JPH0283336A - 乳房炎およびその他のブドウ球菌感染症の治療法並びに同治療用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本出願はブドウ球菌感染の治療および予防へのリゾスタ
フインの使用、特に、ブドウ球菌によるウシ乳房炎の治
療および予防に関する。

リゾスタフィンは、元来５ｃｈｉｎｄｌｅｒおよび５ｃ
ｈｕｈａｒｔにより分離され、スタフィロコッカス・ス
タフィロコッカス（５ｔａｐｈｙｌＯＣＯＣＣｕＳｓｔ
ａｐｈｙ＋ｏ＋ｙｔｔｃｕｓ　”）と命名されたー既知
株スタフイロ１ツカス・シミ１ランス（５ｔａｐｈｙ＋
ｏｃｏｃｃｕｓｓｉｉｕｌａｎｓ）により分泌されるバ
クテリオシンである。リゾスタフィンの３．５ｔａｐｈ
ｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓによる製造は１９６６年１０月１
１日に発行の米国特許Ｎｏ、３．２７８．３７８および
Ｐｒ０Ｃｅｅｄｉｎｌ；１３　ｏｆｔｈｅ　Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ　Ａｃａｄｅ＋＋＋ｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ
、　５１巻、４１４−４２１頁（１９６４年）に記載さ
れている。

リゾスタフィンを生産した一菌株Ｓ、　５ｔａｐｈｙｌ
ｏ−ｙｔｉｃｕｓ　　（Ｎ　ＲＲＬ　　Ｂ　−２６２８
）は最近５ｌｏａｎら、Ｊ、　５ｙｓｔｅｉ、　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、３２巻、１７０−１７４頁（１９８２年
）によりｓ、ｓ＊ｍｕｔａｎｓノ生物変異株と同定され
た。Ｓ、　５ｔａｐｈｙｌｏｌｙｔ＋ｃｕｓはＡｐｐｒ
ｏｖｅｄ　Ｌｉ５ｔ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｎａ
ｍｅｓ　（細菌名の承認リスト）にないので、リゾスタ
フィン生産菌もＳ、ｓｉｍｕｌａｎｓと再命名された。

バクテリアシンはバクテリアが分泌し、近縁バクテリア
を殺したり溶菌したりするたん白質である。例えば、リ
ゾスタフィンは実質的に全ての既知ブドウ球菌種を溶菌
し殺すが、他の属のバクテリアに対しては活性がない。

Ｓ、ｓｉｍｕｌａｎｓ（ＮＲＲＬ　　Ｂ−２６２８）を
報告文献に従って増殖させた培？！濾液から単離される
リゾスタフィンはブドウ球菌の＠直壁に存在するペプチ
ドクリカンのポリグリシン架橋結合を切断するエンドペ
プチダーゼである。さらに、リゾスタフィンを生産する
培養菌はその活性に耐性であるが、リゾスタフィン非生
産条件下で増殖させた培養菌は感受性である。

リゾスタフィンはＳ、ｓｉｍｕｌａｎｓを液体培養で増
殖させる発酵法により生産できることがわかっている。

そのような発酵法は１９６６年１０月１１日発行の米国
特許Ｎｏ、３．２７８．３７８およびＰｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅ
ｌｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ　、５１巻、４１４−４２
１頁（１９６４年）に記載されている。発酵法によるリ
ゾスタフィンの生産の種々の改良は１９６８年８月２０
日発行の米国特許Ｎｏ、３．３９８．０５６および１９
７１年７月２０日発行のＮ０１３，５９４，２８４に記
されている。後ろの２つの文献では発酵によるリゾスタ
フィンの生産を促進し、改良するための培養培地および
植菌方法の改良が開示されている。リゾスタフィンはＳ
、５ｉｌｌｌＬｌｌａｎＳの対数増殖期に不活性な前駆
体として生産される。プＯ酵素はＳ、　ｓｉｍｕｌａｎ
ｓの休止期の培養菌が生産するプロテアーゼにより活性
な成熟たん白質に変換される。

さらにリゾスタフィンはリゾスタフイン遺伝子を発現す
るＥ、　ｃｏｌｉ、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ＩＪｂｔｉ
ｌｉＳおよびＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ
などの組換え微生物によっても生産される。通常の生産
とは違って、組換えのリゾスタフイン生産菌株での培養
培地ではリゾスタフインは対数増殖期に完全にプロセス
された成熟活性酵素として、ブドウ球菌の免疫原性汚染
物の存在なく蓄積する。

ウシ乳房炎は酪農業にとって非経済的な問題であり、ア
メリカ合衆国のみで年間２０億ドル以上かかる。この疾
患はアメリカ酪農牛の５０パーセントにある程度は影響
していると考えられ、その結果、使用できない牛乳が出
て牛乳の生産量が低下し、感染がひどいとウシの死につ
ながる。

乳房炎は乳腺の感染、主に５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓａｕｒｅｕｓ或いは５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　
ａｇａｌａｃｔｉａｅにより、また頻度は低いがＥ、　
ｃｏｌｉおよびその他のダラム陰性細菌或いはそれらの
合併感染により起る。

ブドウ球菌感染のほとんどは従来の抗生？５質療法によ
り効果的に治療できることがわかっている。

しかしながら、ブドウ球菌による乳房炎は治癒するのが
難しいことがわかっている。

ウシ乳房炎の従来からの予防法は乳頭を消毒液に毎日浸
ける複雑な養生法により（Ｊ、５ＨｃＤｏｎａｌｄ、　
　５　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｃｌ１ｎｉｃｓ　ｏｆ　
ＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｌａｒｇｅ　Ａｎｉｍａ
ｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　　２６９　［１９８４年］参照
）、また時には抗生物質含有の乳頭浸漬による。しかし
、日常の抗生物質療法は抗生物質耐性菌株の出願を最少
限とするように注意して行なわねばならない。感染が起
ったら、抗生物質の乳腺注入を必要とする。このような
抗生物質療法は感染を抑え、生産される牛乳は販売でき
るが、通常、原因微生物を完全に消失させることはない
。

過去にはブドウ球菌による乳房炎は抗生物質治療に対し
ての応答が悪く、感染の再発と慢性化の傾向があった。

乳房炎の研究の結果、乳房炎の治療に於ける問題の一部
はブドウ球菌のかなりの数が乳腺中で食細胞の多形核好
中球（ＰＭＮ）の内部に生存して残ることによることが
明かとなった。

