスミドｐ１７をＤｒａ工およびＡ１ｕ工で消化した
。ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１６０のアミノ酸
３４３−５１６ をコードする５２４ｂｐ７ラグメント
はアガロース電気泳動で精製し、ｐＵＣ１９の小さい部
位にクロー二／りした。
間の切断部位、５個のＮ末端ｇｐ４１アミノ酸、および
ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のクリイグル２と
プロテアーゼ領域から成る融合タンパク質遺伝子の構築 ＨＩｖウィルスゲノムの塩基５８２０−８９２６を含む
プラスミドｐ１７をＤｒａ工およびＡ１ｕ工で消化した
。ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１６０のアミノ酸
３４３−５１６ をコードする５２４ｂｐ７ラグメント
はアガロース電気泳動で精製し、ｐＵＣ１９の小さい部
位にクロー二／りした。
５’ Ｄｒａ１部位がｐＵｃ１９ マルチリンカ−の
Ｋｐｎ１部位の方に向いた５２４ｂｐ 挿入物を保有す
る１つの組換えプラスミドｔｉｐＫＧＥ１０００と呼ば
れ、その後の構築のために使用した。
Ｋｐｎ１部位の方に向いた５２４ｂｐ 挿入物を保有す
る１つの組換えプラスミドｔｉｐＫＧＥ１０００と呼ば
れ、その後の構築のために使用した。
後述するようなイン・フレーム融合（読み枠がずれない
）を行うために、両端にＥｃｏＲＩ およびＫｐｎＩ部
位および内部に１３ａｍＨＩ部位を有する２本の合成オ
リゴヌクレオチド： ５’ ＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＡＣ−３’３’
−ＧＣＣＴＡＧＧＣＣ−５’ を合成した。
）を行うために、両端にＥｃｏＲＩ およびＫｐｎＩ部
位および内部に１３ａｍＨＩ部位を有する２本の合成オ
リゴヌクレオチド： ５’ ＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＡＣ−３’３’
−ＧＣＣＴＡＧＧＣＣ−５’ を合成した。
これらの合成リンカ−ばＥｃｏＲＩ／ＫＰｎｌ で消
化したｐＫＧＥ １０ ｏ ｏと連結させて、ｐＫＧＥ
１００１と呼ばれるプラスミドを得た。このプラスミ
ドでは、アミノ酸３４３−５１６ に含まれるｇｐ１
６０のＣＤ４結合領域をコードする配列が５４０ｂｐの
Ｂ＆ｍＨＩフラグメント上に得られる。
化したｐＫＧＥ １０ ｏ ｏと連結させて、ｐＫＧＥ
１００１と呼ばれるプラスミドを得た。このプラスミ
ドでは、アミノ酸３４３−５１６ に含まれるｇｐ１
６０のＣＤ４結合領域をコードする配列が５４０ｂｐの
Ｂ＆ｍＨＩフラグメント上に得られる。
アミノ酸６−１７３を欠失したヒト組織プラスミノーゲ
ン活性化因子をコードする遺伝子ｈｗ許出題第８７０２
５６２−３号（参照にようここに引用される）に詳しく
記述されている。１６７個のアミノ酸の欠失のほかに、
次のアミノ酸残基は合成オリゴヌクレオチドまたは部位
特異的変異導入法により交換した： Ａｓｎ−１８４−〉 Ｇｉｎ Ａａｎ−１７７−〉 ５ｅｔ Ｌｙ８ ２７７ −一÷ Ｖａｌ この遺伝子によってコードされる修飾ｔ−ＰＡｆｌＫ２
（Ｇｉｎ）Ｐ（ＶａＬ）と呼ばレル。
ン活性化因子をコードする遺伝子ｈｗ許出題第８７０２
５６２−３号（参照にようここに引用される）に詳しく
記述されている。１６７個のアミノ酸の欠失のほかに、
次のアミノ酸残基は合成オリゴヌクレオチドまたは部位
特異的変異導入法により交換した： Ａｓｎ−１８４−〉 Ｇｉｎ Ａａｎ−１７７−〉 ５ｅｔ Ｌｙ８ ２７７ −一÷ Ｖａｌ この遺伝子によってコードされる修飾ｔ−ＰＡｆｌＫ２
（Ｇｉｎ）Ｐ（ＶａＬ）と呼ばレル。
ここで使用する代表的なｔ−ＰＡ修飾はに２（Ｇｌｎ）
Ｐ（ｖａｌ）に類倶しているが、次の変更を有していた
： Ｌｙｓ−２７７は修飾されず Ａａｎ−４４８−シＧｌｎ その結果、この修飾はに２（Ｇｉｎ）Ｐ（Ｇｉｎ）と呼
ばれる。この遺伝子によってコードされる修飾ｔ−ＰＡ
分子の１つの＊９ｕ、それがアスパラギン結合グリコシ
ル化部位を完全に欠失している点である。
Ｐ（ｖａｌ）に類倶しているが、次の変更を有していた
： Ｌｙｓ−２７７は修飾されず Ａａｎ−４４８−シＧｌｎ その結果、この修飾はに２（Ｇｉｎ）Ｐ（Ｇｉｎ）と呼
ばれる。この遺伝子によってコードされる修飾ｔ−ＰＡ
分子の１つの＊９ｕ、それがアスパラギン結合グリコシ
ル化部位を完全に欠失している点である。
さらに１それはｔ−ＦＡのクリングル２をコードする配
列のすぐ前にＢａｍＨＩ切断部位を含む。
列のすぐ前にＢａｍＨＩ切断部位を含む。
このＢａｍＨＩ部位にｐＫＧＥ１００１由来のｇｐ１２
０の５４０ｂｐ ＢａｍＨＩフラグメントを挿入する
ことによシ、ｇｐ１２０のＣＤ４結合領域と修飾ｔ−Ｐ
Ａとのイン・フレーム融合が形成される。
０の５４０ｂｐ ＢａｍＨＩフラグメントを挿入する
ことによシ、ｇｐ１２０のＣＤ４結合領域と修飾ｔ−Ｐ
