JPH0279968A - 微生物の作成方法、ヘテロ多糖類を製造するためのこの種の微生物の使用、およびこの使用のための微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、細菌を培養することによるヘテロ多糖類の製
造方法、ヘテロ多ＩＩｉ類の生産増大を特徴とする細菌
、並びにこの種の細菌の作成方法に関するものである。

〔従来の技術〕

ヘテロ多ネ唐類（特にスクシノグルガン）は、たとえば
ヨーロッパ特許第００４０４４５号（Ｋ　１４８０ＲＰ
Ｃ）に記載されたシュードモナスｓｐ、ＮＣＩ　Ｂ　１
１５９２のような成る種の微生物により炭水化物源を発
酵させて製造しうろことが知られている。

このヨーロッパ特許明細書は、油回収に用いられる水溶
液の増粘剤としてヘテロ多糖類を使用することを完全に
開示している。極く最近、微生物Ｎ　ＣＩ　８１１８８
３が、リントン等（１９８？）（この文献およびその他
の文献については後記に一覧表として示す〕により開示
されかつヨーロッパ特許第０１３８２５５号（Ｋ　１９
２４ＲＰＣ）に記載されたように、分離されている。こ
れは、ＮＧＩＢ１１５９２よりもずっと速い速度で多糖
類を生産すると思われる。さらに、培養物の希釈係数に
より表わされる増粘力としての生産性は、シュードモナ
スｓ　ｐ、　ＮＣＩ　Ｂ　１１５９２におけるよりも菌
株ＮＣＩ　Ｂ　１１８８３においてずっと高い。

嫌気増殖しうる大抵の細菌は、ホスホエノールピルベー
トを消費しなからグルコースの吸収および同時のホスホ
リル化を触媒するホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ
）を有すると思われる。これに対し、前記種類のグルコ
ース吸収系は、グルコース移動につき研究されている極
めて限られた数の好気細菌にしか存在しないと思われる
が、シェードモナス・エアルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）にはフラクトース特異
性ＰＴＳが確認されている。

両者ともペリプラスム蛋白に関与するグルコース吸収の
ための他の２つの経過がＰ、エアルギノーサで確認され
ている。グルコース過剰かつ酸素充足の条件下で連続培
養して増殖させる際、この微生物は直接的にはグルコー
スを吸収しないが、２種のベリプラスム酵素（すなわち
グルコースデヒドロゲナゼおよびグルコネートデヒドロ
ゲナーゼ）を産生じて順次にグルコースをグルコネート
および２−ケトグルコネートまで酸化し、次いで特異的
移動系を介しこれらを吸収する（ミツシレーおよびダウ
ニス（１９７３）；ロバーツ等（１９７３）；ホワイテ
ィング等（１９７３））。

この菌体外酸化系はグルコース制限下での増殖に際し抑
制され〔ホワイティング等（１９７６）　）　、かつグ
ルコースは高親和性の移動系を介して直接に吸収される
〔ミツシレーおよびダウニス（１９７３））　。

この移動系はペリプラスム性グルコース結合蛋白を含み
〔スチンソン等（１９７７））、したがって成る種の糖
類、アミノ酸および無機イオンに関する結合蛋白依存性
の移動系と類似していると思われ、腸内細菌において詳
細に研究されている〕エイムス（１９８６））。

アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏ−ｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ　）　Ｎ　Ｃ
Ｉ　Ｂ　１１８８３、すなわち工業上重要である最近分
離された好気細菌は、間接的な酸化経路によってグルコ
ースを代謝することができない。何故なら、・ＰＱＱ　
（ピロロキノリンキノン）補因子を欠如した非官能性ア
ポ酵素型のグルコースデヒドロゲナーゼを生成するから
である〔リントン等（１９８６）；コーニッシュ等（１
９Ｂ？））。

〔発明の要点〕

本発明は、Ｎ　ＣＩ　Ｂ　１１８８３よりも急速にグル
コースからヘテロ多糖類を生産する微生物を前記公知の
微生物から誘導しうるという格別の知見に基づくもので
あり、これら微生物を得るための一般的過程に関しこれ
ら微生物を誘導する蒸機生物と対比して向上した多糖類
もしくはその他の菌体外物質の生産を示すという知見に
基づいている。

本発明による方法は、第１微生物から第２微生物を誘導
し、各微生物は炭素含有基質の存在下に増殖させる際に
菌体外生成物を生産する能力を有し、かつ第１微生物の
基質吸収系は菌体外生成物の生産につき制限的であり、
この方法は第１微生物を基質制限下に増殖させると共に
、第２微生物を基質吸収系が少なくとも部分的に抑制解
除された際に分離することを特徴とする。分離された第
２微生物を好ましくは窒素制限下で増殖させることによ
り菌体外生産物を回収することができる。

菌体外生産物はたとえばヘテロ多Ｉ！類であり、たとえ
ばグルコースとグルコース各７モル当り０．９〜１．２
モルのガラクトースと０，６５〜１．１モルのピルベー
トとをＯ〜２のモル比（グルコース７モルに対し）のス
クシネートおよびアセテートと一緒に含んでなるペテロ
多ｔＩｉ類であり、かつ炭素基質はグルコースとするこ
とができる。

本発明は、グルコース制限下の連続培養における増殖に
際し、Ａ、ラジオバクターがグルコースを直接に吸収す
るためのメカニズムの知見に基づいている。

Ｎ　ＣＩ　８１１８８３を低希釈率にてグルコース制限
下での連続培養で増殖させると、全菌体はエネルギー依
存性メカニズムによりグルコースを移動させて＞２００
０の蓄積比を示した。全菌体蛋白の約４５％までを構成
する３種のベリプラスム蛋白が精製された。これら３種
のうちの２種、すなわち本明細書において規定されるＧ
ＢＰＩ（Ｍ。

３６５００　）およびＧ　Ｂ　Ｐ　２　（Ｍｒ　３３５
００　）は高親和性（それぞれＫＤｏ、２３および０．
０７Ｍ）にてＤグルコースを結合したのに対し、第３の
蛋白（Ｍｒ　３０５００　）は結合能力を示さなかった
（ＧＢＰ＝グルコース結合性蛋白）。各種の同族体を用
いる競合実験は、Ｃ−６においてグルコースと相違する
物質（たとえば６−クロル−６−デオキシＤ−グルコー
スおよび６−ゾオキシーＤ−グルコース）がＧＢＰＩお
よびＧＢＰ２の両者に対するグルコースの結合を可変的
に減少させるのに対し、Ｃ−４にて相違する物質（たと
えばＤ−ガラクトース）のみがＧＢＰ２に対し有効であ
ることを示した。グルコース吸収速度およびグルコース
結合性蛋白の濃度は、本明細書にてＡＲ１８およびＡＲ
９として同定された新規な菌株の出現によりグルコース
制限下での長時間の増殖に際し平行的に増大し、ここで
ＧＢＰＩもしくはＧＢＰ２のいずれか一方の合成がそれ
ぞれ抑制解除された。

したがって明らかに、Ａ、ラジオバクターは、グルコー
ス移動に関与しかつグルコース制限下での増殖に際し抑
制解除が最大となる２種の異なるベリプラスム結合性蛋
白を合成する。菌株ＡＲ１Ｂに近似した菌株も、同様な
低希釈率にてガラクトース制限条件下での連続培養に際
しＮ　ＣＩ　Ｂ　１１８８３の増殖期間中に作成された
。

これら新たに出現した菌株を分離した。ＡＲ１８は１９
８８年５月６日付けでＮＣＩＢに受託番号Ｎ　ＣＩ　Ｂ
４Ｏ０１８として寄託した。

ＡＲ１８は増加した有効濃度のＧＢＰＩを含有すると共
に、たとえば低希釈率におけるアンモニア制限連続培養
にて或いはアンモニア消費に基づくバッチ式培養のいず
れかにおいてグルコースを炭素源としながら増殖させる
と、Ｎ　ＣＩ　Ｂ　１１８８３に比較してヘテロ多ＩＩ
類（特にスクシノグルカン）の生産を増大する。したが
って本発明は、特にアグロバクテリウム・ラジオバクタ
ーＭＣＩＢ　４００１．８、およびヘテロ多１ｍを製造
するためのその使用に関するものである。菌株ＡＲ１８
によるグルコース吸収はアンモニア制限下において原菌
株もしくは菌株ＡＲ９のいずれかを同じ条件下で培養さ
せる場合よりも顕著に抑制が低く、このことは比較的高
いＧＢＰＩの濃度および顕著に高いスクシノグルカン合
成の速度の両者に反映された。グルコース移動の阻止剤
として６−クロル−６−ゾオキシー〇−グルコースを用
いるフランクスコントロール分析は、スクシノグルカン
生産に関し前記グルコースが主たる速度調整点であるこ
とを示した。