ブドウ球菌はＰＭＮ内では抗生物質の作用から防御され
、好中球の溶解が起ると食細胞内ブドウ球菌が乳房炎を
起すブドウ球菌の再増殖源となると考えられている。

乳房炎治療に於ける食細胞内ブドウ球菌の抗生物質攻撃
の機構研究の結果、リゾスタフィンは食細胞内ブドウ球
菌を殺菌する候補物質からは外されていた。Ｃｒａｖｅ
ｎら、２９　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１ｎＶｅｔｅｒｉｎａ
ｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅ　　５７　（１９８０年）；Ｃｒ
ａｖｅｎら、２１　　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　　
Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｌ）Ｖ　　
６１８頁（１９８２年）　ＨＣｒａｖｅｎら、５　Ｃｏ
ｍａ、　Ｉｍｍｕｎ、　Ｈｉｃｒｏｂｉａｌ、　Ｉｎｆ
ｅｃｔ、　Ｄｏｓ４４７頁（１９８２年）　、ｃｒａｖ
ｅｎら、５１Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　Ｄａｉｒｙ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　　５１３　（１９８４年）。これらの
実験ではリゾスタフインを食ｍ胞内のブドウ球菌をクロ
キサシリン、ゲンタマイシン或いはリゾスタフインで処
理する前に細胞外ブドウ球菌を殺菌するための前処理と
してインビトロで使用している。Ｃｒａｖｅｎらの実験
ははっきりと、リゾスタフィン含有の溶液中で２０時間
インキュベートした後も細胞内ブドウ球菌は生存してい
るため、リゾスタフィンは乳房炎には効果がないことを
示しティる。５１Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＤａｉｒｙＲ
ｅｓｅａｒｃｈ　　５１５−５１６頁および第２表。

リゾスタフィンはヒト単核細胞を透過することも報告さ
れている。単核細胞はＰＭＮとは異なるタイプの細胞で
あるから、このヒトのモデルがウシ乳房炎の治療に応用
できるとは思われない（ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｋら
、２１．５ｃａｎｄ、　Ｊ、　ｌｍ１ｕｎｏｌ、１８９
頁［１９８５年〕）。

リゾスタフィンはまたマウスのブドウ球菌性腎膿瘍の治
療に、特にメチシリン投与と連続して使用すると有効で
あることがわかっている。Ｄｉｘｏｎら、４１　　Ｗａ
ｆｅｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｈｅｄ、　６２　（１９６８年
）。

ヒトではリゾスタフインは慢性の鼻ブドウ球菌感染の治
療薬としても使用されてきた。

（Ｑｕｉｃｋｅｌ、　Ｊｒ、ら、２２　＾ｐｐｌｉｅｄ
　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ４４６頁［１９７１年］）
。耐性ブドウ球菌感染の一例ではリゾスタフインが全身
投与された（　５ｔａｒｋら、２９１　　Ｍｅｄｉｃａ
ｌ　Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ　２３９頁［１９７４年
］）。しかし一般には、リゾスタフィンの全身投与につ
いては臨床医療分野でも動物医療分野でも強い疑問およ
び躊躇がある。リゾスタフィンは局所投与以外に一般的
に使用するには免疫原性が強すぎると考えられている。

発明の要約 今回、リゾスタフィンが驚くべき効力でブドウ球菌乳房
炎を、たとえ慢性型であっても、免疫原性の悪影響なし
に予防し、治癒するのに使用できることを発見した。予
防には、リゾスタフィンを日常の乳頭洗滌液の中に入れ
ればよい。リゾスタフィンは単独でも使用できるが、乳
頭洗滌液はリゾスタフインの他に５ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓにより生産されてブ
ドウ球菌に対して有効なバクテリオシンであるムタノリ
シン：およびグラム陽性菌およびダラム陰性菌の細胞壁
に含まれるペプチドグリカンの多糖類骨格を加水分解す
るムラミン酸溶解酵素であるリゾチームのような溶菌剤
を含有する。製剤はまた、エチレンジアミンテトラ酢酸
（ＥＤＴＡ）のようなキレート斉ト；およびバクテリア
の殺菌を高めることの知られている弱性界面活性剤など
も含有できる。適当な弱性界面活性剤としては特に、ポ
リオキシエチレンソルビタンと脂肪酸のエステル類（Ｔ
ｌ１Ｔｅｅｎ系統）、オクチルフェノキシポリエトキシ
エタノール（■「１℃０ｎ−Ｘ系統）、ｎ−オクチル−
β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チ
オグルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラ
ノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシドおよ
び生物に存在する界面活性剤、例えば、脂肪酸、グリセ
リド、モノグリセリド、デオキシコレートおよびデオキ
シコレートのエステル類などがある。

広範囲スペクトルの乳頭洗滌液の予防への使用に加え、
洗滌液の種々の成分を菌を除去し、乳房炎を治癒するた
めに乳房へ注入でき、例えばリゾスタフィンを単独で、
或いは弱性界面活性剤と一緒に注入でき、界面活性剤を
併用することにより驚くことにリゾスタフィンのブドウ
球菌殺菌効果は１０００倍以上上昇する。さらに、リゾ
スタフィンとペニシリンを併用することにより試験管内
で１０００倍のブドウ球菌殺菌作用を示すような相乗作
用が認められた。従って、治療用の注入液はペニシリン
、または弱性界面活性剤と任意にキレート剤とをさらに
含有できる。

界面活性剤、ＥＤＴ△、ペニシリンまたは他の増強剤を
含有する、或いは含有しないリゾスタフィンを治療有効
量注入することによりブドウ球菌感染を除去することが
出来る。好ましくはそのような注入液は他の薬剤を併用
しない場合には２がら４００■のリゾスタフインを含有
する。増強剤を含有する併用の場合にはリゾスタフイン
の必要量はく相乗的に活性が高められるため）１０００
倍も低くできる。

リゾスタフィンとペニシリンの相乗的な殺菌活性はベニ
シリナーゼ陽性のｓ、　ａｕｒｅｕｓおよびメチシリン
耐性Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　（“ＭＲ８Ａ”　）に投与し
た場合にもｖ！ＡＩされた。ＭＲ３Ａは通常多くの抗生
物質に耐性であって特にヒトで問題が多く、殺菌が困難
ぐある。リゾスタフィン／ペニシリンの併用は難しいＭ
　ＲＳ　Ａ感染が従来の抗生物質（例えばペニシリン〉
治療により制御できないような特殊な状況での使用に適
用されよう。さらにペニシリンおよび他の同じような作
用をする物質はリゾスタフインと併用してブドウ球菌感
染および汚染に対する薬剤として有用であろう。

