JPH0276824A - ヘモフイルス・インフルエンザｂ型の酸化された多糖体―外層膜蛋白質複合体ワクチン - Google Patents
ヘモフイルス・インフルエンザｂ型の酸化された多糖体―外層膜蛋白質複合体ワクチンInfo
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- JPH0276824A JPH0276824A JP1095439A JP9543989A JPH0276824A JP H0276824 A JPH0276824 A JP H0276824A JP 1095439 A JP1095439 A JP 1095439A JP 9543989 A JP9543989 A JP 9543989A JP H0276824 A JPH0276824 A JP H0276824A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
現在使用されているヘモフィルス・インフルエンザ（Ｉ
ｌｉｅｍｏｐｈｉｌｕｓ １ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型
の多糖体ワクチンは莢膜多糖体であるポリリボシル−リ
ビトール−フォスフェート（ＰＲＰ）から成り、１８ケ
月以上の幼児に免疫を与えるが、それよりも幼い幼児に
対してはヘモフィルス・インフルエンザｂ型ワクチンは
病気を惹起する危険が最も大きいために使用されていな
い。
ｌｉｅｍｏｐｈｉｌｕｓ １ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型
の多糖体ワクチンは莢膜多糖体であるポリリボシル−リ
ビトール−フォスフェート（ＰＲＰ）から成り、１８ケ
月以上の幼児に免疫を与えるが、それよりも幼い幼児に
対してはヘモフィルス・インフルエンザｂ型ワクチンは
病気を惹起する危険が最も大きいために使用されていな
い。
従来ＰＲＰが蛋白質坦体とカップリングしている多糖体
複合ワクチンをつくって免疫特性を変性し、多糖体の免
疫原性を増加させる試みがなされてきた。
複合ワクチンをつくって免疫特性を変性し、多糖体の免
疫原性を増加させる試みがなされてきた。
関連した研究には次のような文献がある。
（１）チ二一（Ｃｈｕ）等のｒヘモフィルス・インフル
エンザｂ型及び肺炎球菌６＾型多糖体−蛋白質複自体の
免疫原性に関する詳細な研究」と題する１ｎｆｅｅｔ、
Ｉ＋ａｍｕｎ、誌４０巻２４５〜２５６（１３８３）
所載の論文には、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型及
び肺炎球菌６＾型の各々と破傷風変性毒素との複合体を
複雑な工程でつくる方法が記載されている。この方法に
おいては多糖体を臭化シアノーゲンで活性化し、スペー
サー分子であるアジピン酸ジヒドラジド（＾Ｏ１ｌ”）
で誘導体をつくった陳、蛋白質（破傷風変性毒素）を水
溶性のカーポジイミドと複合化させ、蛋白質に対しアミ
ド型の結合及びアジピン酸のスペーサーから多糖体に至
る複雑な種々の結合をつくる。
エンザｂ型及び肺炎球菌６＾型多糖体−蛋白質複自体の
免疫原性に関する詳細な研究」と題する１ｎｆｅｅｔ、
Ｉ＋ａｍｕｎ、誌４０巻２４５〜２５６（１３８３）
所載の論文には、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型及
び肺炎球菌６＾型の各々と破傷風変性毒素との複合体を
複雑な工程でつくる方法が記載されている。この方法に
おいては多糖体を臭化シアノーゲンで活性化し、スペー
サー分子であるアジピン酸ジヒドラジド（＾Ｏ１ｌ”）
で誘導体をつくった陳、蛋白質（破傷風変性毒素）を水
溶性のカーポジイミドと複合化させ、蛋白質に対しアミ
ド型の結合及びアジピン酸のスペーサーから多糖体に至
る複雑な種々の結合をつくる。
（２）ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）等の米国特許
第４゜３５６．１７０号においては、抗原性バクテリア
の多糖体、特に大腸菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、β−溶血
連鎖球菌及びヘモフィルス・インフルエンザの多糖体の
末端基の中に抑制酸化によって反応性アルデヒド基を導
入し、このアルデヒド残基を蛋白質、特に破傷風変性毒
素及びジフテリア変性毒素、並びに免疫原性蛋白質、例
えばβ−溶血連鎖球菌、大腸菌、ヘモフィルス・インフ
ルエンザ、ｍＭ炎菌及び肺炎球菌の蛋白質の遊離アミノ
基と還元アミノ化により反応させて該多糖体と蛋白質と
を共有結合で結合させることが記載されている。
第４゜３５６．１７０号においては、抗原性バクテリア
の多糖体、特に大腸菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、β−溶血
連鎖球菌及びヘモフィルス・インフルエンザの多糖体の
末端基の中に抑制酸化によって反応性アルデヒド基を導
入し、このアルデヒド残基を蛋白質、特に破傷風変性毒
素及びジフテリア変性毒素、並びに免疫原性蛋白質、例
えばβ−溶血連鎖球菌、大腸菌、ヘモフィルス・インフ
ルエンザ、ｍＭ炎菌及び肺炎球菌の蛋白質の遊離アミノ
基と還元アミノ化により反応させて該多糖体と蛋白質と
を共有結合で結合させることが記載されている。
（３）アンダーマン（＾ｎｄｅｒｓｏｎ）の米国特許第
４．６７３．５７４号においては、肺炎球菌（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｅｏｃｃｕｓｕｐｎｅｕｍｏｎｉ＠ｅ）及びヘモ
フィルス・インフルエンザの莢膜の重合体から誘導され
た免疫原性をもつ莢膜多糖体断片の還元アミノ化生成物
から成り、過ヨー素酸塩による酸化開裂またはグリコシ
ド結合の加水分解のような方法でつくられた還元末端と
蛋白質坦体としてのバクテリア毒素または変性毒素を含
む免疫原性をもつ複合体の製造法が記載されている。
４．６７３．５７４号においては、肺炎球菌（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｅｏｃｃｕｓｕｐｎｅｕｍｏｎｉ＠ｅ）及びヘモ
フィルス・インフルエンザの莢膜の重合体から誘導され
た免疫原性をもつ莢膜多糖体断片の還元アミノ化生成物
から成り、過ヨー素酸塩による酸化開裂またはグリコシ
ド結合の加水分解のような方法でつくられた還元末端と
蛋白質坦体としてのバクテリア毒素または変性毒素を含
む免疫原性をもつ複合体の製造法が記載されている。
（４）ヒルマン（Ｈｉｌｌｍａｎ）等の米国特許第４，
４５９゜２８６号においては、ヘモフィルス・インフル
エンザｂ型多糖体を臭化シアノーゲンで活性化し、スペ
ーサー分子である６−アミノカプロン酸で活性化した多
糖体の誘導体をつくり、ネイセリア・メニンギテイデイ
ス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉＬｉｄｉｓ）
の主外層膜蛋白質を水溶性のカーポジイミドと複合させ
、蛋白質に対するアミド型の結合と６−アミノカプロン
酸のスペーサーから多糖体に至る複雑な種々の結合とを
つくる方法が記載されている。
４５９゜２８６号においては、ヘモフィルス・インフル
エンザｂ型多糖体を臭化シアノーゲンで活性化し、スペ
ーサー分子である６−アミノカプロン酸で活性化した多
糖体の誘導体をつくり、ネイセリア・メニンギテイデイ
ス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉＬｉｄｉｓ）
の主外層膜蛋白質を水溶性のカーポジイミドと複合させ
、蛋白質に対するアミド型の結合と６−アミノカプロン
酸のスペーサーから多糖体に至る複雑な種々の結合とを
つくる方法が記載されている。
（５） ゴートン（Ｇｏｒｄｏｎ）の米国特許第４，４
９６，５３８号においては、純粋なヘモフィルス・イン
フルエンザｂ型多糖体を臭化シアノーゲンで活性化し。
９６，５３８号においては、純粋なヘモフィルス・イン
フルエンザｂ型多糖体を臭化シアノーゲンで活性化し。
前辺って＾０１１スペーサーで誘導体をつくったジフテ
リア変性毒素と緊密に混合することにより水に可溶な共
有結合性の多糖体−ジフテリア変性毒素複合体の製造法
が記載されている。
リア変性毒素と緊密に混合することにより水に可溶な共
有結合性の多糖体−ジフテリア変性毒素複合体の製造法
が記載されている。
（６）マンソン（Ｎｕｎａｏｎ）等の「ヘモフィルス・
インフルエンザｂ型分離物から得られる外層膜蛋白質Ｐ
２の生成と比較」と題するＪ、 Ｃｌｉ、 Ｉｎｖｅｓ
ｔ、誌７２巻６７７〜６８４頁（１３８３）所載の論文
には、分子量が３７，０００ダルトンのヘモフィルス・
インフルエンザｂ型から得られるＰ２と名付けられた主
外層膜蛋白質の精製法が記載されている。この主外層膜
蛋白質は免疫原性をもち、Ｐ２に対する抗体は若い動物
に受動免疫を与える。
インフルエンザｂ型分離物から得られる外層膜蛋白質Ｐ
２の生成と比較」と題するＪ、 Ｃｌｉ、 Ｉｎｖｅｓ
ｔ、誌７２巻６７７〜６８４頁（１３８３）所載の論文
には、分子量が３７，０００ダルトンのヘモフィルス・
インフルエンザｂ型から得られるＰ２と名付けられた主
外層膜蛋白質の精製法が記載されている。この主外層膜
蛋白質は免疫原性をもち、Ｐ２に対する抗体は若い動物
に受動免疫を与える。
（７）ウアチョン（Ｖａｃｈｏｎ）等の「＾、モフィル
ス・インフルエンザｂ型の外層膜を横切る膜透過通路」
と題するＪ、 Ｂａａｔｅｒｉｏｌ、誌１６２巻９１８
〜９２４頁（１３８５）においては、ヘモフィルス・イ
ンフルエンザｂ型の外層膜から分子量４０，０００ダル
トン（４０Ｋ）の主蛋白質を分離する方法が記載されて
いる。４０にの蛋白質は低分子鰻の溶質を通過させる水
が満たされた通路を形成することにより、再構成された
小胞中でボーリンとして作用する。
ス・インフルエンザｂ型の外層膜を横切る膜透過通路」
と題するＪ、 Ｂａａｔｅｒｉｏｌ、誌１６２巻９１８
〜９２４頁（１３８５）においては、ヘモフィルス・イ
ンフルエンザｂ型の外層膜から分子量４０，０００ダル
トン（４０Ｋ）の主蛋白質を分離する方法が記載されて
いる。４０にの蛋白質は低分子鰻の溶質を通過させる水
が満たされた通路を形成することにより、再構成された
小胞中でボーリンとして作用する。
本発明はヘモフィルス・インフルエンザｂ型の莢膜多糖
体（ＰＲＰ）と主外層膜蛋白質との酸化型の免疫原性を
もった複合体の製造法、及びヘモフィルス・インフルエ
ンザｂ型による病気を予防するためにこの複合体をワク
チンとして使用する方法に関する。これを要約すれば、
本発明は分子量が３８．０００〜４０，０００ダルトン
のヘモフィルス・インフルエンザｂ型外層膜蛋白質とヘ
モフィルス・インフルエンザｂ型の酸化されたポリリボ
シル−リビトール−フォスフェート断片との免疫原性を
もった複合体に関する。また本発明は該複合体を含むワ
クチンをヘモフィルス・インフルエンザｂ型に起因する
病気に対する免疫を賦与するのに使用する方法に関する
。さらに本発明は分子Ｍ３８，０００〜４０．０００ダ
ルトンの該外Ａ！膜蛋白質の分離及び精製法、並びに酸
化されたポリリボシル−リビトール−フォスフェート断
片の製造法に関する。
体（ＰＲＰ）と主外層膜蛋白質との酸化型の免疫原性を
もった複合体の製造法、及びヘモフィルス・インフルエ
ンザｂ型による病気を予防するためにこの複合体をワク
チンとして使用する方法に関する。これを要約すれば、
本発明は分子量が３８．０００〜４０，０００ダルトン
のヘモフィルス・インフルエンザｂ型外層膜蛋白質とヘ
モフィルス・インフルエンザｂ型の酸化されたポリリボ
シル−リビトール−フォスフェート断片との免疫原性を
もった複合体に関する。また本発明は該複合体を含むワ
クチンをヘモフィルス・インフルエンザｂ型に起因する
病気に対する免疫を賦与するのに使用する方法に関する
。さらに本発明は分子Ｍ３８，０００〜４０．０００ダ
ルトンの該外Ａ！膜蛋白質の分離及び精製法、並びに酸
化されたポリリボシル−リビトール−フォスフェート断
片の製造法に関する。
本発明のＭ／ｌの態様の中には、分子量が３８，０００
（３８Ｋ）または４０，０００（４０Ｋ）のへモフイル
ス・インフルエンザｂ型の事件Ｎ膜蛋白質（Ｐ２蛋白質
）を陰イオン交換及びヒドロキシルアパタイト・カラム
クロマトグラフ法により分離及び精製する方法が含まれ
る。これらの３８Ｋ及び４０に蛋白質のアミノ酸組成、
末端アミノ酸配列及び免疫原作反応性は確定している。
（３８Ｋ）または４０，０００（４０Ｋ）のへモフイル
ス・インフルエンザｂ型の事件Ｎ膜蛋白質（Ｐ２蛋白質
）を陰イオン交換及びヒドロキシルアパタイト・カラム
クロマトグラフ法により分離及び精製する方法が含まれ
る。これらの３８Ｋ及び４０に蛋白質のアミノ酸組成、
末端アミノ酸配列及び免疫原作反応性は確定している。
本発明の他の態様においては、過ヨー素酸塩を使用する
酸化開裂により莢膜多糖体の反応性断片をつくるために
酸化された莢膜多糖体ＲＰＲ（［０］ＰＲＰ）をつくる
方法が提供される。
酸化開裂により莢膜多糖体の反応性断片をつくるために
酸化された莢膜多糖体ＲＰＲ（［０］ＰＲＰ）をつくる
方法が提供される。
本発明のさらに他の態様においては、該多糖体（［０］
ＰＲＰ）断片を蛋白質坦体く３８Ｋまたは４０に蛋白質
）と共有結合的にカップリングさせる方法が提供される
。
ＰＲＰ）断片を蛋白質坦体く３８Ｋまたは４０に蛋白質
）と共有結合的にカップリングさせる方法が提供される
。
本発明においてはさらに上記複合体をワクチン中で使用
する方法が提供される。
する方法が提供される。
本発明の複合体ワクチンは動物モデルにおいて高度の免
疫原性をもっている６本発明の複合体ワクチンは従来報
告されたものに比べＰＲＰに対する抗体反応性が実質的
に高い、該複合体ワクチンはまたヘモフィルス・インフ
ルエンザｂ盟主蛋白質（３８Ｋまたは４０に蛋白Ｎ）に
対する抗体を誘起する。
疫原性をもっている６本発明の複合体ワクチンは従来報
告されたものに比べＰＲＰに対する抗体反応性が実質的
に高い、該複合体ワクチンはまたヘモフィルス・インフ
ルエンザｂ盟主蛋白質（３８Ｋまたは４０に蛋白Ｎ）に
対する抗体を誘起する。
本発明によりつくられた免疫原性をもつ複合体は、蛋白
質坦体がヘモフィルス・インフルエンザｂ型外層１摸蛋
白質から誘導されるという点において従来得られた複合
体に比べ明確な利点をもっている。本発明の複合体ワク
チンはＰＲＰ及びヘモフィルス・インフルエンザｂ型の
外層膜蛋白質の両方に対し抗体を生成し、ヘモフィルス
・インフルエンザｂ型の侵入による病気に対し免疫を賦
与する。１８ケ月よりも若い幼児に対する免疫を賦与す
るワクチンが得られる他に、坦体蛋白質自身も免疫を与
え、［０］ＰＲＰに対する坦体としての作用だけにとど
まらない、下記に説明するように抗体を誘起する坦体蛋
白質は［０］円（Ｐと同じ動物モデルで抗体反応を示す
、最後に本発明の複合体ワクチンはヘモフィルス・イン
フルエンザｂ型バクテリアを使用していないから、この
ワクチンを投与してもヘモフィルス・インフルエンザｂ
型による病気を発症することはない。
質坦体がヘモフィルス・インフルエンザｂ型外層１摸蛋
白質から誘導されるという点において従来得られた複合
体に比べ明確な利点をもっている。本発明の複合体ワク
チンはＰＲＰ及びヘモフィルス・インフルエンザｂ型の
外層膜蛋白質の両方に対し抗体を生成し、ヘモフィルス
