JPH0279980A - ヒトパピローマウイルス５２ｂ遺伝子 - Google Patents
ヒトパピローマウイルス５２ｂ遺伝子Info
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- JPH0279980A JPH0279980A JP23150088A JP23150088A JPH0279980A JP H0279980 A JPH0279980 A JP H0279980A JP 23150088 A JP23150088 A JP 23150088A JP 23150088 A JP23150088 A JP 23150088A JP H0279980 A JPH0279980 A JP H0279980A
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- dna
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はヒトパピローマウィルス５２ｂ型（以下ＨＰＶ
５２ｂと記載する場合がある）の遺伝子に関する。
５２ｂと記載する場合がある）の遺伝子に関する。
この遺伝子は特に、産婦人科の臨床における子宮頚ガン
の診断のために有用であると期待される。
の診断のために有用であると期待される。
パピローマウィルスはヒトをはじめ種々の動物から皮膚
や粘膜に良性腫瘍である虎をつくるウィルスとして分離
された。ヒトから分離されるヒトパピローマウィルス（
ＨＰ Ｖ）は、ＥＢウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスや成人
Ｔ細胞白血病ウィルスとともに、ヒトの癌と密接な関係
を持つと考えられる数少ないウィルスのひとつである。
や粘膜に良性腫瘍である虎をつくるウィルスとして分離
された。ヒトから分離されるヒトパピローマウィルス（
ＨＰ Ｖ）は、ＥＢウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスや成人
Ｔ細胞白血病ウィルスとともに、ヒトの癌と密接な関係
を持つと考えられる数少ないウィルスのひとつである。
ヒトを宿主とするヒトパピローマウィルスのタイピング
はウィルスＤＮＡの相補性の程度〔高ストリンジント（
ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下でのハイブリダイゼーショ
ン効率が５０％以下のものを別タイプとする〕によって
行われ（１，Ｃｏｇｇｉｎら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、
３９＋ ５４５（１９７９）） 、現在、５０数タイ
プが知られている。
はウィルスＤＮＡの相補性の程度〔高ストリンジント（
ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下でのハイブリダイゼーショ
ン効率が５０％以下のものを別タイプとする〕によって
行われ（１，Ｃｏｇｇｉｎら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、
３９＋ ５４５（１９７９）） 、現在、５０数タイ
プが知られている。
ヒトの沈は、その発生部位、形態、Ｍｉ織像などから臨
床的分類がされており、他方ＨＰＶのタイピングが行わ
れて、それぞれのタイプと臨床像との関係が明らかにな
ってきた。足底沈贅から分離されるのはＩＩＰＶ １
、及びＨＰＶ４であり、尋常性沈贅からは）ＩＰＶ ２
、及びＨＰＶ １が分離された。睨贅状表皮発育異常症
（ｅｐｉｄｅｒｍｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｖｅｒｒｕｃ
ｉ−ｆｏｒｍｉｓ ； Ｅ Ｖ ）では多種のＨＰ Ｖ
が得られており、）ＨＰＶ５のほか２０種以上のＨＰ
Ｖの報告がある。
床的分類がされており、他方ＨＰＶのタイピングが行わ
れて、それぞれのタイプと臨床像との関係が明らかにな
ってきた。足底沈贅から分離されるのはＩＩＰＶ １
、及びＨＰＶ４であり、尋常性沈贅からは）ＩＰＶ ２
、及びＨＰＶ １が分離された。睨贅状表皮発育異常症
（ｅｐｉｄｅｒｍｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｖｅｒｒｕｃ
ｉ−ｆｏｒｍｉｓ ； Ｅ Ｖ ）では多種のＨＰ Ｖ
が得られており、）ＨＰＶ５のほか２０種以上のＨＰ
Ｖの報告がある。
性器のコンジローマ（ｃｏｎｄｙｌｏｍａ ａｃｕｍｉ
ｎａｔｕｍ）から取れたものには１ｌＰＶ６、及び１（
ＰＶＩＩがあり、子宮頚ガンからクローンされたものに
はＨＰＶ１６ 。
ｎａｔｕｍ）から取れたものには１ｌＰＶ６、及び１（
ＰＶＩＩがあり、子宮頚ガンからクローンされたものに
はＨＰＶ１６ 。
＋１ＰＶ１Ｂ、ＨＰＶ３１ 、 ＨＰＶ３３．ＨＰ
Ｖ３５などがある。疫学的研究から子宮頚ガンでは高顛
度でＨＰＶ ＤＮＡがみつかっており、欧米ではＩＩ
Ｐ Ｖ １６は６０−９０％〔口。
Ｖ３５などがある。疫学的研究から子宮頚ガンでは高顛
度でＨＰＶ ＤＮＡがみつかっており、欧米ではＩＩ
Ｐ Ｖ １６は６０−９０％〔口。
Ｊ、ＭａＣａｎｃｅらＢｒ、Ｊ、０ｂｓｔｅｔ、 Ｇｙ
ｎａｅｃｏｌ、 ９２＋ １１０１（１９８６） ；
Ｍ、ＤｕｒｓｔらＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＩＪＳＡ８０、３８１２（１９８３）） 、ＨＰＶ
１８は１５−３６％（ＢｏｓｈａｒｔらＥＭＢＯＪ、ユ
、 １１５１ （１９８４） ）との報告もされている
。またＨＰＶ３１． １（ＰＶ３３、及び１ｌＰＶ３５
を加えると子宮頚ガンにおけるＨＰＶの陽性率は９０％
台になるといわれている。ＨＰＶ ＤＮＡのうちいくつ
かは全塩基配列が決定されている（ＩＩＰＶＩ 、
ＨＰＶ５ 。
ｎａｅｃｏｌ、 ９２＋ １１０１（１９８６） ；
Ｍ、ＤｕｒｓｔらＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＩＪＳＡ８０、３８１２（１９８３）） 、ＨＰＶ
１８は１５−３６％（ＢｏｓｈａｒｔらＥＭＢＯＪ、ユ
、 １１５１ （１９８４） ）との報告もされている
。またＨＰＶ３１． １（ＰＶ３３、及び１ｌＰＶ３５
を加えると子宮頚ガンにおけるＨＰＶの陽性率は９０％
台になるといわれている。ＨＰＶ ＤＮＡのうちいくつ
かは全塩基配列が決定されている（ＩＩＰＶＩ 、
ＨＰＶ５ 。
１１ＰＶ６ 、 ＩＰＶＢ 、 ＨＰＶＩＩ、ＨＰ
Ｖ１６ 、 ＨＰＶ１８、及び１１ＰＶ３３）。
Ｖ１６ 、 ＨＰＶ１８、及び１１ＰＶ３３）。
ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）は近年子宮頚ガンと
深い係わりがあることを示唆する報告がなされている。