したがって、特にＧＢＰＩ−依存系を介するＡ。

ラジオバクターによるグルコース吸収はアンモニア制限
下での増殖に際し部分的にのみ抑制され、さらにこの微
生物は過剰量をスクシノグルカンに変換することにより
過剰のグルコースを蓄積するという顕著な感作用を回避
すると思われる。

ＡＲ１８は、全菌体蛋白の比率として３０％までのＧＢ
ＰＩを含有する。蒸機生物のＧＢＰＩ含有量は約５％で
ある。これらはグルコース制限下での数値である。ＧＢ
Ｐ２　（すなわちＮＣｌＢ１１８８３における明らかに
第２のグルコース吸収制限結合性蛋白）は、ＡＲ１８に
おいて効果的に抑制された。

２種の基質結合性蛋白を含有する他の基質吸収系も、任
意適当な菌種にて同様に改変することができる。長時間
の基質制限増殖も、本発明により他の基質吸収系を抑制
解除すると期待することができる。これらの方法は、Ｎ
ＣＩ　Ｂ　１１８８３−ＡＲ１８の特定例におけると同
様に、両者とも再現性がありかつ少くとも部分的に可逆
性である。

本発明により改変された微生物の菌体外生産物はスクシ
ノグルカンヘテロ多Ｗ類からなり、これはグルコースと
グリコース各７モルにつき０．９〜１、２モルのガラク
トースと０．６５〜１．１モルのピルベートとをＯ〜２
のモル比（グルコース７モル当り）におけるスクシネー
トおよびアセテートと共に含む。その種のスクシノグル
カンヘテロ多糖類は、ヨーロッパ特許第００４０４４５
号に記載されている。この目的で、微生物を好気培養に
より水性栄養培地中で増殖させる。この方法は好適には
、供給および抜取りを伴うまたは伴わないバッチ方式も
しくは供給−バッチ方式、或いは連続法として行なうこ
とができる。生産性の観点から、連続法または供給およ
び抜取法が好適である。

好ましくは、微生物を化学的に規定された培地中で酵母
抽出物の不存在下に増殖させる。より好ましくは、この
方法は非炭素源の栄養制限条件下、たとえば窒素制限も
しくは窒素消費の条件下で行なわれる。化学的に規定さ
れた培地の使用が有利である。何故なら、所定の生産性
または所定の最終菌体濃度につき、たとえば酵母抽出物
または蒸留乾燥溶解物のような複雑な窒素源を取扱うよ
りも、たとえばグルタミン酸ナトリウム、アンモニウム
塩もしくは硝酸塩のような窒素源を取扱う方が一層容易
であるからである。好ましくは、窒素源はグルタミン酸
ナトリウム、硫酸アンモニウムおよび硝酸ナトリウムよ
りなる群から選択される。

さらに本発明は、上記方法により製造されるヘテロ多ｖ
Ｍ類、および水溶液における粘度改質剤としてのへテロ
多糖類の使用に関するものである。

さらに本発明は、本発明のへテロ多糖類により増粘され
た水性系に関するものである。好ましくは水性系は完成
液、後処理液、刺激液および掘削液よりなる群に属する
。たとえば刺激液は、ハイドロフラクチャリングおよび
酸フラクチャリングに使用される。大抵の完成液、後処
理液、掘削液および刺激液は少なくとも１種の他の添加
剤、たとえば塩類（全ゆるブライン中に存在しうるよう
な塩類）、液体逸散防止剤、粘土安定剤、酸類、塩基類
、表面活性剤などを含有する。しかしながら、増粘すべ
き水性系は印刷インキ或いはフレンチドレッシングとす
ることもできる。

水と０．０６〜１．５重量％の上記へテロ多糖類とから
なる掘削液が、他の本発明の好適具体例である。さらに
、本発明は油井の処理方法をも包含し、この方法は油井
中に水０．０５〜１．５重量％の上記ペテロ多Ｉｌ！類
とからなる水性媒体を導入することを特徴とする。この
水性媒体は、好適にはブラインであり、所望に応じて添
加剤を含有することもできる。

さらに本発明は、石油回収の向上（ＥＯＲ）における上
記へテロ多糖類からなる水溶液の使用にも関するもので
ある。ＥＯＲにおける使用は、油井および／または油井
と連通ずる透過性地下地質構造に流体を移動させるため
、或いは移動性緩衝液としての移動性調節、たとえば表
面活性剤ミセルフランドとすることができ、或いは水発
生を減少させ、水／石油の比率を減少させるなどの地形
調節に使用することができる。

一般に本発明は、菌体外物質の既知の生産速度を増大さ
せる可能性を与える。制限因子を確認しかつ減少させう
る能力は、実質的に限定はしないが一般に抑制された基
質結合性蛋白のための遺伝子を分離し、或いはその合成
に関連するゲノムの１部を分離して、これを所望の産生
物を作成しうる適当な宿主中にクーロン化させるという
選択を可能にする。

〔実施例〕

以下、添付図面を参照しながら本発明を実施例につきさ
らに説明する。

方法（１） ′生　および１殖　牛 アグロバクテリウム・ラジオバクターＮＣｌＢ１１８８
３を、グルコース（４ｇ　ｌ−’）と硫酸アンモニウム
（３ｇ　ｌ−’）とニトリロ三酢酸（０，１４２ｇ　１
−１　）とが補充された化学的に規定した培地〔リント
ン等、＜１９８７））を用いてグリコース制限下の連続
培養（Ｄ＝０．０４５　ｈ−’）にて３０℃で増殖させ
た。この微生物を、２．１ｇ乾燥ｗＬｌ−’の定常状態
ビオマス密度にて２１作業容積のＬＨシリーズ５００ケ
モスタットで増殖させた。

Ｉ生■歪腹■生戊 コーニソシエ等（１９８７）により記載されたように、
２０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）を用いて
菌体懸濁物を作成した。

グルコース　　の渭 ６０秒間にねたり全菌体中へのＤ−（Ｌｌ−ＣＩ４）グ
ルコースの取入れを測定することにより、グルコース吸
収速度を決定した。分析は、１　ｍｌの２０ｍＭ　　Ｈ
ＥＰＥＳ／ＫＯ）Ｉ緩衝液（ｐＨ７，０）と１ｍｇの乾
燥重量菌体とを含有する開口頂部ランク酸素電極容器で
行なった。容器の内容物を３０℃に維持し、かつこれを
磁気撹拌機により連続混合した。

Ｄ−（Ｕ−Ｃ”）グルコース〔２ＩＩＩＣ１ミリモノＬ
／−１（７４ＭＢｑ　ミリモル−１，０，５μＣｉ　（
１８，５ＫＩｌ）　）を最終濃度２５０μＨとなるまで
添加することにより分析を開始させた。反応混合物の試
料（５０μｌ）を１５秒間隔で抜取り、かつ菌体を減圧
経路に接続されたマニホールドを介し０．４５μ−の孔
径（直径２．５　ｃｍ　；サルトリウス）のニトロセル
ロースフィルタに集めた。これらフィルタを直ちに３　
ｍｌの２０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，０）で洗浄
し、赤外ランプの下で乾燥させ、次いで３Ｌ１１１のフ
ィンフルオル３シンチレーシヨン剤（フイソンス・リミ
テッド社）に浸漬した。菌体中への（Ｃ”）グルコース
の取入れ程度を、ヒユーレット・パラカード・トリーカ
ルブ液体シンチレーションカウンタ（効率８０〜８５％
）を用いてフィルタ上の放射能を計数することにより決
定した。

グルコース吸収速度を各菌体バッチにつき３反復で測定
し、標準誤差は決して平均値の１０％を越えなかった。

低濃度の基質（１〜５μｈ）にてグルコース吸収速度を
測定するため、菌体密度を０．０１ｍｇ　ｍｊ！　−’
まで減少させ、（Ｃ”）グリコースの比活性を８４ｍＣ
１ミリモル−’（３，２Ｇｂｑ　ミリモル−Ｉ）まで増
大させ、かつ菌体中へのＣ１４−標識の組込み速度を３
５秒間にわたり測定した。これらの改変により、２０％
未満のグルコースが培養期間中に消費されるように確保
した。

グルコースを蓄積するＡ、ラジオバクターの能力を、菌
体懸濁物（１ｍｇ乾燥−ｔ　ｍｌ−’）をＤ（Ｕ−Ｃ”
）グルコース（８４ｍＣｉ　　ミリモル−１〕（３，２
Ｇｂｑ　ミリモル−’）：２０μ初期濃度〕と共に培養
して決定した。懸濁物の試料（１００μｉ）をグルコー
スが添加されてから１０秒間後に抜取り、かつ菌体を減
圧が過によりニトロセルロースフィルタ（孔径０．４５
μｆｆ１）の上に集めた。これらフィルタを３　ｒａｌ
の緩衝液で直ちに洗浄し、かつ２０ｍ１の沸とう水中に
浸漬した。４枚のフィルタから作成された水性抽出物を
集め、凍結乾燥し、かつ残留物を２　ｍｌの水に溶解さ
せた。菌体のグルコース含有量を測定し、その際ペーパ
ークロマトグラフィーにより抽出物中に存在する他の標
識代謝物から（Ｃ１４）グルコースを公邸した後に液体
シンチレーションカウンタを用いた。炉液と洗液との混
合試料を同様に計数して、サンプリング時点におけるグ
ルコースを菌体外濃度を決定した。