本発明によるリゾスタフィン含有製剤は乳房炎治療への
利用として示すが、これら製剤でのリゾスタフインの増
強効果はブドウ球菌による感染および汚染が関与する他
の多くの利用にも適当である。従って、本製剤は外傷保
護および治療、消毒液、洗液やローション、或いは外科
用挿入などに加えることによってブドウ球菌感染を制御
することに使用できる。さらに本製剤は医療用様器の洗
滌および環境の消毒が好ましいような時に床、壁および
ベツド等の清掃にも使用できる。他の利用法としては、
ブドウ球菌の＾腔感染を低下するための鼻腔注入、およ
び肉、卵、ヂーズおよび魚類の処理、或いは包装および
取り扱い器具などの食品関連の利用などがある。

本発明の第一の側面は、リゾスタフィンおよびリゾスタ
フィンの殺菌活性を相乗的に高めうる、ペニシリン、合
成ペニシリン、その他の抗生物質、キレート剤、弱い界
面活性剤およびその他の膜活性物質より成る群より選ば
れる少なくとも−っの薬剤とをブドウ球菌を殺す有効量
含有する抗ブドウ球菌組成物に関する。

リゾスタフィンが少なくとも０．０１μ９／ｄの濃度で
存在することが好ましい。

また、ペニシリンはリゾスタフインの殺菌効果を高める
有効量で含有することが望ましい。

その吊としては、０．１μ７／ｄがら１０．０μｇ／ｄ
の範囲内の量が例示される。

リゾスタフィンの殺菌効果を高めるのに有効量の弱界面
活性剤が含有されていてもよい。

その覆としては０．１％から１．０％の徒囲内である。

更に好ましくは、リゾスタフィンの殺菌効果を高める有
効量のペニシリンおよび弱界面活性剤が含有される。

弱界面活性剤は０．１％から１．０％でペニシリンとし
ては０．１μｇ／ｍｌから１０．Ｏｕｇ／ｄの量から好
ましくは選択される。

ざらにムタノリシンおよびリゾチームを含有していても
よい。

リゾスタフィンとしてはリゾスタフインをコードする組
換えプラスミドを保有する形質転換微生物に由来するも
のが好適に使用される。

形質転換微生物としてはプラスミドｐＢＣ１６１Ｌを保
有するものが好適に利用される。

本発明の第２の側面は、許容担体に含有されるリゾスタ
フィンより成る治療薬をブドウ球菌性乳房炎を治癒する
有効量、感染腺に乳腺内注入により投与することより成
るブドウ球菌性乳房炎の治療法に関する。

その場合２〜から４００１ｎｇのリゾスタフインをウシ
乳腺に適用すればよい。

リゾスタフィンとしてはリゾスタフインをコードする組
換えプラスミドを保有するＢａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅ
ｒｉｃｕｓ形質転換株により生産されるものが好適に使
用される。

かかる生産菌としてはプラスミドｐＢＣ１６−１１を保
有する形質転換微生物が挙げられる。

治療薬に更にリゾスタフィンの治療効果を高めるのに有
効量の弱界面活性剤を含有しているものを使用してもよ
い。

さらに、リゾスタフィンの殺菌活性を高めうる、ペニシ
リン、合成ペニシリン類、細胞壁−活性抗生物質、キレ
ート剤および弱界面活性剤より成る群より選ばれる少な
くとも一つの薬剤を、リゾスタフィンの治療効果を相乗
的に高める量で含有していることが好ましい。

治療薬としてはさらに少なくとも一つの追加の細菌溶菌
剤を含有しているものでもよい。

かかる追加の細菌溶菌剤としてはムタノリシンおよびリ
ゾチームより成る群から選ばれるものが挙げられる。

第３の側面は、適当な担体中におよそ０．０１μ９．／
ｌｅから１０．０μｇ／Ｉ＋１１！のリゾスタフインを
含有して成る溶液に乳頭を、各搾乳時の前後に浸すこと
から成るウシ乳房炎の予防方法に関する。

その際に溶液がさらにムタノリシンおよびリゾチームを
含有するものを用いてもよい。

リゾスタフィンとしてはリゾスタフインをコードする組
換えプラスミドを保有するＢａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅ
ｒｉｃｕｓの形質転換株により生産されたものが好適に
使用される。

かかるＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓの形質
転換株としてはプラスミドｐＢＣ１６−Ｉ　Ｌを保有し
ているものが挙げられる。

また、溶液にさらにメタノリシンおよびリゾチームを含
有するものも好適に使用される。

本発明により使用するリゾスタフインは天然または組換
え体より得られる。好ましくはリゾスタフインはリゾス
タフインの合成を指示する組換えプラスミドを保有する
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ００株から得
られ、その結果リゾスタフィンが生育培地中に直接蓄積
するので高収量にかつブドウ球菌由来の免疫原性汚染が
なく、また面倒なリゾスタフイン精製の必要もなく調整
できる。プラスミドｐＢＣ１６−Ｉ　Ｌを保有するＢａ
ｃｉ　ｌ　１ｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ形質転換株がこ
の目的に最も適していることがわかっているが、他の菌
株もリゾスタフイン源として使用できる。リゾスタフィ
ンをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドにより形
質転換した微生物からリゾスタフインを得る一つの方法
は１９８７年８月１０日に出願され、米国特許比！！ｒ
１８５２，４０７の一部継続出願である米国特許出願０
３４，４６４に詳細に開示されている。

両出願共本発明の文献として採用する。

〈治療方法〉 本発明によるウシ乳房炎の予防処理にはリゾスタフイン
含有の乳頭洗滌液を使用する。リゾスタフィン含有の乳
頭洗滌液を搾乳の前後に毎回使用するとウシ乳房炎の有
効な予防が出来る。好ましくは本予防法を群の全てのウ
シに使用するのがよい。乳頭洗滌液はおよそ１．０Ｌｔ
ｇ／ｄのリゾスタフィンを許容担体中に含んで成る。さ
らに、本発明により使用する乳頭洗滌液はおよそ１．０
μＪ／ｄのムタリシン、およそ１０μｇ／ｍｌのりゾチ
ームおよび弱性界面活性剤を含有する。許容担体として
はｐＨおよそ８．０の緩衝液となるもので、水性緩衝液
または親水性の軟こうベースなどがある。例えば、非イ
オン性界面活性剤、脂肪酸または弱性界面活性剤、アル
ブミンやゼラチンのようなたん白担体、粉末セルロース
およびカルメルなどが担体として使用できる。本発明に
よる乳頭洗滌液はまた、ＥＤＴＡのようなキレート剤、
着色剤およびグリセロール或いはソルビトールのような
湿潤剤を含有するのが有利である。

ムタノリシンはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｂｉ
ｓｐｏｒｕｓから得られる。リゾチームはトリ卵白より
１号られる。

予防処置を施しても発生する慢性或いは急性のブドウ球
菌によるウシ乳房炎に感染した動物は、リゾスタフィン
を乳腺内注入することにより有効に治療することができ
る。乳腺当り２から４００　ｒｒｔｙのリゾスタフィン
の一回投与により多くの場合ブドウ球菌乳房炎の感染を
除去して治癒できる。感染が持続する場合にはさらにリ
ゾスタフィンの投与を行なう。４００ＩＩｔｇより高い
投与量は好ましくない副作用、例えば−時的膨潤、柔軟
および搾乳里の低下など、を起すので推奨できない。し
かし、このような影響は治療した腺にのみ見られ、従っ
て重篤な生命を左右するような場合にはその腺のみ高い
投与量で処理することも良い。命に係わる場合には投与
経路も全身分布が可能なように、感染箇所以外の場所も
含み、リゾスタフィンが腸内で失活しないように防御し
た適当な被覆製剤の静注、皮下注射、或いは筋注および
直腸または経口投与などを行なう。

リゾスタフィンおよびペニシリンの組合せの注入はこの
併用による抗菌活性の見かけ上の相乗作用のため、リゾ
スタフィン単独よりも驚くほど効力が高まることも明か
となった。その上、治療用のリゾスタフイン製剤はリゾ
スタフインの抗菌活性を高めるような他の薬剤、例えば
合成ペニシリンやその他の抗生物質、キレート剤、弱い
界面活性剤（例えばデオキシコール酸）、および感染部
位へのリゾスタフインの透過を高めるような膜に活性の
ある他の薬剤を含有できると考えられている。例えばペ
ニシリンを含有する製剤では、リゾスタフィンの抗菌活
性が高められるのでリゾスタフィン投与量を低くできる
。リゾスタフィンの投与量が多いと好ましくない副作用
を誘発する可能性があるため、このような相乗効果は効
力の点からだけでなく、副作用を回避できる点でも有意
義である。

火１」ＬＬ二Ａ リゾスタフィン、ムタノリシンおよびリゾチーム組成物
のｓ、　ａｕｒｅｕｓおよびその他の乳房炎病原菌に対
する殺菌活性を調べるために試験管内実験を行なった。

手順は以下のとおりである：く生菌数測定〉 １、−晩インキュベート（３７℃）した平板からのバク
テリア細胞（通常１０９個／ｍｆ！、）をトリス緩衝液
（２０ｍＨｔ−リス、ｐ＋＋ｓ＞にけん濁する。

２、　１０μｌのバクテリア細胞けん濁液と１ｄの対照
および洗滌試験処方（即ち、リゾスタフィン組成物を含
有する牛乳、緩衝液、或いは緩衝界面活性剤等）を合わ
せる。

３、　細胞を３７℃にて種々の時間インキュベートする
。

４　　細胞液を卓上遠心分離を用いて２分間遠心分離し
て集菌する。

５、　沈でん物を１．０−のファージ緩衝液で２回洗滌
する。

６、　細胞を１．０ｔｉ！のファージ緩衝液に再けん濁
し、ファージ緩衝液を用いて適当に段階希釈した後、１
００ｔｌｌをＧＬ寒天（ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　　Ｅｃｏ
ｌｉ、　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
　）またはトリプトケース大豆寒天（Ｓ、　ａｇａｌａ
ｃｔｉａｅ　）にまく。

７、　平板を３７℃で一晩インキユベートし対照平板お
よび試験平板上のコロニー形成単位（以（Ｉ　ＣＦ　Ｕ
という）を計測して生存パーセントを決定する。

くファージ緩衝液の組成〉 ５０　ｎ＋Ｈｌ−ＩＪ　’）、、ＤＨ７、８：　１　ｍ
ＨＭ　Ｑ　Ｓ　０４　　：４ｍ）Ｉ　　ＣａＣｊ！　　
；１００＋ＨＮａＣｊ！；ゼラチン、１．０’；Ｊ／１
　（ファージ緩衝液は処理により溶菌しなかったプロト
プラストやスフエロプラス＜ＧＬ寒　の１リツトル　た
つの　　〉Ｄ　ｔ　ｒｃｏ製カザミノ酸、３．（：）ｇ
　ＨＤｉｆｃｏ製酵母エキス、３．Ｃ１：ＮａＣ１，５
，９ｇ；乳酸ナトリウム（６０％、Ｗ／Ｖ　）、３．、
Ｍ；　２５％（Ｖ／　Ｖ）グリセロール、４．０ｄ；寒
天、１５ｇ；ｐＨを７．８に調整。

〈トリプトケース大豆寒天培地の１リツトル当たりの組
成〉 バクトドリプトン、１５ｇ；バクトドリトン、５ｈ：Ｎ
ａＣｆ、５ｇ；寒天、１５ｈ；ｐＨは７．３に調整。

各種リゾスタフィン治療製剤の殺菌効果を示す試験管内
実験の結果は第１Ａ表から第１Ｃ表に示す。結果はＳ、
　ａｕｒｅｕｓのＮｅｗｂｏｕｌｄ　３０５株、ＲＮ４
５１株、ペニシリン耐性株ＲＮ１７５３（ベニシリナー
ゼ生産株）およびＣｏ１株（メチシリン耐性）に対する
生存パーセントで表わした。

トを安定化するのに役立つ）。

必　−二 第１Ａ表はリゾスタフインを１μｇ／ｄ。

０．１μ９／ｍｅ、０゜０１μ！？／ｄおよび０．００
μｇ／ａｄ！（対照）含有する製剤の結果を示す。これ
らの結果から明かなように、試験した全ての濃度のリゾ
スタフインで緩衝液中の菌を殺す効果があることがわか
る。牛乳を担体とした場合には１μｇ／ｄおよび０．１
μｇ／ｍｅのみで生存筒の低下が認められた。