深い係わりがあることを示唆する報告がなされている。
現在知られているＨＰＶは５０数タイプにものぼるが、
そのうちでも１（ＰＶ１６ 、１Ｂ 。
そのうちでも１（ＰＶ１６ 、１Ｂ 。
３１ 、３３、及び３５が子宮頚ガンの組織においてよ
く見つかっている。欧米からの報告によるとこれらのタ
イプのＨＰＶが、大半をしめるのであるが、日本におい
てはかならずしも同じ結果ではない。
く見つかっている。欧米からの報告によるとこれらのタ
イプのＨＰＶが、大半をしめるのであるが、日本におい
てはかならずしも同じ結果ではない。
ＨＰＶ３１ 、３３、及び３５についてはほとんど調べ
られていないが、ＨＰＶ１６、及び１８についての報告
では２０−３０％ぐらいにすぎない。ちなみに西ドイツ
ではこの２タイプがほぼ７０％を占めるという報告があ
る。日本においてはさらに新しいタイプのＨＰＶが存在
する可能性が予想されていた。産婦人科の臨床において
は既知のタイプ、特に１６型や１８型が診断の材料とし
て用いられており、その診断において他のタイプのＨＰ
Ｖは見過ごされていることもありえる。
られていないが、ＨＰＶ１６、及び１８についての報告
では２０−３０％ぐらいにすぎない。ちなみに西ドイツ
ではこの２タイプがほぼ７０％を占めるという報告があ
る。日本においてはさらに新しいタイプのＨＰＶが存在
する可能性が予想されていた。産婦人科の臨床において
は既知のタイプ、特に１６型や１８型が診断の材料とし
て用いられており、その診断において他のタイプのＨＰ
Ｖは見過ごされていることもありえる。
従って本発明は、子宮頚ガンと関連の深い新しいタイプ
のヒトパピローマウィルスの遺伝子を提供し、子宮頚ガ
ンの高い確率での診断に寄与しようとするものである。
のヒトパピローマウィルスの遺伝子を提供し、子宮頚ガ
ンの高い確率での診断に寄与しようとするものである。
本発明者等は、子宮頚ガン組織から新しいタイプのＨＰ
Ｖを分離することを試み、分離された遺伝子を既知のＨ
ＰＶと比較した結果、５２番目に分離されたＨＰＶとし
てＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒｌｌｕｍ
ａｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉ
ｒｕｓ よりＨＰＶ５２ｂと命名される新規なＨＰＶを
得た。
Ｖを分離することを試み、分離された遺伝子を既知のＨ
ＰＶと比較した結果、５２番目に分離されたＨＰＶとし
てＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒｌｌｕｍ
ａｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉ
ｒｕｓ よりＨＰＶ５２ｂと命名される新規なＨＰＶを
得た。
従って本発明は、ＨＰＶ５２ｂの遺伝子及びその部分、
並びにこれらを含有するベクターを提供するものである
。
並びにこれらを含有するベクターを提供するものである
。
本発明においては、子宮頚ガンを有する４人の患者から
ガン組織を得、これからウィルスＤＮＡを抽出した。こ
れらのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ又は１ＩｉｎｄｌＩ
Ｉで消化した後、高ストリンジェット（ｓｔｒｉｎｇｅ
ｎｔ）条件下（Ｔｍ −１０℃）でプローブとしてのヒ
トパピローマウィルスＨＰＶ１６のＤＮＡとハイブリダ
イズせしめた。この結果、１つの標本からのＤＮＡがプ
ローブとハイブリダイズし、ＨＰＶ１６のＤＮＡと同一
の位置にバンドが現われた。
ガン組織を得、これからウィルスＤＮＡを抽出した。こ
れらのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ又は１ＩｉｎｄｌＩ
Ｉで消化した後、高ストリンジェット（ｓｔｒｉｎｇｅ
ｎｔ）条件下（Ｔｍ −１０℃）でプローブとしてのヒ
トパピローマウィルスＨＰＶ１６のＤＮＡとハイブリダ
イズせしめた。この結果、１つの標本からのＤＮＡがプ
ローブとハイブリダイズし、ＨＰＶ１６のＤＮＡと同一
の位置にバンドが現われた。
この結果、この標本からのＤＮＡが肝Ｖ１６のＤＮＡと
同一であることが示唆された。さらに、前記制限酵素消
化ＤＮＡサンプルを低ストリンジェット条件下（Ｔｍ
−３７℃）で前記プローブとハイブリダイズせしめたと
ころ、前記の陽性ＤＮＡのほかに、２個のＤＮＡサンプ
ルが該プローブとハイブリダイズし、これらは前者と異
る位置にバンドを示した。従って後者の２種類のＤＮＡ
サンプルは）ＩＰＶ１６のＤＮＡとは異るヒトパピロー
マウィルスのＤＮＡを含んでいることが示唆された。
同一であることが示唆された。さらに、前記制限酵素消
化ＤＮＡサンプルを低ストリンジェット条件下（Ｔｍ
−３７℃）で前記プローブとハイブリダイズせしめたと
ころ、前記の陽性ＤＮＡのほかに、２個のＤＮＡサンプ
ルが該プローブとハイブリダイズし、これらは前者と異
る位置にバンドを示した。従って後者の２種類のＤＮＡ
サンプルは）ＩＰＶ１６のＤＮＡとは異るヒトパピロー
マウィルスのＤＮＡを含んでいることが示唆された。
次に、これら２種類のＤＮＡを各種の制限酵素で消化し
、その消化パターンを比較したところ、これらは同一の
ウィルスＤＮＡを含有することが示唆された。そこで、
これらのＤＮＡサンプルの内の１つをＸｂａ Ｉにより
消化し、Ｘｂａ Ｉ断片をＣｈａｒｏｍｉｄ ９−３６
ベクターＤ Ｎ Ａ （１，５ａｉｔｏ及びＧ、Ｒ，５
ｔａｒｋ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ ８３．８６６４（１９８６） ）に挿入し、低
ストリンジェット条件下（Ｔｍ −３７℃）でのＨＰＶ
１６のＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより選択し
た後、陽性クローンからＸｂａ Ｉにより７．９Ｋｂの
挿入断片を切り出し、プラスミドｐｌＪｃ１９のＸｂａ
Ｉ切断部位にクローニングした。
、その消化パターンを比較したところ、これらは同一の
ウィルスＤＮＡを含有することが示唆された。そこで、
これらのＤＮＡサンプルの内の１つをＸｂａ Ｉにより
消化し、Ｘｂａ Ｉ断片をＣｈａｒｏｍｉｄ ９−３６
ベクターＤ Ｎ Ａ （１，５ａｉｔｏ及びＧ、Ｒ，５
ｔａｒｋ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ ８３．８６６４（１９８６） ）に挿入し、低
ストリンジェット条件下（Ｔｍ −３７℃）でのＨＰＶ
１６のＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより選択し
た後、陽性クローンからＸｂａ Ｉにより７．９Ｋｂの
挿入断片を切り出し、プラスミドｐｌＪｃ１９のＸｂａ
Ｉ切断部位にクローニングした。
次に、このＸｂａ Ｉ ＤＮＡ断片を種々の制限酵素
