JPH0286783A - Ｄｎａ組立て体及びそれらを組込んだ植物 - Google Patents
Ｄｎａ組立て体及びそれらを組込んだ植物Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＤＮＡ組立て体（ＤＮＡ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
ｓ）及びそれらを組込んだ植物に関する。
ｓ）及びそれらを組込んだ植物に関する。
生産性を向上させるための作物植物の育成は、植物組織
中での外来性すなわち外因性の遺伝子又は内在性すなわ
ち内因性の遺伝子の発現を必要とする。
中での外来性すなわち外因性の遺伝子又は内在性すなわ
ち内因性の遺伝子の発現を必要とする。
それらの遺伝子が植物構造中で全般に発現（ｃｏｎｓｔ
ｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）することが多
くの場面で必要とされ得る。しかしながら、個々の特定
のタイプの組織に限って遺伝子の発現があるように制限
することもまた必要とされ得る。例えば、トキシンすな
わち毒素をコードする遺伝子は穀物植物の内胚乳中では
発現されないのが最も良い。
ｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）することが多
くの場面で必要とされ得る。しかしながら、個々の特定
のタイプの組織に限って遺伝子の発現があるように制限
することもまた必要とされ得る。例えば、トキシンすな
わち毒素をコードする遺伝子は穀物植物の内胚乳中では
発現されないのが最も良い。
穀物植物の内胚乳部分は食料として使用されるからであ
る。
る。
本発明は、植物中で外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の遺
伝子を発現させるために用いられ、しかも植物の緑色組
織軸ｒｅｅｎ ｔｉｓｓｕｅ）中にのみ限って特異的に
遺伝子を発現させる組換えＤＮＡのカセット（ｃａｓｓ
ｅ ｔ ｔｅ）に関する。
伝子を発現させるために用いられ、しかも植物の緑色組
織軸ｒｅｅｎ ｔｉｓｓｕｅ）中にのみ限って特異的に
遺伝子を発現させる組換えＤＮＡのカセット（ｃａｓｓ
ｅ ｔ ｔｅ）に関する。
光合成をする植物を光に当てると、重要な生物事象が多
数起こる。それらの事象としては、葉緑体（クロロプラ
スト）内の膜の再組織化、そこに存在する酵素の活性化
、並びに集光と光駆動性（ｌｉｇｈｔ−ｄｒｉｖｅｎ）
・の電子の移送とを可能にするポリペプチド類の合成を
分担する核遺伝子の活性化がある。これらの蛋白質の内
の１つがチラコイド膜の光化学系Ｈに関与するクロロフ
ィルａ／ｂ結合蛋白質（ＣＡＢ）である（後記のリスト
の参考文献１〜４）。暗所で栽培したトウモロコシ植物
に光を当てた後では、ＣＡＢのｍＲＮＡとポリペプチド
類とが増加する。ＣＡＢのｍＲＮＡは緑色を回復する若
葉中では、細胞内にあるｍＲＮＡのうちの０．５〜１％
に達するほど高い濃度に到達できる（後記の参考文献５
）。
数起こる。それらの事象としては、葉緑体（クロロプラ
スト）内の膜の再組織化、そこに存在する酵素の活性化
、並びに集光と光駆動性（ｌｉｇｈｔ−ｄｒｉｖｅｎ）
・の電子の移送とを可能にするポリペプチド類の合成を
分担する核遺伝子の活性化がある。これらの蛋白質の内
の１つがチラコイド膜の光化学系Ｈに関与するクロロフ
ィルａ／ｂ結合蛋白質（ＣＡＢ）である（後記のリスト
の参考文献１〜４）。暗所で栽培したトウモロコシ植物
に光を当てた後では、ＣＡＢのｍＲＮＡとポリペプチド
類とが増加する。ＣＡＢのｍＲＮＡは緑色を回復する若
葉中では、細胞内にあるｍＲＮＡのうちの０．５〜１％
に達するほど高い濃度に到達できる（後記の参考文献５
）。
従って、本発明者らは、トウモロコシＣＡＢの遺伝子が
植物の緑色組織中で特異的に発現をさせるプロモーター
を分離、収得する上の供給源として有用であることを二
＼に提案し、該トウモロコシＣＡＢの遺伝子から単離さ
れたプロモーターが種々の植物中で特にトウモロコシ中
で外来種の蛋白質類を高水準で発現させることを可能に
するであろうと期待する。
植物の緑色組織中で特異的に発現をさせるプロモーター
を分離、収得する上の供給源として有用であることを二
＼に提案し、該トウモロコシＣＡＢの遺伝子から単離さ
れたプロモーターが種々の植物中で特にトウモロコシ中
で外来種の蛋白質類を高水準で発現させることを可能に
するであろうと期待する。
ＣＡＢのｍＲＮＡと遺伝子の多数は、小麦（ｍＲＮＡと
遺伝子）（後記の参考文献６）、エントウ（ｍＲＮＡと
遺伝子）（後記の参考文献７）、キュウリ（ｍＲＮＡ）
（後記の参考文献８）、トウモロコシ（ｍＲＮＡ）（後
記の参考文献４）、トマト（ｍＲＮＡと遺伝子）（後記
の参考文献９）及びタバコ（後記の参考文献１０）を含
む多数の原料源からクローンされている。小麦のＣＡＢ
遺伝子ｗｈＡ８１．６ （後記の参考文献１１）とエン
トウのＣＡＢ遺伝子ＡＢ８０ （後記の参考文献１２）
のプロモーターは形質転換したタバコ中で細菌性マーカ
ー遺伝子を発現できることが例証されている。１．８
ｋｂのプロモーター断片（ｗｈＡＢ １．６）の内部に
ある２６８塩基対を有する短かい配列が詳しく研究され
ており、該配列は前記の細菌性マーカー遺伝子の光調節
（ｌｉｇｈｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ＞性の発現を行い得
るものである（後記の参考文献１２）。これと同じ配列
がエントウの遺伝子中でも例証されている（後記の参考
文献１３）。この１．８ ｋｂの配列の中には、植物の
根の内部では上記プロモーターの発現を“°封じる（ｓ
ｉｌｅｎｃｅ）”作用をもつ部分が在ることも見出され
る（後記の参考文献１３）。
遺伝子）（後記の参考文献６）、エントウ（ｍＲＮＡと
遺伝子）（後記の参考文献７）、キュウリ（ｍＲＮＡ）
（後記の参考文献８）、トウモロコシ（ｍＲＮＡ）（後
記の参考文献４）、トマト（ｍＲＮＡと遺伝子）（後記
の参考文献９）及びタバコ（後記の参考文献１０）を含
む多数の原料源からクローンされている。小麦のＣＡＢ
遺伝子ｗｈＡ８１．６ （後記の参考文献１１）とエン
トウのＣＡＢ遺伝子ＡＢ８０ （後記の参考文献１２）
のプロモーターは形質転換したタバコ中で細菌性マーカ
ー遺伝子を発現できることが例証されている。１．８
ｋｂのプロモーター断片（ｗｈＡＢ １．６）の内部に
ある２６８塩基対を有する短かい配列が詳しく研究され
ており、該配列は前記の細菌性マーカー遺伝子の光調節
（ｌｉｇｈｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ＞性の発現を行い得
