JPH0279975A - タンパク質固定化法 - Google Patents
タンパク質固定化法Info
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- JPH0279975A JPH0279975A JP63233002A JP23300288A JPH0279975A JP H0279975 A JPH0279975 A JP H0279975A JP 63233002 A JP63233002 A JP 63233002A JP 23300288 A JP23300288 A JP 23300288A JP H0279975 A JPH0279975 A JP H0279975A
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- Japan
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- protein
- buffer
- immobilization method
- protein immobilization
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は、タンパク質固定化法に関し、高品質のバイ
オセンサの作製等に利用することがテキる。
オセンサの作製等に利用することがテキる。
従来の技術
タンパク質固定化法には、共有結合法、物理的吸着法、
イオン結合法からなる担体結合法、架橋法、及び包括法
が知られおり、担体の方も、高分子ゲル、マイクロカプ
セル、リポソーム、中空繊維、膜等がよく使用されてい
る。また、酵素を代表とするタンパク質は、比較的不安
定であり、それを固定化することによりかなり安定化す
ることができる。最近、水溶液中だけでなく有機溶媒中
でも酵素反応を速やかに行わせるためのタンパク質固定
化も数多く報告されるようになった。
イオン結合法からなる担体結合法、架橋法、及び包括法
が知られおり、担体の方も、高分子ゲル、マイクロカプ
セル、リポソーム、中空繊維、膜等がよく使用されてい
る。また、酵素を代表とするタンパク質は、比較的不安
定であり、それを固定化することによりかなり安定化す
ることができる。最近、水溶液中だけでなく有機溶媒中
でも酵素反応を速やかに行わせるためのタンパク質固定
化も数多く報告されるようになった。
発明が解決しようとする課題
従来のタンパク質固定化法は、担体結合法がよく使用さ
れているが、この方法は、架橋剤（グルタルアルデヒド
、ジアゾ物、ＢｒＣＮ等）を用いて担体とタンパク質を
結合させるため、タンパク質表面に存在しているアミノ
酸残基（リジン、セリン、ヒスチジン等）を修飾するこ
とになる。そのため、最悪の場合には、触媒反応に必須
のアミノ酸残基を修飾し、全酵素を失活させることもあ
る。−船内な場合でさえ、かなりの酵素を失活させる（
４０〜８０％）という欠点を持っている。
れているが、この方法は、架橋剤（グルタルアルデヒド
、ジアゾ物、ＢｒＣＮ等）を用いて担体とタンパク質を
結合させるため、タンパク質表面に存在しているアミノ
酸残基（リジン、セリン、ヒスチジン等）を修飾するこ
とになる。そのため、最悪の場合には、触媒反応に必須
のアミノ酸残基を修飾し、全酵素を失活させることもあ
る。−船内な場合でさえ、かなりの酵素を失活させる（
４０〜８０％）という欠点を持っている。
また、酵素と担体を結合する場合、従来の技術では酵素
のどの部分が担体と結合しているかわからず、さらには
、その結合位置の制御もできない欠点を持っている。
のどの部分が担体と結合しているかわからず、さらには
、その結合位置の制御もできない欠点を持っている。
課題を解決するための手段
タンパク質のＮ末端あるいは、Ｃ末端に疎水性のポリペ
プチドを導入し、そのタンパク質を固定化面に固定化す
る。
プチドを導入し、そのタンパク質を固定化面に固定化す
る。
作用
上記の構成によれば、ファンデルワールス力の疎水結合
作用により、疎水部分同志が容易に吸着することを利用