で切断し、制限地図を作成したところ、第４図に示す結
果が得られ、この結果を既知のヒトパピローマウィルス
のＤＮＡの制限地図と比較したところ、いずれとも異り
、新規なヒトパピローマウィルスのＤＮＡであることが
確認された。
で切断し、制限地図を作成したところ、第４図に示す結
果が得られ、この結果を既知のヒトパピローマウィルス
のＤＮＡの制限地図と比較したところ、いずれとも異り
、新規なヒトパピローマウィルスのＤＮＡであることが
確認された。
従って、本発明のヒトパピローマウィルスの遺伝子は、
１つの態様において、１個のＸｂａ Ｉ切断部位、２個
のＢａｍＨＩ切断部位、３個のＢｇｌＩｌ、切断部位、
２個のＥｃｏＲＩ切断部位、１個のＥｃｏＲＶ切断部位
、２個のＫｐｎ Ｉ切断部位、６個のＰｓｔＩ切断部位
、２個のＰνＵ■切断部位、１個の５ａｌｌ切断部位、
及び１個の５ａｎｄ Ｉ切断部位を含有し、約８Ｋｂｐ
の長さを有する環状遺伝である。
１つの態様において、１個のＸｂａ Ｉ切断部位、２個
のＢａｍＨＩ切断部位、３個のＢｇｌＩｌ、切断部位、
２個のＥｃｏＲＩ切断部位、１個のＥｃｏＲＶ切断部位
、２個のＫｐｎ Ｉ切断部位、６個のＰｓｔＩ切断部位
、２個のＰνＵ■切断部位、１個の５ａｌｌ切断部位、
及び１個の５ａｎｄ Ｉ切断部位を含有し、約８Ｋｂｐ
の長さを有する環状遺伝である。
しかしながら、ヒトパピローマウィルスは一般に、環状
ウィルス遺伝子が１ケ所で切断されて生ずる線状遺伝子
として宿主動物の染色体中に組み込まれた状態で存在す
る場合もあり、本発明はこの様な存在状態から切り出さ
れた線状遺伝子をも含む。さらに、診断のために使用す
るためには、環状遺伝子が任意の１ケ所で切断されてな
る線状遺伝子も使用することができ、さらに環状遺伝子
が複数ケ所で切断されることにより生ずる遺伝子断片も
使用することができる。従って本発明は、前記環状遺伝
子が任意の１ケ所又は複数ケ所で切断されて生ずる線状
遺伝子、及び遺伝子の部分も本発明に包含される。切断
部位としては、前記の種々の制限酵素切断部位の内の１
ケ所又は複数ケ所の組み合わせを用いることができる。
ウィルス遺伝子が１ケ所で切断されて生ずる線状遺伝子
として宿主動物の染色体中に組み込まれた状態で存在す
る場合もあり、本発明はこの様な存在状態から切り出さ
れた線状遺伝子をも含む。さらに、診断のために使用す
るためには、環状遺伝子が任意の１ケ所で切断されてな
る線状遺伝子も使用することができ、さらに環状遺伝子
が複数ケ所で切断されることにより生ずる遺伝子断片も
使用することができる。従って本発明は、前記環状遺伝
子が任意の１ケ所又は複数ケ所で切断されて生ずる線状
遺伝子、及び遺伝子の部分も本発明に包含される。切断
部位としては、前記の種々の制限酵素切断部位の内の１
ケ所又は複数ケ所の組み合わせを用いることができる。
さらに、本発明のヒトパピローマウィルスの遺伝子は上
記の特徴により定義されるものに限定されない。すなわ
ち、ウィルスは自然に変異しやすいこと等を考慮して、
そのＤＮＡの相補性の程度に基いて他のウィルスと区別
される。すなわち、高ハイブリダイゼーション条件下で
ハイブリダイゼーション効率が５０％以下のものを別タ
イプのウィルスとして定義される。従って、前記のごと
く特徴付けられる遺伝子と高ストリンジェット条件下で
ハイブリダイズするＤＮＡは本発明の遺伝子の範囲に含
まれる。従って本発明は、前に定義したウィルス遺伝子
のほかに、自然に変異したウィルス遺伝子であって高ス
トリンジェット条件下で前に定義した遺伝子とハイブリ
ダイズするもの、及び人為的に変異せしめ又は化学合成
されたＤＮＡ断片であって、高ストリンジェット条件下
で前に定義した遺伝子とハイブリダイズするものも本発
明の範囲に属する。
記の特徴により定義されるものに限定されない。すなわ
ち、ウィルスは自然に変異しやすいこと等を考慮して、
そのＤＮＡの相補性の程度に基いて他のウィルスと区別
される。すなわち、高ハイブリダイゼーション条件下で
ハイブリダイゼーション効率が５０％以下のものを別タ
イプのウィルスとして定義される。従って、前記のごと
く特徴付けられる遺伝子と高ストリンジェット条件下で
ハイブリダイズするＤＮＡは本発明の遺伝子の範囲に含
まれる。従って本発明は、前に定義したウィルス遺伝子
のほかに、自然に変異したウィルス遺伝子であって高ス
トリンジェット条件下で前に定義した遺伝子とハイブリ
ダイズするもの、及び人為的に変異せしめ又は化学合成
されたＤＮＡ断片であって、高ストリンジェット条件下
で前に定義した遺伝子とハイブリダイズするものも本発
明の範囲に属する。
次に、本発明のヒトパピローマウィルスの遺伝子のクロ
ーニング方法を実施例により具体的に説明する。
ーニング方法を実施例により具体的に説明する。
１、 ウィルスＤＮＡの び
子宮頚ガンを有する４人の患者（Ｔ、Ｈ，、Ｍ、に、
。
。
Ｆ、Ｈ，、及びＳ、Ｎ、）からガン組織を採取し、その
ガン組織よりＤＮＡを抽出した。ガン組織より小指大の
切片を切取り、それをＰＢＳ （リン酸緩衝液）にひた
しながらカミソリの刃にて０．５ ｍ大垣下に細切した
。洗浄のためＰＢＳを加え、そして１１０００ｒｐにて
１０分間の遠心分離を二度おこなった。
ガン組織よりＤＮＡを抽出した。ガン組織より小指大の
切片を切取り、それをＰＢＳ （リン酸緩衝液）にひた
しながらカミソリの刃にて０．５ ｍ大垣下に細切した
。洗浄のためＰＢＳを加え、そして１１０００ｒｐにて
１０分間の遠心分離を二度おこなった。
１ｇあたり５〜１０ｍ１の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣ
ｌ （ｐＨ７．８） 、１５０ｍＭ ＮａＣ１、２
ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．５％ ＳＤＳ 。
ｌ （ｐＨ７．８） 、１５０ｍＭ ＮａＣ１、２
ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．５％ ＳＤＳ 。
４００ｎ／ｍｌプロナーゼ（ベーリンガー・マンハイム
社製）にて３７℃で一晩振とうした。フェノール抽出１
回、フェノール／クロロホルム抽出３回、及びクロロホ
ルム抽出２回を行った後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ −ＨＣｌ （ｐｔ１７．５） ／ １ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）にて２４時間透析した。以上の操作により１００
ｔｚｇ−２■のＤＮＡが得られた。
社製）にて３７℃で一晩振とうした。フェノール抽出１
回、フェノール／クロロホルム抽出３回、及びクロロホ