未標識のグルコース同族体（ｌＱｍＭ）が（ＣＩ４）グ
ルコース（２５０ｇＭ）の吸収速度を低下させる程度を
決定することにより、移動系の基質特異性を試験した。

菌体懸濁物をグルコース同族体と共に５秒間培養した後
、〔Ｃ″〕〕グルコース加した。必要に応じ、グルコー
スを添加する１０秒前に菌体懸濁物にカルボニルシアナ
イドｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（Ｆ
ＣＣＰ）（ジメチルホルムアミド中１０ｍＭの保存溶液
２μｍ）を添加した。溶剤単独の存在は吸収に影響を与
えなかった。

漫透圧之ｌヱ久 これは、実質的にノイおよびヘラペル（１９６５）に記
載されたように行なったが、ただし原形質分離菌体には
蒸留水の代りに水冷２０ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐｌ
＋　６．８　）によりショックをかけた。

Ｆ’Ｐ　Ｌ　Ｃ 浸透圧ショックにより放出されたペリプラズム蛋白を、
陰イオン交換急速蛋白液体クロマトグラフィー（Ｆ　Ｐ
　Ｌ　Ｃ）によって分離した。ショック流体の試料（５
〜１０ｍｇの蛋白を含有する１０〜１５ｍ１）を孔径０
．４５μｍのアクロディスクフィルタ（ゲルマンリミテ
ッド社）に通過させて粒状物質を除去すると共に、炉液
を２０ｍＭビス−トリス（ｐＨ６，８）で平衡化された
モノーＱカラム（ファルマシア社）に充填した。これら
の条件下で全ペリプラスム蛋白がカラムに結合し、次い
でこれを直線的ＫＣ１？ａ度勾配（ＫＣＩＩ４度を１　
ｍｊ！ｍ１ｎ−’の流速により２０分間かけて０〜２０
０ＩｎＭの範囲で上昇させる）で溶出させた。流出液の
蛋白含有量を２８０ｎｍにて測定した。３種の最も豊富
なペリプラズム蛋白（それぞれ１４０ｍＭ、６０ｒｒ１
Ｍおよび９０ｍＨのＫＣＩＩを用いて溶出したＭ、　−
３６５００、３３５００および３０５００は、この精製
工程の後に実質的に均質となり（ＳＤＳ−ＰＡＧＡ分析
により判定して〉９５％純度）、かつこれを必要となる
まで一２０℃にて貯蔵した。

ゲルが過ＦＰＬＣを用いて精製蛋白の寸法を推定した。

純蛋白の試料（約２００μｇの蛋白を含有する２００μ
ｌ）を、２０ｍＭビス−トリス（ｐＨ６，８）で平衡化
されたスーパーロース１２カラム（ファルマシア社）に
充填し、かつ０．３　ｍ　ｌ　ｍ１ｎ−’の流速を用い
て溶出させた。流出液の蛋白含有量を２８０ｎｍで測定
し、かつ各蛋白の滞留時間を記録した。このカラムは、
次の蛋白（括弧内にＭ。

値を示す）の混合物を用いて検量した：牛アルブミン（
１３２０００）　　（二重体）および（６６０００）　
　（単量体）；卵アルブミン（４５０００）　　；炭酸
アンヒドラーゼ（２９０００）　　ｉおよび馬−心臓チ
トクロームｃ　、　（１２４００）。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ レムリの方法（１９７０）にしたがって１２％（−ν）
アクリルアミドゲルを用いることにより、蛋白の不連続
電気泳動を行なった。Ａ、ラジオバクターの全菌体を溶
解緩衝液〔レムリ、（１９７０）　）中で４分間煮沸さ
せ、かつ２０ｇの蛋白を含有する量を各ゲルレーンに加
えた。これらゲルをケナシド・ブルーＲ〔ウェーバ−お
よびオスポーン（１９７５））により蛋白につき染色し
、次いで染色解除しかつ記録用積分計に接続されたＬＫ
Ｂレーザー密度測定器を用いて６３３ｎｍで走査した。

分子量標準としては次の蛋白を用いた（括弧内にＭ、値
を示す）：α−ラクトアルブミン（１４２００）；トリ
プシン阻止剤（２０１００）　　ｉ　）リブシノーゲン
（２４０００）　　；炭酸アンヒドラーゼ（２９０００
”）　　；グリセロアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナ
ーゼ（３６０００）　　；卵アルブミン（４５０００）
　　；および牛アルブミン（６６０００）。

を　いる　人　　の゛ これは、８−セル回転モジュール〔米国、カリホルニア
州、サンフランシスコ在、ヘーファー・サイエンティフ
ィック・インストルーメンツ社〕を用いて４℃で行なっ
た。各セルを透析膜により２つの０．５　ｍｌ容積のチ
ャンバに分割した（Ｍｒ分割＝６〜８０００）。純蛋白
（０，５ノナモル）を、０．３ｍｌのビス−トリ、２．
　（ｐ）１６．８）　ニて各セルの一方のチャンバに添
加した。対向チャンバのそれぞれには、Ｄ−（Ｕ−Ｃ１
４）グルコース（２７０ｍＣｉ　　ミリモル−’（１０
ＧＢｑ　ミリモル−１）〕を含有する０、３ｍｌのビス
−トリス（０，３１１１）を充填し、その濃度を適当な
範囲にわたって変化させた。このモジュールを毎分１０
回転の速度で３０時間回転させ（この時間で平衡が達成
される）、かつ試料（５０μｌ）を各チャンバから３反
復で採取し、３−１のフィソフルオロ２　（フィツン・
リミテッド社）で計数した。データをスカソチャードの
方法（１９４９）にしたがって分析した。

Ｄ−（Ｕ−Ｃ”）グルコースが純蛋白に結合する程度を
減少させるグルコース同族体の能力を、分析手順を次の
ように改変して決定した。各セルの一方のチャンバは０
．３ｎｌのビス−トリス（ｐＨ６，８）中に０．５ノナ
モルの純蛋白を含有し、他方のチャンバには３ノナモル
のＤ−（Ｕ−Ｃ”）グルコース（８５ｍＣｉ　　ミリモ
ル−’（３，２ＧＢｑ　ミリモル＝ｌ）〕と１２０ノナ
モルの未標識グルコース同族体とを含有する０、３ｍｊ
！の緩衝液を充填した。

未標識グルコース同族体の存在下および不存在下で蛋白
に結合した（Ｃ”）グルコースの量を、３０時間の培養
後に測定した。

パ土ス亘識 Ｌ　　（Ｓ”）、）’チｔ−７（＞８００Ｃｉミ’Ｊモ
／Ｉｚ−’（３０ＴＢｑ　ミリモル−’）：５０μＣｉ
　（１，８５ＭＢｑ）　）をＡ、ラジオバクターの対数
増殖期培養物（５０ｍｌ）に添加し、次いで１０分後に
未標識メチオニン（１ｍＭ）を添加した。試料（１，５
ｍ１）を５時間にわたり０．５時間間隔で採取し、次い
で直ちに遠心分離し、洗浄しかつ溶解用緩衝液〔レムリ
（１９７０））に再懸濁させた後、４分間煮沸した。５
ＤＳ−ＰＡＧＥの後、主たる蛋白の放射能標識を放射線
写真測定により或いは切断バンドのシンチレーション計
数〔キルターおよびジョーンズ（１９８４））によって
決定した。

征尖分扼 ６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ活性を、ビア
ズモア等の方法（１９８２）を用いて分析した。

ヱニ叉■表示 必要に応じ、数値を平均±ＳＥＭとして示し、括弧内の
数値は独立した測定値である。

−Ｍ Ｄ−（Ｕ−Ｃ”）グルコース（２７０ｍＣｉ　ミリモル
−’　（１０ＧＢｑミリモル−１）〕およびＬ−［Ｓ”
）メチオニン（＞８００Ｃｔミリモルー’（３０ＴＢｑ
　ミリモル−’）　）はアメルシャム社から購入した。

グルコース同族体はシグマ社から入手した。他の試薬は
フィツン・リミテッド社から購入し、最高級の品質で入
手した。

結果（１） 赴 ５種の独立したグルコース制限培養物につき測定したグ
ルコース吸収速度は、５５±３ｎモルｍｉｎ　−’　（
ｍｇ乾燥ｗｔ）−’の平均値を与え、これはμｍ、　　
（０，３５ｈ−’）における現場でのグルコース吸収速
度につき決定された数値と同一でありかつＤ＝０．０４
５ｈ−１における現場でのグルコース利用速度（９ｎモ
ルｌｌ１ｉｎ　−’　（ｍｇ乾燥−ｔ）−’）（リント
ン等（１９８７））よりもずっと大であった。