して、タンパク質を固定基板上に失活させることなく、
かつ方向性を持たせて固定化することができる。
作用により、疎水部分同志が容易に吸着することを利用
して、タンパク質を固定基板上に失活させることなく、
かつ方向性を持たせて固定化することができる。
実施例
ＥＸ 水性のアミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリ
ン、アラニン、フェニールアラニン、トリプトファン）
からなる疎水性ペプチドをコードするＤＮＡ （塩基数
３０〜３００個）の一部を人工的に合成した（第１図〜
第３図の大文字アルファベット）。さらに、ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノー断片を用いて二本鎖ＤＮＡを作製
した（第１図〜第３図）。
ン、アラニン、フェニールアラニン、トリプトファン）
からなる疎水性ペプチドをコードするＤＮＡ （塩基数
３０〜３００個）の一部を人工的に合成した（第１図〜
第３図の大文字アルファベット）。さらに、ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノー断片を用いて二本鎖ＤＮＡを作製
した（第１図〜第３図）。
この二本鎖ＤＮＡを、固定化するタンパク質（グルコー
スオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、インベ
ルターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースデヒドロ
ゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールオ
キシダーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ラクテート
オキシダーゼ、リパーゼ、コレステロールエステラーゼ
、ホスホリパーゼＡ１． Ａ２． Ｃ１Ｄ１ ウ
レアーゼ、ピルベートオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキ
シダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アミラーゼ、ア
ミンオキシダーゼ、ペニシリナーゼ、クレアチナーゼ、
ルシフェラーゼ、抗体）の構造遺伝子が含まれているベ
クターに導入した。導入部分は、上記のタンパク質をコ
ードしている構造遺伝子とプロモーター（ｔａｃ＋
Ｉ ａｃ＋ ｔ ｒｐ＋ λｐ、５ｙｎ）の間とし
、かつ開始コドンから一１０領域にＳＤ配列が存在する
ように導入した。
スオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、インベ
ルターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースデヒドロ
ゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールオ
キシダーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ラクテート
オキシダーゼ、リパーゼ、コレステロールエステラーゼ
、ホスホリパーゼＡ１． Ａ２． Ｃ１Ｄ１ ウ
レアーゼ、ピルベートオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキ
シダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アミラーゼ、ア
ミンオキシダーゼ、ペニシリナーゼ、クレアチナーゼ、
ルシフェラーゼ、抗体）の構造遺伝子が含まれているベ
クターに導入した。導入部分は、上記のタンパク質をコ
ードしている構造遺伝子とプロモーター（ｔａｃ＋
Ｉ ａｃ＋ ｔ ｒｐ＋ λｐ、５ｙｎ）の間とし
、かつ開始コドンから一１０領域にＳＤ配列が存在する
ように導入した。
その後、このベクターをカルシルムーりん酸共沈法によ
り細胞（大腸菌、酵母、は乳類・植物細胞、あるいは、