ルム抽出２回を行った後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ −ＨＣｌ （ｐｔ１７．５） ／ １ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）にて２４時間透析した。以上の操作により１００
ｔｚｇ−２■のＤＮＡが得られた。
これらのＤＮＡのそれぞれ（Ｔ、Ｈ，、Ｍ、に、 、
Ｆ、Ｈ，、及びＳ、Ｎ、） １０Ｉｇに対して１００
ユニツトの制限酵素ＥｃｏＲＩ又は旧ｎｄｌ［ｌを加え
て総容量４００ｐｌにて一晩消化した。さらに１■／−
のＲＮａｓｅＡ （ベーリンガー・マンハイム社製）８
Ｉと前記制限酵素５０ユニツトを加え、数時間後にエタ
ノール沈澱した。
Ｆ、Ｈ，、及びＳ、Ｎ、） １０Ｉｇに対して１００
ユニツトの制限酵素ＥｃｏＲＩ又は旧ｎｄｌ［ｌを加え
て総容量４００ｐｌにて一晩消化した。さらに１■／−
のＲＮａｓｅＡ （ベーリンガー・マンハイム社製）８
Ｉと前記制限酵素５０ユニツトを加え、数時間後にエタ
ノール沈澱した。
この沈澱を１４ｍのＴＥに溶解し、４１１１の泳動緩衝
液を加えてアガロースゲルで泳動をおこなった。
液を加えてアガロースゲルで泳動をおこなった。
アガロースゲルはシーケム・アガロース（宝酒造社製）
を０．６％にして使用した。電気泳動を終ったゲルを０
．２５Ｍ １１ｃＩ溶液（１）中で１０〜１２分間ゆっ
くり振とうした後、０．２ Ｍ ＮａＯＨ／ ０．６
Ｍ ＮａＣ１溶液（２）により１〜２回すすいだ。次
にゲルを前記溶液（２）中で３０分間ゆっくり振とうし
、そして０、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，４
） ／ ０．６Ｍ ＮａＣ１緩衝液（３）で１〜２回す
すいだ。最後にゲルを前記緩衝液（３）中に３０分間ず
つ２回、緩衝液を取りかえながら浸した。
を０．６％にして使用した。電気泳動を終ったゲルを０
．２５Ｍ １１ｃＩ溶液（１）中で１０〜１２分間ゆっ
くり振とうした後、０．２ Ｍ ＮａＯＨ／ ０．６
Ｍ ＮａＣ１溶液（２）により１〜２回すすいだ。次
にゲルを前記溶液（２）中で３０分間ゆっくり振とうし
、そして０、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，４
） ／ ０．６Ｍ ＮａＣ１緩衝液（３）で１〜２回す
すいだ。最後にゲルを前記緩衝液（３）中に３０分間ず
つ２回、緩衝液を取りかえながら浸した。
次に、ニトロセルロースフィルターに一晩ブロソティン
グし、８０℃にて２時間加熱することによりＤＮＡをフ
ィルターに固定した。
グし、８０℃にて２時間加熱することによりＤＮＡをフ
ィルターに固定した。
次に、前記ＤＮＡを、二ツクトランスレーションにより
標識したヒトパピローマウィルス１ｌＰＶ１６のＤＮＡ
（プローブ）とハイブリダイズせしめた（Ｒｉｇｈｂ
ｙ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 １１３．２３７ （１
９７７）を参照のこと〕。ハイブリダイゼーションは高
ストリンジェット（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下及び低
ストリンジェット条件下で行った。なお、対照としてヒ
ト成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者のリンパ球より抽出
したＤＮＡも同様に処理した。
標識したヒトパピローマウィルス１ｌＰＶ１６のＤＮＡ
（プローブ）とハイブリダイズせしめた（Ｒｉｇｈｂ
ｙ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 １１３．２３７ （１
９７７）を参照のこと〕。ハイブリダイゼーションは高
ストリンジェット（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下及び低
ストリンジェット条件下で行った。なお、対照としてヒ
ト成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者のリンパ球より抽出
したＤＮＡも同様に処理した。
高ストリンジェット条件下で（Ｔｍ −１０℃）のハイ
ブリダイゼーションは４２℃にて、５０％ホルムアミド
、５ｘデンハルト溶液、５ｘＳＳＣバツフアー １０％
デキストランサルフエイト、５０ｍＭＴｒｉｓ ・ＩＩ
ｃＩ （ｐＨ７，４）、０．１％ＳＯ５，及び１００
ｇ／−仔牛胸腺ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡの溶液中で
反応させた。その後６８℃にて０．２ｘＳＳＣバツフア
ー及び０．１％ＳＯＳで洗浄した。洗い終わったフィル
ターは増感スクリーンとともに一８０℃にてＸｖＡフィ
ルム（Ｘ−Ｏｍａｔ ＡＲ，Ｋｏｄａｋ）を露出させて
オートラジオグラフィーを行った。
ブリダイゼーションは４２℃にて、５０％ホルムアミド
、５ｘデンハルト溶液、５ｘＳＳＣバツフアー １０％
デキストランサルフエイト、５０ｍＭＴｒｉｓ ・ＩＩ
ｃＩ （ｐＨ７，４）、０．１％ＳＯ５，及び１００
ｇ／−仔牛胸腺ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡの溶液中で
反応させた。その後６８℃にて０．２ｘＳＳＣバツフア
ー及び０．１％ＳＯＳで洗浄した。洗い終わったフィル
ターは増感スクリーンとともに一８０℃にてＸｖＡフィ
ルム（Ｘ−Ｏｍａｔ ＡＲ，Ｋｏｄａｋ）を露出させて
オートラジオグラフィーを行った。
結果を第１図に示す。この図中、レーン２．４゜６．８
及び１０は制限酵素ＥｃｏＲ［で消化したものであり、
そしてレーン３．５，７．９及び１１は制限酵素旧ｎｄ
ｕｌにより消化したものである。レーン１はプローブと
して用いたＨＰＶ１６のＤＮＡについての結果である。
及び１０は制限酵素ＥｃｏＲ［で消化したものであり、
そしてレーン３．５，７．９及び１１は制限酵素旧ｎｄ
ｕｌにより消化したものである。レーン１はプローブと
して用いたＨＰＶ１６のＤＮＡについての結果である。
なお、λフアージＤＮＡを制限酵素旧ｎｄｌｌｌで消化
することにより生成した断片（分子量標準）の位置を左
側に示す。この結果、患者Ｓ、Ｎ、から（７）ＤＮＡサ
ンプルが）ＩＰＶ１６のＤＮＡを含有することが明らか
となった。
することにより生成した断片（分子量標準）の位置を左
側に示す。この結果、患者Ｓ、Ｎ、から（７）ＤＮＡサ
ンプルが）ＩＰＶ１６のＤＮＡを含有することが明らか
となった。
次に、前記のフィルターを０．０１ｘＳＳＣ、１０％Ｓ
Ｏ３で９５℃にて３０分間、放射性のＤＮＡを除くため
に洗浄した。次に、前記と同じプローブを用いて低スト
リンジェット条件下（Ｔｍ ３７℃）でハイブリダイ
ゼーションを行うため、前記フィルターを、４１℃にて
、１．ＯＭ ＮａＣ１、２８％ホルムアミド、５０Ｉ
ＩＭ ＴＥＳ ［Ｎ −）リス（ヒドロキシメチル）−
メチル−２−アミノエタンスルホン酸コ、１０ｘデンハ