菌体懸濁物に（ｃ１４）グルコースを添加してから最初
の６０秒間の後、吸収速度は急激に約４０ｎモル−１（
ｍ　ｇ乾燥−ｔ）−’の数値まで低下し、これは恐らく
移動系自身の潜在的活性でなくグルコースがさらに代謝
される速度を反映している。菌体懸濁物を呼吸基質（た
とえば１０ｍＭのエタノールもしくは１０ｍＭのグリセ
リン）と共に予備培養した後に（Ｃ”）グルコースを添
加した場合は、グルコース吸収速度が上昇せず、このこ
とは内生基質の酸化（コーニッシュ等（１９８７））が
充分なエネルギーを付与してグルコース移動の最大速度
を維持したことを示している。

多数の細菌糖移動系につき、移動活性をその後の代謝か
ら隔離することが可能であり、したがって吸収系の速度
定数およびその他の重要なパラメータを決定しうろこと
が証明された。これは、非代謝性の放射能標識された天
然砂糖の同族体を蓄積する全菌体の能力を測定すること
により、或いは所定の糖を代謝しえないが適切な移動系
を保持しうる突然変異種〔ヘンダーソン（１９８６））
を用いて行なわれている。現在の研究においては、グル
コース代謝を欠如したＡ、ラジオバクターの突然変異種
を用いてグルコース移動を試験するのは適当でない。何
故なら、主たる口約がグルコース制限下での増殖に際し
用いられる移動方式を確認するためであるからである。

グルコース吸収系の人工基質として放射能標識されたα
−１−〇−メチル−Ｄ−グルコース、３−０−メチル−
Ｄ−グルコースもしくは２−デオキシ−Ｄ−グルコース
（これらは市販入手しうるグルコースの非代謝性の放射
能標識された同族体である）を用いる可能性も考えられ
るが、残念ながらこれらの未標識同族体はいずれも４０
：１のモル過剰で添加されるとＡ、ラジオバクターによ
る（Ｃ１４）グルコース吸収速度を顕著に低下させず、
したがって微生物が天然基質を主として優先することを
示している（下記参照）。

グルコース吸収速度を測定すべく用いる分析系は、疑い
もなく実際の移動速度を過少評価する。

何故なら、菌体により吸収された（ＣＩ４］グルコース
の幾分かが０１４０□まで酸化されるからである。これ
は、フィルタを赤外ランプの下で乾燥させずにシンチレ
ーション剤中に直ちに浸漬することによりｌ＋１！　認
された〔ヘンダーソン（１９８６）　）。

これらの条件下で測定されたグルコース吸収速度は２５
％増加した。

Ａ、ラジオバクターによるグルコース移動の速度パラメ
ータ（すなわちＫ。およびＶ、、、＞に関する正確な決
定は、他の代謝が存在する場合は不可能であった。しか
しながら、分析系に用いた（Ｃ”）グルコースの濃度が
１Ｍ〜１ｍＭの範囲で変化した場合にはグルコース吸収
速度は変化せず、このことはグルコース吸収のに、が１
Ｍ未満であることを示している。

グルコース移動は結合解除剤ＦＣＣＰにより強力に阻止
された（２０Ｍにて約９５％阻止）。菌体を急速洗浄し
かつ魚沸水中で抽出する前に菌体を　（ＣＩ４）グルコ
ースと共に１０秒間培養した場合には未改質グルコース
は全放射能の７０％が回収され、かつ１〜３μ１ｍｇ乾
燥−ｔ−１の菌体内容積を前提とすれば、２０００〜６
０００の蓄積比（〔グルコース）　ｉｎ／　（グルコー
ス）　ｏｕｔ　）であると推定される。これらの結果は
、微生物が非ホスホトランスフェラーゼ系を用いて大濃
度勾配に対しグリコースを活発に吸収しうろことを示し
ている〔何故なら、この場合にはグルコースの吸収およ
びホスホリル化が同時に生ずるからである（ポストマ、
１９８６））、プロトンシンポートメカニズムも除外さ
れる。何故なら、厳密な嫌気条件下でヘンダーソンおよ
びマックヘルソンの方法（１９８６）を用いてＡ、ラジ
オバクターの懸濁物にグルコースを添加した場合には、
全くアルカリ化が証明されなかったからである。したが
って可能性として考えられることは、グルコースがペリ
プラスム結合性蛋白を含む系によって吸収されたことで
ある。

腸内細菌における結合性蛋白依存性の移動系は、基質結
合性蛋白をペリプラスムから放出させる浸透圧ショック
法に対し極めて感受性であると報告されているが、結合
解除剤による阻止に対し比較的耐性である〔種々の証明
が示唆するところでは、この種の系はプロトン性の力自
体によるのでな（、ＡＴＰ加水分解によって左右され、
しかもエネルギー結合のメカニズムは一義的に決定され
ていない；エームス（１９８６））。ＦＣＣＰがＡ、ラ
ジオバクターにおけるグルコース移動の強力な阻止剤で
あるという知見は、したがってペリブラスム結合性蛋白
が関与するという可能性に完全に一致する。何故なら、
この種の好気性微生物は主として基質レベルホスホリル
化でなく酸化ホスホリル化に依存してＡＴＰを生成する
と思われるからである。結合性蛋白系の関与を確認すべ
く、Ａ。

ラジオバクターが実際にグルコース制限下での増殖に際
しペリプラスムグルコース結合性蛋白を含有するかどう
かを試験した。

グルコース制限下（Ｄ＝０．Ｏ４５ｈ−’）で増殖させ
たＡ、ラジオバクターの全菌体のグルコース吸収速度は
μｍｏにおけるグルコース吸収速度に匹敵したので、ケ
モスタットにおけるグルコースの一定濃度が極めて低い
場合にはグルコース吸収系が実質的に抑制解除されて微
生物による９ｎモルー１　（ｍ　ｇ乾燥ｗｔ）　−’の
現場速度における吸収を可能にすると結論される。これ
らの観察は、５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて種々異なる栄養
制限下にて増殖させた菌体のポリペプチド配列を比較す
ることにより、グルコース移動系の成分を確認しうろこ
とを示唆し、グルコース制限下での増殖に際してのみ移
動性蛋白が最大に抑制解除されることが期待される。こ
の手段を用いることにより、Ａ、ラジオバクターはグル
コース制限に応じて３種の蛋白（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り判定されたＭ、値＝３６５００　、３３５００および
３０５００　）を高濃度で生産することが判明した（第
１ａ図参照）。さらに、これら３種の蛋白は全て、浸透
圧ショックにより菌体から部分放出され（第１ｂ図）、
さらにこれはグルコース吸収速度における約３０％の低
下を伴った。この処理は細胞質膜を全（損傷しないと思
われる（何故なら、６−ホスホグルコネートデヒドロゲ
ナーゼがショック液には検出されなかったからである）
ので、３種の蛋白は全てペリプラスムに存在すると結論
された。３種の蛋白を陰イオン交換ＦＰＬＣによりショ
ック液からほぼ均質になるまで精製しく第１ｃ図）、か
つその寸法をゲルが過ＦＰＬＣにより推定した（Ｍｒ　
＝４４０００　。

３８０００および３６０００　）。５ＤＳ−ＰＡＧＥを
用いて得られた推定値よりも僅かに高いこれらの数値は
、３種の蛋白が全て単量体として存在することを示唆し
ている。

平衡透析は大きい２種の蛋白のみがグルコースを結合し
うろことを示し、これらの蛋白を以下ＧＢ　Ｐ　１　（
Ｍｒ　＝３６５００　）およびＧＢＰ２　（Ｍｒ＝３３
５００　）と称する。結合等温式は両蛋白が単一のグル
コース結合部位を有することを示すが、ＧＢｐ２　ＣＫ
ｎ　＝０．０７μＭ）はＧＢＰＩ（ＫＤ＝０．２３μＭ
）よりも極めて高いグルコース親和性を示した（第２図
）。競合結合分析は、ＧＢＰＩとＧＢＰ２とが成る種の
グルコース同族体を区別する能力においても相違するこ
とを示した（第１表）。α−１−０−メチル−Ｄ−グル
コース、３−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコースおよび２−デ
オキシ−Ｄ−グルコースは、ＧＢＰＩもしくはＧＢＰ２
のいずれかに対するグルコースの結合に影響を与えず、
さらにＡ、ラジオバクターの全菌体によるグルコース吸
収速度を顕著に低下させなかった（上記参照）。これに
対し、ｃ−６位置に他の置換基を有する点でグルコース
とは相違する同族体（すなわち６−ゾオキシーＤ−グル
コースおよび６−クロル−デオキシ−Ｄ−グルコース）
、或いはＣ−６位置を全く欠如する同族体（すなわちＤ
キシロース）は、ＧＢＰＩとＧＢＰ２の両者に結合する
（ＣＩ４）グルコースの量を顕著に低下させた。しかし
ながら、６−ゾオキシーＤ−グルコースおよびＤ−キシ
ロースはＧＢＰＩよりＧＢＰ２に対しずっと効果的であ
るのに対し、６−クロル−６−ゾオキシーＤ−グルコー
スの場合にはその逆となることが判明した。Ｄ−ガラク
トースおよびＤ−フコース（６−ゾオキシーＤ−ガラク
トース）のみがＧＢＰＩに対し有効であり、したがって
糖がＧＢＰ２につきグルコースと効果的に競合しうるか
どうかを決定するにはＣ−４における配置が重要である
ことを示している。第３のベリプラスム蛋白（Ｍｒ　＝
３０５００　）の機能は、まだ不明である。しかしなが
ら、これもペリプラスム基質結合性蛋白であると思われ
、この検討の目的で以下ＢＰ３と称する。