抗体産生細胞とＩＩｉ１ｇｓ細胞のハイブリドーマ）に
形質転換し、細胞を培養することにより目的とするタン
パク質を産生じた。培養した細胞をフレンチプレスによ
り破砕し、その粗抽出液を遠心分離した後、その上清を
超遠心分離あるいは、バッファで平衡化したＦＰＬＣを
用いて目的とするタンパク質を得た。
り細胞（大腸菌、酵母、は乳類・植物細胞、あるいは、
抗体産生細胞とＩＩｉ１ｇｓ細胞のハイブリドーマ）に
形質転換し、細胞を培養することにより目的とするタン
パク質を産生じた。培養した細胞をフレンチプレスによ
り破砕し、その粗抽出液を遠心分離した後、その上清を
超遠心分離あるいは、バッファで平衡化したＦＰＬＣを
用いて目的とするタンパク質を得た。
この得られたタンパク質をバッファあるいは、両親媒性
分子を含むバッファに溶かし、β−メルカプトエタノー
ルを含むトリスバッファに滴下した後、表面圧０から７
０ Ｘ １０−”Ｎ／ｍ、 室温で、水平付着法によ
り基板（シリコン、Ｓｉｏ２・５ｉｓＮ４で被覆された
シリコン、ガラス、セラミックス、樹脂、金属、半導体
）に吸着させた。吸着後タンパク質が導入した疎水ペプ
チド部が正しく基板方向に配列しているかどうかをその
疎水ペプチドに対する抗体を用いて確認した。また、活
性においてもアッセイを行った。この吸着したタンパク
質はバイオセンサの感応部と、して使用した。
分子を含むバッファに溶かし、β−メルカプトエタノー
ルを含むトリスバッファに滴下した後、表面圧０から７
０ Ｘ １０−”Ｎ／ｍ、 室温で、水平付着法によ
り基板（シリコン、Ｓｉｏ２・５ｉｓＮ４で被覆された
シリコン、ガラス、セラミックス、樹脂、金属、半導体
）に吸着させた。吸着後タンパク質が導入した疎水ペプ
チド部が正しく基板方向に配列しているかどうかをその
疎水ペプチドに対する抗体を用いて確認した。また、活
性においてもアッセイを行った。この吸着したタンパク
質はバイオセンサの感応部と、して使用した。
以下、グルコースオキシダーゼを用いたタンパク質固定
化法について述べる。
化法について述べる。
オリゴヌクレオチドは、官能基を保護したデオキシヌク
レオチド−β−シアノエチルホスホアミンを用いて調整
した（シンバーら、１９８３．１９８４）。この方法で
有機合成したオリゴヌクレオチドの精製は、逆相ＨＰＬ
Ｃを用いて行った。
レオチド−β−シアノエチルホスホアミンを用いて調整
した（シンバーら、１９８３．１９８４）。この方法で
有機合成したオリゴヌクレオチドの精製は、逆相ＨＰＬ
Ｃを用いて行った。
第１図〜第３図に、有機合成されたオリゴヌクレオチド
の塩基配列を示した。すなわち、第１図においては、Ａ
Ｉ（実線）・Ａ２（破線）、第２図においては、Ｂｌ（
−点鎖線）・Ｂ２（二点鎖ｖＡ）、第３図においては、
Ｃ１（二重線） −０２（波線）である。
の塩基配列を示した。すなわち、第１図においては、Ａ
Ｉ（実線）・Ａ２（破線）、第２図においては、Ｂｌ（
−点鎖線）・Ｂ２（二点鎖ｖＡ）、第３図においては、
Ｃ１（二重線） −０２（波線）である。
この有機合成ヌクレオチドＡＩ（実線）、Ａ２（破線）
の５′末端をラベルするために、それぞれ２０ｐｍｏｌ
オレゴヌクレオチドを（γ−５ａｐ）ＡＴＰ （１８０
μＣｉ＝１３ｐｍｏｌ）、ＡＴＰ（ＩＯｐｍｏ ｌ）、
５０ｍＭ）リスバッファー（１）Ｈ＝７．５）、１０ｍ
ＭＭｇＣｌ５，５ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＩＯｌ、 Ｕ、 ）を
含む反応溶液５０〜１００μｌ中、３７℃で３０分間リ
ン酸後、セファデックスＧ−５０により精製した。この
方法により１１０７ｃｐ／μｍｏｌの標品が得られた。
の５′末端をラベルするために、それぞれ２０ｐｍｏｌ
オレゴヌクレオチドを（γ−５ａｐ）ＡＴＰ （１８０
μＣｉ＝１３ｐｍｏｌ）、ＡＴＰ（ＩＯｐｍｏ ｌ）、
５０ｍＭ）リスバッファー（１）Ｈ＝７．５）、１０ｍ
ＭＭｇＣｌ５，５ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＩＯｌ、 Ｕ、 ）を