・インフルエンザｂ型の侵入による病気に対し免疫を賦
与する。１８ケ月よりも若い幼児に対する免疫を賦与す
るワクチンが得られる他に、坦体蛋白質自身も免疫を与
え、［０］ＰＲＰに対する坦体としての作用だけにとど
まらない、下記に説明するように抗体を誘起する坦体蛋
白質は［０］円（Ｐと同じ動物モデルで抗体反応を示す
、最後に本発明の複合体ワクチンはヘモフィルス・イン
フルエンザｂ型バクテリアを使用していないから、この
ワクチンを投与してもヘモフィルス・インフルエンザｂ
型による病気を発症することはない。
本発明に使用する蛋白質はへモフイルス・インフルエン
ザｂ型の外層膜蛋白質であり、その分子量はこれをつく
るのに使用したヘモフィルス・インフルエンザｂ型株に
依存する。特にこの蛋白質は上記マンソン等及びヴアチ
ョン等の文献記載の方法を使用しドデシル硫酸ナトリウ
ム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法（ＳＯＳ−Ｐ
ＡＧＥ）によって決定された分子量が３８Ｋまたは４０
にの主外層膜蛋白質である。
ザｂ型の外層膜蛋白質であり、その分子量はこれをつく
るのに使用したヘモフィルス・インフルエンザｂ型株に
依存する。特にこの蛋白質は上記マンソン等及びヴアチ
ョン等の文献記載の方法を使用しドデシル硫酸ナトリウ
ム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法（ＳＯＳ−Ｐ
ＡＧＥ）によって決定された分子量が３８Ｋまたは４０
にの主外層膜蛋白質である。
３８にの蛋白質はヘモフィルス・インフルエンザｂ型の
レダール（Ｌｅｄｅｒｌｅ）−にと名付けられた株によ
ってつくられる。この株は米国メリーランド州ロツクヴ
イル（Ｒｏｅｋｖｉ ｌ ｌｅ）のアメリカン・タイプ
・力！レチャー１コレクション（＾ａ＋ｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕ１Ｌｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に
＾ＴＣＣアクセス番号５３，７６３として保存されてい
る。４０にの蛋白質はヘモフィルス・インフルエンザｂ
型のレダールＣＫと名付けられな株によってつくられる
。この株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンに＾ＴＣＣアクセス番号３１，４４１として保存さ
れている。
レダール（Ｌｅｄｅｒｌｅ）−にと名付けられた株によ
ってつくられる。この株は米国メリーランド州ロツクヴ
イル（Ｒｏｅｋｖｉ ｌ ｌｅ）のアメリカン・タイプ
・力！レチャー１コレクション（＾ａ＋ｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕ１Ｌｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に
＾ＴＣＣアクセス番号５３，７６３として保存されてい
る。４０にの蛋白質はヘモフィルス・インフルエンザｂ
型のレダールＣＫと名付けられな株によってつくられる
。この株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンに＾ＴＣＣアクセス番号３１，４４１として保存さ
れている。
３８Ｋ及び４０にの主外層膜蛋白質はヘモフィルス・イ
ンフルエンザｂ型から分離された６種の主外層膜蛋白質
の一部である。３８Ｋ及び４０に蛋白質は５Ｏ３−ＰＡ
ＧＥを行う際に分離して生じるバンドによりＰ２または
ｂ／ｃと名付けられてきた。レープ（Ｌｏｅｂ）等の［
ヘモフィルス・インフルエンザｂ型の外層膜抗原の表面
に露出されたエビ］・−プの交叉反応性」と題するＩｎ
ｆｅｃｔ、 Ｉｍ＋ｓｕｎ、誌５５巻２９７７〜２３８
３頁（１３８７）の論文参照、１１（ｌＩ定される分子
量は分析を行うのに使用した方法により僅かに変化する
。
ンフルエンザｂ型から分離された６種の主外層膜蛋白質
の一部である。３８Ｋ及び４０に蛋白質は５Ｏ３−ＰＡ
ＧＥを行う際に分離して生じるバンドによりＰ２または
ｂ／ｃと名付けられてきた。レープ（Ｌｏｅｂ）等の［
ヘモフィルス・インフルエンザｂ型の外層膜抗原の表面
に露出されたエビ］・−プの交叉反応性」と題するＩｎ
ｆｅｃｔ、 Ｉｍ＋ｓｕｎ、誌５５巻２９７７〜２３８
３頁（１３８７）の論文参照、１１（ｌＩ定される分子
量は分析を行うのに使用した方法により僅かに変化する
。
−具体化側番こおいては、３８Ｋ及び４０にダルトンの
外層膜蛋白質の分離及び精製には、ブレイク（Ｂｌａｋ
ｅ）及びゴッチュリッチ（にｏｔｓｃｂｌ １ｃｈ）の
「ネイセリア°ゴノルポエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇ
ｏｎｏｒｒｂｏｅａ）の主外層膜蛋白質の精製と部分的
キャラクタリゼーシラン」と題するＩｎｆｅｃｔ、 Ｉ
ｓ＋５ｕｎｏ１．誌３６巻２７７〜２８３頁（１３８２
）、並びにバチョン等の上記論文記載の改良された方法
を使用する。
外層膜蛋白質の分離及び精製には、ブレイク（Ｂｌａｋ
ｅ）及びゴッチュリッチ（にｏｔｓｃｂｌ １ｃｈ）の
「ネイセリア°ゴノルポエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇ
ｏｎｏｒｒｂｏｅａ）の主外層膜蛋白質の精製と部分的
キャラクタリゼーシラン」と題するＩｎｆｅｃｔ、 Ｉ
ｓ＋５ｕｎｏ１．誌３６巻２７７〜２８３頁（１３８２
）、並びにバチョン等の上記論文記載の改良された方法
を使用する。
０．０１％のチメロサールで不活性化したヘモフィルス
・インフルエンザｂ型２０ｇ（湿潤基準）を９容の蒸留
水中に懸濁させる。このバクテリア懸濁物を臭化ヘキサ
デシルトリメチルアンモニウムを用い最終的に２％（ｗ
／Ｖ）の濃度にし、３７℃で１時間激しく振盪する。４
℃で３０分間１７，０００ｘにで遠心分離した後、ペレ
ットを取り出し再び８容の蒸留水に懸濁させ、塩化カル
シウムを加えて最終濃度を０ 、２５８にする。この溶
液を１時間室温で撹拌し、エタノールで最終濃度を２０
％（ｖ／ｖ）にする。
・インフルエンザｂ型２０ｇ（湿潤基準）を９容の蒸留
水中に懸濁させる。このバクテリア懸濁物を臭化ヘキサ
デシルトリメチルアンモニウムを用い最終的に２％（ｗ
／Ｖ）の濃度にし、３７℃で１時間激しく振盪する。４
℃で３０分間１７，０００ｘにで遠心分離した後、ペレ
ットを取り出し再び８容の蒸留水に懸濁させ、塩化カル
シウムを加えて最終濃度を０ 、２５８にする。この溶
液を１時間室温で撹拌し、エタノールで最終濃度を２０
％（ｖ／ｖ）にする。
この調合物を４℃で３時間放置して沈澱させる。
次に沈澱を遠心分離により除去した後、エタノールを加
えて最終濃度を８０％にして上澄液中の蛋白質を沈澱さ
せる。主外層膜蛋白質を含む材料は４℃で３０分間１７
，０ＯＯｘＧで遠心分離を行って回収し、０．０１％の
チメロサール及び０．１％のオクチル−β−〇−グルコ
ピラノシドを含む２５５Ｍイミダゾール緩衝液（ａｌｌ
７．０）を用いて抽出し、可溶性の不純物であるＰＲ
Ｐ及び核酸を除去する。この主外層膜蛋白質含有材料を
遠心分離により回収し、次いで２％のオクチル−β−Ｄ
−グルコピラノシドを含む２５ｄイミダゾール＆！街液
（ｐＨ７，０）中で室温において１時間可溶化する。遠
心分離により不溶な蛋白質を除去する。主外層膜蛋白質
（３８Ｋ及び４０Ｋ）を含む上澄液を、ＤＥＡＥ−セフ
ァセル（Ｓｅｐｈａｅｅｌ） ［米国ニューシャーシー
州、ビ、スカタウエイ（Ｐｉｓｅａｔａｗａｙ）のファ
ルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製］ Ｉ Ｘ６Ｇｃ
ｍ陰イオン交換カラムに通し不純物のリボ多糖体を除去
する。
えて最終濃度を８０％にして上澄液中の蛋白質を沈澱さ
せる。主外層膜蛋白質を含む材料は４℃で３０分間１７
，０ＯＯｘＧで遠心分離を行って回収し、０．０１％の
チメロサール及び０．１％のオクチル−β−〇−グルコ
ピラノシドを含む２５５Ｍイミダゾール緩衝液（ａｌｌ
７．０）を用いて抽出し、可溶性の不純物であるＰＲ
Ｐ及び核酸を除去する。この主外層膜蛋白質含有材料を
遠心分離により回収し、次いで２％のオクチル−β−Ｄ
−グルコピラノシドを含む２５ｄイミダゾール＆！街液
（ｐＨ７，０）中で室温において１時間可溶化する。遠
心分離により不溶な蛋白質を除去する。主外層膜蛋白質
（３８Ｋ及び４０Ｋ）を含む上澄液を、ＤＥＡＥ−セフ
ァセル（Ｓｅｐｈａｅｅｌ） ［米国ニューシャーシー
州、ビ、スカタウエイ（Ｐｉｓｅａｔａｗａｙ）のファ
ルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製］ Ｉ Ｘ６Ｇｃ
ｍ陰イオン交換カラムに通し不純物のリボ多糖体を除去
する。
分画部分中の蛋白質の存在はロウ９−（Ｌｏｗｒｙ）蛋
白質試験法を用いて試験する０分画部分の１００μｍの
試料を使用した。各試料に対し、０．５％Ｃｕ５Ｏ，−
５１１２０（１４／Ｖ）水溶液１部を２％Ｎａ２ＣＯａ
（ｖ／’ ｖ）、０．０２％酒石酸ナトリウムカリウ
ム（ｗ／ｖ）及び０．４％ＮａＯｆｌ（ｗ／ ｖ）の水
溶液５０部と混合してつくった溶液１ ｍｌを加える。
白質試験法を用いて試験する０分画部分の１００μｍの
試料を使用した。各試料に対し、０．５％Ｃｕ５Ｏ，−
５１１２０（１４／Ｖ）水溶液１部を２％Ｎａ２ＣＯａ
（ｖ／’ ｖ）、０．０２％酒石酸ナトリウムカリウ
ム（ｗ／ｖ）及び０．４％ＮａＯｆｌ（ｗ／ ｖ）の水
溶液５０部と混合してつくった溶液１ ｍｌを加える。
１５分ｔＩｉＩＮのフェノール試薬１００μＩ加える０
周囲温度で２０分間培養した後ジルフォード（Ｇｉｌｆ
ｏｒｄ）の２６０紫外可視分光光度計を使用して７５０
ｎ−における試料の吸光度を測定する。
周囲温度で２０分間培養した後ジルフォード（Ｇｉｌｆ
ｏｒｄ）の２６０紫外可視分光光度計を使用して７５０
ｎ−における試料の吸光度を測定する。
蛋白質の濃度はウシの血清アルブミンの標準蛋白質溶液
と比較して決定した。オクチル−β−Ｄ−グルコピラノ
シドを含む試料に対してはＢＣ＾蛋白質試験機［米国イ
リノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）のピアー
ス・ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅ＋１ｉｅａｌ）社
製］を使用して測定した。
と比較して決定した。オクチル−β−Ｄ−グルコピラノ
シドを含む試料に対してはＢＣ＾蛋白質試験機［米国イ
リノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）のピアー
ス・ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅ＋１ｉｅａｌ）社
製］を使用して測定した。
ｐＨ７，０のイミダゾール緩衝液を用いたカラムから約
３８Ｋまたは４０に蛋白質の約５０％が流出した。
３８Ｋまたは４０に蛋白質の約５０％が流出した。
３８Ｋまたは４０に蛋白質の残りの５０％（約２０ｍｇ
）は０．５Ｈの塩化カリウムを用いて流出させカラム
から回収した。第１図は３８Ｋ及び４０に蛋白質に対応
する５ＯＳ−ＰＡＧＥバンドを既知分子量をもつ標準の
バンドと比較したものである。
）は０．５Ｈの塩化カリウムを用いて流出させカラム
から回収した。第１図は３８Ｋ及び４０に蛋白質に対応
する５ＯＳ−ＰＡＧＥバンドを既知分子量をもつ標準の
バンドと比較したものである。
上記方法で精製した４０に蛋白質は下記実施例１〜５及
び７で使用される。
び７で使用される。
改善された具体化例においては、オクチル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシドを含む燐酸ナトリウムｗｔ澄液を用いて
可溶化し、次いでヒドロキシアパタイト（１１＾）カラ
ム・クロマトグラフ法を用いることにより４０に蛋白質
を精製した。カラム・クロマトグラフによる精製の前に
上記方法を用いて部分的に精製した４０に蛋白質の試料
はリポ多糖体（ＬＰＳ）及びＰＲＰのような不純物を含
んでいた。
ルコピラノシドを含む燐酸ナトリウムｗｔ澄液を用いて
可溶化し、次いでヒドロキシアパタイト（１１＾）カラ
ム・クロマトグラフ法を用いることにより４０に蛋白質
を精製した。カラム・クロマトグラフによる精製の前に
上記方法を用いて部分的に精製した４０に蛋白質の試料
はリポ多糖体（ＬＰＳ）及びＰＲＰのような不純物を含
んでいた。
詳細に説明すると、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型
（ＣＫ株）から得られる部分的に精製された４０に蛋白
質を先ずエタノール（最終エタノール濃度６６％）２容
を用い０〜４℃において少なくとも１０分間沈澱させる
。この試料を２３，０ＯＯＸ（：で１５分間遠心分離す
る。ペレット中において実質的にすべての４０に蛋白質
（〉９０％）が回収された０次にこのペレットを蛋白質
８ｍｇ／ｍｌにおいて２％のオクチル−β−トグルコピ
ラノシドを含む燐酸ナトリウム＊＊液（ｐＨｅ、ｓ）の
５０−Ｎまたは２００ ｍＮ緩衝溶液に溶解させる。こ
の混合物を室温で１時間撹拌し、不溶性物質を遠心分離
により除去する。
（ＣＫ株）から得られる部分的に精製された４０に蛋白
質を先ずエタノール（最終エタノール濃度６６％）２容
を用い０〜４℃において少なくとも１０分間沈澱させる
。この試料を２３，０ＯＯＸ（：で１５分間遠心分離す
る。ペレット中において実質的にすべての４０に蛋白質
（〉９０％）が回収された０次にこのペレットを蛋白質
８ｍｇ／ｍｌにおいて２％のオクチル−β−トグルコピ
ラノシドを含む燐酸ナトリウム＊＊液（ｐＨｅ、ｓ）の
５０−Ｎまたは２００ ｍＮ緩衝溶液に溶解させる。こ
の混合物を室温で１時間撹拌し、不溶性物質を遠心分離
により除去する。
バイオ・ゲル（Ｂｉｏ−（：ｅｌ） ＩＩ＾カラＡ ［
米［１１カリフオルニア州リツチモンド（旧ｃ１ｕａａ
ｎｄ）のバイオ・ラット・ラボラトリ−〈旧ｏ−Ｒａｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）％ｇＪ ］を用いｐＨ６，５
において１１＾クロマトグラフ法を行った。
米［１１カリフオルニア州リツチモンド（旧ｃ１ｕａａ
ｎｄ）のバイオ・ラット・ラボラトリ−〈旧ｏ−Ｒａｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）％ｇＪ ］を用いｐＨ６，５
において１１＾クロマトグラフ法を行った。
１（へカラムは吸着部位を生じるカルシウム及び燐酸イ
オンを含んでいる。５０ｍＭの燐酸ナトリウム６１１液
（ｐＨ６，５）及び２％オクチル−β−Ｄ−グルコピラ
ノシドを用いゲル（４０ｍ ｌ ）を予備処理し、少な
くとも２容の緩衝液と平衡化させる０次いで１０ｍ ｌ
（８０＋＊ｇ）の３８Ｋまたは４０に蛋白質をＨ＾カ
ラム（３Ｘ８ｃｍ）にかける、２％のオクチル−β−Ｄ
−グルコピラノシドを含む燐酸ナトリウムの５０１１Ｉ
ＭからＩＭへ直線勾配をつけた緩衝液（ｐＨ６，５）１
００ ｍｌを用いて試料を流出させる。カラム流出物を
約１０ｍ１／′時間の流速で管１本当り２鏑１の分画部
分として集める。各分画部分をピアースＢＣ＾蛋白質試
験機により５６２ ｎｓの吸光度を用い蛋白質含量を測
定した。４０に蛋白質を含む分画部分を一緒にし、とア