るものである（後記の参考文献１２）。これと同じ配列
がエントウの遺伝子中でも例証されている（後記の参考
文献１３）。この１．８ ｋｂの配列の中には、植物の
根の内部では上記プロモーターの発現を“°封じる（ｓ
ｉｌｅｎｃｅ）”作用をもつ部分が在ることも見出され
る（後記の参考文献１３）。
本発明者らは、トウモロコシ豆且肌■）からＣＡＢ遺伝
子を単離することに成功したので、このＣＡＢ遺伝子の
プロモーターをトウモロコシや他の植物：例えば小麦や
大麦、及び双子葉植物、例えばタバコ、トマト、ジャガ
イモ及びサトウダイコンにおいて外因性（ｅｘｏｇｅｎ
ｏｕｓ）の遺伝子を発現させるのに利用し得るようにな
った。トウモロコシＣＡＢ遺伝子のプロモーターは、各
種多様な外因性の遺伝子を発現させることができ、特に
形質転換したトランスジェニック植物において、昆虫の
襲撃から上記植物を保護するように細菌バシラス・スリ
ンジエンシスＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ由来の
δ−エンドトキシン（内毒素ともいう）遺伝子を含め種
々様々な外因性遺伝子を発現できる。
子を単離することに成功したので、このＣＡＢ遺伝子の
プロモーターをトウモロコシや他の植物：例えば小麦や
大麦、及び双子葉植物、例えばタバコ、トマト、ジャガ
イモ及びサトウダイコンにおいて外因性（ｅｘｏｇｅｎ
ｏｕｓ）の遺伝子を発現させるのに利用し得るようにな
った。トウモロコシＣＡＢ遺伝子のプロモーターは、各
種多様な外因性の遺伝子を発現させることができ、特に
形質転換したトランスジェニック植物において、昆虫の
襲撃から上記植物を保護するように細菌バシラス・スリ
ンジエンシスＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ由来の
δ−エンドトキシン（内毒素ともいう）遺伝子を含め種
々様々な外因性遺伝子を発現できる。
従って、本発明の第１の要旨によれば、トウモロコシ植
物由来のクロロフィルａ／ｂ結合（ＣＡＢ）蛋白質遺伝
子から単離されたプロモーターを含有するＤＮＡ組立て
体であって、このＤＮＡ組立て体中で前記プロモーター
がトウモロコシにとって外因性であるＲＮＡをコードす
る外因性のＤＮＡに対して作動的に（ｏｐｅｒａｔｉｖ
ｅｌｙ）すなわち活動可能に結合されており、それによ
って、前記ＤＮＡ組立て体が該プロモーターの制御下で
のみ前記の外因性ＲＮＡを発現するものであることを特
徴とする前記ＤＮＡ組立て体が提供される。
物由来のクロロフィルａ／ｂ結合（ＣＡＢ）蛋白質遺伝
子から単離されたプロモーターを含有するＤＮＡ組立て
体であって、このＤＮＡ組立て体中で前記プロモーター
がトウモロコシにとって外因性であるＲＮＡをコードす
る外因性のＤＮＡに対して作動的に（ｏｐｅｒａｔｉｖ
ｅｌｙ）すなわち活動可能に結合されており、それによ
って、前記ＤＮＡ組立て体が該プロモーターの制御下で
のみ前記の外因性ＲＮＡを発現するものであることを特
徴とする前記ＤＮＡ組立て体が提供される。
本発明の第２の要旨によれば、前記のようなりＮＡ組立
て体を含有するベクター類が提供される。
て体を含有するベクター類が提供される。
該ベクター類は例えばバクテリオファージ又はプラスミ
ド類であってもよい。
ド類であってもよい。
また、本発明の第３の要旨によればトウモロコシ植物由
来のＣＡＢ蛋白質遺伝子すなわちクロロフィルａ／ｂ結
合蛋白質遺伝子から単離された、プロモーターをトウモ
ロコシにとって外因性であるＲＮＡをコードするＤＮＡ
に作動的に結合させて成るところの該プロモーターを含
有する組換えＤＮＡを、植物染色体中に安定的に組込ん
だ植物染色体であり、それによって、前記の外因性ＲＮ
Ａが前記プロモーターの制御下でのみ発現されるように
してあることを特徴とする植物染色体（ゲノムともいう
）が提供される。
来のＣＡＢ蛋白質遺伝子すなわちクロロフィルａ／ｂ結
合蛋白質遺伝子から単離された、プロモーターをトウモ
ロコシにとって外因性であるＲＮＡをコードするＤＮＡ
に作動的に結合させて成るところの該プロモーターを含
有する組換えＤＮＡを、植物染色体中に安定的に組込ん
だ植物染色体であり、それによって、前記の外因性ＲＮ
Ａが前記プロモーターの制御下でのみ発現されるように
してあることを特徴とする植物染色体（ゲノムともいう
）が提供される。
更にまた本発明の第４の要旨によれば、ＣＡＢ蛋白質遺
伝子すなわちクロロフィルａ／ｂ結合蛋白質遺伝子から
単離された、プロモーターをトウモロコシにとって外因
性であるＲＮＡの発現をコードするＤＮＡに作動的に結
合させて成るところの該プロモーターを含有する組換え
ＤＮＡを、植物の染色体中に安定的に組込んだ植物であ
って、それによって、前記ＲＮＡが植物の緑色組織中の
みに限って発現されることを特徴とする植物が提供され
る。
伝子すなわちクロロフィルａ／ｂ結合蛋白質遺伝子から
単離された、プロモーターをトウモロコシにとって外因
性であるＲＮＡの発現をコードするＤＮＡに作動的に結
合させて成るところの該プロモーターを含有する組換え
ＤＮＡを、植物の染色体中に安定的に組込んだ植物であ
って、それによって、前記ＲＮＡが植物の緑色組織中の
みに限って発現されることを特徴とする植物が提供され
る。
本発明のトランスジェニック植物によって産出された外
因性ＲＮＡは、機能性蛋白質、例えば外因性の蛋白質、
例えば細菌バシラス・スリンジエンシス」ｌ江月且Ｌ
功μｍ旺ｊｙ匡吐のδ−エンドトキシンのような殺虫性
の蛋白質をコードし得る。
因性ＲＮＡは、機能性蛋白質、例えば外因性の蛋白質、
例えば細菌バシラス・スリンジエンシス」ｌ江月且Ｌ
功μｍ旺ｊｙ匡吐のδ−エンドトキシンのような殺虫性
の蛋白質をコードし得る。
また、上記の外因性ＲＮＡは植物細胞内で幾つかの他の
機能を有し得る。例えば、上記外因性ＲＮＡは、アンチ
センスＲＮＡであることができる。すなわちこのアンチ
センスＲＮＡとは、植物細胞によって天然に産生された
内因性のＲＮＡに対しく塩基対の仕方や塩基配列の方向
の点において）相補的（ｃｏｍｐ−１ｅｍｅｎ ｔａｒ
ｙ）であるＲＮＡである。
機能を有し得る。例えば、上記外因性ＲＮＡは、アンチ
センスＲＮＡであることができる。すなわちこのアンチ
センスＲＮＡとは、植物細胞によって天然に産生された
内因性のＲＮＡに対しく塩基対の仕方や塩基配列の方向
の点において）相補的（ｃｏｍｐ−１ｅｍｅｎ ｔａｒ
ｙ）であるＲＮＡである。
そのようなアンチセンスＲＮＡは、天然に産生ずるＲＮ
Ａの、蛋白質翻訳を選択的に阻害することが認められる
。このような訳けで本発明は植物緑色組織における外来