Ａとのイン・フレーム融合が形成される。
５ａｌＩ／ＸｒｎａＩ切断ｐＵｃ１９にクロー二／グし
±Ｓ ａ Ｉ Ｉ／Ｘｍａ Ｉフラグメント上にこの修
飾１−ＰＡ遺伝子の一部を含むプラスミドはＢａｍＨＩ
で消化し、続いてｇｐ１２０のＣＤ４結合領域、ｇｐ１
２０とｇｐ４１の間の切断部位、およびｇｐ４１の５個
のアミノ酸をコードする５４０ｂｐ ＢａｍＨＩフラグ
メントと連結し大。右方向にＢａｍＨＩ部位に挿入し７
ｊ１３ａｍＴ（Ｉフラグメントを含むプラスミドはｐＫ
ＧＥ１００２と名づけた。
±Ｓ ａ Ｉ Ｉ／Ｘｍａ Ｉフラグメント上にこの修
飾１−ＰＡ遺伝子の一部を含むプラスミドはＢａｍＨＩ
で消化し、続いてｇｐ１２０のＣＤ４結合領域、ｇｐ１
２０とｇｐ４１の間の切断部位、およびｇｐ４１の５個
のアミノ酸をコードする５４０ｂｐ ＢａｍＨＩフラグ
メントと連結し大。右方向にＢａｍＨＩ部位に挿入し７
ｊ１３ａｍＴ（Ｉフラグメントを含むプラスミドはｐＫ
ＧＥ１００２と名づけた。
ｐＫＧＥ１００２ は３５個のアミノ酸から成るｔ−
ＰＡシグナルペプチドとそれに続く成熟ｔ−ＰＡタンパ
ク質の最初の５個のアミノ酸をコードしている。その後
Ｋｔ−ＰＡのアミノ酸１７４−ｌ７４−１７７（ＥＧＦ
−Ｆｌｎおよびクリングル１ドメインの欠失による）、
リンカ−配列に由来する３個のアミノ酸、およびｇｐ１
６０のアミノ酸３４３−５１６が続く。このフラグメン
トＦｉｇｐ１２０のＣＤ４結合領域のほかにｇｐ１２０
とｇｐ４１の間の切断部位およびｇｐ４１の５個のアミ
ノ酸をもコードしている。この特徴により、この遺伝子
融合物は上記切断部位を利用し得る真核細胞系でのペプ
チドの生産に非常に有用なものとなっている。最後に、
ｇｐ１６０のアミノ酸５１６とｔ、−ＰＡのアミノ酸１
７８の間の接合部にはｐＵＣ１９配列に由来する３個の
アミノ酸が存在する。−緒になってこれＨｔ−ＰＡ／Ｉ
ＪンカーからのＮ末端アミノ酸を有する５３９個のアミ
ノ酸の成熟タンパク質、それに続（ｇｐ１６０の１７４
個のアミノ酸およびｐＵｃ１９／１−ＰＡ配列の３５３
個のアミノ酸を与える。ｔ−ＰＡのＣ末端部分をコード
する３５０個のアミノ酸は、クリングル２の全領域と完
全なプロテアーゼ領域にわ念っている。
ＰＡシグナルペプチドとそれに続く成熟ｔ−ＰＡタンパ
ク質の最初の５個のアミノ酸をコードしている。その後
Ｋｔ−ＰＡのアミノ酸１７４−ｌ７４−１７７（ＥＧＦ
−Ｆｌｎおよびクリングル１ドメインの欠失による）、
リンカ−配列に由来する３個のアミノ酸、およびｇｐ１
６０のアミノ酸３４３−５１６が続く。このフラグメン
トＦｉｇｐ１２０のＣＤ４結合領域のほかにｇｐ１２０
とｇｐ４１の間の切断部位およびｇｐ４１の５個のアミ
ノ酸をもコードしている。この特徴により、この遺伝子
融合物は上記切断部位を利用し得る真核細胞系でのペプ
チドの生産に非常に有用なものとなっている。最後に、
ｇｐ１６０のアミノ酸５１６とｔ、−ＰＡのアミノ酸１
７８の間の接合部にはｐＵＣ１９配列に由来する３個の
アミノ酸が存在する。−緒になってこれＨｔ−ＰＡ／Ｉ
ＪンカーからのＮ末端アミノ酸を有する５３９個のアミ
ノ酸の成熟タンパク質、それに続（ｇｐ１６０の１７４
個のアミノ酸およびｐＵｃ１９／１−ＰＡ配列の３５３
個のアミノ酸を与える。ｔ−ＰＡのＣ末端部分をコード
する３５０個のアミノ酸は、クリングル２の全領域と完
全なプロテアーゼ領域にわ念っている。
哺乳動物細胞による発現のために、２つの異なる真核細
胞発現ベクターが構築された。
胞発現ベクターが構築された。
（ｉ）ＣＯ８細胞での発現のために、ＳＶ４０後期プロ
モーターを利用するベクターが構築された。
モーターを利用するベクターが構築された。
ｐＫＧＥ１００２を５ａｌＩ／ＡｐａＩ で消化した
。
。
ｇｐ１２０／１−ＰＡ融合物をコートするｓ＆ｌ工ＺＡ
ｐ＆Ｉ７ラグメントは、ｐＢＲ３２２、ＳＶ４０後期ブ
Ｏ％−ター、修飾ｔ−ＰＡ遺伝子（Ｋ２（Ｇｉｎ）Ｐ（
Ｇｉｎ）をコードする）、およびＳＶ４０からの３′調
節シグナルを含むベクター（ＳａｌＩ／ＡｐａＩで消化
したもの）と連結させた。得られたプラスミ）’ｐＫＧ
ｇ１００３（第１図参照） Ｆｉ、、ｇＶ４０後期プロ
モーターの転写制御下にある上記のｇｐ１２０／１−Ｐ
Ａ 融合物をコードする遺伝子を含んでいる。この遺
伝子の下流にはスプライス部位とポリアデニル化シグナ
ルを含むＳＶ４０由来のフラグメントがある。
ｐ＆Ｉ７ラグメントは、ｐＢＲ３２２、ＳＶ４０後期ブ
Ｏ％−ター、修飾ｔ−ＰＡ遺伝子（Ｋ２（Ｇｉｎ）Ｐ（
Ｇｉｎ）をコードする）、およびＳＶ４０からの３′調
節シグナルを含むベクター（ＳａｌＩ／ＡｐａＩで消化
したもの）と連結させた。得られたプラスミ）’ｐＫＧ
ｇ１００３（第１図参照） Ｆｉ、、ｇＶ４０後期プロ
モーターの転写制御下にある上記のｇｐ１２０／１−Ｐ
Ａ 融合物をコードする遺伝子を含んでいる。この遺
伝子の下流にはスプライス部位とポリアデニル化シグナ
ルを含むＳＶ４０由来のフラグメントがある。
（ｉｉ）冠面動物細胞での発現のために、ｇｐ１２０／