ースＢＣ＾蛋白質試験機及び５ＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋
白質濃度及び純度の分析を行った。精製した調合物中の
ＬＳＰ及びＰＲＩ’含量も決定した。
オンを含んでいる。５０ｍＭの燐酸ナトリウム６１１液
（ｐＨ６，５）及び２％オクチル−β−Ｄ−グルコピラ
ノシドを用いゲル（４０ｍ ｌ ）を予備処理し、少な
くとも２容の緩衝液と平衡化させる０次いで１０ｍ ｌ
（８０＋＊ｇ）の３８Ｋまたは４０に蛋白質をＨ＾カ
ラム（３Ｘ８ｃｍ）にかける、２％のオクチル−β−Ｄ
−グルコピラノシドを含む燐酸ナトリウムの５０１１Ｉ
ＭからＩＭへ直線勾配をつけた緩衝液（ｐＨ６，５）１
００ ｍｌを用いて試料を流出させる。カラム流出物を
約１０ｍ１／′時間の流速で管１本当り２鏑１の分画部
分として集める。各分画部分をピアースＢＣ＾蛋白質試
験機により５６２ ｎｓの吸光度を用い蛋白質含量を測
定した。４０に蛋白質を含む分画部分を一緒にし、とア
ースＢＣ＾蛋白質試験機及び５ＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋
白質濃度及び純度の分析を行った。精製した調合物中の
ＬＳＰ及びＰＲＩ’含量も決定した。
約０．４５〜０．５Ｈの燐酸塩濃度を用い２個のピーク
として４０に蛋白質をカラムから流出させた（第２図参
照）。流出した蛋白質は５Ｏ５−ＰＡＧＥによりほとん
ど均一であり、不純物のＬＰＳ及びＩ）ＲＰを実質的に
含んでいなように見える。両方のピークから得られる蛋
白質は同様なＮ−末端配列をもっている。
として４０に蛋白質をカラムから流出させた（第２図参
照）。流出した蛋白質は５Ｏ５−ＰＡＧＥによりほとん
ど均一であり、不純物のＬＰＳ及びＩ）ＲＰを実質的に
含んでいなように見える。両方のピークから得られる蛋
白質は同様なＮ−末端配列をもっている。
またＩＩ八シカラム上おいて階段的な燐酸塩勾配を用い
ＩＩ八へロマトグラフ法により３８Ｋ及び４０に蛋白質
を精製した。ヘモフィルス・インフルエンザｂ型（Ｃに
株）から得られた部分的に精製された４０に蛋白質を１
１八カラムにかけ、先ず１．５容の０．２Ｍの燐酸塩緩
衝液＜ｐＨ６，５）及び２％オクチル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシドを用いて流出させ、次いで１．ＯＭの燐酸塩
緩衝液（ｐＨ８，５）及び２％オクチル−β−Ｄ−グル
コピラノシドを用いて流出させた。この方法を用い燐酸
塩濃度的０．５〜０．７Ｍにおいて１個のピークとして
大部分の４０に蛋白質を流出させたく第３図参照）。
ＩＩ八へロマトグラフ法により３８Ｋ及び４０に蛋白質
を精製した。ヘモフィルス・インフルエンザｂ型（Ｃに
株）から得られた部分的に精製された４０に蛋白質を１
１八カラムにかけ、先ず１．５容の０．２Ｍの燐酸塩緩
衝液＜ｐＨ６，５）及び２％オクチル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシドを用いて流出させ、次いで１．ＯＭの燐酸塩
緩衝液（ｐＨ８，５）及び２％オクチル−β−Ｄ−グル
コピラノシドを用いて流出させた。この方法を用い燐酸
塩濃度的０．５〜０．７Ｍにおいて１個のピークとして
大部分の４０に蛋白質を流出させたく第３図参照）。
また階段的燐酸塩勾配法を用いヘモフィルス・インフル
エンザｂ型（ＷＫ株）から得られる部分的に精製した３
８に蛋白質を精製した。燐酸塩濃度的０．５〜０．７Ｍ
においてｌｌ１８１のピークとして大部分の３８に蛋白
質を流出させたく第４図参照）。
エンザｂ型（ＷＫ株）から得られる部分的に精製した３
８に蛋白質を精製した。燐酸塩濃度的０．５〜０．７Ｍ
においてｌｌ１８１のピークとして大部分の３８に蛋白
質を流出させたく第４図参照）。
低燐酸塩濃度（２００ｍＭ＞においてＩＩ Ｉ（１１を
用い少量の３８Ｋまたは４０に蛋白質を一緒に流出させ
たく第３図及び第４図の第１のピーク）。各蛋白質の該
蛋白質含有部分を一緒にしたが、両方共５ＯＳ−ＰＡに
Ｅによりほとんど均一であることが見出だされた。
用い少量の３８Ｋまたは４０に蛋白質を一緒に流出させ
たく第３図及び第４図の第１のピーク）。各蛋白質の該
蛋白質含有部分を一緒にしたが、両方共５ＯＳ−ＰＡに
Ｅによりほとんど均一であることが見出だされた。
各々の着色したゲル［クーマツシー・ブリリアント・ブ
ルー（ｅｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌ
ｕｅ）により］のデンシトメータによる走査を行うと、
１１＾クロマトグラフ法で精製した３８Ｋ及び４０に蛋
白質は全蛋白質の少なくとも９０％に達した。！１＾ク
ロマトグラフ法を用いて得られた蛋白質のこの９０％以
上の収率は陰イオン交喚りロマトグラフ法によって得ら
れる５０％の収率に比べ著１−い改善である。
ルー（ｅｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌ
ｕｅ）により］のデンシトメータによる走査を行うと、
１１＾クロマトグラフ法で精製した３８Ｋ及び４０に蛋
白質は全蛋白質の少なくとも９０％に達した。！１＾ク
ロマトグラフ法を用いて得られた蛋白質のこの９０％以
上の収率は陰イオン交喚りロマトグラフ法によって得ら
れる５０％の収率に比べ著１−い改善である。
晟終調金物中のＰＲＰの量及び内毒素含液は非常に少な
い。最終蛋白質調合物おいて蛋白質１００μｇ当りＩ’
ＲＰは１．５μｇより少なく、また内−素単位は５．０
より小さかった。またウサギの体重１ ｋｇ当り蛋白質
２，５μｇにおけるウサギの発熱試験にｈ格した。
い。最終蛋白質調合物おいて蛋白質１００μｇ当りＩ’
ＲＰは１．５μｇより少なく、また内−素単位は５．０
より小さかった。またウサギの体重１ ｋｇ当り蛋白質
２，５μｇにおけるウサギの発熱試験にｈ格した。
ｌ＃袈された３８Ｋ及び４０に外層膜蛋白質のキャラク
タリゼーシランをいくつかの方法で行った。ウェスター
ン・プロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）試験では３
８Ｋ及び４０に蛋白質は交叉反応性をもつことがわかっ
た。従って一つの蛋白質が温血動物において一つの抗体
を生じるということがわがつると（下記実施例６参照）
、それは他の蛋白質も交叉反応性の抗体反応を示すこと
を意味している。
タリゼーシランをいくつかの方法で行った。ウェスター
ン・プロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）試験では３
８Ｋ及び４０に蛋白質は交叉反応性をもつことがわかっ
た。従って一つの蛋白質が温血動物において一つの抗体
を生じるということがわがつると（下記実施例６参照）
、それは他の蛋白質も交叉反応性の抗体反応を示すこと
を意味している。
ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ） ｇ！ １２１ ／ Ｍ
ロアミノ酸分析器を使用し１１０℃で２４時間６Ｎの塩
酸を用いて加水分解した各蛋白質の試料についてアミノ
酸分析を行った。３８Ｋ及び４０に蛋白質のアミノ酸組
成を第１表に示す。
ロアミノ酸分析器を使用し１１０℃で２４時間６Ｎの塩
酸を用いて加水分解した各蛋白質の試料についてアミノ
酸分析を行った。３８Ｋ及び４０に蛋白質のアミノ酸組
成を第１表に示す。
第１表
ヘモフィルス・インフルエンザｂ型の
４０Ｋ及び３８に主外層膜蛋白質のアミノ酸組成塩基性
５４（０，１５本本） ５１（０，１
５）リジン ３２２９ ヒスチジン ７７ アルギニン １５１５ ジカルボン酸 ８Ｂ（０，２４） ８５（０
，２４）アスバルチン酸、 アスパラギン ４７４５ グルタミン酸、 グルタミン ４１４０ 天然産 ２２６（０，６１） ２１０（
０，６１）スレオニン ２６２６ セリン １６１３ プロリン ３３ グリシン ５０４４ アラニン ２７２５ ヴアリン ２９２７ メナオニン １１ インロイシン １５１４ ０イシン ２６２４ チロシン ２０２０ 一ノＪニルアーニン １３ １３ −車
５ＯＳ−ＰＡＧＥにより示された蛋白質の分子量による
分類。
５４（０，１５本本） ５１（０，１
５）リジン ３２２９ ヒスチジン ７７ アルギニン １５１５ ジカルボン酸 ８Ｂ（０，２４） ８５（０
，２４）アスバルチン酸、 アスパラギン ４７４５ グルタミン酸、 グルタミン ４１４０ 天然産 ２２６（０，６１） ２１０（
０，６１）スレオニン ２６２６ セリン １６１３ プロリン ３３ グリシン ５０４４ アラニン ２７２５ ヴアリン ２９２７ メナオニン １１ インロイシン １５１４ ０イシン ２６２４ チロシン ２０２０ 一ノＪニルアーニン １３ １３ −車
５ＯＳ−ＰＡＧＥにより示された蛋白質の分子量による
分類。
傘車この群が示すアミノ酸残基の全モル数に対する割合
。
。
アミノ末端配列の分析はアプライド・バイオシステムズ
（Δｐｐ目ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社のガス・フ
ェーズ・シークエンサー（Ｇａｓ Ｐｈａｓｅ ５ｅｑ
ｕｅｎｅｅｒ） ４７０型を使用し、これにヒユーレッ
ト・パラカード（ＩＩｅｍｌｅｔＬ Ｐａｃｋａｒｄ）
社の１０９０型高速液体クロマトグラフを組み合わせ、
アイ・ビー・エム（ＩＢＭ）のシアノ・カラムを取り付
けて行った。カルボキシ末端のアミノ酸配列は酵素法に
よって決定した。消化はカルボキシペプチダーゼ＾及び
８の両方を使用して行い、種々の時間で取り出した試料
のアミノ酸分析はベックマン（Ｂｅａｋ鋤ａｎ）社の６
３００型アミノ酸分析機で行った。
（Δｐｐ目ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社のガス・フ
ェーズ・シークエンサー（Ｇａｓ Ｐｈａｓｅ ５ｅｑ
ｕｅｎｅｅｒ） ４７０型を使用し、これにヒユーレッ
ト・パラカード（ＩＩｅｍｌｅｔＬ Ｐａｃｋａｒｄ）
社の１０９０型高速液体クロマトグラフを組み合わせ、
アイ・ビー・エム（ＩＢＭ）のシアノ・カラムを取り付
けて行った。カルボキシ末端のアミノ酸配列は酵素法に
よって決定した。消化はカルボキシペプチダーゼ＾及び
８の両方を使用して行い、種々の時間で取り出した試料
のアミノ酸分析はベックマン（Ｂｅａｋ鋤ａｎ）社の６
３００型アミノ酸分析機で行った。
３８Ｋ及び４０にの蛋白質のアミノ末端及びカルボキシ
末端は同一であった。配列を第２表に示す。
末端は同一であった。配列を第２表に示す。
第２表
す型４０Ｋ及び３８に蛋白質のアミン末端の配列Ｎ１１
２−アラニンーヴアリンーヴアリンーチロシンーアスパ
ラギンーグルタミン酸−グリシンースレオニンーアスパ
ラギンーヴアリンーグルタミン酸−ロイシン−グリシン
−グリシン−アルギニン−ロイシン−セリン−インロイ
シン−イソロイシン−アラニン−グルタミン酸−グルタ
ミン−セリン−アスパラギン− ｂ型４ＯＫ及び３８に蛋白質のカルボキシ末端の配列ロ
イシン−アルギニン−Ｌフェニルアラニンーチロシンー
ヴアリン］ −ＣＯＯＩＩ さモフイノ［＆ニインフルエン ｂ子の １１木本発
明に使用するヘモフィルス・インフルエンザｂ型ｐｎｐ
はクオ（にｕ０）の米国特許第４，２２０，７１７号に
記載されている。この特許記載の方法を使用し、培養器
中でヘモフィルス・インフルエンザｂ型機生物を生育さ
せ、遠心分離にかけ、細胞を含まない上澄液を捕集した
１次にこの上澄液をエタノールで沈澱させ、この沈澱を
臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムで処理し、再
びエタノールで処理して部分的に精製されたＰＲＰを回
収した。
２−アラニンーヴアリンーヴアリンーチロシンーアスパ
ラギンーグルタミン酸−グリシンースレオニンーアスパ
ラギンーヴアリンーグルタミン酸−ロイシン−グリシン
−グリシン−アルギニン−ロイシン−セリン−インロイ
シン−イソロイシン−アラニン−グルタミン酸−グルタ
ミン−セリン−アスパラギン− ｂ型４ＯＫ及び３８に蛋白質のカルボキシ末端の配列ロ
イシン−アルギニン−Ｌフェニルアラニンーチロシンー
ヴアリン］ −ＣＯＯＩＩ さモフイノ［＆ニインフルエン ｂ子の １１木本発
明に使用するヘモフィルス・インフルエンザｂ型ｐｎｐ
はクオ（にｕ０）の米国特許第４，２２０，７１７号に
記載されている。この特許記載の方法を使用し、培養器
中でヘモフィルス・インフルエンザｂ型機生物を生育さ
せ、遠心分離にかけ、細胞を含まない上澄液を捕集した
１次にこの上澄液をエタノールで沈澱させ、この沈澱を
臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムで処理し、再
びエタノールで処理して部分的に精製されたＰＲＰを回
収した。
次にこのＰＲＰをヒドロキシアパタイトで処理する。
これに不純物が吸着されるので、ＰＲＩ’は上澄液中に
残る。さらに精製が必要な時には、ＰＲＰをセファｏ−
ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） ４Ｂ−ＣＬカラム（前記フ
ァルマシア社製）にかけることができる、このようにし
て得られたＰＲＰはＰＲＰの中でも比較的高分子量をも
ち、セファロース４Ｂ−ＣＬカラムにおいて流出係数（
にａｖ）が０．３０より小さいものが５０％より多かっ
た。この値はｌＸｌ０’ダルトンより高い分子量に対応
する。
残る。さらに精製が必要な時には、ＰＲＰをセファｏ−
ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） ４Ｂ−ＣＬカラム（前記フ
ァルマシア社製）にかけることができる、このようにし
て得られたＰＲＰはＰＲＰの中でも比較的高分子量をも
ち、セファロース４Ｂ−ＣＬカラムにおいて流出係数（
にａｖ）が０．３０より小さいものが５０％より多かっ
た。この値はｌＸｌ０’ダルトンより高い分子量に対応
する。
ＰＲＰはその天然の形においては還元末端をもっていな
い。還元末端（末端の反応性アルデヒド基の形で）を含
むＰＲＰ断片をつくるためには、パリフ（Ｐａｒｉｋｈ
）等のＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、誌３４巻７７
〜１０２頁（１９７４）及びジエニングス等の米国特許
第４ 、３５６ 。
い。還元末端（末端の反応性アルデヒド基の形で）を含
むＰＲＰ断片をつくるためには、パリフ（Ｐａｒｉｋｈ
）等のＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、誌３４巻７７
〜１０２頁（１９７４）及びジエニングス等の米国特許
第４ 、３５６ 。
１７０号記載の方法により、多糖体のシス位のビシナル
・ヒドロキシル基を過ヨー素酸塩、例えば過ヨー素酸ナ
トリウム、過ヨー素酸カリウムまたは過ヨー素酸で酸化
してアルデヒド官能基をつくる。
・ヒドロキシル基を過ヨー素酸塩、例えば過ヨー素酸ナ
トリウム、過ヨー素酸カリウムまたは過ヨー素酸で酸化
してアルデヒド官能基をつくる。
精製されたＰＲＰは暗所において４℃または室温で０２
〜５０ｍＭの過ヨー素酸ナトリウムを用いて種々の時間
の間処理する。特に好適な具体化例においてはＰＲＰを
ｐＨ４〜７において処理する１次に［０］ＰＲＰを発熱
物質を含まない水に対して十分に透析し、低分子量の物
質を除去する。別法としては、ゲル濾過カラム［ビーズ
状のアガロース−アクリルアミド共重合体くファルマシ