ルト溶液、０．５ ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ２０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）、 １００ｇ／ｍ１ｔＲ
ＮＡ及び１００ｎ／−サケ精子ＤＮＡの溶液中でインキ
エベートした。その後５２℃にて１．１ ｘ ＳＳＣバ
ッファー０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、 １０ｍＭ リン酸
ナトリウム及び０．１％ＳＤＳで洗浄した。次に、前記
と同様にしてオートラジオグラフィーを行った。この結
果を第２図に示す。この結果、前記のＳ、Ｎ、からのＤ
ＮＡに加えて、Ｍ、に、及びＴ、Ｈ，からのＤＮＡサン
プルも）ＩＰＶ１６のＤＮＡとハイブリダイズした。こ
のことからＭＪ、及びＴ、Ｈ，から（７）ＤＮＡサンプ
ルニは、ＨＰＶ１６のＤＮＡとは同一ではないが、それ
にある程度相同性を有するウィルス遺伝子が含有される
ことが推定された。
Ｏ３で９５℃にて３０分間、放射性のＤＮＡを除くため
に洗浄した。次に、前記と同じプローブを用いて低スト
リンジェット条件下（Ｔｍ ３７℃）でハイブリダイ
ゼーションを行うため、前記フィルターを、４１℃にて
、１．ＯＭ ＮａＣ１、２８％ホルムアミド、５０Ｉ
ＩＭ ＴＥＳ ［Ｎ −）リス（ヒドロキシメチル）−
メチル−２−アミノエタンスルホン酸コ、１０ｘデンハ
ルト溶液、０．５ ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ２０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）、 １００ｇ／ｍ１ｔＲ
ＮＡ及び１００ｎ／−サケ精子ＤＮＡの溶液中でインキ
エベートした。その後５２℃にて１．１ ｘ ＳＳＣバ
ッファー０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、 １０ｍＭ リン酸
ナトリウム及び０．１％ＳＤＳで洗浄した。次に、前記
と同様にしてオートラジオグラフィーを行った。この結
果を第２図に示す。この結果、前記のＳ、Ｎ、からのＤ
ＮＡに加えて、Ｍ、に、及びＴ、Ｈ，からのＤＮＡサン
プルも）ＩＰＶ１６のＤＮＡとハイブリダイズした。こ
のことからＭＪ、及びＴ、Ｈ，から（７）ＤＮＡサンプ
ルニは、ＨＰＶ１６のＤＮＡとは同一ではないが、それ
にある程度相同性を有するウィルス遺伝子が含有される
ことが推定された。
次に、陽性標本Ｍ、に、及びＴ、Ｈ，からのＤＮＡそれ
ぞれ１０河を種々の制限酵素で消化した後、電気泳動に
より分離し、前記のＩＩＩ”Ｖ１６のＤＮＡをプローブ
として用いて、低ストリンジェット（Ｔｍ −３７℃）
サザンブロッティングを行った。その結果を第３図に示
す。この図中、レーン２及び１０は制限酵素ＢａｍＨＩ
により；レーン３はＥｃｏＲＴにより；レーン４及び１
１は旧ｎｄＩ［Ｉにより；レーン５はＰｓｔＩにより；
レーン６はＳａｃ Ｉにより；レーン７及び１２はＸｂ
ａ Ｉにより；レーン８はＥｃｏＲＩ ＋ＢａｍＨＩに
より；そしてレーン９はＥｃｏＲＩ ＋ＨｉｎｄＩ［Ｉ
により消化した結果を示す。Ｍ、に、からのＤＮＡ及び
Ｔ、）１．からのＤＮＡがＢａｍＨＩ 、 ＨｉｎｄＩ
［［、及びＸｂａｌにより消化された場合に同一のパタ
ーンを示すことから、これらのＤＮＡは同一のウィルス
ＤＮＡを含有することが推定された。
ぞれ１０河を種々の制限酵素で消化した後、電気泳動に
より分離し、前記のＩＩＩ”Ｖ１６のＤＮＡをプローブ
として用いて、低ストリンジェット（Ｔｍ −３７℃）
サザンブロッティングを行った。その結果を第３図に示
す。この図中、レーン２及び１０は制限酵素ＢａｍＨＩ
により；レーン３はＥｃｏＲＴにより；レーン４及び１
１は旧ｎｄＩ［Ｉにより；レーン５はＰｓｔＩにより；
レーン６はＳａｃ Ｉにより；レーン７及び１２はＸｂ
ａ Ｉにより；レーン８はＥｃｏＲＩ ＋ＢａｍＨＩに
より；そしてレーン９はＥｃｏＲＩ ＋ＨｉｎｄＩ［Ｉ
により消化した結果を示す。Ｍ、に、からのＤＮＡ及び
Ｔ、）１．からのＤＮＡがＢａｍＨＩ 、 ＨｉｎｄＩ
［［、及びＸｂａｌにより消化された場合に同一のパタ
ーンを示すことから、これらのＤＮＡは同一のウィルス
ＤＮＡを含有することが推定された。
２、 ウィルスＤＮＡの ローニング
前記陽性標本Ｍ、に、からの６０ｘのＤＮＡを制限酵素
Ｘｂａ １にて消化したのち、０．６％のアガロースゲ
ルにて電気泳動した。７．９Ｋｂの直鎖状ＤＮＡの位置
に相当するアガロースゲルの部分を切り出して、ｇｅｎ
ｅ ｃｌｅａｎキット（Ｂｉｏ １０１社製）を用いて
ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを、制限酵素Ｘｂａ
Ｉにて消化したＣｈａｒｏｍｉｄ ９−３６ ＤＮＡ
（Ｓａｉｔ。
Ｘｂａ １にて消化したのち、０．６％のアガロースゲ
ルにて電気泳動した。７．９Ｋｂの直鎖状ＤＮＡの位置
に相当するアガロースゲルの部分を切り出して、ｇｅｎ
ｅ ｃｌｅａｎキット（Ｂｉｏ １０１社製）を用いて
ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを、制限酵素Ｘｂａ
Ｉにて消化したＣｈａｒｏｍｉｄ ９−３６ ＤＮＡ
（Ｓａｉｔ。
らＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８
３．８６６４（１９８６））と８時間連結反応を行った
。連結したＤＮＡをインビトロ・パッケージング・キッ
ト（アマジャム社製）を用いてラムダファージにパッケ
ージングして大腸菌ＤＨＩ株に形ｉｔ導入した。感染し
た大腸菌を、５０ｎ／ｍ１のアンピシリンを含む寒天培
地の上でニトロセルロース膜上に培殖させた。４×１０
ｈコロニーが得られた。Ｈａｎａｈａｎ らの方法（Ｇ
ｅｎｅｌＯ，６３（１９８０））に従ってコロニーハイ
ブリダイゼーションを行い、低ストリンジェット条件下
において肝Ｖ１６のＤＮＡとハイブリダイズするコロニ
ーが２３コロニー得ラレタ。拾った６コロニーすべてが
、いくつかの制限酵素を用いた解析において同じ結果を
示した。それらのクローンのうちのひとつから７．ｌｂ
の挿入断片を制限酵素Ｘｂａｌによって切り出してｐＨ
ｃ１９のＸｂａ Ｉ認識部位にリクローニングした。
３．８６６４（１９８６））と８時間連結反応を行った
。連結したＤＮＡをインビトロ・パッケージング・キッ
ト（アマジャム社製）を用いてラムダファージにパッケ
ージングして大腸菌ＤＨＩ株に形ｉｔ導入した。感染し
た大腸菌を、５０ｎ／ｍ１のアンピシリンを含む寒天培
地の上でニトロセルロース膜上に培殖させた。４×１０
ｈコロニーが得られた。Ｈａｎａｈａｎ らの方法（Ｇ
ｅｎｅｌＯ，６３（１９８０））に従ってコロニーハイ