種（ｆｏｒｅｉｇｎ）の蛋白質の生成を促進する手段ば
かりではなく、天然に存在する蛋白質の生成を減少又は
阻害する手段を提供する。植物緑色組織中で生成され得
る外来種の蛋白質の例としては、除草剤、カビ菌及び昆
虫を含めた外部要因による被害から植物を防護する酵素
類が挙げられる。例えば、緑色組織は、Ａｒｏ Ａ耐性
遺伝子を組込むことによってグリホセートのような除草
剤に対して耐性に改質し得、またアセトラクテート合成
酵素（ＡＬＳ）耐性遺伝子を組込むことによってイミダ
シリン系除草剤やスルホンアミド系除草剤のような除草
剤に対し耐性に改質し得る。
Ａの、蛋白質翻訳を選択的に阻害することが認められる
。このような訳けで本発明は植物緑色組織における外来
種（ｆｏｒｅｉｇｎ）の蛋白質の生成を促進する手段ば
かりではなく、天然に存在する蛋白質の生成を減少又は
阻害する手段を提供する。植物緑色組織中で生成され得
る外来種の蛋白質の例としては、除草剤、カビ菌及び昆
虫を含めた外部要因による被害から植物を防護する酵素
類が挙げられる。例えば、緑色組織は、Ａｒｏ Ａ耐性
遺伝子を組込むことによってグリホセートのような除草
剤に対して耐性に改質し得、またアセトラクテート合成
酵素（ＡＬＳ）耐性遺伝子を組込むことによってイミダ
シリン系除草剤やスルホンアミド系除草剤のような除草
剤に対し耐性に改質し得る。
植物緑色組織において、該組織を昆虫による襲撃に対し
て抵抗性にする蛋白質の生成を促進できることが特に有
用である。この目的に特に有用な蛋白質は、チオニン類
、キチナーゼ類、プロテアーゼ阻害剤及びバシラス・ス
リンジエンシスのδ−エンドトキシンである。
て抵抗性にする蛋白質の生成を促進できることが特に有
用である。この目的に特に有用な蛋白質は、チオニン類
、キチナーゼ類、プロテアーゼ阻害剤及びバシラス・ス
リンジエンシスのδ−エンドトキシンである。
その生成が減少又は制限され得る天然蛋白質の例は、多
数ある。その中に本発明のＤＮＡ組立て体を組込み得る
植物の具体例としては、単子葉植物類と双子葉植物類の
両方が挙げられる。現在、単子葉植物類の形質転換法が
幾つか報告されているが、その成功は限られている。そ
れにもかかわらず、上記のような技術が間もなく利用で
きるようになることは必然的であるように思われ、従っ
て種々様々な耕種学的に重要な単子葉植物、例えば小麦
、大麦、トウモロコシ、ライ麦、オート麦。
数ある。その中に本発明のＤＮＡ組立て体を組込み得る
植物の具体例としては、単子葉植物類と双子葉植物類の
両方が挙げられる。現在、単子葉植物類の形質転換法が
幾つか報告されているが、その成功は限られている。そ
れにもかかわらず、上記のような技術が間もなく利用で
きるようになることは必然的であるように思われ、従っ
て種々様々な耕種学的に重要な単子葉植物、例えば小麦
、大麦、トウモロコシ、ライ麦、オート麦。
サトウダイコン、モロコシ、アルファルファ、牧草類及
び稲を含めた単子葉植物中に本発明のＤＮＡ組立て体を
組込むことが可能であろう。トウモロコシが特に好適で
ある。
び稲を含めた単子葉植物中に本発明のＤＮＡ組立て体を
組込むことが可能であろう。トウモロコシが特に好適で
ある。
双子葉植物の一般的な形質転換法（−船釣にアグロバク
テリウム・ツメファシェンス７ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓ又はこの微生物由来の物質の使用による〕
が現在利用できる技術であって、例えばタバコ、ジャガ
イモ、トマトサトウダイコン、及びキャベツやナタネの
ような他のブラシカ■■用江ｕ種、綿、落花生、大豆及
びヒマワリを形質転換することによって本発明による新
規植物を作るのに利用し得る。
テリウム・ツメファシェンス７ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓ又はこの微生物由来の物質の使用による〕
が現在利用できる技術であって、例えばタバコ、ジャガ
イモ、トマトサトウダイコン、及びキャベツやナタネの
ような他のブラシカ■■用江ｕ種、綿、落花生、大豆及
びヒマワリを形質転換することによって本発明による新
規植物を作るのに利用し得る。
本発明の実施例及びそれに関連した試験例を以下の図面
を参考に詳しく説明する。
を参考に詳しく説明する。
すなわち、第１図は本発明による３種のＤＮＡ組立て体
ｇｃＡＢ４８． ｐＣＡ８４Ｂ及びｐＣＡ８４８．１の
制限酵素切断地図を図式的に示す。
ｇｃＡＢ４８． ｐＣＡ８４Ｂ及びｐＣＡ８４８．１の
制限酵素切断地図を図式的に示す。
第２図は前記ＤＮＡ組立て体ｐＣＡ８４８．１のＸｂａ
ｌ／Ｎｃｏｌプロモーター断片の塩基配列を示す。
ｌ／Ｎｃｏｌプロモーター断片の塩基配列を示す。
第３図はＤＮＡ組立て体ｐＣＡ８４８．１中のＣＡＢ遺
伝子の構造を示す。
伝子の構造を示す。
第４図はＤＮＡ組立て体ｐＣＡ８４８．１とプラスミド
ｐＴＡＫ３からプラスミドｐｃＧ１とプラスミドｐＣＧ
２を構築する方法を図解的に示す。
ｐＴＡＫ３からプラスミドｐｃＧ１とプラスミドｐＣＧ
２を構築する方法を図解的に示す。
第５図はプラスミドｐＯシ１の構築に使用した合成オリ
ゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
ゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
第６図はプラスミドｐｃＢＴ１ とプラスミドｐＣＢＴ
２の合成を図解的に例示する。
２の合成を図解的に例示する。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
温室栽培したトウモロコシの品種系統ＢＥＩＯ（Ｈｏｌ
ｄｅｎｓ から市販の適当なホモ接合性トウモロコシ
系統）の植物全体からＤＮＡ全部を抽出した。
ｄｅｎｓ から市販の適当なホモ接合性トウモロコシ
系統）の植物全体からＤＮＡ全部を抽出した。
このＤＮＡの抽出にはＭｕｒｒａｙとＴｈｏｍｐｓｏｎ
の方法（後記の参考文献１４）を使用した。Ｍａｎｉａ
ｔｉｓらによって記載されたようにして（後記の参考文
献１５）ＤＮＡを精製し、制限酵素５ａｕ３Ａで部分的
に特定部位を切断した。ショ糖密度勾配分離法により約
２０Ｋｂの複数のＤＮＡ断片を単離し、次いでそれらＤ
ＮＡ断片を制限酵素Ｂａｍ）ＩＩで切断しておいたファ
ージベクターＥＭＢＬ３中へ組込みクローニングした。
の方法（後記の参考文献１４）を使用した。Ｍａｎｉａ
ｔｉｓらによって記載されたようにして（後記の参考文
献１５）ＤＮＡを精製し、制限酵素５ａｕ３Ａで部分的
に特定部位を切断した。ショ糖密度勾配分離法により約