ア社製セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） Ｓ−２０
０またはＳ−３００］を通して［０］ＰＩ’ＩＰを精製
することができる。ゲル濾過カラムを使用する場合には
、Ｄ−リボースを標準にしてオルシノール反応により［
０］ＰＲＰの存在について分画部分の試験を行う、６７
２ ｎｍにおいて分画部分の吸光度を測定する０次に遠
心分離及び乾燥を行って精製された生成物を回収する。
〜５０ｍＭの過ヨー素酸ナトリウムを用いて種々の時間
の間処理する。特に好適な具体化例においてはＰＲＰを
ｐＨ４〜７において処理する１次に［０］ＰＲＰを発熱
物質を含まない水に対して十分に透析し、低分子量の物
質を除去する。別法としては、ゲル濾過カラム［ビーズ
状のアガロース−アクリルアミド共重合体くファルマシ
ア社製セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） Ｓ−２０
０またはＳ−３００］を通して［０］ＰＩ’ＩＰを精製
することができる。ゲル濾過カラムを使用する場合には
、Ｄ−リボースを標準にしてオルシノール反応により［
０］ＰＲＰの存在について分画部分の試験を行う、６７
２ ｎｍにおいて分画部分の吸光度を測定する０次に遠
心分離及び乾燥を行って精製された生成物を回収する。
得られた［０］ＰＲＰ断片は約８〜１２０単量体単位の
鎖長をもっている。この鎖長はまた重合度（Ｄ、Ｐ、）
と呼ばれる０次いで［０］ＰＲＰを下記に説明するよう
に還元アミン化によって３８Ｋまたは４０に蛋白質とカ
ップリングさせる。
鎖長をもっている。この鎖長はまた重合度（Ｄ、Ｐ、）
と呼ばれる０次いで［０］ＰＲＰを下記に説明するよう
に還元アミン化によって３８Ｋまたは４０に蛋白質とカ
ップリングさせる。
０ＰＲＰ−主タ ム の 告［０］Ｐ１１Ｐ
のアルデヒド官能基を、アミン基を含む外層膜蛋白質の
溶液と反応させシッフ塩基をつくる。この反応はｐＨ３
，５〜９、好ましくは５〜９で行われる。このシッフ塩
基を次にρ■６．０〜６，７において適当な硼水素化物
で還元して安定な共有結合で結合した複合体をつくる。
のアルデヒド官能基を、アミン基を含む外層膜蛋白質の
溶液と反応させシッフ塩基をつくる。この反応はｐＨ３
，５〜９、好ましくは５〜９で行われる。このシッフ塩
基を次にρ■６．０〜６，７において適当な硼水素化物
で還元して安定な共有結合で結合した複合体をつくる。
このような硼水素化物の例としては硼水素化ナトリウム
、シアン硼水素化ナトリウム、硼水素化カリウム及び硼
水素化リチウムである。シアノ硼水素化ナトリウムを使
用することが好ましい、酸化された多糖体または多糖体
断片を硼水素化物を使用して蛋白質とカップリングさせ
る方法はパリフ等の論文（前述）、及びシュヴアルツ（
Ｓｃｈｗａｒｔｚ）及びグレイ（［；ｒａｙ＞のＡｒｅ
ｈ、 Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、誌１８１
巻５４２〜５４９頁（１９７７）の論文に記載されてい
るｌｔ？Ｗした主蛋白質（濃度１−４０輸ｇ／論１）を
［０］ＰＲＰ （ｆｉ度１０〜８０Ｂ／論１）とｐ１１
６．０〜６．７の０．２Ｍ燐酸カリウム緩衝液中で室温
において混合する。ゆっくりと撹拌【７ながら２０〜３
０分間保温した後、発熱物質を含まない水の中に溶解し
た０、１〜２．０ｍＭのシアン硼水素化ナトリウムを加
える。
、シアン硼水素化ナトリウム、硼水素化カリウム及び硼
水素化リチウムである。シアノ硼水素化ナトリウムを使
用することが好ましい、酸化された多糖体または多糖体
断片を硼水素化物を使用して蛋白質とカップリングさせ
る方法はパリフ等の論文（前述）、及びシュヴアルツ（
Ｓｃｈｗａｒｔｚ）及びグレイ（［；ｒａｙ＞のＡｒｅ
ｈ、 Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、誌１８１
巻５４２〜５４９頁（１９７７）の論文に記載されてい
るｌｔ？Ｗした主蛋白質（濃度１−４０輸ｇ／論１）を
［０］ＰＲＰ （ｆｉ度１０〜８０Ｂ／論１）とｐ１１
６．０〜６．７の０．２Ｍ燐酸カリウム緩衝液中で室温
において混合する。ゆっくりと撹拌【７ながら２０〜３
０分間保温した後、発熱物質を含まない水の中に溶解し
た０、１〜２．０ｍＭのシアン硼水素化ナトリウムを加
える。
次にこの混合糊を２５〜３７℃においてゆっくり撹拌し
ながら１〜６日間保温し、［０］ＰＲＰ−外層膜蛋白質
複合体をつくる。この複合体はセファクリル（Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ） Ｓ−２００、Ｓ−３００及びセファロー
ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） ＣＬ−４８（ファルマシア
社）のようなゲル濾過カラム上で精製する。前記のよう
に分画した部分について蛋白質及び［０］Ｐｉの試験を
行った。
ながら１〜６日間保温し、［０］ＰＲＰ−外層膜蛋白質
複合体をつくる。この複合体はセファクリル（Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ） Ｓ−２００、Ｓ−３００及びセファロー
ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） ＣＬ−４８（ファルマシア
社）のようなゲル濾過カラム上で精製する。前記のよう
に分画した部分について蛋白質及び［０］Ｐｉの試験を
行った。
複合体を含むピークの分画部分を一緒にし、交叉濾過及
び／または凍結乾燥を行う、別法としては透析により複
合体を精製することができる。
び／または凍結乾燥を行う、別法としては透析により複
合体を精製することができる。
本発明により製造され精製された複合体はヘモフィルス
・インフルエンザｂ型による病気を予防するワクチンの
製造に使用することが好ましい。
・インフルエンザｂ型による病気を予防するワクチンの
製造に使用することが好ましい。
この複合体に免疫学的に許容できる稀釈剤または坦体を
通常の方法で加え、注射可能な溶液または懸濁液をつく
ることができる。また複合体を水酸化アルミニウム、燐
酸アルミニウムまたは他の薬物学的に許容できる助剤と
結合させることができる。
通常の方法で加え、注射可能な溶液または懸濁液をつく
ることができる。また複合体を水酸化アルミニウム、燐
酸アルミニウムまたは他の薬物学的に許容できる助剤と
結合させることができる。
例えばヘモフィルス・インフルエンザｂ型の［０］ＰＲ
Ｐ及び主外層膜蛋白質を含む複合体ワクチンをつくるた
めには、複合体調合物を燐酸ナトリウムで緩衝した塩水
（ＰＢＳ） （ｐＨ７，０〜７．４）の中にＰＲＰ濃度
５〜１００μｇ／ｌで懸濁させる。この濃度はオルシノ
ール反応により測定される濃度である［ハ−バー） （
Ｈｅｒｂｅｒｔ）等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ誌５Ｂ巻２８５〜２９１頁（１９）１
）］。
Ｐ及び主外層膜蛋白質を含む複合体ワクチンをつくるた
めには、複合体調合物を燐酸ナトリウムで緩衝した塩水
（ＰＢＳ） （ｐＨ７，０〜７．４）の中にＰＲＰ濃度
５〜１００μｇ／ｌで懸濁させる。この濃度はオルシノ
ール反応により測定される濃度である［ハ−バー） （
Ｈｅｒｂｅｒｔ）等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ誌５Ｂ巻２８５〜２９１頁（１９）１
）］。
本発明の複合体ワクチンは皮下注射または筋肉注射のよ
うな通常の方法で注射により溢血動物に投与し、病原体
のヘモフィルス・インフルエンザｈ型による全身的感染
を予防する活性免疫反応性を得ることができる。投与量
は当業界の専門家に公知の方法で決定される。ワクチン
を一回投与することにより予防を行うことができ、或い
は数回に亙り逐次増量して投与する必要がある場合もあ
る。
うな通常の方法で注射により溢血動物に投与し、病原体
のヘモフィルス・インフルエンザｈ型による全身的感染
を予防する活性免疫反応性を得ることができる。投与量
は当業界の専門家に公知の方法で決定される。ワクチン
を一回投与することにより予防を行うことができ、或い
は数回に亙り逐次増量して投与する必要がある場合もあ
る。
下記の実施例により本発明を例示する。これらの実施例
は単に例示のためのものであり、本発明を限定するもの
ではない、実施例１及び２は室温で行った。実施例３〜
５の酸化工程は２〜８℃で行った。実施例３〜５の複合
化工程は３７℃で行った。つくられた［０］ＰＲＰの近
似的なり、Ｐ、値は、パーク（Ｐａｒｋ）及びジョンソ
ン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）のＪ、 Ｂｉｏｌ。
は単に例示のためのものであり、本発明を限定するもの
ではない、実施例１及び２は室温で行った。実施例３〜
５の酸化工程は２〜８℃で行った。実施例３〜５の複合
化工程は３７℃で行った。つくられた［０］ＰＲＰの近
似的なり、Ｐ、値は、パーク（Ｐａｒｋ）及びジョンソ
ン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）のＪ、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｗ、誌１８１巻１４９〜１５１頁（１９４９）記
載の蔗糖を還元する方法により測定し、１０（実施例１
） 、３７（実施例２）、８（実施例３）、４０（実
施例４）及び１２０（実施例５）であった。
載の蔗糖を還元する方法により測定し、１０（実施例１
） 、３７（実施例２）、８（実施例３）、４０（実
施例４）及び１２０（実施例５）であった。
実施例１
〔０ＰＲＰ−４０Ｋ ムの
５００ ｍｇのＰＲＰを０．１ｔ１酢酸ナトリウムＭｉ
ｌｌ液（ｐＨ４，６）５０ｍｌに溶解する。過ヨー素酸
ナトリウム１０７−ｇを暗所において加え、この混合物
を栓付きの褐色のガラス瓶の中に入れ、アルミニウム箔
を巻付けて３０分間ゆっくりと撹拌する。３１４のソル
ビトール溶液５００μｌを加えて過剰の過ヨー素酸ナト
リウムを破壊し、１０分間ゆっくりと撹拌する。得られ
た［０］ＰＲＰを含む反応混合物をカットオフ特性３゜
５Ｋ（分子量）のスペクトロボア（Ｓｐｅａｔｒｏｐｏ
ｒ）・膜の管［米国カリフォルニア州ロスアンジェルス
（Ｌｏｇ Ａｎｇｅｌｅｓ）のスペクトラム・メディカ
ル・インダストリーズ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）製］中で発熱物質を含ま
ない水に対し４℃において３日間毎日新しい水を２１使
用して十分に透析を行った。透析した（０］ＰＲＰを０
．２μのナルジ（Ｎａｌｇｅ） 濾過器を通して枦遇し
、凍結乾燥して４℃で貯蔵する。この［０］ＰＲＰの０
゜Ｐ、値は約１０であった。この［０１ＰＲＰはセファ
クリルＳ−２００のカラムから約０．５のＫａｖ値で流
出することが見出だされた。 ＰＲＰ調金物からの［０
］ＰＲＰの回収率は約５０％であった。
ｌｌ液（ｐＨ４，６）５０ｍｌに溶解する。過ヨー素酸
ナトリウム１０７−ｇを暗所において加え、この混合物
を栓付きの褐色のガラス瓶の中に入れ、アルミニウム箔
を巻付けて３０分間ゆっくりと撹拌する。３１４のソル
ビトール溶液５００μｌを加えて過剰の過ヨー素酸ナト
リウムを破壊し、１０分間ゆっくりと撹拌する。得られ
た［０］ＰＲＰを含む反応混合物をカットオフ特性３゜
５Ｋ（分子量）のスペクトロボア（Ｓｐｅａｔｒｏｐｏ
ｒ）・膜の管［米国カリフォルニア州ロスアンジェルス
（Ｌｏｇ Ａｎｇｅｌｅｓ）のスペクトラム・メディカ
ル・インダストリーズ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）製］中で発熱物質を含ま
ない水に対し４℃において３日間毎日新しい水を２１使
用して十分に透析を行った。透析した（０］ＰＲＰを０
．２μのナルジ（Ｎａｌｇｅ） 濾過器を通して枦遇し
、凍結乾燥して４℃で貯蔵する。この［０］ＰＲＰの０
゜Ｐ、値は約１０であった。この［０１ＰＲＰはセファ
クリルＳ−２００のカラムから約０．５のＫａｖ値で流
出することが見出だされた。 ＰＲＰ調金物からの［０
］ＰＲＰの回収率は約５０％であった。
アミコン（八ｍ１ｃｏｎ）濃縮器（１０Ｋ （分子量
）でカットする濾過器１を使用し、０．２Ｈの燐酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ８，５）及び２％のオクチル−β−〇
−グルコピラノシドを用いて４０に外層膜蛋白質を濃縮
し、蛋白質濃度を約２０５ｇ／輸ｌにした。８０−ｇの
［０］ＰＲＰを上記４０に外層膜蛋白質溶液４−１に溶
解し、ゆっくりと撹拌する。 ２０分後０．５輪Ｎのシ
アノ硼水素化ナトリウムを加え、この混合物を室温で３
日間ゆっくりと撹拌する。この混合物を０．２Ｈの酢酸
アンモニウム（ｐｉｆ ７．０）及び１％のオクチル−
β−Ｄ−グルコピラノシドと平衡にしたセファクリルＳ
−２００のカラムを用いてクロマトグラフにかける。複
合体を含む第１のピークの分画部分を一緒にし、ワクチ
ンの調製に使用する。この［０１ＰＲＰ−４０に蛋白質
複合体のＰＲＰ ／蛋白質の比（、／ｗ）は約１：２．
５であった。
）でカットする濾過器１を使用し、０．２Ｈの燐酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ８，５）及び２％のオクチル−β−〇
−グルコピラノシドを用いて４０に外層膜蛋白質を濃縮
し、蛋白質濃度を約２０５ｇ／輸ｌにした。８０−ｇの
［０］ＰＲＰを上記４０に外層膜蛋白質溶液４−１に溶
解し、ゆっくりと撹拌する。 ２０分後０．５輪Ｎのシ
アノ硼水素化ナトリウムを加え、この混合物を室温で３
日間ゆっくりと撹拌する。この混合物を０．２Ｈの酢酸
アンモニウム（ｐｉｆ ７．０）及び１％のオクチル−
β−Ｄ−グルコピラノシドと平衡にしたセファクリルＳ
−２００のカラムを用いてクロマトグラフにかける。複
合体を含む第１のピークの分画部分を一緒にし、ワクチ
ンの調製に使用する。この［０１ＰＲＰ−４０に蛋白質
複合体のＰＲＰ ／蛋白質の比（、／ｗ）は約１：２．
５であった。
実施例２
０ＰＲＰ−４０に ムの
５００−ｇのＰＲＰを０．ＩＮ酢酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ４，５）５０ｍｌに溶解する。過ヨー素酸ナトリウ
ム２１．４ｍｇを暗所において加え、この混合物を栓付
きの褐色のガラス瓶の中に入れ、アルミニウム箔を巻付
けて３０分間ゆっくりと撹拌する。 ３Ｈのソルビトー
ル溶液５００μｍを加えて１０分間反応させて過剰の過
ヨー素酸ナトリウムを破壊する。得られた［０］ＰＲＰ
を含む反応混合物をカットオフ特性１２Ｋ（分子量）の
スペクトロボア・膜の管中で発熱物質を含まない水に対
し４℃において３日間子分に透析を行った。透析した［
０］ＰＲＰを０．２μのナルジ濾過器を通して濾過し、
凍結乾燥して４℃で貯蔵する。
ｐＨ４，５）５０ｍｌに溶解する。過ヨー素酸ナトリウ
ム２１．４ｍｇを暗所において加え、この混合物を栓付
きの褐色のガラス瓶の中に入れ、アルミニウム箔を巻付
けて３０分間ゆっくりと撹拌する。 ３Ｈのソルビトー
ル溶液５００μｍを加えて１０分間反応させて過剰の過
ヨー素酸ナトリウムを破壊する。得られた［０］ＰＲＰ
を含む反応混合物をカットオフ特性１２Ｋ（分子量）の
スペクトロボア・膜の管中で発熱物質を含まない水に対