ブリダイゼーションを行い、低ストリンジェット条件下
において肝Ｖ１６のＤＮＡとハイブリダイズするコロニ
ーが２３コロニー得ラレタ。拾った６コロニーすべてが
、いくつかの制限酵素を用いた解析において同じ結果を
示した。それらのクローンのうちのひとつから７．ｌｂ
の挿入断片を制限酵素Ｘｂａｌによって切り出してｐＨ
ｃ１９のＸｂａ Ｉ認識部位にリクローニングした。
なおこの挿入断片を含有するプラスミドを含む大腸菌Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＪＩＢ １０Ｈｐ１９
）ＩＰＶ５２ｂ’）は工業技術院微生物工学技術研究
所に微工研菌寄第１ｏ）ｇ１号（ＦＥＲ１’Ｉ Ｐ−／
υｇ７＞とじて寄託されている。
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＪＩＢ １０Ｈｐ１９
）ＩＰＶ５２ｂ’）は工業技術院微生物工学技術研究
所に微工研菌寄第１ｏ）ｇ１号（ＦＥＲ１’Ｉ Ｐ−／
υｇ７＞とじて寄託されている。
３の
ｐＵｃ１９にクローニングしたＸｂａｌ ７．９ Ｋｂ
断片を、制限酵素ＢａｍＨＩ 、Ｂｇｌ ＩＴ 、Ｅ
ｃｏＲＩ 、ＥｃｏＲＶ 、Ｋｐｎ Ｉ 。
断片を、制限酵素ＢａｍＨＩ 、Ｂｇｌ ＩＴ 、Ｅ
ｃｏＲＩ 、ＥｃｏＲＶ 、Ｋｐｎ Ｉ 。
Ｐｓｔ Ｉ 、Ｐｖｕ ＩＩ 、Ｓａｌ Ｉ及びＳｍ
ａ Ｉを単独で、又は２種類組み合わせで用いて消化
し、得られた断片長を組み合わせて制限酵素地図を作成
した。なお制限酵素旧ｎｄｌｌ［、Ｓａｃ Ｉ 、
Ｓｐｈ Ｉ及びＸｈｏ Ｉの各酵素についてはその
認識部位は７．９にｂのＸｂａ １断片内には存在し
なかった。以下にそれぞれの制限酵素の反応条件を示す
。反応はｌｎのＤＮＡに対して制限酵素５ユニツトを反
応液に加えて３７℃で２時間インキュベートすることに
より行った。
ａ Ｉを単独で、又は２種類組み合わせで用いて消化
し、得られた断片長を組み合わせて制限酵素地図を作成
した。なお制限酵素旧ｎｄｌｌ［、Ｓａｃ Ｉ 、
Ｓｐｈ Ｉ及びＸｈｏ Ｉの各酵素についてはその
認識部位は７．９にｂのＸｂａ １断片内には存在し
なかった。以下にそれぞれの制限酵素の反応条件を示す
。反応はｌｎのＤＮＡに対して制限酵素５ユニツトを反
応液に加えて３７℃で２時間インキュベートすることに
より行った。
ＢａｍＨＩ １０＋ｗＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８
，０）、７ｍＭ ＭｇＣ１ｇ、１００ｍＭＮａＣ１，２
ｍＭ ２−メルカプトエタノールＢｇｌ ＩＩ
、 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ（ｐｔ１７．５）、
７ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１００ｍＭＮａＣ１，７ｍＭ
２−メルカプトエタノールＥｃｏＲＩ １００
ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、７ｍＭ
ＭｇＣｈ。
，０）、７ｍＭ ＭｇＣ１ｇ、１００ｍＭＮａＣ１，２
ｍＭ ２−メルカプトエタノールＢｇｌ ＩＩ
、 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ（ｐｔ１７．５）、
７ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１００ｍＭＮａＣ１，７ｍＭ
２−メルカプトエタノールＥｃｏＲＩ １００
ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、７ｍＭ
ＭｇＣｈ。
５０ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノールＥｃｏＲＶ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，５）、７ｍＭ ＭｇＣＩｚ、１５０ｍＭＮ
ａＣ１，７ｍＭ ２−メルカプトエタノールＨｉｎｄ
ｌｌｒ １０＋＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＦＩＣＩ（ｐＨ７，
５）、７ｍＭ Ｍｇｃ＋、、６ｏ ｍＭａＣＩ Ｋｐｎ Ｉ ６ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣ１，。
ノールＥｃｏＲＶ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，５）、７ｍＭ ＭｇＣＩｚ、１５０ｍＭＮ
ａＣ１，７ｍＭ ２−メルカプトエタノールＨｉｎｄ
ｌｌｒ １０＋＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＦＩＣＩ（ｐＨ７，
５）、７ｍＭ Ｍｇｃ＋、、６ｏ ｍＭａＣＩ Ｋｐｎ Ｉ ６ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣ１，。
５ｍＭ２−メルカプトエタノール
Ｐｓｔ Ｉ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐｆ＋７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣＩｚ、１００ａ
＋Ｍ ＮａＣＩ Ｐｖｕ ＩＩ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ７，５）、７ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、６０ ｍＭＮ
ａＣ！、７ｍＭ ２−メルカプトエタノールＳａｃ
Ｉ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０
）、７ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、７ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール Ｓａｔ Ｉ １０ｍＭ ↑ｒｉｓ−）Ｉｃ
Ｉ （ｐＨ７，５）、？ｆｆ１Ｍ ＭｇＣｈ＋ １７
５ｍＭＮａＣ１，７１１ＩＭ ２−メルカプトエタノ
ール、０．２ｎ＋Ｍ ＥＤＴＡＳｍａ Ｉ
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、７ｍ
Ｍ ＭｇＣ１ｚ、２０ ｍＭＭＣｌ、７ｍＭ ２
−メルカブトエタノールＳｐｈ Ｉ １０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ）１８．０）、７ｍＭ ＭｇＣ１
ｚ、１５０ｍＭＮａＣ１，７ｍＭ ２−メルカプトエ
タノールＸｂａ Ｉ １０ｏ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ（ｐＨ７，５）、７ｎ＋Ｍ ＭｇＣ１ｚ、１００ｍ