含む反応溶液５０〜１００μｌ中、３７℃で３０分間リ
ン酸後、セファデックスＧ−５０により精製した。この
方法により１１０７ｃｐ／μｍｏｌの標品が得られた。
オリゴヌクレオチドＡＩ（実線）、Ａ２（破線）をそれ
ぞれ３０ｐｍｏｌを１５μｍの水に溶かし、それを３分
間沸騰させた後、３５℃で１時間以上放置し、その後４
°Ｃで放冷した。ハイブリッド鎖の一本鎖部分を相補的
な二本鎖にするためにこのハイブリッド鎖に６０ｍＭＮ
ａＣ１，６ｍＭβ−メルカプトエタノール、８ ｍ Ｍ
Ｍ ｇ Ｃｌ ２１ それぞれ０．１ｍＭのｄＡＴ
Ｐ−ｄＣＴＰ ＠ｄＧＴＰ−ｄＴＴＰ及び１２０Ｕ／ｍ
ｌのクレノー断片酵素を含む２５μｌの１０ｍＭ）リス
バッファ（ｐＨ＝７．６）中、室温で３０分間放置した
。その後、この水溶液を８％未未変性悪態ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけた後、完全なハイブリッド鎖
を含む部分を切り出し、このゲル切片を一晩中６０℃で
、 ５００ｍＭＮａＣＩ、 ５ｍＭＥＤＴＡを含む２５
ｍＭ）リスバッフｙ（ｐＨ＝８．０）１ｍｌ中に放置し
ておいた。この溶出液をセファデックスＧ−５０にかけ
脱塩した。
ぞれ３０ｐｍｏｌを１５μｍの水に溶かし、それを３分
間沸騰させた後、３５℃で１時間以上放置し、その後４
°Ｃで放冷した。ハイブリッド鎖の一本鎖部分を相補的
な二本鎖にするためにこのハイブリッド鎖に６０ｍＭＮ
ａＣ１，６ｍＭβ−メルカプトエタノール、８ ｍ Ｍ
Ｍ ｇ Ｃｌ ２１ それぞれ０．１ｍＭのｄＡＴ
Ｐ−ｄＣＴＰ ＠ｄＧＴＰ−ｄＴＴＰ及び１２０Ｕ／ｍ
ｌのクレノー断片酵素を含む２５μｌの１０ｍＭ）リス
バッファ（ｐＨ＝７．６）中、室温で３０分間放置した
。その後、この水溶液を８％未未変性悪態ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけた後、完全なハイブリッド鎖
を含む部分を切り出し、このゲル切片を一晩中６０℃で
、 ５００ｍＭＮａＣＩ、 ５ｍＭＥＤＴＡを含む２５
ｍＭ）リスバッフｙ（ｐＨ＝８．０）１ｍｌ中に放置し
ておいた。この溶出液をセファデックスＧ−５０にかけ
脱塩した。
この精製ＤＮＡ（ＡＩ−２）塩基配列は、第１図に示し
ている。また、他のオリゴヌクレオチド（Ｂ１（−点鎖
線）、Ｂ２（二点鎖線）、Ｃ１（二ｆｆ１１１り、Ｃ２
（波線））のハイブリッドも上記と同様に行った。得ら
れた二本鎖ＤＮＡ （Ｂ １−２、Ｃ１−２）の塩基配
列も第２図、第３図にそれぞれ示している。
ている。また、他のオリゴヌクレオチド（Ｂ１（−点鎖
線）、Ｂ２（二点鎖線）、Ｃ１（二ｆｆ１１１り、Ｃ２
（波線））のハイブリッドも上記と同様に行った。得ら
れた二本鎖ＤＮＡ （Ｂ １−２、Ｃ１−２）の塩基配
列も第２図、第３図にそれぞれ示している。
５′末端をラベルした断片Ａ１−２ （２ｐｍ。
ｌ）を３７℃、１時間、３ＵＢｃｌＩを含む１０μｌの
Ｙ−１０バツフｙ（１０ｍＭ）リス、７ｍＭＭｇＣ１２
，１０ｍＭＮａＣ１，６ｍＭβ−メルカプトエタノール
）中で消化した。さらに、３゜５ＵＥｃｏＲＩを含む１
５μｌのＥｃｏＲＩバッフｙ（１００ｍＭ）リス、７
ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃｌ ２− ５０ｍＭＮａｃ１．８ｍ
Ｍβ−メルカプトエタノール）中で３７°Ｃ１２時間消
化した。
Ｙ−１０バツフｙ（１０ｍＭ）リス、７ｍＭＭｇＣ１２
，１０ｍＭＮａＣ１，６ｍＭβ−メルカプトエタノール
）中で消化した。さらに、３゜５ＵＥｃｏＲＩを含む１
５μｌのＥｃｏＲＩバッフｙ（１００ｍＭ）リス、７
ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃｌ ２− ５０ｍＭＮａｃ１．８ｍ
Ｍβ−メルカプトエタノール）中で３７°Ｃ１２時間消
化した。
一方、ベクターであるｐＫＫ３１ （１００ｎｇ）も同
様にＢｃｌＩとＥｃｏＲＩで消化した。これに上記の消
化したＤＮＡ断片Ａ１−２を加え、バッフｙＡ（２０ｍ