し４℃において３日間子分に透析を行った。透析した［
０］ＰＲＰを０．２μのナルジ濾過器を通して濾過し、
凍結乾燥して４℃で貯蔵する。
この［０］ＰＲＰのり、Ｐ、値は約３７であった。この
［０］ＰＲＰはセファクリル５−ａｏｏのカラムから約
０．５〜Ｏ１ＢのＫａｖ値で流出することが見出だされ
た。 ’ＰＲＰ調合物からの［０］ＰＲＰの回収率は約
６８％であった。
［０］ＰＲＰはセファクリル５−ａｏｏのカラムから約
０．５〜Ｏ１ＢのＫａｖ値で流出することが見出だされ
た。 ’ＰＲＰ調合物からの［０］ＰＲＰの回収率は約
６８％であった。
アミコン（＾５ｉｃｏｎ）濃縮器［１ＯＫ （分子量
）でカットする濾過器］を使用し、０．２Ｈの燐酸カリ
ウム緩溶液（ｐ）ｌ ６．５）及び２％のオクチル−β
−Ｄ−グルコピラノシドを用いて４０に外Ｍ膜蛋白質を
濃縮し、蛋白質濃度を約１６ＩＩＩｇ／Ｉ１１にした。
）でカットする濾過器］を使用し、０．２Ｈの燐酸カリ
ウム緩溶液（ｐ）ｌ ６．５）及び２％のオクチル−β
−Ｄ−グルコピラノシドを用いて４０に外Ｍ膜蛋白質を
濃縮し、蛋白質濃度を約１６ＩＩＩｇ／Ｉ１１にした。
４０＋ａｇの１−ＯＩＰＲＩＩを上記４０に外層膜蛋
白質溶液１１に溶解し、ゆっくりと撹拌する。２０分？
＆０．５ｍＭのシアノ硼水素化ナトリウムを加え、この
混合物を室温で３回間ゆっくりと撹拌しながら保温した
。この混合物を０．２Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ７，
０）及び１％のオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドと
平衡にした七フアクリルＳ−３００のカラムを用いてク
ロマトグラフにかける。複合体を含む第１のピークの分
画部分を一緒にし、キャラクタリゼーシランを行い、ワ
クチンの調製に使用する。複合体中の［０］ＰＲＰ及び
４０に蛋白質の回収率は夫々的２０％及び６０％であっ
た。
白質溶液１１に溶解し、ゆっくりと撹拌する。２０分？
＆０．５ｍＭのシアノ硼水素化ナトリウムを加え、この
混合物を室温で３回間ゆっくりと撹拌しながら保温した
。この混合物を０．２Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ７，
０）及び１％のオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドと
平衡にした七フアクリルＳ−３００のカラムを用いてク
ロマトグラフにかける。複合体を含む第１のピークの分
画部分を一緒にし、キャラクタリゼーシランを行い、ワ
クチンの調製に使用する。複合体中の［０］ＰＲＰ及び
４０に蛋白質の回収率は夫々的２０％及び６０％であっ
た。
この［０］ＰＲＰ −４０に蛋白質複合体のＰＲＰ ／
蛋白質の比（ｗ／ｗ）は約１：２であった。
蛋白質の比（ｗ／ｗ）は約１：２であった。
実施例３
０ ＰＲＰ−４０Ｋ Ａの潰
特記しない限りすべての反応は２〜８℃で行った。
ＰＲＰ ３００＋ｍｇを発熱物質を含まない水３０ｍ１
に溶解し、次いで冷たい０．２Ｎ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ４，０）２４ｍｌを加え、さらに酢酸ナトリウム
＃ｌｔｍ液（ｐＨ４，０）中に５０Ｂ／鍮１の濃度で過
ヨー素酸ナトリウムを含む溶液６１を加える。最終的な
溶液は２３．４ｍＨの過ヨー素酸ナトリム及び５餉ｇ／
ｍｌのＰＲＰの溶液である０次にこの混合物を暗所にお
いて栓付きの褐色のガラス瓶中に入れ、アルミニウム箔
を巻付けて水浴中で３０分間保温する。 １８．７Ｈの
エチレングリコール９０μｍと１０分間反応させて過剰
の過ヨー素酸ナトリウムを破壊する０次にこの混合物を
３．５Ｋ （分子量）のカットオフ特性をもつスペクト
ロボアの膜の管中で先ず滅菌したＩＩＢｓ（４Ｎ、２回
交換、１回当り１８時間）に対し、次いで発熱物質を含
まない水（同じ量）に対して４℃において十分に透析を
行った。透析した［０］ＰＲＰを容器に移し、複合体の
調合に使用するまで一２０℃で胛蔵する。この［０］Ｐ
ＲＰのり、Ｐ、値は約８であった。この［０］ＰＲＰは
セファロース４Ｂ−ＣＬのカラムから約０．９のＫａｖ
値で流出することが見出だされた。 ［０］ＰＲＰ１０
０ｍｇを発熱物質を含まない水に濃度５ｍｇ／ｍｌで採
った溶液を分子量カットオフ特性３．５にのスペクトロ
ボア［Ｆ］膜の管に入れ、１％のオクチル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシドを含む０．２Ｎ燐酸カリウムｖｉ衝液（
ｐｌ！ ６．７）Ｈ！に対して透析することにより再平
衡化させた。乾燥したポリエチレングリコールを満たし
た浅い容器の中に透析管を入れてこの［０］ＰＲＰを濃
縮する。Ｏ，ＺＨ＠酸カジカリウム緩衝液Ｈ８，７）を
用いて最終的な［０］ＰＲＰの濃度を約３３ｍＨ／ｍｌ
に調節した。
に溶解し、次いで冷たい０．２Ｎ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ４，０）２４ｍｌを加え、さらに酢酸ナトリウム
＃ｌｔｍ液（ｐＨ４，０）中に５０Ｂ／鍮１の濃度で過
ヨー素酸ナトリウムを含む溶液６１を加える。最終的な
溶液は２３．４ｍＨの過ヨー素酸ナトリム及び５餉ｇ／
ｍｌのＰＲＰの溶液である０次にこの混合物を暗所にお
いて栓付きの褐色のガラス瓶中に入れ、アルミニウム箔
を巻付けて水浴中で３０分間保温する。 １８．７Ｈの
エチレングリコール９０μｍと１０分間反応させて過剰
の過ヨー素酸ナトリウムを破壊する０次にこの混合物を
３．５Ｋ （分子量）のカットオフ特性をもつスペクト
ロボアの膜の管中で先ず滅菌したＩＩＢｓ（４Ｎ、２回
交換、１回当り１８時間）に対し、次いで発熱物質を含
まない水（同じ量）に対して４℃において十分に透析を
行った。透析した［０］ＰＲＰを容器に移し、複合体の
調合に使用するまで一２０℃で胛蔵する。この［０］Ｐ
ＲＰのり、Ｐ、値は約８であった。この［０］ＰＲＰは
セファロース４Ｂ−ＣＬのカラムから約０．９のＫａｖ
値で流出することが見出だされた。 ［０］ＰＲＰ１０
０ｍｇを発熱物質を含まない水に濃度５ｍｇ／ｍｌで採
った溶液を分子量カットオフ特性３．５にのスペクトロ
ボア［Ｆ］膜の管に入れ、１％のオクチル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシドを含む０．２Ｎ燐酸カリウムｖｉ衝液（
ｐｌ！ ６．７）Ｈ！に対して透析することにより再平
衡化させた。乾燥したポリエチレングリコールを満たし
た浅い容器の中に透析管を入れてこの［０］ＰＲＰを濃
縮する。Ｏ，ＺＨ＠酸カジカリウム緩衝液Ｈ８，７）を
用いて最終的な［０］ＰＲＰの濃度を約３３ｍＨ／ｍｌ
に調節した。
１％のオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド及び３７μ
ｍのシアン硼水素化ナトリウム（１＋ｓｇ／μｍ）を含
む燐酸塩緩衝液中に４０に蛋白質を含む溶液〈１．５３
−１／鴫１） １．３ｅ＊ｌ を１１００ａ （約３
．０輪１）の［Ｏ］ＰＲＰ溶液に加える。１％のオクチ
ル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む燐酸塩Ｍｉ衝澄液
用いて最終容積を５−１に調節する。この混合物を３７
℃で５日間ゆっくりと撹拌しながら保温する。複合体の
精製は、４℃において燐酸塩でＭｔｌｌシた塩水に対し
十分に透析を行い（４２，２回交換、１回当り１８時間
）、この間複合体を沈澱させ、遠心分離により捕集する
。このペレットを次に１％のオクチル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシドを含む０．２Ｍ燐酸カリウムＭＷＩ液（ｐＨ
６，７）に溶解し、５ＯＳ−ＰＡＧＥでキャラクタリゼ
ーシランを行い、下記に述べる動物実験に使用した。
ｍのシアン硼水素化ナトリウム（１＋ｓｇ／μｍ）を含
む燐酸塩緩衝液中に４０に蛋白質を含む溶液〈１．５３
−１／鴫１） １．３ｅ＊ｌ を１１００ａ （約３
．０輪１）の［Ｏ］ＰＲＰ溶液に加える。１％のオクチ
ル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む燐酸塩Ｍｉ衝澄液
用いて最終容積を５−１に調節する。この混合物を３７
℃で５日間ゆっくりと撹拌しながら保温する。複合体の
精製は、４℃において燐酸塩でＭｔｌｌシた塩水に対し
十分に透析を行い（４２，２回交換、１回当り１８時間
）、この間複合体を沈澱させ、遠心分離により捕集する
。このペレットを次に１％のオクチル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシドを含む０．２Ｍ燐酸カリウムＭＷＩ液（ｐＨ
６，７）に溶解し、５ＯＳ−ＰＡＧＥでキャラクタリゼ
ーシランを行い、下記に述べる動物実験に使用した。
この［０］ＰＲＰ−４０に外層膜蛋白質権自体のＰＲＰ
／蛋白質比は約に４であった。
／蛋白質比は約に４であった。
実施例４
０ＰＲＰ−４０に 人の１
特記しない限りすべての反応は２〜８℃で行った。
ＰＲＰ ３００ｍｇを発熱物質を含まない水３０ｍ１に
溶解する。冷たい０．２Ｈ酢酸ナトリウムＭ衝液（ｐＨ
４，０）２９．４ｍｌを加え、さらに酢酸ナトリウムＭ
街液（ｐＨ４，０）中に５０ｍｇ／曽１の濃度で過ヨー
素酸ナトリウムを含む溶液Ｏｍｌを加える。最終的な溶
液は２．３４＋＊Ｎの過ヨー素酸ナトリム及び５Ｂ／ｍ
ｌのＰＲＰの溶液である０次にこの混合物を暗所におい
て栓付きの褐色のガラス瓶中に入れ、アルミニウム箔を
巻付けて水浴中で３０分間保温する。 １６．７Ｈのエ
チレングリコール９０μｍと１０分間反応させて過剰の
過ヨー素酸ナトリウムを破壊する。次に得られた［０］
ＰＲＰを含む混合物を３．５Ｋ （分子１ｍ）のカット
オフ特性をもつスペクトロボア・膜の管中で先ず滅菌し
たＰＢＳ（４１，２回交換、１回当り１８時間）に対し
、次いで発熱物質を含まない水（同じ量）に対して４℃
において十分に透析を行う、透析した［０］１１ＲＰを
容器に移し、複合体の調合に使用するまで一２０℃で貯
蔵する。この［０］ＰＲＰのり、Ｐ、値は約４０であっ
た。この［０ＪＰＲＰはセファロース４Ｂ−ＣＬのカラ
ムから約０．５〜０．７のＫａｖ値で流出することが見
出だされた。［０］ＰＲＰ １００＋ａビを発熱物質を
含まない水に濃度５ａ＋ｇ／＋ｓｌで採った溶液を分子
量カットオフ特性約３５００ダルトンのスペクトロボア
＠膜の管に入れ、１％のオクチル−β−ｎ−グルコピラ
ノシドを含む０．２Ｎ燐酸力リウムＭＩ街液（ｐＨ６，
７＞１１に対して室温で８時間透析することにより再平
衡化させた。乾燥したポリエチレングリコールを満たし
た浅い容器の中に透析管を入れてこの［０］ＰＲＰを濃
縮する。０．２Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐ）Ｉ ６−７
）を用いて最終的な［０］ＰＲＰの濃度を約３３ｍｇ／
ｓｌに調節した。
溶解する。冷たい０．２Ｈ酢酸ナトリウムＭ衝液（ｐＨ
４，０）２９．４ｍｌを加え、さらに酢酸ナトリウムＭ
街液（ｐＨ４，０）中に５０ｍｇ／曽１の濃度で過ヨー
素酸ナトリウムを含む溶液Ｏｍｌを加える。最終的な溶
液は２．３４＋＊Ｎの過ヨー素酸ナトリム及び５Ｂ／ｍ
ｌのＰＲＰの溶液である０次にこの混合物を暗所におい
て栓付きの褐色のガラス瓶中に入れ、アルミニウム箔を
巻付けて水浴中で３０分間保温する。 １６．７Ｈのエ
チレングリコール９０μｍと１０分間反応させて過剰の
過ヨー素酸ナトリウムを破壊する。次に得られた［０］
ＰＲＰを含む混合物を３．５Ｋ （分子１ｍ）のカット
オフ特性をもつスペクトロボア・膜の管中で先ず滅菌し
たＰＢＳ（４１，２回交換、１回当り１８時間）に対し
、次いで発熱物質を含まない水（同じ量）に対して４℃
において十分に透析を行う、透析した［０］１１ＲＰを
容器に移し、複合体の調合に使用するまで一２０℃で貯
蔵する。この［０］ＰＲＰのり、Ｐ、値は約４０であっ
た。この［０ＪＰＲＰはセファロース４Ｂ−ＣＬのカラ
ムから約０．５〜０．７のＫａｖ値で流出することが見
出だされた。［０］ＰＲＰ １００＋ａビを発熱物質を
含まない水に濃度５ａ＋ｇ／＋ｓｌで採った溶液を分子
量カットオフ特性約３５００ダルトンのスペクトロボア
＠膜の管に入れ、１％のオクチル−β−ｎ−グルコピラ
ノシドを含む０．２Ｎ燐酸力リウムＭＩ街液（ｐＨ６，
７＞１１に対して室温で８時間透析することにより再平
衡化させた。乾燥したポリエチレングリコールを満たし
た浅い容器の中に透析管を入れてこの［０］ＰＲＰを濃
縮する。０．２Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐ）Ｉ ６−７
）を用いて最終的な［０］ＰＲＰの濃度を約３３ｍｇ／
ｓｌに調節した。
１％のオクチル−β−ｎ−グルコピラノシド及び３７μ
ｍのシアン硼水素化ナトリウム（ｌａｇ／μｍ）を含む
燐酸塩Ｍ［ｒ液中に４０に蛋白質を含む溶液（１，５：
（ｅｌ ／ｅｅｌ） １．３ｍｌ を１００論ｇ
（約３．０ｍｌ ） の［０］ＰＲＰ溶液に加
える。１％のオクチル−β−ｎ−グルコピラノシドを含
む燐酸塩［１！液を用いて最終容積を５−１に調節する
。この混合物を３７℃で５日間ゆっくりと撹拌しながら
保温する６次にこの混合物をＯ，ＺＨの酢酸アンモニウ
ム（ｐｉ（７，０） を用いて平衡化させたセファク
リルＳ−３００のカラムを使用してクロマトグラフにか
けた。同じ緩衝液を使用し複合体を空の容積に流出させ
た。ピークの分画部分を一緒に集め、キャラクタリゼー
シランを行い、ワクチンの調製に使用した。この［０］
ＰＲＰ−４０に外層膜蛋白質複合体のＰＲＰ ／蛋白質
比は約１：２であった。
ｍのシアン硼水素化ナトリウム（ｌａｇ／μｍ）を含む
燐酸塩Ｍ［ｒ液中に４０に蛋白質を含む溶液（１，５：
（ｅｌ ／ｅｅｌ） １．３ｍｌ を１００論ｇ
（約３．０ｍｌ ） の［０］ＰＲＰ溶液に加
える。１％のオクチル−β−ｎ−グルコピラノシドを含
む燐酸塩［１！液を用いて最終容積を５−１に調節する
。この混合物を３７℃で５日間ゆっくりと撹拌しながら
保温する６次にこの混合物をＯ，ＺＨの酢酸アンモニウ
ム（ｐｉ（７，０） を用いて平衡化させたセファク
リルＳ−３００のカラムを使用してクロマトグラフにか
けた。同じ緩衝液を使用し複合体を空の容積に流出させ
た。ピークの分画部分を一緒に集め、キャラクタリゼー
シランを行い、ワクチンの調製に使用した。この［０］
ＰＲＰ−４０に外層膜蛋白質複合体のＰＲＰ ／蛋白質
比は約１：２であった。
実施例５
０ＰＲＰ−４０に 人 の製造
特記しない限りすべての反応は２〜８℃で行った。
ＰＲＰ ３００＋Ｈを発熱物質を含まない水３０ｍ ｌ
に溶解し、０．２Ｍ酢酸ナトリウムＭ街液（ｐＨ４，０
）２９．４ｍｌを加え、さらに酢酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ４，０）中に５０鵠ｇ ／ ｍ ｌの濃度で過ヨー
素酸ナトリウムを含む溶液０．０６ ｍｌ を加える。
に溶解し、０．２Ｍ酢酸ナトリウムＭ街液（ｐＨ４，０
）２９．４ｍｌを加え、さらに酢酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ４，０）中に５０鵠ｇ ／ ｍ ｌの濃度で過ヨー
素酸ナトリウムを含む溶液０．０６ ｍｌ を加える。
最終的な溶液は０．２３４ｍＨの過ヨー素酸ナトリム及