第１Ｂ表はリゾスタフイン製剤に弱非イオン性界面活性
剤活性剤、オクチルフェノキジルポリエトキシ（１０）
エタノール、（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００）、の添加
効果を示す。例えば、０．１Ｂｇ／ｄのリゾスタフイン
と０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００で処理すると０
．００１％以下の細胞しか生存しないが、それぞれの薬
剤での単独処理ではそれぞれ２．２％および７．７％が
生存した。さらに驚くことに、０．０１Ｂｇ／ｄのリゾ
スタフィンと０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００でも
０．００１％以下の生存が観察された。

第１Ｃ表はブドウ球菌の３株に対してのリゾスタフイン
／ペニシリン併用の相乗効果を示す。各薬剤の溌磨によ
ってリゾスタフィンにペニシリンを添加した併用は３株
全てでリゾスタフィンまたはペニシリンの単独よりも１
００倍からｉ　ｏｏ。

倍有効である。

第１Ｄ表はＳ、　ａＬｌｒｅｔｌｓに対するリゾスタフ
ィンとペニシリンの順次投与に比較して併用の効果を示
す。Ｓ、　ａｕｒｅｕｓを牛乳中に１０７個／威の細胞
数でけん濁し、リゾスタフィンとペニシリンと同時に、
或いは順次に記載の時間インキュベートした。インキュ
ベション後、試料を遠心分離して細胞を集め、２回洗滌
後１．０ｄのファージ緩衝液に再けん濁し、希釈して１
００μｍをＧし寒天にまく。コロニー形成単位（ＣＦＵ
）を３７℃に一晩インキユベーションしてから計測し、
対照に対する生存率をパーセントで測定した。リゾスタ
フィン／ペニシリン併用はｓ、　ａｕｒｅｕｓに対して
これらを順次添加したものより少なくとも３桁高い殺菌
活性の相乗効果を示す。

第１Ｄ表 ５ｏｎ（０，５ｈ）　　　　ｐｅｎ（０，５ｈ）生存率
　０．０００５　　２３　　　　２５　　　　０．３　
　　　　　１０（％） ｓｐｎ−リゾスタフィン　　ｐｅハローニシリンさらに
、Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ、　Ｓ、　ａｇａｌａｃｔｉａｅ
およびＥ、　ｃｏｌｉまたはにＩｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐ
ｎｅｔ＋ｍｏｎｉａｅ生菌けん濁液の６００　ｎｍに於
ける濁度を測定するリゾスタフイン、ムタノリシンおよ
びリゾチームの活性測定でキレ−１〜剤（例えばＥＤＴ
Ａ）がこれら３薬剤のそれぞれの活性を高めることがわ
かった。

これらのデータは、リゾスタフィンは速効性で高活性の
ブドウ球菌殺菌剤であり、その殺菌活性はペニシリンま
たは弱い界面活性剤、ＴｒｉｔｏｎＸｌｏｏにより１０
００倍以上高められることを示す。さらにキレート剤を
添加するとリゾスタフインの殺菌活性は高まる。また合
成ペニシリンや細胞壁に活性のある抗生物質もリゾスタ
フインの活性を高めると考えられている。リゾスタフィ
ンは牛乳中でもブドウ球菌に対する殺菌剤であるが、ｆ
ｆｉ衝液中では牛乳中で見られるおよそ１０倍の殺菌活
性を示す。

実施例５ 実施例１から４までに記載した一般手順に従い、溶菌酵
素、非イオン性界面活性剤および緩衝キレート剤を含有
するリゾスタフイン組成物の殺菌活性を評価するために
試験管内実験を行なった。第■表に示すように、１％Ｔ
ｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００゜０．１Ｂｇ／ｍｌリゾスタ
フィン、１０μ７／ａｔｅリゾチームおよび２０ｆｆ１
１４トリス、ｐＨ８，Ｏ中の５ｍＨＥＤＴＡを含む製剤
（ＡＭＢ　Ｉ乳頭洗滌液０．１）はＳ、　ａｕｒｅｕｓ
　ｔ４ｅｗｂｏｕｌｄ　　３　Ｑ　５株、Ｓ（！ｐ！ｄ
ｅｒｌｌｌ！ｄｆｓ、　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　
ａｇａｌａｃｔｉａｅＨＣＤＯｎａ同株および０４８株
を含む広範囲の乳房炎起因の病原菌および５ｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ　ｕｂｅｒｉｓＥ、　ｃｏｌｉ並びに　
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの臨床分
離株に対して非常に有効であった。

第■表 （Ｎｅｗｂｏｕｌｄ　３０５） Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ（ＲＮ４
５１） Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｃｌｅｒｎ＋１
ｄｉｓ（ｐｓ） ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｔ＋ｓ　ａ［１ａｌａｃｔｉａ
Ｇ（ＨｃＤｏｎａｌｄ） ＳｔｒＱｐｔＯＣＯＣＣｕＳ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ（
Ｃ４８） ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｕｂｅｒｉｓ（ＰＳ） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ （ｐｓ） ＫＩｅｂＳｉｅｌ　ｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ｐｓ
） ５．７ｘ１０” ８．３Ｘ１０５ ３．９Ｘ１０５ ２□９Ｘ１０４ ６９Ｘ１０５ ９、ｌＸ１０５ ９．６Ｘ１０５ ＜０　００１ ＜０．００１ ＜０．００１ ＜０．００１ ＜０．００１ 〈１．０ 〈１，０ 実施例６ リゾスタフィン乳頭洗滌液組成物の生体内での効力を示
すためウシでの試験を行なった。試験は一般にはＮａｔ
ｉｏｎａｌ　Ｍａｓｔｉｔｉｓ　Ｃｏｕｎｃｉｌ　（国
立乳房炎評議会）のプロトコールＡに従って行なった。

−殻内には、乳頭を１％ヨード洗液で清浄してベーパー
タオルで乾かす。次に乳頭をアルコールで洗って自然乾
燥する。次に一頭当たり４個全ての乳頭をＳ、　ａｕｒ
ｅｕｓ　Ｎｅｗｂｏｕｌｄ　３０５株の１０８個／ａｄ
！のけん濁液に乳頭の１／２が浸かるように浸漬し、３
０分間自然乾燥する。２個の乳頭（前の右と後ろの左）
をリゾスタフィンの試験用乳頭洗滌液製剤＜０．８５％
食塩水中に１０μｇ／ｄのリゾスタフィン）の中に２／
３が浸かるように浸漬し、３０分間自然乾燥する。残り
の２個の乳頭は非処理対照とする。それぞれの乳頭を先
ず湿った綿でふき、１０−の０．８５％滅菌食塩水で洗
う。洗液は３０ｍの滅菌管に集める。洗液の０．２ｔｄ
およびその適当な希釈液を血液寒天平板上に二連でまき
、３７℃で２４−４８時間インキュベートした。コロニ
ー形成単位を計測し、５ａｕｒｅｕｓの対照に対する生
存率を計算する。