１−ＰＡ融合物をコードする遺伝子セグメントは特許出
願第８７０２５６２−３号（参照の大めにここに引用さ
れる）Ｋ記載される発現ベクターｐＫＧＥ１１３に挿入
し穴。
１−ＰＡ融合物をコードする遺伝子セグメントは特許出
願第８７０２５６２−３号（参照の大めにここに引用さ
れる）Ｋ記載される発現ベクターｐＫＧＥ１１３に挿入
し穴。
簡単に述べると、このプラスミドはその唯一のＢ＆ｍＨ
Ｉ部位で開環されるウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）
の全ゲノムを含む。この部位に細菌ベクターｐＭＬ２ｄ
、強力な構成プロモーターのｉウスメタロチオネイン−
１、修飾ｔ−ＰＡ遺伝子Ｃ３Ｖ４０由来のスプライスお
よびポリアデニル化シグナルが続く）が挿入される。３
つのフラグメントリ連結により、ｐＫＧＥ１１３ に
含まれるような修飾ｔ−ＰＡ遺伝子はここで述べ六ｔ−
ＦＡ／ｇｐ１２０融合物によって交換することができる
。
Ｉ部位で開環されるウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）
の全ゲノムを含む。この部位に細菌ベクターｐＭＬ２ｄ
、強力な構成プロモーターのｉウスメタロチオネイン−
１、修飾ｔ−ＰＡ遺伝子Ｃ３Ｖ４０由来のスプライスお
よびポリアデニル化シグナルが続く）が挿入される。３
つのフラグメントリ連結により、ｐＫＧＥ１１３ に
含まれるような修飾ｔ−ＰＡ遺伝子はここで述べ六ｔ−
ＦＡ／ｇｐ１２０融合物によって交換することができる
。
ｇｐ１２０配列およびｔ＝ＰＡコード配列の大部分は３
ａｌＩ＝ＡｐａＩフラグメントに含まれる。
ａｌＩ＝ＡｐａＩフラグメントに含まれる。
５ａｌＩ＝ＸｂａＩフラグメ／トはＭＴ−１プロモータ
ーとＢＰＶゲノムの一部を含む。最後に、Ｘｂ、ＩＬＩ
−ＡｐａＩはＢＰＶゲノムの残υ、ｐＭＬ２ｄ。
ーとＢＰＶゲノムの一部を含む。最後に、Ｘｂ、ＩＬＩ
−ＡｐａＩはＢＰＶゲノムの残υ、ｐＭＬ２ｄ。
ＳＶ４０スプライスおよびポリアデニル化シグナル、並
びＫｔ−ＰＡの残部を含む。３つのフラグメントの連結
によυ、プラスミドＰＫＧＥ１００４が得られた。
びＫｔ−ＰＡの残部を含む。３つのフラグメントの連結
によυ、プラスミドＰＫＧＥ１００４が得られた。
実施例２
哺乳動物細胞によるｇｐｔ２ｏ／１−ＰＡの発現゛プラ
スミドｐＫＧＥ１００４はネオマイシン耐性遺伝子と共
にハムスター肺線維芽細胞株ＤＯＮ（ＡＴＣＣＣＣＬ
１６）にトランスフェクションした。０４１８を含む選
択培地中で生育する細胞クローンはその後、個々の細胞
単離物として単離し、２４ウエルプレートで増殖させた
。これらのクローンのうち４８が増殖し、培地全面の増
殖が達せられたとき細胞上清を線維未溶解活性について
分析しな。その結果を以下に示す： 表 １ 解活性 通常の培−一の濃度のウシ胎児崩清を含む生産培地２−
を加え、細胞をさらに２４時間培養し、その後上清をＢ
のよりにして検定した。Ｂ＝検定は寒天平板に埋入した
フィブリノーゲンを用いて行った。結果は２４時間後に
測定した。
スミドｐＫＧＥ１００４はネオマイシン耐性遺伝子と共
にハムスター肺線維芽細胞株ＤＯＮ（ＡＴＣＣＣＣＬ
１６）にトランスフェクションした。０４１８を含む選
択培地中で生育する細胞クローンはその後、個々の細胞
単離物として単離し、２４ウエルプレートで増殖させた
。これらのクローンのうち４８が増殖し、培地全面の増
殖が達せられたとき細胞上清を線維未溶解活性について
分析しな。その結果を以下に示す： 表 １ 解活性 通常の培−一の濃度のウシ胎児崩清を含む生産培地２−
を加え、細胞をさらに２４時間培養し、その後上清をＢ
のよりにして検定した。Ｂ＝検定は寒天平板に埋入した
フィブリノーゲンを用いて行った。結果は２４時間後に
測定した。
上記試験で最高の生産値を示したクローンは２５０−フ
ラスコ中で継代培養し、全面増殖後ローラーフラスコ中
で培養した。全面増殖後ローラーフラスコの培地を上記
のような生産培地に取り換え、その培養期間中３日ごと
に培地を回収した。
ラスコ中で継代培養し、全面増殖後ローラーフラスコ中
で培養した。全面増殖後ローラーフラスコの培地を上記
のような生産培地に取り換え、その培養期間中３日ごと
に培地を回収した。
上清は次のようＫして精製し、＋：
１）上清は５００ＸＦで遠心することＫよシ澄明化した
。遠心後その培地はヒ）ｔ−ＰＡ分子のタンパク質分解
活性部分に対して誘導された抗体（スウエーデ／国［ａ
ｂｉｖｉｔｒｕｍ ＡＢ、 Ｂｒａｎｄｔ博士から贈ら
れたもの）を固定化させた（購買者に提供された方法）
ＣＮＢｒ−セファロース（スウェーデン国Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社）と共にインキュベートし大。パッチ方式によ
る吸着後に、ゲルは連続遠心によ）回収し、残存するゲ
ルをカラムに移し、０、０１ ％ Ｔｗｅｅｎ ２０お
よび０．２５ Ｍ ＫＳＣＮを含むリン酸緩衝溶液（Ｐ