び５論ｇ／麟１のＰＲＰの溶液である０次にこの混合物
を暗所に・おいて栓付きの褐色のガラス瓶中に入れ、ア
ルミニウム箔を巻付けて水浴中で３０分間保温する。１
６．７１４のエチレングリコール９０μｍと１０分間反
応させて過剰の過ヨー素酸ナトリウムを破壊する。得ら
れた［０］ＰＲＰを含む混合物を３．５Ｋ （分子量）
のカットオフ特性をもつスペクトロボアＯ膜の管中で先
ず滅菌したＰＢＳ（４Ｉｔ、２回交換、１回当り１８時
間）に対し、次いで発熱物質を含まない水（同じ量）に
対して４℃において十分に透析を行う、この［０］ＰＲ
Ｐのり、Ｐ。
び５論ｇ／麟１のＰＲＰの溶液である０次にこの混合物
を暗所に・おいて栓付きの褐色のガラス瓶中に入れ、ア
ルミニウム箔を巻付けて水浴中で３０分間保温する。１
６．７１４のエチレングリコール９０μｍと１０分間反
応させて過剰の過ヨー素酸ナトリウムを破壊する。得ら
れた［０］ＰＲＰを含む混合物を３．５Ｋ （分子量）
のカットオフ特性をもつスペクトロボアＯ膜の管中で先
ず滅菌したＰＢＳ（４Ｉｔ、２回交換、１回当り１８時
間）に対し、次いで発熱物質を含まない水（同じ量）に
対して４℃において十分に透析を行う、この［０］ＰＲ
Ｐのり、Ｐ。
値は約１２０であった。この［０］ＰＲＰはセファロー
ス４Ｂ−ＣＬのカラムから約０．３〜０．６のＫａｖ値
で流出することが見出だされた。 ［０］ＰＲＰ ｌｏ
ｏｍｇを発熱物質を含まない水に濃度５５１ｇ／ｍｌで
採った溶液を分子量カットオフ特性的３．５にのスペク
トロボア・膜の管に入れ、１％のオクチル−β−トグル
コピラノシドを含む０．２Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６，７）１１に対して室温で８時間透析することにより
再平衡化させた。乾燥したポリエチレングリコールを満
たした浅い容器の中に透析管を入れてこの［０］ＰＲＰ
を濃縮する。 ０．２Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨｅ、
））を用いて最終的な［０］ＰＲＰの濃度を約３３ｍｇ
／ｅｉｌに調節した。
ス４Ｂ−ＣＬのカラムから約０．３〜０．６のＫａｖ値
で流出することが見出だされた。 ［０］ＰＲＰ ｌｏ
ｏｍｇを発熱物質を含まない水に濃度５５１ｇ／ｍｌで
採った溶液を分子量カットオフ特性的３．５にのスペク
トロボア・膜の管に入れ、１％のオクチル−β−トグル
コピラノシドを含む０．２Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６，７）１１に対して室温で８時間透析することにより
再平衡化させた。乾燥したポリエチレングリコールを満
たした浅い容器の中に透析管を入れてこの［０］ＰＲＰ
を濃縮する。 ０．２Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨｅ、
））を用いて最終的な［０］ＰＲＰの濃度を約３３ｍｇ
／ｅｉｌに調節した。
１％のオクチル−β−ｎ−グルコピラノシド及び３７１
のシアノ硼水素化ナトリウム（ｌｅｅｇ／μｍ）を含む
燐酸塩ＨＩＩ液中に４０に蛋白質を含む溶液（１，５３
１／鴫１） １．３ｅｅｌ を１００輪ｇ （約３
．０ｍｌ ） の［０］ＰＲＰ溶液に加える。１％
のオクチル−β−トグルコビラノシドを含む燐酸塩＆！
衝澄液用いて最終容積を５１に調節する。この混合物を
３７℃で５日間ゆっくりと撹拌しながら保温する０次に
この混合物を０．２Ｈの酢酸アンモニウム（ｐＨ７，０
）を用いて平衡化させなセファロース４Ｂ−ＣＬのカラ
ムを使用してクロマトグラフにかけた。同じ緩衝液を使
用し複合体を流出させた。ピークの分画部分を一緒に集
め、キャラクタリゼーシランを行い、ワクチンの調製に
使用した。この［Ｏ］ＰＲＰ −４０に外層膜蛋白質複
合体のＰＲＩＩ ／蛋白質比は約２：１であった。
のシアノ硼水素化ナトリウム（ｌｅｅｇ／μｍ）を含む
燐酸塩ＨＩＩ液中に４０に蛋白質を含む溶液（１，５３
１／鴫１） １．３ｅｅｌ を１００輪ｇ （約３
．０ｍｌ ） の［０］ＰＲＰ溶液に加える。１％
のオクチル−β−トグルコビラノシドを含む燐酸塩＆！
衝澄液用いて最終容積を５１に調節する。この混合物を
３７℃で５日間ゆっくりと撹拌しながら保温する０次に
この混合物を０．２Ｈの酢酸アンモニウム（ｐＨ７，０
）を用いて平衡化させなセファロース４Ｂ−ＣＬのカラ
ムを使用してクロマトグラフにかけた。同じ緩衝液を使
用し複合体を流出させた。ピークの分画部分を一緒に集
め、キャラクタリゼーシランを行い、ワクチンの調製に
使用した。この［Ｏ］ＰＲＰ −４０に外層膜蛋白質複
合体のＰＲＩＩ ／蛋白質比は約２：１であった。
実施例６
°０ＰＲＰ−３８Ｋ 戊（欠１１ＰＲＰ Ｉｇを
発熱物質を０．１Ｍ酢酸ナトリウム［澄液（ｐＨ４，５
）１００ ｍｌに溶解する。過ヨー素酸ナトリウム１０
７１１ｇを暗所において加え、混合物を栓付きの褐色の
ガラス瓶中に入れ、アールミニラム箔を巻付けて３０分
間ゆっくりと撹拌する。３Ｎのリビｌ〜−ル溶液１ ｍ
ｌを加えて過剰の過ヨー素酸ナトリウムを破壊する。得
られた［０］ＰＲＰを含む混合物を３．５Ｋ（分子量）
のカットオフ特性をもつスペクトロボア０膜の管中で発
熱物質を含まない水に対して４℃において十分に透析を
行う。透析した［０］ＰＲＰを０．２μのナルジ濾過器
を通して濾過し、凍結乾燥して４℃で貯蔵する。この［
０］ＰＲＰのり、Ｐ、値は約３５であつた。この［０］
ＰＲＰは七フアクリルＳ−３００のカラムから約０．５
のＫａｖ値で流出することが見出だされた。
発熱物質を０．１Ｍ酢酸ナトリウム［澄液（ｐＨ４，５
）１００ ｍｌに溶解する。過ヨー素酸ナトリウム１０
７１１ｇを暗所において加え、混合物を栓付きの褐色の
ガラス瓶中に入れ、アールミニラム箔を巻付けて３０分
間ゆっくりと撹拌する。３Ｎのリビｌ〜−ル溶液１ ｍ
ｌを加えて過剰の過ヨー素酸ナトリウムを破壊する。得
られた［０］ＰＲＰを含む混合物を３．５Ｋ（分子量）
のカットオフ特性をもつスペクトロボア０膜の管中で発
熱物質を含まない水に対して４℃において十分に透析を
行う。透析した［０］ＰＲＰを０．２μのナルジ濾過器
を通して濾過し、凍結乾燥して４℃で貯蔵する。この［
０］ＰＲＰのり、Ｐ、値は約３５であつた。この［０］
ＰＲＰは七フアクリルＳ−３００のカラムから約０．５
のＫａｖ値で流出することが見出だされた。
ＰＲＰ調合物からの［０］ＰＲＰの回収率は約７８％で
あった。
あった。
アミコン（＾−１ｃｏｎ）濃縮器を使用し、０．２Ｍの
燐酸カリウムＭＩ澄液（ｐ）ｌ ６．５）及び２％のオ
クチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを用いて精製した３
８に外層膜蛋白質を濃縮した。３０ｍＭの［０］ＰＲＰ
を上記３８に蛋白質溶液（蛋白質３０＋ｍｇ） ３ ＋
＊ｌに溶解し、ゆっくりと撹拌する。２０分後０．３＋
Ｍのシアノ硼水素化ナトリウム（水０．３１中３０ｍｇ
）を加え、この混合物を室温で３日間ゆっくりとかき混
ぜながら３７℃（振盪型水浴）で保温する。反応混合物
を２％のオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（水溶液
）で稀釈して蛋白質濃度を約２−Ｆ１７ｍｌにし、５０
ｍＭのＮａＣ１（５００ｍ ｌ ）を２回交換して洗剤
を加えない５０ＭＭＮａＣｌに対し分子量力・ットオフ
特性約３．５にのスペクトロボア＠＠の管の中で４℃に
おいて２日間十分に透析を行う、透析した材料を１２，
０００×Ｃで１０分間遠心分離して不溶材料を除去する
。上澄液（５〜１５＋＋＋ｌ）を、５０ｍＭのＮａＣｌ
で予め平衡化させたセファロース４Ｂ−ＣＬのカラム（
１，５Ｘ９０ｃｍ）にかけ、同じ緩衝液で流出させる。
燐酸カリウムＭＩ澄液（ｐ）ｌ ６．５）及び２％のオ
クチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを用いて精製した３
８に外層膜蛋白質を濃縮した。３０ｍＭの［０］ＰＲＰ
を上記３８に蛋白質溶液（蛋白質３０＋ｍｇ） ３ ＋
＊ｌに溶解し、ゆっくりと撹拌する。２０分後０．３＋
Ｍのシアノ硼水素化ナトリウム（水０．３１中３０ｍｇ
）を加え、この混合物を室温で３日間ゆっくりとかき混
ぜながら３７℃（振盪型水浴）で保温する。反応混合物
を２％のオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（水溶液
）で稀釈して蛋白質濃度を約２−Ｆ１７ｍｌにし、５０
ｍＭのＮａＣ１（５００ｍ ｌ ）を２回交換して洗剤
を加えない５０ＭＭＮａＣｌに対し分子量力・ットオフ
特性約３．５にのスペクトロボア＠＠の管の中で４℃に
おいて２日間十分に透析を行う、透析した材料を１２，
０００×Ｃで１０分間遠心分離して不溶材料を除去する
。上澄液（５〜１５＋＋＋ｌ）を、５０ｍＭのＮａＣｌ
で予め平衡化させたセファロース４Ｂ−ＣＬのカラム（
１，５Ｘ９０ｃｍ）にかけ、同じ緩衝液で流出させる。
［Ｏ］ＰＲＰに対し２個のピークが得られた。 ［０］
ＰＲＰ−３８に蛋白質複合体はｖｏで流出した。複合体
（ＰＲＰ及び蛋白質）を含むピークの分画部分を一緒に
し、使用するまで４℃で貯蔵する。この［０］ＰＲＰ−
３８に外層膜蛋白質複合体のＰＲＰ／蛋白質の比は約１
：５であった。
ＰＲＰ−３８に蛋白質複合体はｖｏで流出した。複合体
（ＰＲＰ及び蛋白質）を含むピークの分画部分を一緒に
し、使用するまで４℃で貯蔵する。この［０］ＰＲＰ−
３８に外層膜蛋白質複合体のＰＲＰ／蛋白質の比は約１
：５であった。
実施例７
ヘ ワク ンに る′ 一
実施例１〜５の方法でつくられた複合体を９１１７゜０
において滅菌したＰＢＳ中に稀釈し、０．５Ｔｌ＋の投
与量が５または１０ｇｇのＰＲＰを含むようにする。
において滅菌したＰＢＳ中に稀釈し、０．５Ｔｌ＋の投
与量が５または１０ｇｇのＰＲＰを含むようにする。
この複合体ワクチンを０．２０μのゲルマン（にｅ１ｍ
ａｎ）濾過器を通して膜ｒ遇する。必要になるまで滅菌
したワクチンを４℃で貯蔵する。
ａｎ）濾過器を通して膜ｒ遇する。必要になるまで滅菌
したワクチンを４℃で貯蔵する。
この複合体ワクチン（１回の投与当り０．５ｍｌ ）を
３週間の間１週に１回の割合で若いラットに皮下注射す
る。
３週間の間１週に１回の割合で若いラットに皮下注射す
る。
第３表は実施例１〜５の複合体からつくられたワクチン
のＰＲＰに対する抗体反応性を、ＰＢＳ （対照）
、Ｉ’ＲＰのみ及び２種の公知複合体と比較したもので
ある。第４表は実施例１．３及び４の複合体からつくら
れたワクチン投与後の４０に蛋白質に対する抗体反応性
をＰＢＳ （対照）と比較したものである。
のＰＲＰに対する抗体反応性を、ＰＢＳ （対照）
、Ｉ’ＲＰのみ及び２種の公知複合体と比較したもので
ある。第４表は実施例１．３及び４の複合体からつくら
れたワクチン投与後の４０に蛋白質に対する抗体反応性
をＰＢＳ （対照）と比較したものである。
１’ＲＰ抗体の測定に使用された放射線免疫試験（ＲＩ
＾）法は、クオ等のＪ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｈｅｔｂ
ｏｄｓ、誌４３巻３５〜４７頁（１３８１）の論文に記
載されている。
＾）法は、クオ等のＪ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｈｅｔｂ
ｏｄｓ、誌４３巻３５〜４７頁（１３８１）の論文に記
載されている。
４０に蛋白質抗体はヴオラー（Ｖｏｌｌｅｒ）等のＬａ
ｎｃｅｔ誌第１巻４６９頁（１９）５）の論文記載の酵
素結合免疫吸着試験により決定した。
ｎｃｅｔ誌第１巻４６９頁（１９）５）の論文記載の酵
素結合免疫吸着試験により決定した。
第３表及び第４表の結果は、ＰＲＰのみを注射されたラ
ットは３回の免疫化の後も対照の血清に比べＰＲＰ抗体
レベルに何等認められる増加がないことを示している。
ットは３回の免疫化の後も対照の血清に比べＰＲＰ抗体
レベルに何等認められる増加がないことを示している。
蛋白質坦体としてジフテリア変性毒素を含む複合体を注
射されたラットは抗体レベルが増加した。［０］ＰＲＰ
及び４０に蛋白質から成る複合体ワクチンを注射された
ラットはＰＲＰ （第３表）及び４０に蛋白質（第４
表）に対する抗体レベルが著しく高いことで示されるよ
うに優れた抗体反応性をもっていた。
射されたラットは抗体レベルが増加した。［０］ＰＲＰ
及び４０に蛋白質から成る複合体ワクチンを注射された
ラットはＰＲＰ （第３表）及び４０に蛋白質（第４
表）に対する抗体レベルが著しく高いことで示されるよ
うに優れた抗体反応性をもっていた。
第３表
ＰＢＳ（対照） −＜４０ ＜４０ｒ’Ｒ
Ｐ １０ ＜４０ ≧４０
複合体本車 １０ １５６２ １１１
９車１群当り５匹のラットにワクチンを注射した。
Ｐ １０ ＜４０ ≧４０
複合体本車 １０ １５６２ １１１
９車１群当り５匹のラットにワクチンを注射した。
抗体の幾何平均力価（にＨＴ）は５個の別々の力価から
計算した。
計算した。
車掌この複合体はチュウ（Ｃｂｕ）等のＩｎｆ、、 ｌ
５ｎｕｎ、誌４０巻２４５〜２５６頁（１３８３）記載
の方法によりつくられたＰＲＰ（ＡＤＨ）−ジフテリア
変性毒素から成っている。 ＰＲＰは臭化シアノーゲン
及び水溶性カーポジイミドを使用しスペーサーのアジピ
ン酸ジヒドラジド（八〇〇）を通してジフテリア変性毒
素にカップリングしている。
５ｎｕｎ、誌４０巻２４５〜２５６頁（１３８３）記載
の方法によりつくられたＰＲＰ（ＡＤＨ）−ジフテリア
変性毒素から成っている。 ＰＲＰは臭化シアノーゲン
及び水溶性カーポジイミドを使用しスペーサーのアジピ
ン酸ジヒドラジド（八〇〇）を通してジフテリア変性毒
素にカップリングしている。
第３表（続き）
［０］ＰＲＰ−４０に１匡１３１木
本１群当り５匹のラットにワクチンを注射した。
抗体の幾何平均力価（Ｇｔ４Ｔ）は５個の別々の力価か
ら計算した。
ら計算した。
第４表
３ ０．４５０
１０ ２５ １１ １．３４３１０ ４０
７ １．２８０本最初に注射した後４週間目 第４表（続き） 本最初に注射した後４週間目 本発明の主な特徴及び態様は次の通りである。
７ １．２８０本最初に注射した後４週間目 第４表（続き） 本最初に注射した後４週間目 本発明の主な特徴及び態様は次の通りである。
１、 （ａ）ヘモフィルス・インフルエンザｂ型の莢膜
多糖体から１秀導された酸化されたポリリボシル−リビ
トール−フォスフェート多糖体断片、及び（ｂ）分子量
が約３８，０００〜４０，０００ダルトンのヘモフィル
ス・インフルエンザｂ型外層膜蛋白質の還元アミノ化生
成物から成る免疫原性をもった多糖体−蛋白質複合体。
多糖体から１秀導された酸化されたポリリボシル−リビ
トール−フォスフェート多糖体断片、及び（ｂ）分子量
が約３８，０００〜４０，０００ダルトンのヘモフィル
ス・インフルエンザｂ型外層膜蛋白質の還元アミノ化生
成物から成る免疫原性をもった多糖体−蛋白質複合体。
２、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型の蛋白質は該微
生物の主外層膜蛋白質である上記第１項記載の複合体。
生物の主外層膜蛋白質である上記第１項記載の複合体。
３．ヘモフィルス・インフルエンザｂ型の３８，０００
ダルトンまたは４０，０００ダルトンの外層膜蛋白質の
Ｈ−末端アミノ酸配列は Ｎｌ２−アラニンーヴアリンーヴアリンーチロシンーア
スパラギンーグルタミン酸−グリシンースレオニンーア