ＭＮａＣｌ、７ｍＭ ２−メルカブトエタ／−ＩＣＸ
ｈｏ Ｉ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７
，５）、７ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１００ｍＭＮａＣ１，７
ｍＭ ２−メルカプトエタノール得られた結果を第４
図に示す。制限酵素認識部位間の距離はキロベースで示
されている。本発明のＨＰＶの制限酵素地図は既知のＨ
Ｐ Ｖ （ＨＰＶ６゜＋１ＰＶ１１．ＨＰＶ１６，１Ｉ
ＰＶ１８．ＨＰＶ３１．及びＨＰＶ３５）のものとは異
ることが確かめられた（ＢｏｓｈａｒｔらＥＭＢＯＪ、
３ 。
（ｐｆ＋７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣＩｚ、１００ａ
＋Ｍ ＮａＣＩ Ｐｖｕ ＩＩ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ７，５）、７ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、６０ ｍＭＮ
ａＣ！、７ｍＭ ２−メルカプトエタノールＳａｃ
Ｉ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０
）、７ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、７ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール Ｓａｔ Ｉ １０ｍＭ ↑ｒｉｓ−）Ｉｃ
Ｉ （ｐＨ７，５）、？ｆｆ１Ｍ ＭｇＣｈ＋ １７
５ｍＭＮａＣ１，７１１ＩＭ ２−メルカプトエタノ
ール、０．２ｎ＋Ｍ ＥＤＴＡＳｍａ Ｉ
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、７ｍ
Ｍ ＭｇＣ１ｚ、２０ ｍＭＭＣｌ、７ｍＭ ２
−メルカブトエタノールＳｐｈ Ｉ １０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ）１８．０）、７ｍＭ ＭｇＣ１
ｚ、１５０ｍＭＮａＣ１，７ｍＭ ２−メルカプトエ
タノールＸｂａ Ｉ １０ｏ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ（ｐＨ７，５）、７ｎ＋Ｍ ＭｇＣ１ｚ、１００ｍ
ＭＮａＣｌ、７ｍＭ ２−メルカブトエタ／−ＩＣＸ
ｈｏ Ｉ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７
，５）、７ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１００ｍＭＮａＣ１，７
ｍＭ ２−メルカプトエタノール得られた結果を第４
図に示す。制限酵素認識部位間の距離はキロベースで示
されている。本発明のＨＰＶの制限酵素地図は既知のＨ
Ｐ Ｖ （ＨＰＶ６゜＋１ＰＶ１１．ＨＰＶ１６，１Ｉ
ＰＶ１８．ＨＰＶ３１．及びＨＰＶ３５）のものとは異
ることが確かめられた（ＢｏｓｈａｒｔらＥＭＢＯＪ、
３ 。
１１５１ （１９８４）； ＬｏｒｉｎｃｚらＪ、Ｖｉ
ｒｏｌ、 ５８．２５５（１９８６）；Ｂｅａｕｄｅｎ
ｏｎらＮａｔｕｒｅ ３２１．２４６ （１９８６）ｓ
ＬｏｒｉｎｃｚらＩｎν１ｒａｌ ＥＬｉｏｌｇｙ
ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ＋ Ｂｕｎｂｕ
ｒｙＲｅｐｏｒｔ ２Ｌ ２２５＋ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
： Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ （１９８６）； ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓら
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。
ｒｏｌ、 ５８．２５５（１９８６）；Ｂｅａｕｄｅｎ
ｏｎらＮａｔｕｒｅ ３２１．２４６ （１９８６）ｓ
ＬｏｒｉｎｃｚらＩｎν１ｒａｌ ＥＬｉｏｌｇｙ
ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ＋ Ｂｕｎｂｕ
ｒｙＲｅｐｏｒｔ ２Ｌ ２２５＋ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
： Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ （１９８６）； ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓら
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。
並、 ９３２（１９８１）； ＧｉｓｓｍａｎらＪ、Ｖ
ｉｒｏｌ、 ４４．３９３（１９８２） ；及びＤｕ
ｒｓｔらＪ、ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、 ６６、１５１５（
１９８５）） 、 こうして得られた新規なヒトパピ
ローマウィルスはＨＰＶ５２ｂと命名された。
ｉｒｏｌ、 ４４．３９３（１９８２） ；及びＤｕ
ｒｓｔらＪ、ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、 ６６、１５１５（
１９８５）） 、 こうして得られた新規なヒトパピ
ローマウィルスはＨＰＶ５２ｂと命名された。
ＨＰＶ５２ｂの゛ の 配 の
ベクターｐＵｃ１９のＸｂａ Ｉ切断部位にクローニン
グされた、ＨＰＶ５２ｂ遺伝子を含む？、９ＫｂのＸｂ
ａ １断片を上記の各制限酵素で消化したのち、ｐｔｌ
ｃ１１８に組み込んで、Ｓａｎｇｅｒらによって開発さ
れたジデオキシ法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ？Ｃ５４６３（１９７７） ）を用いて決
定した。
グされた、ＨＰＶ５２ｂ遺伝子を含む？、９ＫｂのＸｂ
ａ １断片を上記の各制限酵素で消化したのち、ｐｔｌ
ｃ１１８に組み込んで、Ｓａｎｇｅｒらによって開発さ
れたジデオキシ法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ？Ｃ５４６３（１９７７） ）を用いて決
定した。
この結果を第５−１図〜第５−５図に示す。第５−１図
〜第５−２図は、第４図に示す制限地図中、２． Ｉ
ＫｂｐのＸｂａ Ｉ −ＢａｍＨＩ断片の塩基配列を示
し、第５−３〜第５−５図は第４図に示す制限地図中、
左側のＫｐｎ＋ Ｉ部位から右側のＰｖｏ Ｉｔ部位ま
での３．２にｂｐの塩基配列を示す。