ＢＳ）で洗った。溶出は３ＭＫＳＣＮを含むＰＢＳ−Ｔ
ｖｅｅｎ テ行ツタ。代表的す溶出パターンを表２に示
す： 表 ２ Ｂ＝表１と同じ。２ｍＶｉ完全なｔ−ＰＡ分子５００ｎ
ｆＫ等しいｔ＝ＰＡ含量に相当する。
。遠心後その培地はヒ）ｔ−ＰＡ分子のタンパク質分解
活性部分に対して誘導された抗体（スウエーデ／国［ａ
ｂｉｖｉｔｒｕｍ ＡＢ、 Ｂｒａｎｄｔ博士から贈ら
れたもの）を固定化させた（購買者に提供された方法）
ＣＮＢｒ−セファロース（スウェーデン国Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社）と共にインキュベートし大。パッチ方式によ
る吸着後に、ゲルは連続遠心によ）回収し、残存するゲ
ルをカラムに移し、０、０１ ％ Ｔｗｅｅｎ ２０お
よび０．２５ Ｍ ＫＳＣＮを含むリン酸緩衝溶液（Ｐ
ＢＳ）で洗った。溶出は３ＭＫＳＣＮを含むＰＢＳ−Ｔ
ｖｅｅｎ テ行ツタ。代表的す溶出パターンを表２に示
す： 表 ２ Ｂ＝表１と同じ。２ｍＶｉ完全なｔ−ＰＡ分子５００ｎ
ｆＫ等しいｔ＝ＰＡ含量に相当する。
２）細胞からの培地は１）のように調製した。
その後、この培地はＣＮＢｒ活性化セファロースに固定
化され＆ｇｐ１２０のＣＤ４ 結合ドメイン内の領域
に対する反応性のために選ばれ７ＩｃＨＩ’Ｖからの抗
体から成るカラムに吸着させ、その後１）のように処理
した。代表的な溶出プロフィールを以下に示す： 表 ３ Ａ；免疫吸着剤はバッチごとに吸着させ、洗浄し、カラ
ムに移し、さらに洗浄した後溶出した。
化され＆ｇｐ１２０のＣＤ４ 結合ドメイン内の領域
に対する反応性のために選ばれ７ＩｃＨＩ’Ｖからの抗
体から成るカラムに吸着させ、その後１）のように処理
した。代表的な溶出プロフィールを以下に示す： 表 ３ Ａ；免疫吸着剤はバッチごとに吸着させ、洗浄し、カラ
ムに移し、さらに洗浄した後溶出した。
両分は溶出緩衝液を加えた後の画分を示す。
装填物
通夛抜は画分
Ａ；表１および２と同じ、六だし装填物および通り抜は
画分はカラムへの融合タンパク質の完全な吸着を示して
いる。
画分はカラムへの融合タンパク質の完全な吸着を示して
いる。
Ｂり表１および２と同じ。
細胞はペプチド生産物に結合され六炭水化物を標識する
ために三重水素化（３Ｈ）グルコサミンおよびマンノー
スの存在下で培養した。ｔ−ＰＡ融合相手は可能なグリ
コシル化部位を欠いているので、炭水化物の存在を示す
信号は融合タンパク質のＨＩｖ部分から発せられる。こ
のような溶出からの代表的な結果を以下に示す： 表 ４ 両分に） 線維素溶解活性（功 グリコ
シル化（０Ａ＝表２と同じ。
ために三重水素化（３Ｈ）グルコサミンおよびマンノー
スの存在下で培養した。ｔ−ＰＡ融合相手は可能なグリ
コシル化部位を欠いているので、炭水化物の存在を示す
信号は融合タンパク質のＨＩｖ部分から発せられる。こ
のような溶出からの代表的な結果を以下に示す： 表 ４ 両分に） 線維素溶解活性（功 グリコ
シル化（０Ａ＝表２と同じ。
Ｂ−表１および２と同じ。
Ｃ＝線維素溶解活性について検定した試料の、取υ込ま
れたグルコサミンおよびマンノースからの放射能を測定
した。
れたグルコサミンおよびマンノースからの放射能を測定
した。
表２のように精製した物質は表１〜４のように調製し六
フィブリン上層によυ１２％ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル上で分析し、分子量を決定した。この方法はＧｒａ
ｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ａｎｄｌａｔｃｈ、 Ｊ
、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、、 １４８ 、２２３．１９７
８に示されている。上層に現れるゾーンは分子量に応じ
て決定された。代表的な実験を以下に示す。
フィブリン上層によυ１２％ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル上で分析し、分子量を決定した。この方法はＧｒａ
ｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ ａｎｄｌａｔｃｈ、 Ｊ
、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、、 １４８ 、２２３．１９７
８に示されている。上層に現れるゾーンは分子量に応じ
て決定された。代表的な実験を以下に示す。
表 ５
全ｔ−ＰＡ分子
Ａ＝全ｔ−ＰＡ分子およびｔ−ＰＡ／ｇｐ１２０融合タ
ンパク質のｔ−ＰＡ 部分からのｔ−ＰＡ変異タンパ
ク質は親切にもＫａｂｉＧｅｎＡＢのＧ、 Ｐｏｈｌ博
士から提供された。融合タンパク質は表２のようにして
調製した。
ンパク質のｔ−ＰＡ 部分からのｔ−ＰＡ変異タンパ
ク質は親切にもＫａｂｉＧｅｎＡＢのＧ、 Ｐｏｈｌ博
士から提供された。融合タンパク質は表２のようにして