スパラギンーヴアリンーグルタミン酸−ロイシン−グリ
シン−グリシン−アルギニン−ロイシン−セリン−イソ
ロイシン−イソロイシン−アラニン−グルタミン酸−グ
ルタミン−セリン−アスパラギン− である上記第１項記載の複合体。
ダルトンまたは４０，０００ダルトンの外層膜蛋白質の
Ｈ−末端アミノ酸配列は Ｎｌ２−アラニンーヴアリンーヴアリンーチロシンーア
スパラギンーグルタミン酸−グリシンースレオニンーア
スパラギンーヴアリンーグルタミン酸−ロイシン−グリ
シン−グリシン−アルギニン−ロイシン−セリン−イソ
ロイシン−イソロイシン−アラニン−グルタミン酸−グ
ルタミン−セリン−アスパラギン− である上記第１項記載の複合体。
４、上記第１項記載の免疫原性をもった複合体から成る
ワクチン。
ワクチン。
５、さらに一種またはそれ以上の免疫学的に許容される
稀釈剤、坦体または助剤を含んでいる。Ｅ記第４項記載
のワクチン。
稀釈剤、坦体または助剤を含んでいる。Ｅ記第４項記載
のワクチン。
６、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型を不活性化し、
このバクテリアを水中に懸濁させ、この懸濁液の塩化ヘ
キサデシルトリメチルアンモニウムの最終濃度を２％（
ｗ／ｖ）にし、該懸濁液を１〜２時間激しくＳ盪し、該
懸濁液を遠心分離にかけ、ペレットを取り出し、このペ
レットを再び水に懸濁させ、この懸濁液の塩化カルシウ
ム最終濃度を０．２５Ｍにし、該懸濁液を遠心分離にか
け、懸濁液にエタノールを加えてその最終濃度を２０％
（ｖ／ｖ）にし、調合物を沈澱させ、遠心分離により沈
澱を除去し、エタノールで上澄液を稀釈してその濃度を
８０％（ｖ／ｖ）にし、沈澱を遠心分離にかけてペレッ
ト中の３８，０００または４０，０００ダルトンの外層
１摸蛋白質を沈澱させ、この蛋白質を２％のオクチル−
β−〇−グルコピラノシドを含むイミダゾールｖｉ街液
（ｐ７．０＞中に再可溶化し、遠心分離にかけて不溶の
蛋白質を除去し、陰イオン交換クロマトグラフ・カラム
上でイミダゾールＭ澄液（ｐＨ７，０）を用いて流出さ
せ精製された３８，０００ダルトンまたは４０，０００
ダルトンの蛋白質を回収する分子量が３８，０００ダル
トンまたは４０，０００ダルトンのヘモフィルス・イン
フルエンザｂ型主外層膜蛋白質を分離、精製する方法。
このバクテリアを水中に懸濁させ、この懸濁液の塩化ヘ
キサデシルトリメチルアンモニウムの最終濃度を２％（
ｗ／ｖ）にし、該懸濁液を１〜２時間激しくＳ盪し、該
懸濁液を遠心分離にかけ、ペレットを取り出し、このペ
レットを再び水に懸濁させ、この懸濁液の塩化カルシウ
ム最終濃度を０．２５Ｍにし、該懸濁液を遠心分離にか
け、懸濁液にエタノールを加えてその最終濃度を２０％
（ｖ／ｖ）にし、調合物を沈澱させ、遠心分離により沈
澱を除去し、エタノールで上澄液を稀釈してその濃度を
８０％（ｖ／ｖ）にし、沈澱を遠心分離にかけてペレッ
ト中の３８，０００または４０，０００ダルトンの外層
１摸蛋白質を沈澱させ、この蛋白質を２％のオクチル−
β−〇−グルコピラノシドを含むイミダゾールｖｉ街液
（ｐ７．０＞中に再可溶化し、遠心分離にかけて不溶の
蛋白質を除去し、陰イオン交換クロマトグラフ・カラム
上でイミダゾールＭ澄液（ｐＨ７，０）を用いて流出さ
せ精製された３８，０００ダルトンまたは４０，０００
ダルトンの蛋白質を回収する分子量が３８，０００ダル
トンまたは４０，０００ダルトンのヘモフィルス・イン
フルエンザｂ型主外層膜蛋白質を分離、精製する方法。
７、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型を不活性化し、
このバクテリアを水中に懸濁させ、この懸濁液の塩化ヘ
キサデシルトリメチルアンモニウムの最終濃度を２％（
ｗ／ν）にし、該懸濁液を１〜２時間激しく振盪し、該
懸濁液を遠心分離にかけ、ペレットを取り出し、このペ
レットを再び水に懸濁させ、この懸濁液の塩化カルシウ
ム最終濃度を０．２５Ｍにし、該懸濁液を遠心分離にか
け、懸濁液にエタノールを加えてその最終濃度を２０％
（Ｖ／ｖ）にし、調合物を沈澱させ、遠心分離により沈
澱を除去し、エタノールで上澄液を稀釈してその濃度を
８０％（ｖ／ｖ）にし、遠心分離にかけてペレット中の
３８，０００または４０，０００ダルトンの外層膜蛋白
質を沈澱させ、この蛋白質を２％のオクチル−β−〇−
グルコピラノシドを含むイミダゾールＭｆｆｉ液〈ｐ７
゜Ｏ）または燐酸塩Ｍ澄液（ｐｉｌ ６．５）中に再可
溶化し、遠心分離にかけて不溶の蛋白質を除去し、この
上澄液をエタノールで稀釈してエタノール濃度を６６％
（ｖ／ｖ）にし、遠心分離にかけてペレット中の３８゜
０００または４０，０００ダルトンの外層膜蛋白質を沈
澱させ、２％のオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを
含む２００ｓＮ燐酸ナトリウム（ｐｉｌ ６．５）
中に再可溶化し、遠心分離にかけて不溶の蛋白質を除去
し、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフ・カラム
上で燐酸ナトリウムＭ街液（ｐＨ６，５）を用いて流出
させ精製された３８，０００ダルトンまたは４０，００
０ダルトンの蛋白質を回収する分子量が３８，０００ダ
ルトンまたは４０，０００ダルトンのヘモフィルス・イ
ンフルエンザｂ型主外層膜蛋白質を分離、精製する方法
。
このバクテリアを水中に懸濁させ、この懸濁液の塩化ヘ
キサデシルトリメチルアンモニウムの最終濃度を２％（
ｗ／ν）にし、該懸濁液を１〜２時間激しく振盪し、該
懸濁液を遠心分離にかけ、ペレットを取り出し、このペ
レットを再び水に懸濁させ、この懸濁液の塩化カルシウ
ム最終濃度を０．２５Ｍにし、該懸濁液を遠心分離にか
け、懸濁液にエタノールを加えてその最終濃度を２０％
（Ｖ／ｖ）にし、調合物を沈澱させ、遠心分離により沈
澱を除去し、エタノールで上澄液を稀釈してその濃度を
８０％（ｖ／ｖ）にし、遠心分離にかけてペレット中の
３８，０００または４０，０００ダルトンの外層膜蛋白
質を沈澱させ、この蛋白質を２％のオクチル−β−〇−
グルコピラノシドを含むイミダゾールＭｆｆｉ液〈ｐ７
゜Ｏ）または燐酸塩Ｍ澄液（ｐｉｌ ６．５）中に再可
溶化し、遠心分離にかけて不溶の蛋白質を除去し、この
上澄液をエタノールで稀釈してエタノール濃度を６６％
（ｖ／ｖ）にし、遠心分離にかけてペレット中の３８゜
０００または４０，０００ダルトンの外層膜蛋白質を沈
澱させ、２％のオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを
含む２００ｓＮ燐酸ナトリウム（ｐｉｌ ６．５）
中に再可溶化し、遠心分離にかけて不溶の蛋白質を除去
し、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフ・カラム
上で燐酸ナトリウムＭ街液（ｐＨ６，５）を用いて流出
させ精製された３８，０００ダルトンまたは４０，００
０ダルトンの蛋白質を回収する分子量が３８，０００ダ
ルトンまたは４０，０００ダルトンのヘモフィルス・イ
ンフルエンザｂ型主外層膜蛋白質を分離、精製する方法
。
８、酸化されたポリリボシル−リビトール−フォスフェ
ート多糖体断片は、精製したポリリボシル−リビトール
−フォスフェート多糖体を過ヨー素酸ナトリウム、過ヨ
ー素酸カリウム及び過ヨー素酸から成る群から選ばれた
過ヨー素酸化合物を用いて暗中で４〜２５℃において処
理し、発熱物質を含まない水に対して透析を行うが、ま
たはゲル濾過クロマトグラフ法で精製し、次いで遠心分
離にかけ酸化されたポリリボシルーリビｌ−−ルーフオ
スフェート多糖体を乾燥することによりつくられる上記
第１項記載の方法。
ート多糖体断片は、精製したポリリボシル−リビトール
−フォスフェート多糖体を過ヨー素酸ナトリウム、過ヨ
ー素酸カリウム及び過ヨー素酸から成る群から選ばれた
過ヨー素酸化合物を用いて暗中で４〜２５℃において処
理し、発熱物質を含まない水に対して透析を行うが、ま
たはゲル濾過クロマトグラフ法で精製し、次いで遠心分
離にかけ酸化されたポリリボシルーリビｌ−−ルーフオ
スフェート多糖体を乾燥することによりつくられる上記
第１項記載の方法。
９．免疫原性をもった多糖体−蛋白質複合体は、上記第
６記載の方法によりつくられた主外層膜蛋白質を上記第
８項記載の方法で−）くられた酸化されたポリリボシル
−リビトール−フォスフェート多糖体とｐＨ３，５〜９
において緩衝液中で混合１−１酸化されたポリリボシル
−リビトール−フォスフェート多糖体と主外層膜蛋白質
との間にシッフ塩基結合をつくり、この結きを適当な硼
水素化物還元剤で還元し、得られた複自体をゲル濾過カ
ラム・クロマトグラフ法または透析法により精製するこ
とによりつくられる上記第１項記載の方法。
６記載の方法によりつくられた主外層膜蛋白質を上記第
８項記載の方法で−）くられた酸化されたポリリボシル
−リビトール−フォスフェート多糖体とｐＨ３，５〜９
において緩衝液中で混合１−１酸化されたポリリボシル
−リビトール−フォスフェート多糖体と主外層膜蛋白質
との間にシッフ塩基結合をつくり、この結きを適当な硼
水素化物還元剤で還元し、得られた複自体をゲル濾過カ
ラム・クロマトグラフ法または透析法により精製するこ
とによりつくられる上記第１項記載の方法。
１０、免疫原性をもった多糖体−蛋白質座合体は、上記
第７記載の方法によりつくられた主外層膜蛋白質を上記
第８項記載の方法でつくられた酸化されたポリリボシル
−リビトール−フォスフェート多糖体とｐＨ３，５〜９
においてａｒｅ液中で混合し、酸化されたポリリボシル
−リビトール−フォスフェート多糖体と主外層膜蛋白質
との間にシッフ塩基結合をつくり、この結合を適当な硼
水素化物還元剤で還元し、得られた複自体をゲルー過カ
ラム・クロマトグラフ法または透析法により精製するこ
とによりつくられる上記第１項記載の方法。
第７記載の方法によりつくられた主外層膜蛋白質を上記
第８項記載の方法でつくられた酸化されたポリリボシル
−リビトール−フォスフェート多糖体とｐＨ３，５〜９
においてａｒｅ液中で混合し、酸化されたポリリボシル
−リビトール−フォスフェート多糖体と主外層膜蛋白質
との間にシッフ塩基結合をつくり、この結合を適当な硼
水素化物還元剤で還元し、得られた複自体をゲルー過カ
ラム・クロマトグラフ法または透析法により精製するこ
とによりつくられる上記第１項記載の方法。
第１図は主外層膜蛋白質の５ＯＳ−ＰＡにＥによる分析
を示す、レーン＾：分子量標準（ティプシン阻害剤、２
１に；炭酸脱水酵素、３１に；卵アルブミン、４５に；
血清アルブミン、６６に；フォスフォリラーゼｂ、９２
Ｋ）；レーンＢ、 Ｃ，Ｄ：ヘモフィルス・インフル
エンザｂ型（レダールＣＩ株及びレダールーに株）及び
ヘモフィルス・インフルエンザの非典型的な株から得ら
れる部分的に精製された外層膜蛋白質：レーンＥ：ヘモ
フイルス・インフルエンザｂ型（レダールＣＩ株）から
得られる精製された４０に蛋白質：レーンＦ ：ヘモフ
イルス・インフルエンザｂ型（レダールＩＩＩＫ株）か
ら得られる精製された３８に蛋白質である。 第２図は２％のオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを
含む５０ｍＭ〜ＩＭの直線的勾配をもった燐酸塩Ｉ！衝
澄液ｐＨ６，５）１００ ｍｌを使用し４０に蛋白質の
試料をヒドロキシルアパタイト・カラムを用いクロマト
グラフにかけた結果を示す、ピアースのＢＣ＾蛋白質試
験機により５６２１１Ｍの吸光度を用いて各背画部分力
蛋白質含量を測定した。 第３図は（ａ）２％のオクチル−β−Ｄ−グルコピラノ
シドを含む０．２Ｎ燐酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）、次い
で（ｂ）２％のオクチル−β−ローグルコピラノシドを
含む１．ＯＭ燐酸塩ＭＷＩ液（ｐＨ６，５）の階段的燐
酸塩勾配を使用し、４０に蛋白質の試料をヒドロキシル
アパタイト・カラムを用いクロマトグラフにかけた結果
を示す。第２図と同様に分画部分の測定を行った。 第４図は第３図の階段的燐酸塩勾配を使用し、３８に蛋
白質の試料をヒドロキシルアパタイト・カラムを用いク
ロマトグラフにかけた結果を示す。 第２図と同様に分画部分の測定を行った。 ９２Ｋ −ｍ− ６６Ｋ □ ４５Ｋ −１が一□ １−一、、１ｊ１−一１．。 ３１い、−□１ □′−１１ ２１Ｋ −＠ｍ 第２図 分画番号＋ ２ＭＬ １ ＢＣＡ蛋白質試１峡 吸光度 （５６２ｎｍ ）
を示す、レーン＾：分子量標準（ティプシン阻害剤、２
１に；炭酸脱水酵素、３１に；卵アルブミン、４５に；
血清アルブミン、６６に；フォスフォリラーゼｂ、９２
Ｋ）；レーンＢ、 Ｃ，Ｄ：ヘモフィルス・インフル
エンザｂ型（レダールＣＩ株及びレダールーに株）及び
ヘモフィルス・インフルエンザの非典型的な株から得ら
れる部分的に精製された外層膜蛋白質：レーンＥ：ヘモ
フイルス・インフルエンザｂ型（レダールＣＩ株）から
得られる精製された４０に蛋白質：レーンＦ ：ヘモフ
イルス・インフルエンザｂ型（レダールＩＩＩＫ株）か
ら得られる精製された３８に蛋白質である。 第２図は２％のオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを
含む５０ｍＭ〜ＩＭの直線的勾配をもった燐酸塩Ｉ！衝
澄液ｐＨ６，５）１００ ｍｌを使用し４０に蛋白質の
試料をヒドロキシルアパタイト・カラムを用いクロマト
グラフにかけた結果を示す、ピアースのＢＣ＾蛋白質試
験機により５６２１１Ｍの吸光度を用いて各背画部分力
蛋白質含量を測定した。 第３図は（ａ）２％のオクチル−β−Ｄ−グルコピラノ
シドを含む０．２Ｎ燐酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）、次い
で（ｂ）２％のオクチル−β−ローグルコピラノシドを
含む１．ＯＭ燐酸塩ＭＷＩ液（ｐＨ６，５）の階段的燐
酸塩勾配を使用し、４０に蛋白質の試料をヒドロキシル
アパタイト・カラムを用いクロマトグラフにかけた結果
を示す。第２図と同様に分画部分の測定を行った。 第４図は第３図の階段的燐酸塩勾配を使用し、３８に蛋
白質の試料をヒドロキシルアパタイト・カラムを用いク
ロマトグラフにかけた結果を示す。 第２図と同様に分画部分の測定を行った。 ９２Ｋ −ｍ− ６６Ｋ □ ４５Ｋ −１が一□ １−一、、１ｊ１−一１．。 ３１い、−□１ □′−１１ ２１Ｋ −＠ｍ 第２図 分画番号＋ ２ＭＬ １ ＢＣＡ蛋白質試１峡 吸光度 （５６２ｎｍ ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ヘモフィルス・インフルエンザｂ型の莢膜多
糖体から誘導された酸化されたポリリボシル−リビトー
ル−フォスフェート多糖体断片、及び（ｂ）分子量が約
３８，０００〜４０，０００ダルトンのヘモフィルス・
インフルエンザｂ型外層膜蛋白質の還元アミノ化生成物
から成ることを特徴とする免疫原性をもった多糖体−蛋
白質複合体。 ２、特許請求の範囲第１項記載の免疫原性をもった複合
体から成ることを特徴とするワクチン。 ３、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型を不活性化し、
このバクテリアを水中に懸濁させ、この懸濁液の塩化ヘ
キサデシルトリメチルアンモニウムの最終濃度を２％（
ｗ／ｖ）にし、該懸濁液を１〜２時間激しく振盪し、該