Ｍ）リス、 １０ｍＭＭｇＣ１２１１０ｍＭＤＴＴ、
０． ５ｍＭＡＴＰ）中、 ４℃で１５時間放置した
のち、エタノール沈澱により回収した（ｐＫＫ３１−１
）。
様にＢｃｌＩとＥｃｏＲＩで消化した。これに上記の消
化したＤＮＡ断片Ａ１−２を加え、バッフｙＡ（２０ｍ
Ｍ）リス、 １０ｍＭＭｇＣ１２１１０ｍＭＤＴＴ、
０． ５ｍＭＡＴＰ）中、 ４℃で１５時間放置した
のち、エタノール沈澱により回収した（ｐＫＫ３１−１
）。
次に、ＤＮＡ断片Ｂ １−２ （２ｐｍｏ ｌ）を３Ｕ
ＫｐｎＩを含む１０μ１Ｙ−１０バツフア中で３７℃、
１時間消化した。更に、３．５ＵＥｃ。
ＫｐｎＩを含む１０μ１Ｙ−１０バツフア中で３７℃、
１時間消化した。更に、３．５ＵＥｃ。
ＲＩを含む１５μ１ＥｃｏＲＩバツフ１中で３７℃、２
時間消化した。
時間消化した。
一方、ｐＫＫ３１−１ベクター（１００ｎｇ）も同様に
ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで消化し、これに上記の消化した
ＤＮＡ断片Ｂ １−２ （２１）ｍｏ ｌ）を加え、バ
ッファＡ中、４℃で１５時間放置した後、エタノール沈
澱により回収した（ｐＫＫ３１−２）。更に、ＤＮＡ断
片ＣＩ−２Ｃｌ−２（２ｐを３ＵＫｐ ｎ Ｉを含む１
０μ１Ｙ−１０バー／ ７ Ｆ中で３７℃、１時間消化
した。また、３ＵＢａｍＨＩを含む１０μ１Ｙ−１００
バツフｙ（１０ｍＭトリス、 ７ｍＭＭｇＣ１ｔ、
１００ｍＭＮａＣ１゜６ｍＭβ−メルカプトエタノー
ル）中、３７℃で１時間消化した。
ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで消化し、これに上記の消化した
ＤＮＡ断片Ｂ １−２ （２１）ｍｏ ｌ）を加え、バ
ッファＡ中、４℃で１５時間放置した後、エタノール沈
澱により回収した（ｐＫＫ３１−２）。更に、ＤＮＡ断
片ＣＩ−２Ｃｌ−２（２ｐを３ＵＫｐ ｎ Ｉを含む１
０μ１Ｙ−１０バー／ ７ Ｆ中で３７℃、１時間消化
した。また、３ＵＢａｍＨＩを含む１０μ１Ｙ−１００
バツフｙ（１０ｍＭトリス、 ７ｍＭＭｇＣ１ｔ、
１００ｍＭＮａＣ１゜６ｍＭβ−メルカプトエタノー
ル）中、３７℃で１時間消化した。
一方、ｐＫＫ３１−２ベクター（１００ｎｇ）も同様に
ＫｐｎＩとＢａｍＨＩで消化し、これに、上記の消化し
たＤＮＡ断片Ｃ１−２を加え、バッファＡ中、４℃で１
５時間放置した後、エタノール沈澱により回収した（、
ｐＫＫ３１−３）。
ＫｐｎＩとＢａｍＨＩで消化し、これに、上記の消化し
たＤＮＡ断片Ｃ１−２を加え、バッファＡ中、４℃で１
５時間放置した後、エタノール沈澱により回収した（、
ｐＫＫ３１−３）。
一方、グルコースオキシダーゼ遺伝子含有ベクターｐＨ
ＵＲ３２（１００ｎｇ）を３ＵＢｃ ｌ Ｉを含むＹ−
１０バツフＴ中、３７℃で２時間消化し、更に３ＵＥｃ
ｏＲＩを含むＥｃｏＲＩバッファ中、３７℃で２時間消
化を行った。同様に、上記のｐＫＫ３１−３ベクターを
ＢｃｌＩとＥｃ。
ＵＲ３２（１００ｎｇ）を３ＵＢｃ ｌ Ｉを含むＹ−
１０バツフＴ中、３７℃で２時間消化し、更に３ＵＥｃ
ｏＲＩを含むＥｃｏＲＩバッファ中、３７℃で２時間消
化を行った。同様に、上記のｐＫＫ３１−３ベクターを
ＢｃｌＩとＥｃ。
ＲＩで消化を行い、これに、消化したｐＨＵＲ３２ベク
ターを加えてバッファＡ中、４℃で１５時間放置後、エ
タノール沈澱により回収した（ｐＨＵＲ３２０）。この
ｐＨＵＲ３２０ベクター１００μｌ （０，０４ｐｍｏ
ｌ）、０．４ＭのＭｇＣｌ２．０．１ＭのＣａＣｌ２お
よび、大腸菌株５ＢＨ５１（１００μｌ）を混ぜ、０°
Ｃで２０分間、４２°Ｃで２分間、室温で１０分間処理
することにより形質転換を行った。
ターを加えてバッファＡ中、４℃で１５時間放置後、エ
タノール沈澱により回収した（ｐＨＵＲ３２０）。この
ｐＨＵＲ３２０ベクター１００μｌ （０，０４ｐｍｏ
ｌ）、０．４ＭのＭｇＣｌ２．０．１ＭのＣａＣｌ２お
よび、大腸菌株５ＢＨ５１（１００μｌ）を混ぜ、０°
Ｃで２０分間、４２°Ｃで２分間、室温で１０分間処理
することにより形質転換を行った。