調製した。
Ｂ＝キロダルトン。
従って、本発明者らは、生産されたタンパク質が２つの
物質、すなわちグリコシル化された全長タンパク質から
なるものおよびタンパク質分解活性ｔ−ＰＡ部分とＨＩ
Ｖ部分から誘導された仮定のフラグメントから成る２つ
の追加フラグメントから成ると結論づけることができた
。
物質、すなわちグリコシル化された全長タンパク質から
なるものおよびタンパク質分解活性ｔ−ＰＡ部分とＨＩ
Ｖ部分から誘導された仮定のフラグメントから成る２つ
の追加フラグメントから成ると結論づけることができた
。
しかしながら、このフラグメントは抗ＨＩＶ抗血清を用
いる免疫螢光法により検出できるであろう。
いる免疫螢光法により検出できるであろう。
実施例３
ｇｐ１２０とｇｐ４１の間の切断部位を欠く、ｇｐ１２
０のＣＤ４結合領域と修飾ｔ−ＰＡとの融合タンパク質
の構築 ｇｐ１２０のＣＤ４結合領域とｔ−ＰＡのクリングル２
幹よびプロテアーゼドメインを含む安定な融合タンパク
質を得るために、ｇｐ１２０とｇｐ４１の間の切断部位
は次の方法に従って除いた。
０のＣＤ４結合領域と修飾ｔ−ＰＡとの融合タンパク質
の構築 ｇｐ１２０のＣＤ４結合領域とｔ−ＰＡのクリングル２
幹よびプロテアーゼドメインを含む安定な融合タンパク
質を得るために、ｇｐ１２０とｇｐ４１の間の切断部位
は次の方法に従って除いた。
ｐＫＧＫ１００２中の唯一のＳｔｙＩ部位は、ｇｐ１２
０とｇｐ４１の間の切断部位の約１１アミノ酸下流でｇ
ｐ１２０をフードするＤＮＡを切断する。ｐＫＧＥ１０
０２中のｔ−ＰＡのクリングル２に先行するＳｔｙ Ｉ
部位とＢ＆ｍＨＩ部位の間にあるＤＮＡを除き、そこに
合成ＳｔｙＩ−ＢａｍＨＩリンカ−を導入することによ
り、プラスミドｐＫＧＥ１００６が作製され六。
０とｇｐ４１の間の切断部位の約１１アミノ酸下流でｇ
ｐ１２０をフードするＤＮＡを切断する。ｐＫＧＥ１０
０２中のｔ−ＰＡのクリングル２に先行するＳｔｙ Ｉ
部位とＢ＆ｍＨＩ部位の間にあるＤＮＡを除き、そこに
合成ＳｔｙＩ−ＢａｍＨＩリンカ−を導入することによ
り、プラスミドｐＫＧＥ１００６が作製され六。
５’ −ＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＧ−３’ ＳｔｙＩ
−ＢａｍＨＩ−リンカ−３’−ＣＧＴＴＴＣＣＣＴＡＧ
−５’ｐＫＧＥ１００６ では、切断部位をコードす
るＤＮＡ 配列（ｇｐ４１の最初の５個のアミノ酸およ
びｇｐ１２０の最後の９個のアミノ酸をコードするＤＮ
Ａ配列）が除かれ、こうしてｇｐ１２０とｇｐ４１の間
の２つの可能なトリプシン切断部位を欠く融合タンパク
質をコードする遺伝子セグメントが形成される。
−ＢａｍＨＩ−リンカ−３’−ＣＧＴＴＴＣＣＣＴＡＧ
−５’ｐＫＧＥ１００６ では、切断部位をコードす
るＤＮＡ 配列（ｇｐ４１の最初の５個のアミノ酸およ
びｇｐ１２０の最後の９個のアミノ酸をコードするＤＮ
Ａ配列）が除かれ、こうしてｇｐ１２０とｇｐ４１の間
の２つの可能なトリプシン切断部位を欠く融合タンパク
質をコードする遺伝子セグメントが形成される。
哺乳動物細胞での発現のために、この修飾融合タンバグ
質のコード領域の大部分を含むｐＫＧξ、Ｅｌｏ、０６
．の５ａｌｌ−ＡｐａＩフラグメントは、実施例１のよ
うにして、マウスＭＴ−１プロモーター、ＢＰＶゲノム
、ｐＭＬ２ｄおよびｔ−ＰＡの一部、並びにＳ Ｖ ４
０ カらの３′グロセツシングシグナルを含む２つの他
のフラグメントと連結させた。
質のコード領域の大部分を含むｐＫＧξ、Ｅｌｏ、０６
．の５ａｌｌ−ＡｐａＩフラグメントは、実施例１のよ
うにして、マウスＭＴ−１プロモーター、ＢＰＶゲノム
、ｐＭＬ２ｄおよびｔ−ＰＡの一部、並びにＳ Ｖ ４
０ カらの３′グロセツシングシグナルを含む２つの他
のフラグメントと連結させた。
これｔ−！ｔ−ＰＡのクリングル２およびプロテアーゼ
ドメインに融合されたＨＩＶｇｐ１２０のアミノ酸３４
３−５０２ をコードする遺伝子を含むプラスミドＰ
ＫＧＥ１００７（第１図参照）をもたらす。
ドメインに融合されたＨＩＶｇｐ１２０のアミノ酸３４
３−５０２ をコードする遺伝子を含むプラスミドＰ
ＫＧＥ１００７（第１図参照）をもたらす。
この融合物はｇｐ１２０のＣＤ４ 結合領域とｔ−Ｐ
Ａ領領域間の２つの可能なトリプシン切断部位を欠損し
ている。
Ａ領領域間の２つの可能なトリプシン切断部位を欠損し
ている。
実施例４
哺乳動物細胞での発現
プラスミドｐＫＧＥ１００７ はマウスＣ−１２７細
胞（ＡＴＣＣＣＲＬ １６１６）にトランスフェクシ
ョンした。
胞（ＡＴＣＣＣＲＬ １６１６）にトランスフェクシ
ョンした。
選択、増殖および培地の処理（その一部に精製を含む）
に関する技法は実施例２と同様であった。
に関する技法は実施例２と同様であった。
１つの追加実験が行われた。ＨＩＶのレセプターである
トラフ１フフ１２フ部分ＣＤ４は組換え技術によって製
造され（親切にも、ＫａｇｉＧｅｎＡ ＢのＰ、Ｌｌｎ