グルコース制　　での０．０４５ｈ−’の　　　にお■ グルコース制限下で増殖したＡ、ラジオバクター（Ｄ＝
０．０４５　ｈ−’）の全菌体につき上記した約５５ｎ
モルｗｉｎ−’　（ｍｇ乾燥−ｔ）　−’（７）グルコ
ース吸収速度は、これら条件下で少なくとも２０世代に
わたり増殖させた培養物に関するものである。

次いで、グルコース制限下でより短い期間（く１０世代
）にわたり増殖させた培養物は、しばしば２０ｎモルｗ
ｉｎ−’　（＋＋＋ｇ乾燥ｗｔ）　−’程度に低いグル
コース吸収速度を示すことが判明した。異なるグルコー
ス吸収速度を有する菌体のポリペプチド配列を５ＤＳ−
ＰＡＧＥにより比較した際、ＧＢＰＩおよびＧＢＰ２の
絶対濃度と相対濃度との両者は異なる培養物間で顕著に
変化することが判明し、しかもＢ’Ｐ３の濃度は比較的
一定に留まった（第３図）。さらに、種々異なるグルコ
ース制限培養物から得られた菌体のグルコース吸収速度
とＧＢＰ１＋ＧＢＰ２の合計濃度との間には明瞭な相関
関係が存在したが、ＢＦ２には存在しなかった（第４図
）。この関係は、ＧＢＰＩおよびＧＢＰ２の両者がグル
コース制限下での連続培養の増殖に際しＡ、ラジオバク
ターによるグルコースの吸収に役割を演することを確認
するが、この段階では何故微生物が２種の異なるグルコ
ース結合性蛋白を生産し、その発現レベルが異なる培養
物間で変化するのかまだ不明であった。

しかしながらその後、微生物をグルコース制限下で長期
間にわたり連続培養にて増殖させるとＧＢＰＩおよびＧ
ＢＰ２の両者（ＢＦ２は含まない）の濃度は増大するが
、最終的にＧＢＰＩが主体となることが認められた（第
５図）。この観察は、グルコース制限下での長期間の増
殖（すなわち極めて低いグルコースの周囲濃度における
増殖）に際し加えられる選択圧力が、蒸機生物に存在す
るよりも高濃度で２種のグルコース結合性蛋白を含有す
るＡ、ラジオバクターの菌株の増殖に好適であり、した
がって現場でのグルコースをより高い速度で吸収しうろ
ことを示唆している。

Ａ化 ２種のグルコース結合性蛋白を含む移動系がケモスタッ
トにおける全細菌群にわたり同時に抑制解除されるかど
うかを検討するため、グルコース吸収（６４ｎモルｌｌ
ｌ１ｎ　−’　（ｍｇ乾燥−ｔ）−１に関し充分抑制解
除されたグルコース制御培養物から試料を抜取り、かつ
菌体を唯一の炭素源としてグルコースを含有する固体培
地に塗抹した。次いで、２３個のコロニーをランダムに
釣上げ、かつこれらを用いて３　ｍｌのグルコース最小
培地を含有する小瓶に接種した。グルコースが消費され
るまで（最終菌体密度＝　０．５　ｍｇ乾燥ｗｔｍ１−
’）培養物をμｍ８にて３０℃で増殖させ、次いで菌体
のポリペプチド配列を５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検査し
た。２種の異なる表現系をＧＢＰＩ、ＧＢＰ２およびＢ
Ｆ２の相対濃度に基づき区別することができた。１１種
のコロニーから得られた菌体は主としてＧＢＰＩを含有
、したのに対し、ＧＢＰ２およびＢＦ２は残余のコロニ
ーから得られた菌体に最も豊富であったが、まだＧＢＰ
Ｉも識別できた（第６図）。表現系は、個々の分離物を
さらに２回のコロニー選別に続く液体培地での増殖にか
けた際、蛋白配列に変化が観察されなかったので安定で
あると思われる。これらの観察は、Ａ、ラジオバクター
が、ＧＢＰＩおよびＧＢＰ２を別々に発現する異なる群
に分離することによりグルコース制限下での長期間の増
殖に反応したことを示唆する。

異なる表現型を代表する２種の分離物をさらに特性化し
、すなわちＧＢＰ２およびＧＢＰＩをそれぞれ主たるグ
ルコース結合性蛋白とするＡＲ９およびＡＲ１８である
。菌株ＡＲ９およびＡＲ１８の単一のコロニーをグルコ
ース制限下での連続培養（０，０４５ｈ−’）で増殖さ
せた際、これらは定常状態に達すると直ちにそれぞれ６
３および７４ｎモルｗｉｎ　−’　（ｍｇ乾燥−ｔ）−
１のグルコース吸収速度を示した。全菌体懸濁物のＳ’
　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　ＧＥおよび２種の菌体から作成さ
れたショック液のＦＰＬＣ分析は、極めて異なる量では
あるがグルコース結合性蛋白の両者を生産する能力を保
持したことを示す。ＧＢＰ２は菌株ＡＲ９により生産さ
れた主たるグルコース結合性蛋白であったのに対し、Ｇ
ＢＰＩは菌株ＡＲ１８に最も豊富であり、かつ両菌株は
同量のＢＦ２を生産した（第３図も参照）、この知見は
、グルコース制限下での長時間の増殖がＡ、ラジオバク
ターの菌株の選別をもたらすことを示唆し、グルコース
結合性蛋白のいずれか一方（両者でない）が蒸機生物に
対比しさらに抑制解除されたことを示唆する。

インビトロにてＧＢＰｌに対する（ｃ１４）グルコース
の結合程度を減少させる未標識グルコース同族体（第１
表）も、同序列の強度にて菌株ＡＲ１８によるグルコー
スの吸収速度を減少させた（第２表）〔すなわちＤ−ガ
ラクトース−６−クロル−６−ゾオキシーＤ−グルコー
ス〉Ｄ−７コース〉６−ゾオキシーＤ−グルコース〉Ｄ
−キシロース〕。比較として、菌株ＡＲ９による（Ｃ”
）グルコースの吸収は、所定の同族体による阻止に対し
ずっと感受性が低く、唯一の例外は６−ゾオキシーＤ−
グルコース（第２表）であってインビトロではＧＢＰＩ
に対するよりもＧＢＰ２に対しグルコースが結合するの
を防止するのに一層効果的であった（第１表）。これら
競合実験の結果は、菌株ＡＲ１８により吸収されたグル
コースの大部分がＧＢＰＩを含む系により移動する一方
、菌株ＡＲ９が主としてＧＢＰ２を使用するという知見
と完全に一致した。事実、インビトロにてＧＢＰｌに対
するグルコースの結合を防止するがＧＢＰ２については
効果を示さなかったＤ−ガラクトースにより得られた結
果（第１表）は、菌株ＡＲ１８により吸収されたグルコ
ースの約９０％がＧＢＰｌを介して移動したのに対し、
菌株ＡＲ９については僅か２５％であったことを示唆す
る（第２表）。２−デオキシ−Ｄ−グルコースは両菌株
につきグルコース吸収速度を比較的小さい程度で低下さ
せたが、インビトロにおけるＧＢＰＩもしくはＧＢＰ２
に対するグルコースの結合に影響を与えず、したがって
微生物はまだ特性化されてない低活性の他のグルコース
吸収系を有しうろこと或いは結合と移動作用との間に若
干の差が存在することを示唆する。

方法（２） Ａ、ラジオバクター菌　ＡＲ９およびＡＲ１８を一７０
℃にて２０％（ｖ／ｖ）グリセリン中に貯蔵した。

グルコース制限下での増殖を上記と同様に行なった。ア
ンモニア制限増殖（定常状態のビオマス密度＝　１．１
　ｇ　ｌ−’）を達成するため、硫酸アンモニウムの投
入濃度を０．５ｇ１−’まで減少させ、かつグルコース
濃度を特記しない限り１６　ｇ　Ｎ＝まで増加させた。