〜第５−２図は、第４図に示す制限地図中、２． Ｉ
ＫｂｐのＸｂａ Ｉ −ＢａｍＨＩ断片の塩基配列を示
し、第５−３〜第５−５図は第４図に示す制限地図中、
左側のＫｐｎ＋ Ｉ部位から右側のＰｖｏ Ｉｔ部位ま
での３．２にｂｐの塩基配列を示す。
本発明によって今まで子宮頚ガンにおいて同定すること
ができなかったＨ Ｐ Ｖ （ＨＰＶ５２ｂ）が確実に
同定できるようになる。このことは、これまでの１１Ｐ
Ｖ ＤＮＡが存在しているかどうかだけの診断から、子
宮頚ガンへと移行する可能性のあるタイプのＨＰＶを区
別する診断への貴重な材料を提供することになるであろ
う。
ができなかったＨ Ｐ Ｖ （ＨＰＶ５２ｂ）が確実に
同定できるようになる。このことは、これまでの１１Ｐ
Ｖ ＤＮＡが存在しているかどうかだけの診断から、子
宮頚ガンへと移行する可能性のあるタイプのＨＰＶを区
別する診断への貴重な材料を提供することになるであろ
う。
第１図は、子宮頚ガン患者のガン組織から抽出されたＤ
ＮＡをＥｃｏＲＩ又は旧ｎｄＩ［［で消化することによ
り得られるＤＮＡｌｉｌｒ片を、ヒトパピローマウィル
ス１ＩＰＶ１６のＤＮＡをプローブとして、高ストリン
ジェット条件下で検出した場合の５ｏｕｔｈｅｒｎプロ
ツテイング図である。 第２図は、低ストリンジェット条件下で得られた、第１
図に対応するＳｏｕ ｔｈｅｒｎブロッティング図であ
る。 第３図は、第１図に示す５ｏｕｔｈｅＦｎプロツテイン
グにおいて陰性であり且つ第２図に示す５ｏｕｔｈｅｒ
ｎプロツテイングにおいて陽性であるＭ、に、由来のＤ
ＮＡ及びＴ、）１．由来のＤＮＡを種々の制限酵素で消
化した場合のＳｏｕ ｔｈｅｒｎプロッティング図であ
る。 第４図は、本発明のヒトパピローマウィルスＨＰＶ５２
ｂの遺伝子ＤＮＡの制限地図である。 第５−１図〜第５−５図は、本発明のヒトパピローマウ
ィルスＨＰＶ５２ｂの遺伝子ＤＮＡの部分塩基配列を示
す。
ＮＡをＥｃｏＲＩ又は旧ｎｄＩ［［で消化することによ
り得られるＤＮＡｌｉｌｒ片を、ヒトパピローマウィル
ス１ＩＰＶ１６のＤＮＡをプローブとして、高ストリン
ジェット条件下で検出した場合の５ｏｕｔｈｅｒｎプロ
ツテイング図である。 第２図は、低ストリンジェット条件下で得られた、第１
図に対応するＳｏｕ ｔｈｅｒｎブロッティング図であ
る。 第３図は、第１図に示す５ｏｕｔｈｅＦｎプロツテイン
グにおいて陰性であり且つ第２図に示す５ｏｕｔｈｅｒ
ｎプロツテイングにおいて陽性であるＭ、に、由来のＤ
ＮＡ及びＴ、）１．由来のＤＮＡを種々の制限酵素で消
化した場合のＳｏｕ ｔｈｅｒｎプロッティング図であ
る。 第４図は、本発明のヒトパピローマウィルスＨＰＶ５２
ｂの遺伝子ＤＮＡの制限地図である。 第５−１図〜第５−５図は、本発明のヒトパピローマウ
ィルスＨＰＶ５２ｂの遺伝子ＤＮＡの部分塩基配列を示
す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒトパピローマウイルスの遺伝子であって、１個の
Ｘｈａ I 切断部位、２個のＢａｍＨ I 切断部位、３個
のＢｇｌII切断部位、２個のＥｃｏＲ I 切断部位、１
個のＥｃｏＲＶ切断部位、２個のＫｐｎ I 切断部位、
６個のＰｓｔ I 切断部位、２個のＰｖｕII切断部位、
１個のＳａｌ I 切断部位、及び１個のＳｍａ I 切断部
位を含有し、約８Ｋｂｐの長さを有する環状遺伝子及び
１ヶ所又は複数ヶ所で切断されて生ずる遺伝子断片。 ２、前記各種制限酵素の切断部位が第４図の制限酵素地
図により表わされる、請求項１に記載の遺伝子及びその
断片。 ３、塩基配列の部分が第５図にり示されるものである請
求項１又は２に記載の遺伝子及びその断片。 ４、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子と、高
ストリンジェット条件下でハイブリダイズすることがで
きるＤＮＡ。 ５、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子を含有
するベクター。 ６、請求項４に記載のＤＮＡ断片を含有するベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23150088A JPH0279980A (ja) | 1988-09-17 | 1988-09-17 | ヒトパピローマウイルス５２ｂ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23150088A JPH0279980A (ja) | 1988-09-17 | 1988-09-17 | ヒトパピローマウイルス５２ｂ遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0279980A true JPH0279980A (ja) | 1990-03-20 |
Family
ID=16924467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23150088A Pending JPH0279980A (ja) | 1988-09-17 | 1988-09-17 | ヒトパピローマウイルス５２ｂ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0279980A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001059124A1 (en) * | 2000-02-09 | 2001-08-16 | Sapporo Immuno Diagnostic Laboratory | Microplate fluorescent screening method for detecting gene anomaly allowing convenient and less expensive treatment of specimens on mass scale |
-
1988
- 1988-09-17 JP JP23150088A patent/JPH0279980A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001059124A1 (en) * | 2000-02-09 | 2001-08-16 | Sapporo Immuno Diagnostic Laboratory | Microplate fluorescent screening method for detecting gene anomaly allowing convenient and less expensive treatment of specimens on mass scale |
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