ｄおよびＭｏｎａ Ｓｙｄｏｗ両博士によシ提供された
）、ＣＤ４のＨＩＶｅｎマ結合部分と反応することが分
かつている固定化Ｔ４．２抗体を用いる免疫吸着カラム
で精製した（ Ｄａｌｇｌｅｉｇｈ ｅｔａｌ、、 Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１２．７６３．１９８４を参照）。精製
後ＣＤ４タンパク質１１ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析
し、４２キロダルトンに選択的なｇｐ１２０結合特性を
有する単一バンドを示す（ＫａｒｏＬｉｎ＠ｋａ研究所
、免疫学部の人、ＮｙｇｒｅｎおよびＭ。
トラフ１フフ１２フ部分ＣＤ４は組換え技術によって製
造され（親切にも、ＫａｇｉＧｅｎＡ ＢのＰ、Ｌｌｎ
ｄおよびＭｏｎａ Ｓｙｄｏｗ両博士によシ提供された
）、ＣＤ４のＨＩＶｅｎマ結合部分と反応することが分
かつている固定化Ｔ４．２抗体を用いる免疫吸着カラム
で精製した（ Ｄａｌｇｌｅｉｇｈ ｅｔａｌ、、 Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１２．７６３．１９８４を参照）。精製
後ＣＤ４タンパク質１１ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析
し、４２キロダルトンに選択的なｇｐ１２０結合特性を
有する単一バンドを示す（ＫａｒｏＬｉｎ＠ｋａ研究所
、免疫学部の人、ＮｙｇｒｅｎおよびＭ。
Ｊａｎｓａｏｎ両博士によって精製され、分析され、そ
して親切にも贈与されたタンパク質）。次の実験では、
ｔ−ＰＡ／ｇｐ１２０融合タ／バク質を産生ずる細胞か
らの上清を、固定化ＣＤ４を含むカラムに吸着させ、そ
の後実施例１の表２で用いた条件を使って溶出した。代
表的な結果を以下の表に示す。
して親切にも贈与されたタンパク質）。次の実験では、
ｔ−ＰＡ／ｇｐ１２０融合タ／バク質を産生ずる細胞か
らの上清を、固定化ＣＤ４を含むカラムに吸着させ、そ
の後実施例１の表２で用いた条件を使って溶出した。代
表的な結果を以下の表に示す。
表 １
非置換 Ｏ
抗ｔ−ＰＡ １５
Ａ＝タンパク質はＣＮＢｒ活ａ化セファロース（スウェ
ーデン国、Ｐｈａｒｔｎａｃｉａ社）に結合させ、製造
者が推せんする通夛に使用した。
ーデン国、Ｐｈａｒｔｎａｃｉａ社）に結合させ、製造
者が推せんする通夛に使用した。
Ｂ＝実施例１０表１と同じ。
寄託
微生物、組換えＤＮＡ分子 および本発明の２種類のｇ
ｐ１２０／１−ＰＡコード配列は１９８８年６月９日に
ドイツ国Ｄ−３３００Ｂｒａｕｎ８ｅｈｗｅｉｇ。
ｐ１２０／１−ＰＡコード配列は１９８８年６月９日に
ドイツ国Ｄ−３３００Ｂｒａｕｎ８ｅｈｗｅｉｇ。
ＭＩＬｒｓｅｈｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｉＢ 、 ” ］
）ｅｕｔｓｅｈｅＳａｍｍｌｕｎｇ ｗｏｎ Ｍｉｋｒ
ｏｏｒｇａｎＬａｒｎｅｎ’のカルチャーコレクション
に寄託され、 Ａ、：Ｆ、 ｃｏｌｔ ＤＨ５（ｐＫＧＥ１００３）寄
託番号：ＤＳＭ ４６６２ Ｂ：Ｅ、ｅｏｌｉ ＤＨ５（ＰＫＧＥ１００７）寄託
番号：ＤＳＭ ４６６３ として同定された。
）ｅｕｔｓｅｈｅＳａｍｍｌｕｎｇ ｗｏｎ Ｍｉｋｒ
ｏｏｒｇａｎＬａｒｎｅｎ’のカルチャーコレクション
に寄託され、 Ａ、：Ｆ、 ｃｏｌｔ ＤＨ５（ｐＫＧＥ１００３）寄
託番号：ＤＳＭ ４６６２ Ｂ：Ｅ、ｅｏｌｉ ＤＨ５（ＰＫＧＥ１００７）寄託
番号：ＤＳＭ ４６６３ として同定された。
文献
１、 Ｎａｖｉａ ｅｔ、 ａｌ
Ａｎｎ、 Ｎｅｕｒｏｌ、１９，５２５（１９８６）Ｚ
、 ＣｈＬｏｄｉ ｅｔ、ａｌ Ｊ、ｖｉｒｏｌ、６１，１２４４（１９８７）３、
Ｂａｒｒｅ−８ｉｎｏｕｍａｉ ｅｔ、ａｌＳｅｉｅ
ｎｃｅ ２２０，６６８（１９８３）４、Ｑａｌｌｏ
、Ｒ，Ｃ，５ｃｉｅｎｃｅ ２２４，５００（１９８
５）５− Ｗｏｎｇ−８ｔａｈｌ ｓｔ、ａｌＮａ
ｔｕｒｅ ３１７，３９５（１９８５）６、 ｐｍ
ｌｇｌｅｉｇｈ ｅｔ＠ａｌＮａｔｕｒｅ ３１２
，７６３（１９８４）７、 Ａｇｊｏ、 Ｂ、、ｅｔ
、ａｌＶｉｒｏｌｏｑｙ １５７，３５９（１９８７
）Ｂ、Ｉ、ｊｕｎｇｇｒｅｎ、に、、ｅｔ、ＰＬＪ、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、、１３９．２２６３（１９８７）９、Ｌ
ｕｎｄｉｎ、Ｋ。
、 ＣｈＬｏｄｉ ｅｔ、ａｌ Ｊ、ｖｉｒｏｌ、６１，１２４４（１９８７）３、
Ｂａｒｒｅ−８ｉｎｏｕｍａｉ ｅｔ、ａｌＳｅｉｅ
ｎｃｅ ２２０，６６８（１９８３）４、Ｑａｌｌｏ
、Ｒ，Ｃ，５ｃｉｅｎｃｅ ２２４，５００（１９８
５）５− Ｗｏｎｇ−８ｔａｈｌ ｓｔ、ａｌＮａ
ｔｕｒｅ ３１７，３９５（１９８５）６、 ｐｍ
ｌｇｌｅｉｇｈ ｅｔ＠ａｌＮａｔｕｒｅ ３１２
，７６３（１９８４）７、 Ａｇｊｏ、 Ｂ、、ｅｔ
、ａｌＶｉｒｏｌｏｑｙ １５７，３５９（１９８７