２０Ｋｂの複数のＤＮＡ断片を単離し、次いでそれらＤ
ＮＡ断片を制限酵素Ｂａｍ）ＩＩで切断しておいたファ
ージベクターＥＭＢＬ３中へ組込みクローニングした。
得られたゲノムライブラリーを標準条件（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓによる）下でに８０３バクテリア細胞に取込ませて
培養した。
ｉｓによる）下でに８０３バクテリア細胞に取込ませて
培養した。
１．２゛ツム−イブ−１−の
前記ゲノムライブラリー（１０５個のプラーク）を、公
表された小麦のＣＡＢ遺伝子配列（熟成ＣＡＢ蛋白質の
アミノ酸５５〜６３と２０２〜２０７を配置する）に対
応する合成オリゴヌクレオチド類とキュウリのＣＡＢの
ｃＤＮＡ （後記参考文献８）とを用いて選別、採取し
た。
表された小麦のＣＡＢ遺伝子配列（熟成ＣＡＢ蛋白質の
アミノ酸５５〜６３と２０２〜２０７を配置する）に対
応する合成オリゴヌクレオチド類とキュウリのＣＡＢの
ｃＤＮＡ （後記参考文献８）とを用いて選別、採取し
た。
オリゴヌクレオチド類のハイブリダイゼーション条件は
２ Ｘ５ＳＣ、４２°Ｃであり、４２°Ｃで２ｘｓｓｃ
中での洗浄を伴った。キュウリのＣＡＢのｃＤＮＡは次
の条件下：すなわち２ Ｘ５ＳＣ、５５℃でハイブリダ
イズした。ハイブリダイゼーションとプラーク精製を数
回行なった後に、小麦のオリゴヌクレオチド類とキュウ
リのＣＡＢ ｃＤＮＡの両方にハイブリダイズしたとこ
ろの約２０Ｋｂの１個のクローンを単離した。このクロ
ーンをｇＣＡ８４８と命名した。このクローンの制限酵
素地図を第１図に示した。第１図には別の分析用に形成
されたサブクローン類も示す。また、第１図において、
プラスミドｐｃＡＢ４８は自由分譲されるプラスミドｐ
ＢＲ３２２中に上記クローンｇＣＡ８４Ｂの１３Ｋｂの
ｔｉｃｏＲＩ断片をクローニングすることによって得ら
れたプラスミドである。プラスミドｐＣＡ８４８．１は
自由分譲されるプラスミドｐＵｃ１９中に上記クローン
ｇＣＡ８４８の２．８ＫｂのＰｓｔＩ断片をクローニン
グすることによって得られたプラスミドである。
２ Ｘ５ＳＣ、４２°Ｃであり、４２°Ｃで２ｘｓｓｃ
中での洗浄を伴った。キュウリのＣＡＢのｃＤＮＡは次
の条件下：すなわち２ Ｘ５ＳＣ、５５℃でハイブリダ
イズした。ハイブリダイゼーションとプラーク精製を数
回行なった後に、小麦のオリゴヌクレオチド類とキュウ
リのＣＡＢ ｃＤＮＡの両方にハイブリダイズしたとこ
ろの約２０Ｋｂの１個のクローンを単離した。このクロ
ーンをｇＣＡ８４８と命名した。このクローンの制限酵
素地図を第１図に示した。第１図には別の分析用に形成
されたサブクローン類も示す。また、第１図において、
プラスミドｐｃＡＢ４８は自由分譲されるプラスミドｐ
ＢＲ３２２中に上記クローンｇＣＡ８４Ｂの１３Ｋｂの
ｔｉｃｏＲＩ断片をクローニングすることによって得ら
れたプラスミドである。プラスミドｐＣＡ８４８．１は
自由分譲されるプラスミドｐＵｃ１９中に上記クローン
ｇＣＡ８４８の２．８ＫｂのＰｓｔＩ断片をクローニン
グすることによって得られたプラスミドである。
を標的とするのに必要な３２個のアミノ酸からなるリー
ダー配列を含む２６４個のアミノ酸からなる一つの完全
なＣＡＢ遺伝子をコードする。上記ＣＡＢ遺伝子は、所
要とされる植物緑色組織中の特異的な発現を行うのに十
分な１．９Ｋｂの５′−上流配列も含んでいる。
ダー配列を含む２６４個のアミノ酸からなる一つの完全
なＣＡＢ遺伝子をコードする。上記ＣＡＢ遺伝子は、所
要とされる植物緑色組織中の特異的な発現を行うのに十
分な１．９Ｋｂの５′−上流配列も含んでいる。
ズしているＰｓｔＩ断片をＭ１３ベクター中にサブクロ
ーンして塩基配列分析に供した。この分析はＳａｎｇｅ
ｒらの方法（後記の参考文献１６）で行なった。この遺
伝子の完全な配列と、上記Ｐｓｔｌ断片上に含まれるそ
の５′及び３′フランキング領域とが配列決定された。
ーンして塩基配列分析に供した。この分析はＳａｎｇｅ
ｒらの方法（後記の参考文献１６）で行なった。この遺
伝子の完全な配列と、上記Ｐｓｔｌ断片上に含まれるそ
の５′及び３′フランキング領域とが配列決定された。
第２図にＸｂａｌ／Ｎｃｏｌ切断部位の間のＣＡＢプロ
モーター断片の塩基配列を示す。第３図にプラスミドｐ
ＣＡ８４８．１中にコードされているＣＡＢ遺伝子の図
式的な表示を示す、この第３図に示されたＣＡＢ遺伝子
は、葉緑体（クロロプラスト）膜前記実施例１の１．３
で得た完全なＣＡＢ遺伝子の全体を含有する２、８Ｋｂ
のＰｓｔｌ断片を、普通のクローニング用ベクターｐＵ
ｃ１９中にサブクローンしてベクターｐＣＡＢを得た。
モーター断片の塩基配列を示す。第３図にプラスミドｐ
ＣＡ８４８．１中にコードされているＣＡＢ遺伝子の図
式的な表示を示す、この第３図に示されたＣＡＢ遺伝子
は、葉緑体（クロロプラスト）膜前記実施例１の１．３
で得た完全なＣＡＢ遺伝子の全体を含有する２、８Ｋｂ
のＰｓｔｌ断片を、普通のクローニング用ベクターｐＵ
ｃ１９中にサブクローンしてベクターｐＣＡＢを得た。
このプラスミドｐＣＡＢから、ＣＡＢプロモーターはＸ
ｂａ Ｉ −Ｎｃｏ Ｉ断片としてこの断片に乗せて都
合良く単離できる。このＸｂａＩ−Ｎｃ。
ｂａ Ｉ −Ｎｃｏ Ｉ断片としてこの断片に乗せて都
合良く単離できる。このＸｂａＩ−Ｎｃ。
Ｉ断片としてのＤＮＡ断片は１．ＯＫｂの５′上流領域
（すなわちプロモーター）と、ＣＡＢ ｍＲＮＡの５′
未翻訳領域の塩基６０個と、プレーＣＡＢポリペプチド
配列のアミノ酸類をコードする塩基１８個とを含む。上
記のプロモーター断片は翻訳用融合（ｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎｓ ）の作製のために利用で
きる。
（すなわちプロモーター）と、ＣＡＢ ｍＲＮＡの５′
未翻訳領域の塩基６０個と、プレーＣＡＢポリペプチド
配列のアミノ酸類をコードする塩基１８個とを含む。上
記のプロモーター断片は翻訳用融合（ｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎｓ ）の作製のために利用で
きる。
バクテリアの酵素β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝
子に対するＣＡＢプロモーターの翻訳用融合（ｔｒａｎ
ｓｌａｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ）は、プラスミドｐ
ＣＡＢ４８．１を制限酵素Ｎｃｏ Ｉで切断し、次いで
その切断した末端を、ＤＮＡポリメラーゼ・フレノウ（
Ｋｌｅｎｏｗ）断片Ａを用いる標準条件下でプラント末