Ｋ＋制限増殖（定常状態のビオマス密度＝１．１ｇ乾燥
ｗｔｔ’−’）についてはグルコースを１５ｇｊ！−’
の投入濃度にて培養物に添加し、ＫＨ，ＰＯ，の代わり
にＮａｚＨＰＯａ　＋　０．２　ｍＭ　　ＫＣ１を使用
し、培養物のｐＨをＫＯ）Ｉでなく２ＭのＮａＯＨによ
り７．０に維持した。

Ｉ生■１春曵立底 上記と同様に、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ緩衝液（
ｐＨ７，０）を用いて、グルコース制限培養物から菌体
懸濁物を作成した。アンモニヤーおよびカリウム制限培
養物からの試料を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，０）
により適当な係数で希釈した後、遠心分離して上澄液中
に存在する高粘性のスクシノグルカンエキソ多ｔｉ類か
らの菌体の分離を容易化させた。スクシノグルカンをプ
ロパン−２−オール（４容量プロパン−２−オール：ｌ
容量上澄液）により沈澱させ、ガラス棒を用いて集め、
次いで１００℃にて一定重量になるまで乾燥させた。

バッチ式培養によるスクシノグルカン生産の測Ａ、ラジ
オバクターを、硫酸アンモニウム（０，２２ｇ　ｊ！−
’）とグルコースもしくはシュークロースのいずれか（
８ｇ　ｌ−’）とが補充された１３０ｍ１の最小培地〔
リントン等（１９８７））を含有する邪魔板付きフラス
コにて３０℃で増殖させた。接種後、菌体はアンモニア
が消費されるまで対数的に増殖しく菌体密度＝０．５ｇ
乾燥−ｔｚ−’）、その後にスクシノグルカンを生産し
た。接種してから２４時間後に培養物を収穫し、かつス
クシノグルカンの濃度を上記と同様に測定した。間けつ
的に２ＭのＫＯＨを添加することにより、ｐＨを６．８
〜０．２に維持した。

Ａ、ラジオバクターの懸濁物〔電極容器（ランク・ブロ
ス社）における乾燥重量３ｍｇの菌体〕。

この懸濁物を磁気撹拌器により連続混合して、溶存酸素
濃度が５０％飽和を越えるように確保した。

Ｄ−（Ｕ−Ｃ”）グルコース（０，５ｍＣ１ミリモルー
１（１８，５ＭＢｑ　ミリモル−’）ｉ２．２５μＣｉ
　（０，０８３ＭＢＱ　）　）を１．５ｍＭの最終濃度
になるよう添加して培養を開始させた。菌体懸濁物の試
料（０，３ｍｊりを４５分間にわたり所定間隔で抜取り
、遠心分離（１分間にわたり１３０００　ｇ）によって
菌体をベレット化させ、かつ各懸濁物の試料（２５μｌ
）をワットマンＤＥ８１クロマトグラフ紙に載せた。

りＯ？トゲラフ紙を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７゜
０）によって展開し、次いで１００℃にて１５分間乾燥
させた〔グルコースは溶媒と共に先端まで移動し、かつ
スクシノグルカンはこの系により原点に留まった〕。グ
ルコースとスクシノグルカンとを含有するクロマトグラ
ムの領域を放射能写真により正確に位置決めし、次いで
切除すると共に３１１１Ｎのフィソフルオル３　（フィ
ソンス・リミテッド社）に浸漬し、ヒユーレット・パラ
カード・トリーカルブ液体シンチレーションカウンタを
用いて計数した（効率５０〜６０％）。

Ａ、ラジオバクター菌株ＡＲ１８の懸濁物によるグルコ
ース吸収速度および呼吸を前記と同様に測定した〔コー
ニッシュ等（１９８７）、上記〕。

Ｄ−グルコースを２５０Ｍの最終濃度になるよう添加し
て分析を開始し、かつグルコース吸収速度を、適当ン農
度（０〜１．５　ｍＭ）の６−クロル−６＝デオキシ−
Ｄ−グルコースを用いてグルコース移動系を阻止するこ
とにより変化させた。グルコース吸収速度および呼吸を
、それぞれグルコースが添加されてから最初の１分後お
よび２分後に測定した。菌体懸濁物によるグルコース利
用速度およびスクシノグルカン生産を上記と同様に測定
したが、ただし培養はＤ−（Ｕ−Ｃ１４）グルコース（
０，５ｍｃｉ　　ミリモル−”）　１８．５　ＭＢｑ　
ミリモル−１；２．２５Ｃｉ　（０，０８３ＭＢｑ　）
　）を１ｍＭの最終濃度になるよう添加して開始させ、
かつ測定は６−クロル−６−ゾオキシーＤ−グルコース
（０〜２１１１Ｍ）の存在下および不存在下で１２分間
にわたって行なった。フラックスコントロール係数は、
グルコース吸収、呼吸およびスクシノグルカン生産の基
準速度を阻止剤濃度に対しプロットすることによりワル
ター等（１９８７）の方法を用いて決定した。

菌体フリー抽出物における酵素活性の 菌体フリー抽出物を上記と同様に作成した〔コーニソシ
ュ等（１９８７））。確立された方法（括弧内に示す）
の変法を用いて次の酵素を３０℃にて分析した：ヘキソ
キナーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホフラクトキナ
ーゼおよびＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ベ
ルクマイヤー、メソソズ・オブ・エンチマチック・アナ
リシス、第１巻（１９７４））；グルコース−６−燐酸
デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコネートデヒド
ロキナーゼ（ＮＡＤＰ”　−結合）（ベアズモア等（１
９８２））；６−ホスホグルコネートヒドラターゼ＋２
−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコネートアルド
ラーゼ（ウッド（１９’７１））　；およびＵＤＰ−ガ
ラクトース−４−エピメラーゼ（マクスウェル等（１９
６２））。

血叫方広 ペリプラスムグルコース結合性蛋白の精製、５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥおよび平衡透析による基質結合性の測定を上記と
同様に行なった。

ヱニ叉曳表丞 必要に応じ、数値を平均±ＳＥＭとして示し、括弧内に
測定回数を示す。

１−皿 Ｄ−（Ｕ−Ｃ”）グルコース（２７０ｍＣｉ　　ミリモ
ル−’）（１０ＧＢｑ　ミリモル−１）はアメルシャム
・インターナショナル社から購入した。６−クロル−６
−ゾオキシーＤ−グルコースはシグマ社から入手した。

他の試薬はフィソンス・リミテッド社から購入し、最高
級品として入手した。

Ａ、ラジオバクター菌株ＡＲ９はアンモニア制限増殖に
際し蒸機生物と同じ速度でスクシノグルカンを生産し、
かつ２種の菌株のグルコース吸収系は両者とも実質的に
抑制された（第３表）。これに対し、菌株ＡＲ１８のグ
ルコース吸収系はずっと低い強度で抑制され、かつこの
菌株は蒸機生物もしくは菌株ＡＲ９のいずれよりも極め
て高い速度でスクシノグルカンを生産した。これらの観
察は、ＧＢＰＩを含むグルコース移動系がＧＢＰ２を含
む移動系よりも抑制に対し感受性が実際に低いことを示
唆し、さらにスクシノグルカン生産速度を決定する際に
グルコース吸収系の活性が重要な因子になるという証明
を与えた。インヒドロにてＧＢＰＩにつきグルコースと
効果的に競合するがＧＢＰ２とは競合しない未標ｍＤ−
ガラクトース（上記参照）はグルコース吸収速度を菌株
ＡＲ９およびＡＲ１８によりそれぞれ約５０％および９
５％低下させ、この場合（Ｃ’ａグルコースより４０倍
モル過剰で菌体懸濁物に添加し、菌株ＡＲ１８がアンモ
ニア制限増殖に際し主としてＧＢＰＩによりグルコース
を吸収するのに対し、菌株ＡＲ９は同程度までＧＢＰＩ
およびＧＢＰ２を明らかに使用することを確認した。

Ａ、ラジオバクター菌株ＡＲ１８はさらに炭素源として
グルコースを使用したバッチ式培養実験に際し菌株ＡＲ
９もしくは蒸機生物のいずれよりも顕著に高い速度でス
クシノグルカンを生産したが（第４表）、３種の菌株は
グルコースの代りにシュークロースを用いた場合には同
様な速度でスクシノグルカンを生産した。したがって、
これらの結果はさらに、グルコース吸収もしくは代謝に
特異的に関与する酵素が他の菌株に対比して菌株ＡＲ１
８につき抑制解除されることにより、グルコースをスク
シノグルカンまで高速度で変換させうるという見解を支
持する。