０．８５％塩溶液中の１０μｇ／ｄのリゾスタフィン溶
液はウシ乳頭表面に感染したｓ、　ａｕｒｅｕｓを完全
に消毒した。さらに乳頭をＳ、　ａｕｒｅｕｓの細胞液
で処理する前にリゾスタフィンを乳頭表面に投与しても
乳頭表層に十分な活性が残存して乳頭での増殖を防いだ
。残存活性はリゾスタフインが除去されるのを軽減する
ために重合体吸着剤および／または不活性担体たん白を
添加することで高めることができる。

実施例７ 実施例６の結果および試験管内実験で得られた結果に従
って、１．０μ９／ｕｄｌリゾスタフイン、１０ｕｇ／
ｍＲリゾチーム、１．０％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００
および５ｍ）４ＥＤＴＡを２０ｍＨトリス！ｉ衝液、ｔ
ｌＨ８，Ｏｌに溶解した強力乳頭洗滌液製剤（ＡＭＢ　
１乳頭洗滌液１．０）についてＳ、　ａｕｒｅｕｓ　Ｎ
ｅｗｂｏｕｌｄ　３０５株に対する消毒効果を調べた。

乳頭をＳ、　ａｕｒｅｕｓ　Ｎｅｗｂｏｕｌｄ　３０５
株細胞１０８個／ｍｌに浸け、３０分間自然乾燥した。

次に乳頭をＡＭＢ　Ｉ試験用乳頭洗滌液−１，０（１，
０μｇ／Ｉｎ１リゾスタフィン、１０μｇ／ｄリゾチー
ム、１．Ｏ％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００，５ｍ）４　
　ＥＤＴＡ、２０ｍＨトリス緩衝液、ＤＨ８，０）に浸
けて３０分間自然乾燥した。乳頭を湿った綿でふき、１
０ｄの滅菌０．８５％塩溶液ですすいだ。綿と洗液とを
別々に血液寒天平板にまき、２４−４８時間インキュベ
ートした後ＣＦｔＪを測定した。第１１１Ａ表に示す結
果は明かに本調製物の有効性を示す。処理乳頭では少な
くとも３桁低い数（７）　Ｓ、　ａｕｒｅｕｓｌｔｌ胞
が見られ、５０％の乳頭でＳ。

ａｕｒｅｕｓの感染が全く見られなかった。

同様の実験を５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａ
ｃｔｉａｅＨｃＤＯｎａｌｄ株の２×１０７個／ｍｌの
細胞液に乳頭を浸け、３０分間自然乾燥して行なった。

この実験結果を第■Ｂ表に示す。処理した乳頭は全て５
ａＯａｌａｃｔｉａｅが検出されなかった。

第１１１Ａ表 第１［１８表 対照 処理 平均 陰性の数 ０／１０ ０／１０ ６／１０ ４／１０ ウシ番号 平均 陰性の数 対照 １−当たりのＣＦＵ ＬＦ　　　　ＲＦ １／１０ ０／１０ 処理 １＃Ｌｉ！当たりのＣＦＵ ＬＨＲＦ 実施例６ モルモットの乳腺に２００−３００ＣＦＵのＳ、　ａｕ
ｒｅｕｓ　Ｎｅｗｂｏｕｌｄ　　３０５株を感染させた
。感染３日後に２００μｌの０．８５％滅菌塩溶液に溶
解したリゾスタフインを一回注入した。処理後６時間口
およびそれ以後１２時間毎に少なくとも５日間、乳を採
取した。処理および非処理の乳腺からの乳試料１００ｕ
１を血液寒天平板上にまいた。２４−４８時間インキュ
ベート後、ＣＦＵを決定するために計測した。感染を防
止できる十分量のリゾスタフインを単回投与しても副作
用は見られず、リゾスタフィンの乳腺内への注入はブド
ウ球菌性乳房炎に対して有効であることを示した。

１２５μｇ／Ｋｇの処理で６時間までに乳腺は感染から
回復し、実験中感染は見られなかった。

第■入 非感染動物数　（０／１０）　　（Ｉｌｏ）　　（１／
２）　　（２／２）　　（１／１）　　（７／７）以上
の実施例からリゾスタフインがブドウ球菌乳房炎の治療
に有効であり、その効果はペニシリンまたは弱性界面活
性剤やキレート剤などの物質と併用して使用することに
より大きく高められることがわかる。

リゾスタフィンのＢａＣ１１ｌｊｌＳを　いた本発明に
より使用するリゾスタフインは天然源または組換え体か
ら得ることが出来る。好ましくは、リゾスタフィンはリ
ゾスタフイン合成を指示する組換えプラスミドにより形
質転換したＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　
　Ｏ０株に由来する培養物より得られ、これに関しては
１９８６年４月１６日に出願された米国特許Ｎｏ、８５
２．４０７号の一部継続出願であり、１９８７年４月１
０日に出願された同時係続出願であるＮｏ、０３４．４
６４号に記載されている。水沫によると高レベルでブド
ウ球菌由来の免疫原性汚染のないリゾスタフィンの生産
が出来る。活性型リゾスタフィンが生育培地中に直接蓄
積するのでリゾスタフィンの精製も容易である。この方
法を用いる際、プラスミドｐＢＣ１６−１１を保有する
ＢａＣ１１ｌＬＩＳｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ　　ＯＯ形質
転換株（Ｂ、　５ｐｈａｅｒｉＣｕＳ００／１）ＢＣｌ
　６／Ｉ　Ｌ）が目的に特に適していることがわかって
いるが、他のＢａｃｉｌｌｕｓの形質転換株も有用なリ
ゾスタフイン源となる。

リゾスタフィン生産微生物をリゾスタフィン生産に適し
た条件下で生育させる。至適条件は菌株により変わるが
、ある種の生育培地および発酵条件がリゾスタフィン生
産を高めることが知られている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５
ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　　００　／　ｐＢ　Ｃ１６／ＩＬ
形質転換株では、好ましい生育培地はＶＹ液体培地（２
５ｇ子牛肉浸出液＋５ｇ酵母エキス／リットル）で十分
に通気した条件がよい（第Ｖ表参照）。