端化（ｆｉｌｉｎｇｉｎ）することによって行なった。
子に対するＣＡＢプロモーターの翻訳用融合（ｔｒａｎ
ｓｌａｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ）は、プラスミドｐ
ＣＡＢ４８．１を制限酵素Ｎｃｏ Ｉで切断し、次いで
その切断した末端を、ＤＮＡポリメラーゼ・フレノウ（
Ｋｌｅｎｏｗ）断片Ａを用いる標準条件下でプラント末
端化（ｆｉｌｉｎｇｉｎ）することによって行なった。
次いで、得られたプラスミドを制限酵素Ｘｂａ Ｉで切
断した。切断消化物をアガロースゲル電気泳動によって
分離分画した後に、１．２Ｋｂのプロモータ断片を単離
採取し、フェノール抽出とエタノール沈澱法により精製
した。次い〜でこの１．２にｂ断片を、制限酵素Ｘｈｏ
ｌとＳｍａ ｒで切断しであるプラスミドｐＴＡＫ３
（後記の参考文献１７）中にクローンした。この操作
によって、プラスミドｐｃＧ１、すなわちバイナリ−な
植物形質転換用ベクターを得た。このようにして得られ
たＣＡＢ−ＧＵＳ発現カセットは、第４図に示したよう
に制限酵素旧ｎｄＩＩ［とＥｃｏＲＩで切断する手段を
用いて、自由分譲されるプラスミドｐＵｃ１８に容易に
移入、連結できた。これで得られたプラスミドはｐＣＧ
２と命名した。
断した。切断消化物をアガロースゲル電気泳動によって
分離分画した後に、１．２Ｋｂのプロモータ断片を単離
採取し、フェノール抽出とエタノール沈澱法により精製
した。次い〜でこの１．２にｂ断片を、制限酵素Ｘｈｏ
ｌとＳｍａ ｒで切断しであるプラスミドｐＴＡＫ３
（後記の参考文献１７）中にクローンした。この操作
によって、プラスミドｐｃＧ１、すなわちバイナリ−な
植物形質転換用ベクターを得た。このようにして得られ
たＣＡＢ−ＧＵＳ発現カセットは、第４図に示したよう
に制限酵素旧ｎｄＩＩ［とＥｃｏＲＩで切断する手段を
用いて、自由分譲されるプラスミドｐＵｃ１８に容易に
移入、連結できた。これで得られたプラスミドはｐＣＧ
２と命名した。
上記のＣＡＢプロモーターは、殺虫性遺伝子例えばバシ
ラス・スリンジエンシスＢ、ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓ）由来のδ−エンドトキシン遺伝子を発現させるのに
使用し得る。これは、本例では、バシラス・スリンジエ
ンシスＨＤ７３菌株（米国農務省から入手できる）から
単離した遺伝子の融合（ｆｕｓｉｏｎ）によって例証さ
れる。しかしながら、代わりに他のバシラス・スリジエ
ンシス−建工抽且己工ｌμ到直遺伝子を使用してもよい
。中間のベクターｐＯＬ１が第５図に示した構造の合成
オリゴヌクレオチドをプラスミドｐｔｌｃ１Ｂ中にクロ
ーニングすることによって作製された。プラスミドｐＪ
ＲＤ２ （後記参照）由来であって末端切除（ｔｒｕ
ｎｃａｔｅｄ）されたバシラス・スリジエンシス（Ｂ、
ｔ）遺伝子を、このベクターｐＯＬｌ中にクローンした
。これの操作を第６図に示もプラスミドｐＪＲＤ２は、
δ−エンドトキシン遺伝子のＮ−末端部のＮ−末端部を
切断し、２．２Ｋｂの叶ａＩ断片として切出してそして
この断片をプラスミド−ｐＪＲ１中のＣａＭＶ３５Ｓプ
ロモーターの後方にクローニングすることによって作製
された（後記の参考文献２０）、この断片を含有するプ
ラスミド類は、それらで形質転換されて誘導された細菌
株や植物に殺虫性を付与することが既に知見されている
。
ラス・スリンジエンシスＢ、ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓ）由来のδ−エンドトキシン遺伝子を発現させるのに
使用し得る。これは、本例では、バシラス・スリンジエ
ンシスＨＤ７３菌株（米国農務省から入手できる）から
単離した遺伝子の融合（ｆｕｓｉｏｎ）によって例証さ
れる。しかしながら、代わりに他のバシラス・スリジエ
ンシス−建工抽且己工ｌμ到直遺伝子を使用してもよい
。中間のベクターｐＯＬ１が第５図に示した構造の合成
オリゴヌクレオチドをプラスミドｐｔｌｃ１Ｂ中にクロ
ーニングすることによって作製された。プラスミドｐＪ
ＲＤ２ （後記参照）由来であって末端切除（ｔｒｕ
ｎｃａｔｅｄ）されたバシラス・スリジエンシス（Ｂ、
ｔ）遺伝子を、このベクターｐＯＬｌ中にクローンした
。これの操作を第６図に示もプラスミドｐＪＲＤ２は、
δ−エンドトキシン遺伝子のＮ−末端部のＮ−末端部を
切断し、２．２Ｋｂの叶ａＩ断片として切出してそして
この断片をプラスミド−ｐＪＲ１中のＣａＭＶ３５Ｓプ
ロモーターの後方にクローニングすることによって作製
された（後記の参考文献２０）、この断片を含有するプ
ラスミド類は、それらで形質転換されて誘導された細菌
株や植物に殺虫性を付与することが既に知見されている
。
次いで、ベクターｐＯＬ１を制限酵素ＸｂａｌとＮｃｏ
ｌで消化して切断し、そしてプラスミドｐｃＡ８４８．
１由来であってＸｂａｌ／ＮｃｏＩで切断された１、Ｉ
Ｋｂのプロモーター断片′を、前記のベクターｐＯＬ１
のＸｂａｌ／Ｎｃｏｌ切断片中に〜クローンした。これ
によりプラスミドｐｃＯＬ１を得た。プラスミドｐｃＯ
Ｌ１を制限酵素Ｃ１ａｌと旧ｎｄｌ［Ｉで消化し、それ
で得られた切断片を、他方、プラスミドｐＪＲＤ２の制
限酵素器ｎｄＩ［とＣ１ａｌによる部分消化によって該
プラスミドｐＪＲＤ２から単離した２、２Ｋｂの断片中
にクローンすることによって、プラスミドｐｃＢＴ１を
作製させた。その後、プラスミドｐｃＢＴ１から３．６
ＫｂのＣＡＢ−ａｔ−ｎｏｓ断片を単離し、次いで制限
酵素器ｎｄＩ［とＥｃｏＲＩ （部分的に）で消化し
、バイナリ−ベクターＢ１ｎ１９中にクローンすること
によって、プラスミドｐｃＢＴ２を調製した。
ｌで消化して切断し、そしてプラスミドｐｃＡ８４８．
１由来であってＸｂａｌ／ＮｃｏＩで切断された１、Ｉ
Ｋｂのプロモーター断片′を、前記のベクターｐＯＬ１
のＸｂａｌ／Ｎｃｏｌ切断片中に〜クローンした。これ
によりプラスミドｐｃＯＬ１を得た。プラスミドｐｃＯ
Ｌ１を制限酵素Ｃ１ａｌと旧ｎｄｌ［Ｉで消化し、それ
で得られた切断片を、他方、プラスミドｐＪＲＤ２の制
限酵素器ｎｄＩ［とＣ１ａｌによる部分消化によって該
プラスミドｐＪＲＤ２から単離した２、２Ｋｂの断片中
にクローンすることによって、プラスミドｐｃＢＴ１を
作製させた。その後、プラスミドｐｃＢＴ１から３．６
ＫｂのＣＡＢ−ａｔ−ｎｏｓ断片を単離し、次いで制限
酵素器ｎｄＩ［とＥｃｏＲＩ （部分的に）で消化し
、バイナリ−ベクターＢ１ｎ１９中にクローンすること
によって、プラスミドｐｃＢＴ２を調製した。
多くの場合、転写用融合体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ
ｎａｌｆｕｓｉｏｎ）の中における外来遺伝子の発現を
駆動させるのにＣＡＢプロモーターが必要とされ得る。
ｎａｌｆｕｓｉｏｎ）の中における外来遺伝子の発現を
駆動させるのにＣＡＢプロモーターが必要とされ得る。
このＣＡＢプロモーター断片は、制限酵素Ｘｂａ ｌと
部分的に５ａｕ３Ａとで切断した後に、Ｘｂａｌ−Ｓａ
ｕ３Ａ断片として、この断片に乗っている形で単離でき
る。上記５ａｕ３Ａ切断部位はメチオニン開始コドンか
ら１２塩基及び７塩基の所に位置する。
部分的に５ａｕ３Ａとで切断した後に、Ｘｂａｌ−Ｓａ
ｕ３Ａ断片として、この断片に乗っている形で単離でき
る。上記５ａｕ３Ａ切断部位はメチオニン開始コドンか
ら１２塩基及び７塩基の所に位置する。
２．５ ＧＵＳ に るＣＡＢプロモー −
〇 へＣＡＢプロモーター断片は、ＧＩＪＳを発現する
ベクターｐＴＡＫ１／３ （後記参考文献１７）のポ
リリンカー領域に在るＸｂａｌ−Ｂａｍ旧切断部位中に
挿入することによって、該ｃｕｓ発現性ベクターｐＴＡ
Ｋｌ／３中にクローンできる。
〇 へＣＡＢプロモーター断片は、ＧＩＪＳを発現する
ベクターｐＴＡＫ１／３ （後記参考文献１７）のポ
リリンカー領域に在るＸｂａｌ−Ｂａｍ旧切断部位中に
挿入することによって、該ｃｕｓ発現性ベクターｐＴＡ
Ｋｌ／３中にクローンできる。
２．６ Ｂ、ｔ、 ’ に るＣＡＢプロモー
−の金 上記のＸｂａｌ−Ｓａｕ３Ａ切断断片として単離したＣ
ＡＢプロモーターをプラスミドｐＵｃ１９中にクローン
した。この際、プラスミドｐＵｃ１９は制限酵素Ｂａｍ
旧とＸｂａ Ｉで切断して置く。このようにしてプラス
ミドｐＴｃＡＢ１を得た。プラスミドｐＪＲＤ２を制限
酵素Ｈｉｎｄｌｌｌで切断し、制限酵素Ｃ１ａｌで部分
的に切断することによって、該プラスミドｐＪＲＤ２か
らＢ、 ｔ、遺伝子を切出して得た。得られたＢ、 ｔ
、遺伝子とｎｏｓターミネータ−とを含んだ２．４Ｋｂ
の断片は、タレノウポリメラーゼ断片Ａを用いてプラン
ト末端化した。この断・片を、制限酵素Ｓｍａ Ｉで切
断して置いたプラスミドＩ）ＴＣＡＢＩ中にクローンす
ることによって、プラスミドｐＴｃＢＴ１を得た。この
組換えプラスミドは転写用融合物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔｉｏｎａｌｆｕｓｉｏｎ）であり、これは直接的なり
ＮＡ形質転換ベクターである。アグロバクテリウムＡ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 仲介による形質転換を行う
のに用いるに際してプラスミドｐＴｃＢＴ１をバイナリ
−ベクターＢ１ｎ１９に移入、組込むために、該プラス
ミドｐＴｃＢＴ１を制限酵素ＥｃｏＲ■と旧ｎｄＩ［［
で切断、した。これで得られた断片をバイナリ−ベクタ
ーＢ１ｎ１Ｑ中にクローンする。
−の金 上記のＸｂａｌ−Ｓａｕ３Ａ切断断片として単離したＣ
ＡＢプロモーターをプラスミドｐＵｃ１９中にクローン
した。この際、プラスミドｐＵｃ１９は制限酵素Ｂａｍ
旧とＸｂａ Ｉで切断して置く。このようにしてプラス
ミドｐＴｃＡＢ１を得た。プラスミドｐＪＲＤ２を制限
酵素Ｈｉｎｄｌｌｌで切断し、制限酵素Ｃ１ａｌで部分
的に切断することによって、該プラスミドｐＪＲＤ２か
らＢ、 ｔ、遺伝子を切出して得た。得られたＢ、 ｔ
、遺伝子とｎｏｓターミネータ−とを含んだ２．４Ｋｂ
の断片は、タレノウポリメラーゼ断片Ａを用いてプラン
ト末端化した。この断・片を、制限酵素Ｓｍａ Ｉで切
断して置いたプラスミドＩ）ＴＣＡＢＩ中にクローンす
ることによって、プラスミドｐＴｃＢＴ１を得た。この
組換えプラスミドは転写用融合物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔｉｏｎａｌｆｕｓｉｏｎ）であり、これは直接的なり
ＮＡ形質転換ベクターである。アグロバクテリウムＡ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 仲介による形質転換を行う
のに用いるに際してプラスミドｐＴｃＢＴ１をバイナリ
−ベクターＢ１ｎ１９に移入、組込むために、該プラス
ミドｐＴｃＢＴ１を制限酵素ＥｃｏＲ■と旧ｎｄＩ［［
で切断、した。これで得られた断片をバイナリ−ベクタ
ーＢ１ｎ１Ｑ中にクローンする。
盗
前記実施例２の２．２に記載のベクターｐｃＧ１ （第
４図）は、バイナリ−な植物形質転換ベクターＢ１ｎ１
９を基体とするものであり、このベクターｐｃＧ１をト
リペアレンタル・マツチング（ｔｒ １ｐａｒｅｎ ｔ
ａ １憤ａｔｔｎｇ）法によって細菌アゲロバクチリア
狐肛トｂＢｃｔｅｒｉａ）に組入れた。次いで該バクテ
リアの培養細胞を用いて、標準的な方法（後記の参考文
献１日）に従ってタバコ植物中にベクターｐｃＧ１のＩ
ＩＮＡを組込む。カナマイシン含有培地で選抜した後に
、形質転換されたタバコ植物が産生された（欧州特許出
願第２７０２４８号明細書に記載の方法を利用）。
４図）は、バイナリ−な植物形質転換ベクターＢ１ｎ１
９を基体とするものであり、このベクターｐｃＧ１をト
リペアレンタル・マツチング（ｔｒ １ｐａｒｅｎ ｔ
ａ １憤ａｔｔｎｇ）法によって細菌アゲロバクチリア
狐肛トｂＢｃｔｅｒｉａ）に組入れた。次いで該バクテ
リアの培養細胞を用いて、標準的な方法（後記の参考文
献１日）に従ってタバコ植物中にベクターｐｃＧ１のＩ
ＩＮＡを組込む。カナマイシン含有培地で選抜した後に
、形質転換されたタバコ植物が産生された（欧州特許出
願第２７０２４８号明細書に記載の方法を利用）。
このようにＧＵＳ発現の遺伝子のカセットモジュールで
形質転換されであるタバコ植物について、標準的な方法
により室温で該植物のＣＵＳ活性を測定し評価した。
形質転換されであるタバコ植物について、標準的な方法
により室温で該植物のＣＵＳ活性を測定し評価した。
得られた結果を以下の第３．１表に示す、その結果ハ、
用イたトウモロコシのＣＡＢ遺伝子プロモーターが上記
の形質転換されたタバコ植物中で外来性遺伝子であるＧ
ＵＳ遺伝子の発現をさせることを示す。
用イたトウモロコシのＣＡＢ遺伝子プロモーターが上記
の形質転換されたタバコ植物中で外来性遺伝子であるＧ
ＵＳ遺伝子の発現をさせることを示す。
１衷
＊Ｆｕは蛍光の単位を表わす。
３．２ バコ へのべ −ＣＢｒ４の上記３．１
に記載されると同様に、タバコ植物の形質転換を、実施
例２の２．３で得たベクターｐＣＢＴ２を用いて反復し
た。実施例２の２．３の細菌Ｂ、 ｔ。
に記載されると同様に、タバコ植物の形質転換を、実施
例２の２．３で得たベクターｐＣＢＴ２を用いて反復し