）Ｂ、Ｉ、ｊｕｎｇｇｒｅｎ、に、、ｅｔ、ＰＬＪ、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、、１３９．２２６３（１９８７）９、Ｌ
ｕｎｄｉｎ、Ｋ。
Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、９７．９３（１９８７）１０、
Ｌａ５ｋｅｙ ｅｔ、ａｌＣｅｌｌ ５０，９
７５（１９８７）１１、 Ｐｏｈｌ ＠ｔ、ａ１ １３ｉｏｅｈ＠ｍ、２３゜３７０１（１９８７）１２、
Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、Ｌ、Ａ、、ｅ ｔ 、ａＩ
Ａｎｎ、Ｒｅｖ、 工ｍｍｍｕｎｏ１．１，６０９
Ｌａ５ｋｅｙ ｅｔ、ａｌＣｅｌｌ ５０，９
７５（１９８７）１１、 Ｐｏｈｌ ＠ｔ、ａ１ １３ｉｏｅｈ＠ｍ、２３゜３７０１（１９８７）１２、
Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、Ｌ、Ａ、、ｅ ｔ 、ａＩ
Ａｎｎ、Ｒｅｖ、 工ｍｍｍｕｎｏ１．１，６０９
第１図はＳＶ４０後期プロモーターの転写制御下にある
ｇｐ１２０／１−ＰＡ融合タンパク質をコードする遺伝
子を含むプラスミドｐＫＧＥ １００３、およびｔ−Ｆ
Ａのクリングル２およびプロテアーゼドメインに融合さ
れたＨＩＶｇｐ１２０ のアミノ酸３４３−５０２を
コードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＧＥ１００７を
示す。
ｇｐ１２０／１−ＰＡ融合タンパク質をコードする遺伝
子を含むプラスミドｐＫＧＥ １００３、およびｔ−Ｆ
Ａのクリングル２およびプロテアーゼドメインに融合さ
れたＨＩＶｇｐ１２０ のアミノ酸３４３−５０２を
コードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＧＥ１００７を
示す。
Claims (22)
- （１）タンパク質加水分解作用を有するタンパク質フラ
グメントおよびＨＩＶに由来するＣＤ４結合性グリコシ
ル化フラグメントから成る融合タンパク質。 - （２）上記タンパク質フラグメントはｔ−ＰＡフラグメ
ントである、請求項１記載の融合タンパク質。 - （３）上記ｔ−ＰＡフラグメントはｔ−ＰＡ分子のクリ
ングル２およびタンパク質加水分解部分から成る、請求
項１または２記載の融合タンパク質。 - （４）ｔ−ＰＡフラグメントはグリコシル化されている
、請求項１、２または３記載の融合タンパク質。 - （５）ｔ−ＰＡフラグメントはグリコシル化されていな
い、請求項１、２または３記載の融合タンパク質。 - （６）上記ＣＤ４結合性フラグメントはＨＩＶ−エンベ
ロープに由来する、請求項１〜５のいずれか１項記載の
融合タンパク質。 - （７）上記フラグメントはＨＩＶ−ｇｐ１２０に由来す
る、請求項６記載の融合タンパク質。 - （８）請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質
をコードするＤＮＡ配列。 - （９）ｔ−ＰＡのシグナル配列を含む、請求項８記載の
ＤＮＡ配列。 - （１０）ｔ−ＰＡのリーダー配列をも含む、請求項８ま
たは９記載のＤＮＡ配列。 - （１１）請求項１または７記載の融合タンパク質に対し
て、もしくは該タンパク質のＣＤ４結合性フラグメント
に対して誘導された抗体。 - （１２）請求項８〜１０のいずれかに記載のＤＮＡ配列
を保有するプラスミドまたはベクター。 - （１３）請求項１２記載のプラスミドまたはベクターを
含む宿主細胞。 - （１４）真核細胞である、請求項１３記載の宿主細胞。
- （１５）哺乳動物細胞である、請求項１４記載の宿主細
胞。 - （１６）ＨＩＶ−エンベロープの一次配列から誘導され
るＣＤ４結合性フラグメント内の領域と反応するＨＩＶ
に対する抗体の試料中での存在を検出する方法であつて
、 ａ）上記試料を、タンパク質加水分解作用を有するｔ−
ＰＡフラグメントとＨＩＶ由来のＣＤ４結合性グリコシ
ル化フラグメントから成る融合タンパク質と接触させる
工程（この接触は上記試料の抗体と上記融合タンパク質
との相互作用をもたらす）； ｂ）上記相互作用から生ずる産物を、該産物のタンパク
質加水分解作用を用いて分析する工程；および ｃ）上記試料の抗体含量を評価する工程から成る上記方
法。 - （１７）溶解状態のＣＤ４または哺乳動物細胞の表面で
発現されたＣＤ４の存在を検出する方法であつて、 ａ）この種の細胞を含む試料を、タンパク質加水分解作
用を有するｔ−ＰＡフラグメントとＨＩＶ由来のＣＤ４
結合性グリコシル化フラグメントから成る融合タンパク
質と接触させる工程（この接触は上記細胞のＣＤ４と上
記融合タンパク質との相互作用をもたらす）； ｂ）上記相互作用から生ずる産物を、該産物のタンパク
質加水分解作用を用いて分析する工程；および ｃ）上記細胞のＣＤ４含量を評価する工程から成る上記
方法。 - （１８）上記ｔ−ＰＡフラグメントはｔ−ＰＡ分子のク