玉Ｙ衣 にＩｅｔｔ １００　ｒｐｍ ２００　ｒｐｍ　　　２００　ｒｐｍ （みぞつき） ３２０　ｒｐｍ ２５０　　２１．８　　　　３６．２　　　　３５．９
　　　　３０．０３５０　　４０．１　　　　６８，９
　　　　４５．３　　　　４５．０４００　　８８．５
　　　　６２．７　　　　１０２．８　　　’　　　７
１．４４５Ｏｎ／ａ　　　　　　８６．４　　　　５２
．３　　　　１３５．９０／Ｎ　　　６４，４　　　　
３１，３　　　　３７．６　　　　５７．５３００ｄの
クレットフラスコに容れた培地（４０ａｄりに４ｄの一
晩前培養物を植菌した。

生育培地＝５μ９／ｌｄのエリスロマイシン含有■Ｙブ
ロス。

増殖過程で試料を採取した。上澄液についてリゾスタフ
ィンの活性をＳ、　ａｕｒｅｕｓの死菌けん濁液の清澄
の濁度により測定した。結果は１ｄ当たりのリゾスタフ
インのμ９で表わしである。

Ｂ、　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　　００／ｐＢＣ１６−Ｉ
　Ｌ形質転換株はＶＹ培地で増殖させると培養液１リツ
トル当たりおよそ１３０ｊ１！Ｊのリゾスタフィンを生
産し、分泌した。これは現在可能な最適の発酵条件下で
Ｓ、　５ｉｌｌＬｌｌａｎＳが生産する値の４倍以上の
量である。リゾスタフィンは培養液中で長くインキュベ
ーションを続けてもほとんど分解せずに培地中に蓄積さ
れ、菌体外の全たん白の８０％以上を占める。

リゾスタフィンは培養液より公知の分画法でん（塩析）
法により単離される。別法として、特に効果的な精製は
リゾスタフイン生産性Ｂｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ　　ＯＯ
／　ｐＢ　Ｃ１６−Ｉ　Ｌ形質転換株の培養物の発酵液
を沈でん法とクロマトグラフィーによる分離とを組合せ
てできる。

菌体は発酵液より、例えば遠心分離または限外濾過によ
って、除去し、固型硫酸アンモニウムも４０−６０％飽
和、好ましくは５０％飽和で上澄液に添加する。４℃に
て１時間後にリゾスタフィンを含有する沈でんを遠心分
離により回収する。

この段階での回収は８０％以上である。

沈でんは最少量のり／υ酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ７，
００，５０ｍＨＮａＣｊりに再溶解し、１００培容の同
じ緩衝液に対して透析する。特別の物質を除去した後、
透析液を陽イオン交換カラム（好ましくはＰｈａｒｍａ
ｃｉａ　　Ｆ　Ｐ　Ｌ　ＣモノＳ）でクロマトグラフィ
ーにか１′、Ｉ、塩濃度０．０５から０．２５Ｍ　　Ｎ
ａ（ｌの緩衝勾配を用いて溶出する。−回のクロマトグ
ラフィーでのリゾスタフインの回収は９０％以上であっ
た。リゾスタフィン活性は二つの主要ピーク（第１図）
に存在した。

後ろに溶出するリゾスタフインのピークはたん白の非共
有凝集物より成る。この凝集物は緩衝液での希釈および
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動下で遊離する。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓのリゾスタフ
ィン生産株は組換えＤＮＡ技術を用いて、好ましくは同
時係属出願８５２，４０７号および０３４，４６４に記
載される方法により調整できる。具体的には、Ｓ、　ｓ
ｉｍｕｌａｎｓの全ＤＮＡを適当な制限エンドヌクレア
ーゼで部分消化し、得られるＤＮＡ断片を適合する末端
を有し、抗生物質耐性マーカーおよびａｃ　Ｚ’遺伝子
（即ち、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）を保有する線状
化した既知ベクター（ｐＵｃ８）と結合する。ライゲー
ション反応液を形質転換によりＥ、ｃｏｌｉ（ＪＭ１０
５）に移す。

リゾスタフィン遺伝子がプラスミド中にうまく挿入した
ものは先ず適当な抗生物質に生育する形質転換株を選択
し、続いて　ｌａｃ　Ｚ’陰性の表現型を見つけること
により検出できる。リゾスタフィンの生産はｓ、　ａｕ
ｒｅｕｓのけん濁の濁度清澄を液体または寒天平板での
重層で検出する。

種々のりシスタチン生産Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＪＭ　１０
５形質負転換株を用いてそのプラスミドＤＮＡの制限酵
素解析およびサブクローニングをした結果、リゾスタフ
ィンをコードするＤＮＡ配列は１．５ｋｂｐのＨｐａＩ
Ｉ−Ｈｉ　ｎｄｌｌ［ＤＮＡ断片に特定された。断片は
電気泳動後臭化エチジウム染色により検出し、ニトロセ
ルロースフィルターに移した。

フィルターをＮＥＴＩｖｊｉＪ液（０，１５ＭＮａＣｊ
！、０．１ｍＥＤＴＡ、０．０２Ｍトリス、１）Ｈ８，
Ｏ＞で洗い、移したＤＮＡを１ＭＮａＣ１含有のＮＥＴ
緩衝液中で６５℃、１時間インキュベーションして溶出
した。ｎ−ブタノールによる抽出で臭化エチジウムをＤ
ＮＡから除去する。水溶液に２培容の冷９５％エタノー
ルを添加してＤＮＡを沈でんし、遠心分離によって集め
た後８０％エタノールで洗ってＴＥ緩衝液（１０１８１
−ＩＪス、１ｍＨＥＤＴＡ、ｐＨ１８，０＞に溶解する
。Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ、　５ｐｈａｅｒｉ
ｃｕｓを形質転換してリゾスタフィン発現の出来る組換
えプラスミドはプラスミドｐＢｃ１６の誘導体（ＤＢＣ
ｌ６−１）をクローニングベクターとして使用して構築
した。ｐＢｃｌ６は元来、Ｂ、　１ｒｅＬＩ３から単離
され（に、　Ｂｅｒｎｈａｒｄ、　ｔｌ、　Ｓｃｈｒｅ
ｍｐおよび―Ｇｏｅｖｅｌ、　Ｊ、　Ｂａｃｔ　、　１
３３巻、８９７頁、１９７８年）だテトラサイクリン耐
性（Ｔｅし　＞のＢａｃｉｌｌｕｓのプラスミドである
。制限酵素分析およびサザンハイプリダイゼーションで
ＤＢＣｌ　６と区別のつかないプラスミドがＢ、　５Ｌ
ＩｂｔｉｌｉＳおよびＢ、　５ｐｈａｅ−ｒ　１ｃｕｓ
の土壌分離株からも見つかっている（Ｊ ＰｏｌａｋおよびＲ，Ｎ、　Ｎｏｖｉｃｋ、　Ｐｌａｓ
ｍｉｄ　　７巻、１５２頁、１９８２年）。