た。実施例２の２．３の細菌Ｂ、 ｔ。
のδ−エンドトキシン遺伝子の発現カセットを用いて形
質転換されたタバコ植物を、供試昆虫りし１ｏｔｈｉｓ
ｖｉｒｅｓｅｎｓ （ガの１種）の感染に耐える能
力について試験した。６匹の第１令幼虫を、形質転換し
たタバコ植物の１本毎に置いた。半定量的（ｓｅｍｉ−
ｑｕａｎｔａｔｉｖｅ）試験で食害された葉の面積を（
被食葉面積）評価した。
質転換されたタバコ植物を、供試昆虫りし１ｏｔｈｉｓ
ｖｉｒｅｓｅｎｓ （ガの１種）の感染に耐える能
力について試験した。６匹の第１令幼虫を、形質転換し
たタバコ植物の１本毎に置いた。半定量的（ｓｅｍｉ−
ｑｕａｎｔａｔｉｖｅ）試験で食害された葉の面積を（
被食葉面積）評価した。
最初の生物検定は２４本の植物について、行ない、各個
の植物に６匹のＨｅ１ｉｏｔｈｉｓ幼虫を放飼させて行
なった。得られた結果を以下の第３．２表に示す。
の植物に６匹のＨｅ１ｉｏｔｈｉｓ幼虫を放飼させて行
なった。得られた結果を以下の第３．２表に示す。
得られた結果は、形質転換したタバコ植物は同じ大きさ
の対照植物よりも食害の程度がかなり少ないことを示す
。例えば、植物Ｎα２１とＮα３１では、食−書は対照
植物の食害のわずか３３％にすぎない。
の対照植物よりも食害の程度がかなり少ないことを示す
。例えば、植物Ｎα２１とＮα３１では、食−書は対照
植物の食害のわずか３３％にすぎない。
供試植物の所与の本数当りで、相当な程度の保護を示す
植物の割合が意外に高い。従来の経験からみると、供試
植物の２４本のうち約１４本のタバコのみがδ−エンド
キシンの有意な発現を示すであろうと予期されていた。
植物の割合が意外に高い。従来の経験からみると、供試
植物の２４本のうち約１４本のタバコのみがδ−エンド
キシンの有意な発現を示すであろうと予期されていた。
劇的に増大した程度の保護が得られる出現率は６０本の
植物のうちで約１本であろうことも予測されていたが、
事実上は、供試された形質転換タバコ植物のうちで、昆
虫の侵蝕からの保護を劇的に増大されたものはなかった
。
植物のうちで約１本であろうことも予測されていたが、
事実上は、供試された形質転換タバコ植物のうちで、昆
虫の侵蝕からの保護を劇的に増大されたものはなかった
。
３．３ バコの のプロ ブース のタバコの葉肉
細胞のプロトプラストを公知方法（後記の参考文献１９
）に従って調製し、実施例２０２．２で得たプラスミド
ｐＣＧ２のＤＮＡを用いるＰＥＧ仲介によるＤＮＡの取
込み実験にプロトプラストを使用した。前記のＣＡＢ−
プロモーターで駆動されるバクテリア性マーカー遺伝子
（ＧＵＳ）の発現をプロトプラストについて標準方法で
測定した。得られた測定結果はこの系においてトウモロ
コシのＣＡＢプロモーターが極めて効果的にＧＵＳ遺伝
子の発現を駆動させることを示す（第３．３表）。
細胞のプロトプラストを公知方法（後記の参考文献１９
）に従って調製し、実施例２０２．２で得たプラスミド
ｐＣＧ２のＤＮＡを用いるＰＥＧ仲介によるＤＮＡの取
込み実験にプロトプラストを使用した。前記のＣＡＢ−
プロモーターで駆動されるバクテリア性マーカー遺伝子
（ＧＵＳ）の発現をプロトプラストについて標準方法で
測定した。得られた測定結果はこの系においてトウモロ
コシのＣＡＢプロモーターが極めて効果的にＧＵＳ遺伝
子の発現を駆動させることを示す（第３．３表）。
１３３表
ｒＤＮＡなし
ＣａＭＶ３５ｓ−ＧＵＳ
ＣＡＢ−ＧＩＪＳ （明所）
ＣＡＢ−ＧＵＳ （暗所）
４．６
８８．８
１４．５
Ｇ５２０３
ＣＧ２
ＣＧ２
ＰＯＢｏｘ ３Ｌ １３５ 八ｂｂｅｙ Ｒｏ
ａｄ、 Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ９ ８ＤＧ。
ａｄ、 Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ９ ８ＤＧ。
５ｃｏｔｌａｎｄ〕で宿主として大腸菌■匹匡旦往ｈ
聾且）ＴＧ２菌株に組込んで寄託されている。
聾且）ＴＧ２菌株に組込んで寄託されている。
実施例３で産生じた形質転換したタバコ植物からＤＮＡ
を単離し、形質転換した遺伝子組立て体の存在をサザン
・パイプリダイゼーションにより調べた。
を単離し、形質転換した遺伝子組立て体の存在をサザン
・パイプリダイゼーションにより調べた。
本明細書中に挙げたプラスミド類及びＤＮＡ組立て体は
下記の書記的事項でスコツトランドのザ・ナショナル・
コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マ
リン・バクテリア（ｔｈｅ Ｎａｔ−１ｏｎａｌ Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａ
ｎｄ ＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）
Ｔｏｒｒｙ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ５ｔａｔｉｏｎ。
下記の書記的事項でスコツトランドのザ・ナショナル・
コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マ
リン・バクテリア（ｔｈｅ Ｎａｔ−１ｏｎａｌ Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａ
ｎｄ ＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）
Ｔｏｒｒｙ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ５ｔａｔｉｏｎ。
１、ＢｏａｒｄｍａｎらｒＣｕｒｒ、 Ｔｏｐ、 Ｂｉ
ｏｎｅｒｇ、 Ｊ ８．３５２、ＫｉｒｋらｒＴｈｅ
Ｐｌａｓｔｉｄｓ、 Ｈｌｓｅｖｉｅｒ」１−９０（
１９７Ｂ）３、 Ｅｌｌｉｓ ｒＡｎｎ、 Ｒｅ
ｖ、 Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｇ ３２ １１４
、 Ｔｈｏｒｎｂｅｒ ［Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、Ｐ
ｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｊ Ｚ６゜５、 Ｎｅ１
ｓｏｎらｒＪ、ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、 Ｊ ９Ｂ、 ５
５８−５６４（１９８４）５、ｌａｍｐｐａらｒＭｏｌ
、 Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、 Ｊ ５ 、１３７０−１３