懸濁液を遠心分離にかけ、ペレットを取り出し、このペ
レットを再び水に懸濁させ、この懸濁液の塩化カルシウ
ム最終濃度を０．２５Ｍにし、該懸濁液を遠心分離にか
け、懸濁液にエタノールを加えてその最終濃度を２０％
（ｖ／ｖ）にし、調合物を沈澱させ、遠心分離により沈
澱を除去し、エタノールで上澄液を稀釈してその濃度を
８０％（ｖ／ｖ）にし、沈澱を遠心分離にかけてペレッ
ト中の３８，０００または４０，０００ダルトンの外層
膜蛋白質を沈澱させ、この蛋白質を２％のオクチル−β
−Ｄ−グルコピラノシドを含むイミダゾール緩衝液（ｐ
７．０）中に再可溶化し、遠心分離にかけて不溶の蛋白
質を除去し、陰イオン交換クロマトグラフ・カラム上で
イミダゾール緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて流出させ精
製された３８，０００ダルトンまたは４０，０００ダル
トンの蛋白質を回収することを特徴とする分子量が３８
，０００ダルトンまたは４０，０００ダルトンのヘモフ
ィルス・インフルエンザｂ型主外層膜蛋白質を分離、精
製する方法。 ４、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型を不活性化し、
このバクテリアを水中に懸濁させ、この懸濁液の塩化ヘ
キサデシルトリメチルアンモニウムの最終濃度を２％（
ｗ／ｖ）にし、該懸濁液を１〜２時間激しく振盪し、該
懸濁液を遠心分離にかけ、ペレットを取り出し、このペ
レットを再び水に懸濁させ、この懸濁液の塩化カルシウ
ム最終濃度を０．２５Ｍにし、該懸濁液を遠心分離にか
け、懸濁液にエタノールを加えてその最終濃度を２０％
（ｖ／ｖ）にし、調合物を沈澱させ、遠心分離により沈
澱を除去し、エタノールで上澄液を稀釈してその濃度を
８０％（ｖ／ｖ）にし、遠心分離にかけてペレット中の
３８，０００または４０，０００ダルトンの外層膜蛋白
質を沈澱させ、この蛋白質を２％のオクチル−β−Ｄ−
グルコピラノシドを含むイミダゾール緩衝液（ｐ７．０
）または燐酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）中に再可溶化し、
遠心分離にかけて不溶の蛋白質を除去し、この上澄液を
エタノールで稀釈してエタノール濃度を６６％（ｖ／ｖ
）にし、遠心分離にかけてペレット中の３８，０００ま
たは４０，０００ダルトンの外層膜蛋白質を沈澱させ、
２％のオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む２０
０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ６．５）中に再可溶化し、
遠心分離にかけて不溶の蛋白質を除去し、ヒドロキシル
アパタイト・クロマトグラフ・カラム上で燐酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて流出させ精製された３
８，０００ダルトンまたは４０，０００ダルトンの蛋白
質を回収することを特徴とする分子量が３８，０００ダ
ルトンまたは４０，０００ダルトンのヘモフィルス・イ
ンフルエンザｂ型主外層膜蛋白質を分離、精製する方法
。 ５、酸化されたポリリボシル−リビトール−フォスフェ
ート多糖体断片は、精製したポリリボシル−リビトール
−フォスフェート多糖体を過ヨー素酸ナトリウム、過ヨ
ー素酸カリウム及び過ヨー素酸から成る群から選ばれた
過ヨー素酸化合物を用いて暗中で４〜２５℃において処
理し、発熱物質を含まない水に対して透析を行うか、ま
たはゲル濾過クロマトグラフ法で精製し、次いで遠心分
離にかけ酸化されたポリリボシル−リビトール−フォス
フェート多糖体を乾燥することによりつくられることを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、免疫原性をもった多糖体−蛋白質複合体は、特許請
求の範囲第３記載の方法によりつくられた主外層膜蛋白
質を、特許請求の範囲第５項記載の方法でつくられた酸
化されたポリリボシル−リビトール−フォスフェート多
糖体とｐＨ３．５〜９において緩衝液中で混合し、酸化
されたポリリボシル−リビトール−フォスフェート多糖
体と主外層膜蛋白質との間にシッフ塩基結合をつくり、
この結合を適当な硼水素化物還元剤で還元し、得られた
複合体をゲル濾過カラム・クロマトグラフ法または透析
法により精製することによりつくられることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、免疫原性をもった多糖体−蛋白質複合体は、特許請
求の範囲第４記載の方法によりつくられた主外層膜蛋白
質を、特許請求の範囲第５項記載の方法でつくられた酸
化されたポリリボシル−リビトール−フォスフェート多
糖体とｐＨ３．５〜９において緩衝液中で混合し、酸化
されたポリリボシル−リビトール−フォスフェート多糖
体と主外層膜蛋白質との間にシッフ塩基結合をつくり、
この結合を適当な硼水素化物還元剤で還元し、得られた
複合体をゲル濾過カラム・クロマトグラフ法または透析
法により精製することによりつくられることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18320688A | 1988-04-19 | 1988-04-19 | |
| US183206 | 1988-04-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0276824A true JPH0276824A (ja) | 1990-03-16 |
Family
ID=22671900
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1095439A Pending JPH0276824A (ja) | 1988-04-19 | 1989-04-17 | ヘモフイルス・インフルエンザｂ型の酸化された多糖体―外層膜蛋白質複合体ワクチン |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0338265B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0276824A (ja) |
| AT (1) | ATE105189T1 (ja) |
| AU (1) | AU627455B2 (ja) |
| DE (1) | DE68915046T2 (ja) |
| ES (1) | ES2051909T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007197419A (ja) * | 1993-12-24 | 2007-08-09 | Ilexus Pty Ltd | 抗原炭水化物複合体及びその免疫療法への応用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0378929A3 (en) * | 1988-12-23 | 1990-08-01 | Connaught Laboratories Limited | Membrane proteins and peptides of haemophilus influenzae type b |
| SE466259B (sv) * | 1990-05-31 | 1992-01-20 | Arne Forsgren | Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal |
| ES2131066T3 (es) * | 1990-12-21 | 1999-07-16 | Antex Biolog Inc | Vacuna de conjugacion de oligosacarido con adhesina para hi(haemophilus influenzae). |
| US5843463A (en) * | 1990-12-21 | 1998-12-01 | Antexbiologics, Inc. | Adhesin-oligosaccharide conjugate vaccine for Haemophilus influenzae |
| CA2059693C (en) * | 1991-01-28 | 2003-08-19 | Peter J. Kniskern | Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae |
| CA2059692C (en) * | 1991-01-28 | 2004-11-16 | Peter J. Kniskern | Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine |
| EP0647139A4 (en) * | 1992-06-22 | 1997-09-03 | Microcarb Inc | CONJUGATE VACCINE FROM ADHESINE OLIGOSACCHARIDE AGAINST -i (HEMOPHILUS IN FLUENZA). |
| US5439808A (en) * | 1993-07-23 | 1995-08-08 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis |
| US5681570A (en) * | 1995-01-12 | 1997-10-28 | Connaught Laboratories Limited | Immunogenic conjugate molecules |
| US5747287A (en) * | 1995-04-28 | 1998-05-05 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis |
| CA2297072A1 (en) * | 1997-07-17 | 1999-01-28 | Baxter Healthcare S.A. | Immunogenic conjugates comprising a group b meningococcal porin and an h. influenzae polysaccharide |
| CA3052621A1 (en) | 2017-02-03 | 2018-08-09 | Schadeck, Eva Barbara | Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof |
| WO2019070994A1 (en) | 2017-10-04 | 2019-04-11 | Liffey Biotech Limited | SACCHARIDE-POLYPEPTIDE CONJUGATE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4356170A (en) * | 1981-05-27 | 1982-10-26 | Canadian Patents & Development Ltd. | Immunogenic polysaccharide-protein conjugates |
| US4673574A (en) * | 1981-08-31 | 1987-06-16 | Anderson Porter W | Immunogenic conjugates |
| US4451446A (en) * | 1982-03-04 | 1984-05-29 | Smithkline-Rit | Process for the preparation of polysaccharide-protein complexes from bacterial capsules, obtained products and immunogenic compositions containing them |
| US4623574A (en) * | 1985-01-14 | 1986-11-18 | Allied Corporation | Ballistic-resistant composite article |
| US4707543A (en) * | 1985-09-17 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Process for the preparation of detoxified polysaccharide-outer membrane protein complexes, and their use as antibacterial vaccines |
| NZ223009A (en) * | 1986-12-31 | 1990-06-26 | Nl Rivm Of Thoven | Oligosaccharides containing d-ribose d-ribitol and phosphate units mimicing haemophilus influenzae type b antigens |
-
1989
- 1989-03-21 DE DE68915046T patent/DE68915046T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-21 AT AT8989104996T patent/ATE105189T1/de active
- 1989-03-21 ES ES89104996T patent/ES2051909T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-21 EP EP89104996A patent/EP0338265B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-17 JP JP1095439A patent/JPH0276824A/ja active Pending
- 1989-04-18 AU AU33137/89A patent/AU627455B2/en not_active Ceased
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|---|---|---|---|---|
| JP2007197419A (ja) * | 1993-12-24 | 2007-08-09 | Ilexus Pty Ltd | 抗原炭水化物複合体及びその免疫療法への応用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE105189T1 (de) | 1994-05-15 |
| EP0338265A3 (en) | 1989-12-13 |
| AU3313789A (en) | 1989-10-26 |
| ES2051909T3 (es) | 1994-07-01 |
| AU627455B2 (en) | 1992-08-27 |
| DE68915046T2 (de) | 1994-12-08 |
| DE68915046D1 (de) | 1994-06-09 |
| EP0338265B1 (en) | 1994-05-04 |
| EP0338265A2 (en) | 1989-10-25 |
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