クローニングベクターとして使用したＤＢＣｌ６の誘導
体（ＯＢＣＩ　６−１　＞はＳ、　ａｕｒｅｕｓ由来の
エリスロマイシン耐性（ｅｒｍ　　）プラスミドである
プラスミドｏ　Ｅ　１９４　（Ｂ、　Ｗｅｉｓｂｌｕｍ
。

阻Ｙ、　Ｇｒａｈａｍ、　Ｔ、　Ｇｒｙｃｚａｎおよび
り、　ＤｕｂｎａｕＪ、　Ｂａｃｔ　、　１３７巻、６
３５頁、１９７９年）のＴａｑ　ＩＡ断片とプラスミド
１）ＢＣＩ　６のＴａｑＩ部分消化物とをＴ４リガーゼ
でライゲーションして構築した。ライゲーション液をプ
ロトプラスト形質転換（Ｓ、　ＣｈａｎｇおよびＳ、　
Ｎ。

Ｃｏｈｅｎ、ｍｏｌｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ　、１６
８巻、１１１頁、１９７９年）によってＢ、　５ｕｂＮ
ｌｉｓに移し、テトラサイクリンとエリスロマイシンの
両剤に耐性のクローンを選択した。その一つをｐＢｃｌ
　６−１と命名した。

制限酵素分析の結果、ｐＢＣｌ　６−１はｐＢＣ１６の
Ｔａｑ　Ｉ断片の全てとｐＥ１９４のエリスロマイシン
耐性を含有するＴａａ　ＩＡ断片とを含有していること
がわかった。次にｐＢＣｌ　６−１を制限エンドヌクレ
アーゼＰｖｕＩＩで消化してテトラサイクリン耐性因子
の大部分を含むプラスミドＤＮＡの２５％を除去した。

ＰｖｕＩＩ消化したベクターｐＢｃ１６−１は仔つアル
カリフオスファターゼで処理した。リゾスタフィンをコ
ードする１、５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラー
ゼのフレナラ断片で処理した。１．５ｋｂａのＤＮＡ断
片とプラスミドＤＮＡを混合してＴ４リガーゼを用いて
ライゲーションし、ライゲーション液をプロトプラスト
形質転換によりＢ、　ａｕｂｔｉｌｉｓに移した。形質
転換株はエリスロマイシン耐性、テトラサイクリン感受
性でＳ、　ａｕｒｅｕｓの死菌を含む寒天で培養した時
透明ゾーンで示されるように、リゾスタフィンを生産し
た。一つのそのようなリゾスタフイン生産クローンを選
択してＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＢＣ１６−Ｉ　Ｌと
命名した。

Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ／　ｐＢ　Ｃ１６−１Ｌ形質転
換株から抽出したプラスミドｐＢｃ１６−ＩＬ　　ＤＮ
Ａを臭化エチジウム−塩化セシウム密度勾配超遠心分離
の後単離した。プラスミドｐＢｃ１６−Ｉ　ＬＤＮＡを
プロトプラスト形質転換により、Ｂ。

５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　　００株を含む各種ＢａＣ１１
ｌｊｌＳ種に移した。形質転換株はエリスロマイシン耐
性でリゾスタフィンヲ生産した。Ｂ、　５ｐｈａｅｒｉ
ｃｕｓ　　００１ｐＢＣ１６−Ｉ　Ｌ形質転換株が最大
量のリゾスタフイン生産を示し、天然の酵素的に活性の
ある生成物を蓄積した。Ｂ、　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　
　００株は元は土壌より分離され、ニューヨーク州、ニ
ューヨークのＰｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　　（公衆衛生研究所）の
保存菌株で（ＲＮ３１０６）維持さレテイル。Ｂ、　５
ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　　００　／　ｐＢ　Ｃ１６−ＩＬ
もニューヨーク州、ニューヨークのＰｕｂｌｉｃ　Ｈｅ
ａｌｔｈ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅの保
存菌株中で維持され、ＡｌｅｒｉＣａｎ　ＴＶＤｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに受理番号ＡＴＣ
ＣＮｏ、６７３９８として寄託されている。

【図面の簡単な説明】

第１図はリゾスタフインをコードする組換えプラスミド
ｐＢｃ１６−Ｉ　Ｌを保有するＢ、　５ｐｈａｅ−ｒｉ
ｃｕｓＯＯ株の形質転換株が生産するリゾスタフインの
クロマトグラムをホす。 図面の浄書（内容に変更なし）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）リゾスタフインおよびリゾスタフインの殺菌活性
   を相乗的に高め、ペニシリン、合成ペニシリン、その他
   の抗生物質、キレート剤、弱い界面活性剤およびその他
   の膜活性物質より成る群より選ばれる少なくとも一つの
   薬剤とをブドウ球菌を殺す有効量含有する抗ブドウ球菌
   組成物。
2. （２）許容担体に含有されるリゾスタフインとさらに、
   リゾスタフインの殺菌活性を高めうる、ペニシリン、合
   成ペニシリン類、細胞壁−活性抗生物質、キレート剤お
   よび弱界面活性剤より成る群より選ばれる少なくとも一
   つの薬剤を、リゾスタフインの治療効果を相乗的に高め
   る有効量含有することより成る治療薬をブドウ球菌性乳
   房炎を治癒する有効量、感染腺に乳腺内注入により投与
   することより成るブドウ球菌性乳房炎の治療法。
3. （３）適当な担体中におよそ０．０１μｇ／ｍｌから１
   ０．０μｇ／ｍｌのリゾスタフインとムタノリシンおよ
   びリゾチームを含有して成る溶液に乳頭を、各搾乳時の
   前後に浸すことから成るウシ乳房炎の予防方法。