形質転換した大腸菌を１ｍｌのＬ−Ｂｒｏｔｈ中、３７
°Ｃで８時間培養した後、この培養液を、３１の１００
ｕ ｇ／ｍ ｌアンピシリン、０．１ｍＭＩＰＴＧを
含むＬ−Ｂｒｏｔｈ中、３７℃で１２時間培養した。こ
の培養液を遠心分離（８，００Ｏｒｐｍ１０°Ｃ１２０
分間）し、大腸菌を集菌した後、フレンチプレスで菌を
破砕し、遠心分離（８＋ ＯＯＯｒｐｍ、０℃、３０
分間）を行なった。さらに、この上清を超遠心分離（２
０，００Ｏｒｐｍ、４℃、６０分間）することにより、
沈澱物から組換えグルコースオキシダーゼを含むベシク
ルを得た。このベシクルを０． １％β−メルカプトエ
タノールを含む２５ｍＭ）リスバッファ（ｐ Ｈ＝ ７
． ５ ）中で超音波処理により破砕した後、０．１％
β−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭトリスバッフ
ァ（ｐＨ＝７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース
イオン交換クロマトグラフィにかけて、同バッファで洗
浄後、Ｏ〜１゜０ＭＮａＣｌグラジェントをかけ溶出し
た。
°Ｃで８時間培養した後、この培養液を、３１の１００
ｕ ｇ／ｍ ｌアンピシリン、０．１ｍＭＩＰＴＧを
含むＬ−Ｂｒｏｔｈ中、３７℃で１２時間培養した。こ
の培養液を遠心分離（８，００Ｏｒｐｍ１０°Ｃ１２０
分間）し、大腸菌を集菌した後、フレンチプレスで菌を
破砕し、遠心分離（８＋ ＯＯＯｒｐｍ、０℃、３０
分間）を行なった。さらに、この上清を超遠心分離（２
０，００Ｏｒｐｍ、４℃、６０分間）することにより、
沈澱物から組換えグルコースオキシダーゼを含むベシク
ルを得た。このベシクルを０． １％β−メルカプトエ
タノールを含む２５ｍＭ）リスバッファ（ｐ Ｈ＝ ７
． ５ ）中で超音波処理により破砕した後、０．１％
β−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭトリスバッフ
ァ（ｐＨ＝７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース
イオン交換クロマトグラフィにかけて、同バッファで洗
浄後、Ｏ〜１゜０ＭＮａＣｌグラジェントをかけ溶出し
た。
得られた組換えグルコースオキシダーゼ溶液を０．１％
β−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭトリスバッフ
ァ（ｐＨ＝７．５）中に滴下し、表面圧１（１２Ｎ／ｍ
で室温において水平付着法によりシリコンウェハー基板
上に吸着固定化させた。
β−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭトリスバッフ
ァ（ｐＨ＝７．５）中に滴下し、表面圧１（１２Ｎ／ｍ
で室温において水平付着法によりシリコンウェハー基板
上に吸着固定化させた。
固定化の方向性を調べるため、疎水領域に対するモノク
ローナル抗体を作製し、固定化した組換えグルコースオ
キシダーゼと反応させた。その結果、抗原抗体反応は起
こらず、確かに疎水領域側がシリコンウェハーに吸着し
ていた。
ローナル抗体を作製し、固定化した組換えグルコースオ
キシダーゼと反応させた。その結果、抗原抗体反応は起
こらず、確かに疎水領域側がシリコンウェハーに吸着し
ていた。
発明の効果
本発明のタンパク質固定化法によれば、タンパク質のＮ
末端あるいは、Ｃ末端に疎水性ペプチドを導入すること
により、この疎水性部分を利用して膜あるいは、固相面
上に失活することなく、かつ、方向性を持たせて固定化
することできる。
末端あるいは、Ｃ末端に疎水性ペプチドを導入すること
により、この疎水性部分を利用して膜あるいは、固相面
上に失活することなく、かつ、方向性を持たせて固定化
することできる。
第１図〜第３図は、本発明のタンパク質固定化法の遺伝
子操作に用いた合成二本鎖ＤＮＡの塩基配列を示す図で
ある。 代理人の氏名 弁理士 粟野重孝 はか１名第１図 ＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴｃａ
ｃｔａｇｔａａｇａａｇａａｇａａｇａａｇａａＣＴＴ
ＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴｇａａｇ
ａａｇａａｇａａｇａａｇａａｇａａｇａａＣＴＴＣＴ
ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴｃ ｔ ｔ ｃ ｔ ｔ ｃ ｔ
ｔｑ人Δ−ｑＡ五β−Δ−八へ−八へ−ｑ人Δ−ｑΔ
−八へ、八人ｑ、八へｃｔｔｃｔｔｃｔｔｃｔｔｇｇｇ
ｔａｃｃｔｔｇｇａｑ人Δ−ｔ２Ａ五９−ΔＡＩＱ入Δ
−ｑρ−ｑ人τ−ｑ９Δ人ｑ−ｃ−τｔｔｃｔｃ 工人Δ−ｑΔ−ｑ 第２図 ＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣ
ＣＣａｔｇｇａａＣＣＣｔａｇｇａｇｇａａｇａａＣＴ
ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴｇａａ
ｇａａｇａａｇａａｇａａｇａａｇａａｇａａＣＴＴＣ
ＴＴＣＴＴＣＴＴＣ ｔ ｔ ｃ ｔ ｔ ｃ ｔ ｔ
ｃ ｔ ｔＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡ ＧＡＡ
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ｔｔｃｔｔＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡ
ＡＧＡＡｇｇａａｔｔｃｔｃ 第３図 ＧＧＧＴＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣ
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子操作に用いた合成二本鎖ＤＮＡの塩基配列を示す図で
ある。 代理人の氏名 弁理士 粟野重孝 はか１名第１図 ＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴｃａ
ｃｔａｇｔａａｇａａｇａａｇａａｇａａｇａａＣＴＴ
ＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴｇａａｇ
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ｔａｃｃｔｔｇｇａｑ人Δ−ｔ２Ａ五９−ΔＡＩＱ入Δ
−ｑρ−ｑ人τ−ｑ９Δ人ｑ−ｃ−τｔｔｃｔｃ 工人Δ−ｑΔ−ｑ 第２図 ＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣ
ＣＣａｔｇｇａａＣＣＣｔａｇｇａｇｇａａｇａａＣＴ
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ＡＧＡＡｇｇａａｔｔｃｔｃ 第３図 ＧＧＧＴＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣ
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Claims (5)
- （１）タンパク質のＮ末端あるいは、Ｃ末端に疎水性の
ポリペプチドを導入し、そのタンパク質を固定化面に固
定化することを特徴とするタンパク質固定化法。 - （２）タンパク質が、酵素、ホルモン、免疫抗体または
その誘導体からなることを特徴とする請求項１に記載の
タンパク質固定化法。 - （３）固定化面が、膜または固相であることを特徴とす
る請求項１に記載のタンパク質固定化法。 - （４）膜の実質的成分が、生体膜、ＬＢ膜または酸化膜
であることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質固
定化法。 - （５）固相の実質的成分が、ビーズ、平面基板または電
極であること特徴とする請求項３に記載のタンパク質固