リングル２およびタンパク質加水分解部分から成る、請
求項１６または１７記載の方法。 - （１９）上記ＣＤ４結合性フラグメントはＨＩＶ−エン
ベロープに由来する、請求項１６、１７または１８記載
の方法。 - （２０）上記フラグメントはＨＩＶ−ｇｐ１２０に由来
する、請求項１９記載の方法。 - （２１）請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク
質を精製する方法であつて、 ａ）請求項１１記載の抗体を不溶性担体に固定化する工
程； ｂ）上記融合タンパク質を含む物質を該固定化抗体と接
触させて、それらの間に相互作用を生じさせる工程；お
よび ｃ）担体から融合タンパク質を溶出する工程から成る上
記方法。 - （２２）溶出はｐＨを下げることにより行われる、請求
項２１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8802176-1 | 1988-06-10 | ||
| SE8802176A SE8802176D0 (sv) | 1988-06-10 | 1988-06-10 | Fusion protein and its use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0272199A true JPH0272199A (ja) | 1990-03-12 |
Family
ID=20372584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1148169A Pending JPH0272199A (ja) | 1988-06-10 | 1989-06-09 | 融合タンパク質およびその用途 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0346316A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0272199A (ja) |
| SE (1) | SE8802176D0 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5225538A (en) * | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
| US6406697B1 (en) | 1989-02-23 | 2002-06-18 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| US5116964A (en) * | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| US5846946A (en) | 1996-06-14 | 1998-12-08 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Compositions and methods for administering Borrelia DNA |
| US7048929B1 (en) * | 1997-11-10 | 2006-05-23 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Stabilized primate lentivirus envelope glycoproteins |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0198015B2 (en) * | 1984-10-02 | 1995-07-19 | Biogen, Inc. | Production of streptavidin-like polypeptides |
| GB8525615D0 (en) * | 1985-10-17 | 1985-11-20 | Hoffmann La Roche | Polypeptides |
-
1988
- 1988-06-10 SE SE8802176A patent/SE8802176D0/xx unknown
-
1989
- 1989-06-08 EP EP19890850190 patent/EP0346316A3/en not_active Withdrawn
- 1989-06-09 JP JP1148169A patent/JPH0272199A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE8802176D0 (sv) | 1988-06-10 |
| EP0346316A3 (en) | 1991-07-17 |
| EP0346316A2 (en) | 1989-12-13 |
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