アンモニア　　　で増殖させた（Ｄ　＝０．０４５ｈ−
’）Ａ、ラジオバク　−のスクシノグルカン′生とグル
コース　　系の活　との Ａ、ラジオバクターはアンモニア制限下（Ｄ＝０、０４
５　ｈ−’）での長時間の増殖に際しスクシノグルカン
を漸減する速度で生産することが認められ、さらに同じ
現象がこの試験において菌株ＡＲ９についても観察され
た。この菌株がスクシノグルカンを生産する速度は、ア
ンモニア制限増殖の最初の３０世代にわたり徐々に０．
２０ｈ−１から０、１６　ｇ　ｈ伺（ｇ乾燥−ｔ）−１
まで減少し、次いで次の１６世代にわたり０．０７ｇ　
ｈ−’　（ｇ乾燥−ｔ）の数値まで一層急速に低下した
が、その後は一定に留まった。このスクシノグルカン生
産速度の低下は、エキソ多糖類を生産する能力を完全に
喪失した（たとえば生合成経路における損傷の結果とし
て）突然変異種の出現によるものでない。何故なら、試
料を能力低下培養物から抜取りかつスクシノグルカン生
産を維持する固体培地に接種した際に、ムコイドコロニ
ーのみが観察されたからである。さらに、これはグルコ
ース代謝の初期段階またはスクシノグルカン先駆体の生
成に関与する酵素の抑制によるものでもない。何故なら
、異化作用に関与する酵素の活性がアンモニア制限増殖
の全期間にわたり一定に保たれたからである。しかしな
がら、菌株ＡＲ９がスクシノグルカンを生産する速度と
グルコースを移動する速度との間に強力な相関関係が存
在し、さらにこの関係はスクシノグルカンが菌株ＡＲ１
８により０．３ｇｈ−’（ｇ乾燥ｗｔ）　−’のずっと
高い減衰速度で生産される場合にも当てはまる（第７図
）。したがって、このデータは、微生物がスクシノグル
カンを生産する速度が主としてグルコース吸収系の活性
により決定されることを示す。しかしながら、何故スク
シノグルカン生産速度がアンモニア制限下での長期間の
増殖に際し低下するのかまだ未確定であり、考えうる説
明はグルコース吸収系がグルコース制限増殖の際に抑制
解除をもたらす過程の逆転により徐々に抑制されるから
であると思われる（上記参照）。

第７図におけるプロットは原点を通らずに横座標と交わ
ることが認められる。グルコース利用速度に関するこの
交点の数値は、グルコース制限増殖に際しＡ、ラジオバ
クターがグルコースを現場で消費する速度（９ｎモルｗ
ｉｎ　−’　（ｍｇ乾燥−ｔ）　−’）と同じである。

グルコース吸収速度に関する交点の数値はこれよりも低
かったが、実測されたグルコース吸収速度はグルコース
の実際の利用速度よりも低かったことを思い出すべきで
ある。何故なら、菌体により吸収された標識の顕著な比
率（４０％まで）が他の代謝により喪失されるからであ
る。

明らかに、これらの観察は、Ａ、ラジオバクターがアン
モニア制限増殖に際しスクシノグルカンを生産して増殖
の要求に対し過剰である移動グルコースを処分するとい
う思想を支持する。

未標識糖類の存在下および不存在下における純結合性蛋
白に対する（Ｃ”）グルコースの結合を、上記方法で説
明した平衡透析により測定した。

葛−一」Ｌ−一人 なしく比較） ルコース Ｄ−フコース Ｄ−ガラクトース ６−ゾオキシーＤ−グ フコース６ Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース それぞれ高濃度のＧＢＰＩおよびＧＢＰ２を含有する菌
株ＡＲ１８およびＡＲ９を、上記したようにＡ．ラジオ
バクターのグルコース制限培養物から分離した。（Ｃ”
）グルコース（２５０Ｍ）の吸収を上記方法で説明した
ように測定した。未標識ＩＩｉ類（１０ｍＭ）を、表示
したように分析に存在させた。比較培養物につき測定さ
れた吸収速度〔ｎモルｍｉｎ　−’　（ｍｇ乾燥ｗｔ）
−’）は次の通りであった：ＡＲ１８は７２；ＡＲ９は
６３。ＮＤは数値を測定しなかったことを示す。

１−一ヨし一一表 なしく比較） Ｄ−フコース Ｄ−ガラクトース 洗浄した懸濁物によるグルコース吸収速度および増殖培
養物によるスクシノグルカン生産速度を、上記方法に説
明したように測定した。菌株ＡＲ９およびＡＲ．、１８
につき示した結果は個々の実験を示す。

Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース ＮＤ 原 ＾Ｒ９ Ｒ９ ＡＲ１８ ＡＲ１８ Ｒ１８ １０　±　１（３） １４　±　１（４） １９　±　１（３） ２１　　”：　　１　　（３） １９　　　＋１） ０、２１±０．０１ ０、２０±０．０１ ０、２１±０．０２ ０、２９±０．０１ ０、３１±０．０２ ０、２９±０．０２ 第 表 低濃度の硫酸アンモニウム（０，２２ｇ　ｌ−’）を含
有する培地に種々の菌株を接種し、アンモニアが無くな
るまで対数増殖させ〔最終菌体密度＝０．５ｇ乾燥ｗｔ
１−’）　、その後にスクシノグルカンを生産した。接
種してから２４時間後に培養物を回収し、かつスクシノ
グルカン生産速度を上記方法に説明したように測定した
。

原 Ｒ９ Ｒ１８ グルコース シュークロース グルコース シュークロース グルコース シュークロース （ｇｈ−（ｇ乾燥ｗｔ） ０．２０±０．０１ ０．１９±０．０１ ０．２０±０．０１ ０．１６±０．０１ ０．２９±０．０２ ０．１９±０．０１ １〕　　％ ＋３）　　　　９５ （３１１ＱＱ ＋４１　　　９５ 添付図面につき以下詳細に説明する。

第１図ニゲルコース制限下での連続培養（Ｄ＝０、　Ｏ
４５ｈ−’）にて増殖させたＡ、ラジオバクターの全菌
体から得られる３種の主たるベリプラスム蛋白の精製。

ｆａ）グルコースおよびアンモニアの制限下で増殖させ
た後の３種の蛋白の相対的濃度を示す５ＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲル（Ｇ＝ニブルコースＡ＝チアンニア）。（ｂ）浸透
圧ショックによる蛋白の部分放出（Ｗ　Ｃ＝全菌体、Ｓ
Ｃ＝ショック菌体、ＳＦ−ショック液）。（Ｃ）陰イオ
ン交換ＦＰＬＣ（上記方法参照）を用いてショック液か
ら精製された個々の蛋白を示す５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル。

第２図：浸透圧ショックによりＡ、ラジオバクターの全
菌体から放出された２種の蛋白に対するグルコースの結
合を示すスカッチャードプロット。

ＧＢ　Ｐ　１　（Ｍｒ　＝３６５００　）　　（・）お
よびＧＢＰ２（Ｍｒ　＝３３５００　）　　（○）の純
試料に対するＣ１４−グルコースの結合は、上記方法で
説明した平衡透析を用いて測定した。Ｋｎ値は、スカッ
チャードの方法（１９４９）を用いて傾斜勾配から得ら
れた。横座標における交点は結合の理論側を示す。

第３図ニゲルコース制限下で増殖する（０．０４５）、
−１）数種の異なる培養物から得られるＡ、ラジオバク
ターの全菌体におけるＧＢＰＩ、ＧＢＰ２およびＢＦ２
の濃度変化を示す５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル。レーンの標識
ＡＲ９およびＡＲ１８は、２種の新たなＡ、ラジオバク
ターの菌株におけるポリペプチド分布を示し、これら菌
体の分離については上記した通りである。

第４図ニゲルコース制限下での連続培養（Ｄ＝０、　Ｏ
４５ｈ−’）で増殖させたＡ、ラジオバクターの全菌体
のグルコース吸収能力とＧＢＰＩＧＢＰ２およびＢＦ２
の濃度との関係。試料を種々異なる培養物から抜取り、
かつ菌体のグルコース吸収能力を（Ｃ”）−グルコース
を用いて測定した。

次いで、５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて菌体蛋白を分離し、
かつＧＢＰＩ、ＧＢＰ２およびＢＦ２の濃度をミクロ密
度測定法を用いて決定し、全菌体蛋白に対する比率とし
て表わした。ＧＢＰ　１　千ＧＢＰ２（○）およびＢＦ
２　（・）の存在を、次いでグルコース吸収速度に対し
てプロットした。

第５図ニゲルコース制限下でのＡ、ラジオバクターの長
時間にわたる増殖（Ｄ＝０．Ｏ４５ｈ−’）の後のＧＢ
ＰＩおよびＧＢＰ２の濃度変化を示す５ＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲル。試料を種々の時間間隔で培養物から抜取り、かつ
菌体のポリペプチド分布を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより検査
した。個々のレーンの上に示した数値は、グルコース制
限の開始とサンプリング時点との間の世代数を示す。グ
ルコース吸収速度〔ｎモルｍｉｎ　−’　（ｍｇ乾燥−
ｔ）−’）を各レーンの下に示す。