定化法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63233002A JPH0753108B2 (ja) | 1988-09-16 | 1988-09-16 | タンパク質固定化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63233002A JPH0753108B2 (ja) | 1988-09-16 | 1988-09-16 | タンパク質固定化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0279975A true JPH0279975A (ja) | 1990-03-20 |
| JPH0753108B2 JPH0753108B2 (ja) | 1995-06-07 |
Family
ID=16948274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63233002A Expired - Fee Related JPH0753108B2 (ja) | 1988-09-16 | 1988-09-16 | タンパク質固定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0753108B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6736472B2 (en) * | 2002-04-29 | 2004-05-18 | Camco Inc. | Refrigerator cabinet refrigerant tube assembly |
| GB2433591A (en) * | 2005-12-20 | 2007-06-27 | Sharp Kk | Method for functionalising a hydrophobic substrate |
| JP2009519433A (ja) * | 2005-12-20 | 2009-05-14 | シャープ株式会社 | リガンド結合用多量体型捕捉剤の製造方法 |
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Families Citing this family (1)
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-
1988
- 1988-09-16 JP JP63233002A patent/JPH0753108B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
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|---|---|---|---|---|
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| JP2009519433A (ja) * | 2005-12-20 | 2009-05-14 | シャープ株式会社 | リガンド結合用多量体型捕捉剤の製造方法 |
| JP4750187B2 (ja) * | 2005-12-20 | 2011-08-17 | シャープ株式会社 | リガンド結合用多量体型捕捉剤の製造方法 |
| US8697349B2 (en) | 2007-11-01 | 2014-04-15 | Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho | Method of producing solid-phase body having immobilized microobject and the use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0753108B2 (ja) | 1995-06-07 |
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