第６図：種々異なる濃度のグルコース−結合性蛋白を有
するＡ、ラジオバクターの菌株を示す５ＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲル。試料をＡ、ラジオバクターのグルコース制限培養
物から抜取り、かつ固体培地上に塗抹した。次いで、２
３種のコロニーをランダムに選別し、かつ小規模（３Ｉ
１１１）のバッチ式培養にて１晩増殖させた。次いで、
個々の培養物の蛋白分布を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより比較
し、かつこれらのうち１３種を示す。ＧＢＰＩ、ＧＢＰ
２およびＢＦ２の位置が示されている。２種の異なる表
現型が区別され、そのうち菌株ＡＲ９およびＡＲ１８が
代表的である。

第７図：洗浄した菌体のグルコース吸収および利用速度
とアンモニア制限下での連続培養（Ｄ＝０、０４５　ｈ
”’）にて増殖させたＡ、ラジオバクター菌株ＡＲ９お
よびＡＲ１８による現場でのスクシノグルカン生産速度
との間の関係。菌株ＡＲ９をアンモニア制限下に５０世
代にわたり連続培養で増殖させ、その間にスクシノグル
カン生産速度は相当に低下した（本文参照）。菌株ＡＲ
１８も同じ条件下で増殖させたが、ただし測定はアンモ
ニア制限定常状態が確立させた１５世代内で行なった。

洗浄した菌体懸濁物によるグルコース吸収速度（○）及
び利用速度（ロ）　；菌株ＡＲ９（開放記号）および菌
株ＡＲ１８（閉鎖記号）。

上記に引用した刊行物の著者および刊行臼は次の通りで
ある： Ｇ、　Ｆ、　Ｌ、エイムズ（１９８６）。細菌ペリプラ
スム移動系：構造、メカニズムおよび発生。

アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー、第
５５巻、第３９７〜４２５頁。

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ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー
、第１２８巻、第１４２３〜１４３９頁。

Ｊ、Ｍ、プラス、Ｕ、ニーマンおよびＢ、ブカウ（１９
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トースレギユロン突然変異種のカルシウム処理菌体に対
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ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１５５巻、第
９７〜１０６頁。

Ｓ、Ｈ，コリンス、Ａ、Ｗ、ジャルビス、ＲｏＪ、リン
グセイおよびＷ、Ａ、ハミルトン（１９７６）。

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ロトン移動：アラニン移動における理論的変化を伴う突
然変異種の分離。ジャーナル・オブ・バタテリオロジー
、第１２６巻、第１２３２〜１２４４頁。

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クターのスクシングルカン生産性菌株の呼吸系に対する
増殖条件の作用。ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイ
クロバイオロジー第１３３巻、第２９７１〜２９７８頁
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特性化：シュードモナス・エアルギノーサからのフラク
トース１−ホスホトランスフェラーゼ系。ジャーナル・
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カル・ケミストリー、第２４０巻、第３６８５〜３６９
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Ｂ、に、　ロバーツ、Ｍ、ミツシレーおよびＥ。

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ノーサによる２−オキソグルコネートの代謝。ジャーナ
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Ｍ、ルトガース、Ｍ、Ｊ、テイキセラ・ド・マトス、ｐ
、ｗ、ポストマおよびに、パン・ダン（１９８７）。ク
レブシェラ・ニューモニアのグルコース制限ケモスタン
ト培養における定常状態の確立。ジャーナル・オブ・ジ
ェネラル・マイクロバイオロジー、第１３３巻、第４４
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に対する蛋白の吸引。アナルス・オブ・ザ・ニューヨー
ク・アカデミ−・オブ・サイエンス、第５１巻、第６６
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メリック（１９７７）。シュードモナス・エアルギノー
サのベリプラスム・グルコース結合性蛋白の精製および
性質。ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１３１
巻、第６７２〜６８１頁。

Ｇ、Ｅ、　　ドフリース、Ａ、Ｎ、パン・ブルッセルお
よびＡ、キスペル（１９８２）。リゾビウムレグミノサ
ルムにおけるグルコース移動のメカニズムおよび制御。

ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１４９巻、第
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Ｒ，Ｐ、ワルター、Ｊ、Ｇ、モリスおよびり。

Ｂ、ケル（１９８７）。クロストリジウム・パフスーリ
アヌムの増殖、糖分解およびグルコースホスホトランス
フェラーゼ系の阻止における浸透圧ストレスおよび水活
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イオロジー、第１３３巻、第２５９．〜２６６頁。

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蛋白およびドデシル硫酸ナトリウム：ポリアクリルアミ
ドゲルおよび関連法における分子量測定。

ザ・プロティン１１第３版、第１７９〜２２３頁、Ｈ，
ニューラスおよびＲ，Ｌ、ヒル編、ロンドン、アカデミ
ツク・プレス社。

Ｐ、Ｈ，ホワイティング、Ｍ、ミツシレーおよびＥ、Ａ
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ーサにおけるグルコース、グルコネートおよび２−オキ
ソグルコネートの移動、並びにグルコース代謝の調整に
おけるグルコース制限の役割。ジャーナル・オブ・ジェ
ネラル・マイクロバイオロジー、第９２巻、第３０４〜
３１０頁。

Ｗ、Ａ、ウッド（１９７１）。代謝経路を代表する酵素
の分析。メソッズ・イン・マイクロバイオロジー、第６
Ａ巻、第４１１〜４２４頁、Ｊ。

Ｒ，フリユおよびり、Ｗ、　　リボンス編、アカデミツ
ク・プレス社、ロンドン。

【図面の簡単な説明】

第１図はＡ、ラジオバクターの全菌体からの蛋白精製の
結果を示すクロマトグラムであり、第２図は浸透圧ショ
ックによりＡ、ラジオバクターの全菌体から放出された
２種の蛋白に対するグルコース結合に関するグラフ（ス
カッチャードプロット）であり、 第３図はグルコース制限下で増殖させた数種の異なる培
養物から得られたＡ、ラジオバクターの菌体におけるＧ
ＢＰＩ　ＧＢＰ２およびＢＦ２の濃度の変化を示すクロ
マトグラムであり、第４図はＧＢＰＩ、ＧＢＰ２および
ＢＦ２の濃度に対するグルコース吸収能力の関係を示す
グラフであり、 第５図はグルコース制限下でＡ、ラジオバクターを長時
間増殖させた後のＧＢＰＩおよびＧＢＰ２の濃度変化を
示すクロマトグラムであり、第６図はグルコース結合性
蛋白の種々異なる濃度を有するＡ、ラジオバクターの菌
株を例示するクロマトグラムであり、 第７図はアンモニア制限下にて連続培養で増殖させたＡ
、ラジオバクター菌株ＡＲ９およびＡＲ１８によるグル
コース吸収および利用の速度、並びにスクシノグルカン
生産速度を示すグラフである。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１微生物からの誘導化により第２微生物を作成
   するに際し、各微生物は炭素含有基質の存在下に増殖さ
   せる際に菌体外生成物を生産する能力を有しかつ第１微
   生物の基質吸収系は菌体外生成物の生産につき制限的で
   ある微生物の作成方法において、第１微生物を基質制限
   下に増殖させると共に、第２微生物を基質吸収系が少な
   くとも部分的に抑制解除された際に分離することを特徴
   とする微生物の作成方法。
2. （２）分離された第２微生物を増殖させると共に、菌体
   外生成物を回収する工程をさらに含む請求項１記載の方
   法。
3. （３）分離された第２微生物を窒素制限下に連続培養で
   増殖させ、または窒素欠乏期と共に培養する請求項２記
   載の方法。
4. （４）菌体外生成物がヘテロ多糖類である請求項１〜３
   のいずれか一項に記載の方法。
5. （５）菌体外生成物がスクシノグルカンヘテロ多糖類で
   あって、グルコースとグルコース各７モルにつき０．９
   〜１．２モルのガラクトースと０．６５〜１．１モルの
   ピルベートとを０〜２のモル比（グルコース７モルに対
   し）のスクシネートおよびアセテートと共に含んでなる
   請求項４記載の方法。
6. （６）炭素基質がグルコースである請求項１〜５のいず
   れか一項に記載の方法。
7. （７）第１および第２微生物の各吸収系が２種の基質結
   合性蛋白からなり、これら蛋白の一方の含有量が増大し
   てなる請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. （８）一方の基質結合性蛋白がＮＣＩＢ１１８８３に見
   られるグルコース結合性蛋白（Ｍ＿ｒ３６５００）であ
   る請求項７記載の方法。
9. （９）微生物が菌種アグロバクテリウム・ラジオバクタ
   ーである請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. （１０）アグロバクテリウム・ラジオバクターＮＣＩＢ
    ４００１８。
11. （１１）ヘテロ多糖類を製造するためのアグロバクテリ
    ウム・ラジオバクターＮＣＩＢ４００１８の使用。