７８７、ＣｏｒｕｚｚｉらｒＥＭＢｏ Ｊ、Ｊ ３．１
６７１−１６７９（１９８４）８、 Ｇｒｅｅｎｌａｎ
ｄらｒＰｌａｎｔａＪ １７０ 、９９−１１０（１９
８７）９、 ＰｉｃｈｅｒｓｋｙらｒＰＩａｎｔ Ｍｏ
ｌ旧ｏ１ 」９ 、２０５−２１６１０、 Ｃａ５ｔｒ
ｅｓａｎａらｒＰｌａｎｔ Ｍｏｌ ＢｉｏｌＪｌｌ、
１１７−１２６１１、ＬａｍｐｐａらｒＮａｔｕｒｅ
Ｊ３１６．７５０−７５２（１９８５）１２、 Ｓｉｍ
ｐｓｏｎらｒＮａｔｕｒｅＪ３２３．５５１−５５４（
１９８６）１３、 ＮａｇｙらｒＥＭＢＯＪ、Ｊ ６．
２５３７−２５４２（１９８７）１４、 Ｍｕｒｒａｙ
及びＴｈｏｍｐｓｏｎ ’ＮＡＲＪ ８，４３２１−４
３２５１５、 Ｍａｎｉａｔｉｓらｒｃｌｏｎｉｎｇ
Ｍａｎｕａｌ」（１９８２）１６、ＳａｎｇｅｒらｒＰ
ＮＡＳ、 ７４．５４６３−５４６７（１９７７）１７
、 ＪｅｆｆｅｒｓｏｎらｒＥＭＢｏ ＪＪ （１’９
８７）１８、 Ｂｅｖａｎ ’ＮＡＲＪ １２．８７１
１−８７２１（１９８４）１９、Ｎｅｇｒｕｔｉｕらｒ
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｊ ８ 、３６３−３
７３２０、ＥＰＡ ２７０２４８（ＩＣＩ）上記文献の
記載は本明細書において参照される。
ｏｎｅｒｇ、 Ｊ ８．３５２、ＫｉｒｋらｒＴｈｅ
Ｐｌａｓｔｉｄｓ、 Ｈｌｓｅｖｉｅｒ」１−９０（
１９７Ｂ）３、 Ｅｌｌｉｓ ｒＡｎｎ、 Ｒｅ
ｖ、 Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｇ ３２ １１４
、 Ｔｈｏｒｎｂｅｒ ［Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、Ｐ
ｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｊ Ｚ６゜５、 Ｎｅ１
ｓｏｎらｒＪ、ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、 Ｊ ９Ｂ、 ５
５８−５６４（１９８４）５、ｌａｍｐｐａらｒＭｏｌ
、 Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、 Ｊ ５ 、１３７０−１３
７８７、ＣｏｒｕｚｚｉらｒＥＭＢｏ Ｊ、Ｊ ３．１
６７１−１６７９（１９８４）８、 Ｇｒｅｅｎｌａｎ
ｄらｒＰｌａｎｔａＪ １７０ 、９９−１１０（１９
８７）９、 ＰｉｃｈｅｒｓｋｙらｒＰＩａｎｔ Ｍｏ
ｌ旧ｏ１ 」９ 、２０５−２１６１０、 Ｃａ５ｔｒ
ｅｓａｎａらｒＰｌａｎｔ Ｍｏｌ ＢｉｏｌＪｌｌ、
１１７−１２６１１、ＬａｍｐｐａらｒＮａｔｕｒｅ
Ｊ３１６．７５０−７５２（１９８５）１２、 Ｓｉｍ
ｐｓｏｎらｒＮａｔｕｒｅＪ３２３．５５１−５５４（
１９８６）１３、 ＮａｇｙらｒＥＭＢＯＪ、Ｊ ６．
２５３７−２５４２（１９８７）１４、 Ｍｕｒｒａｙ
及びＴｈｏｍｐｓｏｎ ’ＮＡＲＪ ８，４３２１−４
３２５１５、 Ｍａｎｉａｔｉｓらｒｃｌｏｎｉｎｇ
Ｍａｎｕａｌ」（１９８２）１６、ＳａｎｇｅｒらｒＰ
ＮＡＳ、 ７４．５４６３−５４６７（１９７７）１７
、 ＪｅｆｆｅｒｓｏｎらｒＥＭＢｏ ＪＪ （１’９
８７）１８、 Ｂｅｖａｎ ’ＮＡＲＪ １２．８７１
１−８７２１（１９８４）１９、Ｎｅｇｒｕｔｉｕらｒ
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｊ ８ 、３６３−３
７３２０、ＥＰＡ ２７０２４８（ＩＣＩ）上記文献の
記載は本明細書において参照される。
第１図は本発明のＤＮＡ組立て体ｇＣＡＢ４８． ｐＣ
ＡＢ４８及びｐｃＡ８４８．１の夫々の制限酵素切断地
図を示す。 第２図は前記ＤＮＡ組立て体ｐｃＡ８４８．１のＸｂａ
ｌ／Ｎｃｏｌ切断プロモーター断片の塩基配列を示す。 第３図はＤＮＡ組立て体ｐＣＡ８４８．１中のＣＡＢ遺
伝子の構造を示す。第４図はＤＮＡ組立て体ｐＣＡＢ４
８．１とｐＴＡに３からのプラスミドｐｃＧ１とプラス
ミドｐＣＧ２の作製法の図解図である。第５図はプラス
ミドｐＯＬ１の作製に使用した合成オリゴヌクレオ、チ
ドの塩基配列を示す。第６図はプラスミドｐｃＢＴ１と
プラスミドｐＣＢＴ２の作製法の図解図である。 第 図 ＝ ＣＡＴとＴＡＴＡ ノ塩基配列 京 ＝ 推定される転写開始部位 Ｎｅｏ工
ＡＢ４８及びｐｃＡ８４８．１の夫々の制限酵素切断地
図を示す。 第２図は前記ＤＮＡ組立て体ｐｃＡ８４８．１のＸｂａ
ｌ／Ｎｃｏｌ切断プロモーター断片の塩基配列を示す。 第３図はＤＮＡ組立て体ｐＣＡ８４８．１中のＣＡＢ遺
伝子の構造を示す。第４図はＤＮＡ組立て体ｐＣＡＢ４
８．１とｐＴＡに３からのプラスミドｐｃＧ１とプラス
ミドｐＣＧ２の作製法の図解図である。第５図はプラス
ミドｐＯＬ１の作製に使用した合成オリゴヌクレオ、チ
ドの塩基配列を示す。第６図はプラスミドｐｃＢＴ１と
プラスミドｐＣＢＴ２の作製法の図解図である。 第 図 ＝ ＣＡＴとＴＡＴＡ ノ塩基配列 京 ＝ 推定される転写開始部位 Ｎｅｏ工
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、トウモロコシ植物由来のクロロフィルａ／ｂ結合（
ＣＡＢ）蛋白質遺伝子から単離されたプロモーターを含
有するＤＮＡ組立て体であって、このＤＮＡ組立て体中
で、前記プロモーターがトウモロコシにとって外因性で
あるＲＮＡをコードする外因性のＤＮＡに作動的に結合
されており、それによって、前記ＤＮＡ組立て体が該プ
ロモーターの制御下でのみ前記の外因性のＲＮＡを発現
するものであることを特徴とするＤＮＡ組立て体。 ２、前記の外因性ＤＮＡがバシラス・スリンジエンシス
（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ￥
）のδ−エンドトキシンをコードするものである請求項
１記載の組立て体。 ３、前記の外因性ＤＮＡが、植物の内因性遺伝子によっ
て発現されるｍＲＮＡに対して相補的な配列を有するア
ンチセンスｍＲＮＡをコードするものである請求項１記
載の組立て体。 ４、請求項１又は請求項２又は請求項３記載のＤＮＡ組
立て体を含有するベクター。 ５、バクテリオファージ又はプラスミドを含む請求項４
記載のベクター。 ６、トウモロコシ植物由来のＣＡＢ蛋白質遺伝子すなわ
ちクロロフィルａ／ｂ結合蛋白質遺伝子から単離された
プロモーターを、トウモロコシにとって、外因性である
ＲＮＡをコードするＤＮＡに作動的に結合させて成ると
ころの該プロモーターを含有する組換えＤＮＡを、植物
染色体中に安定的に組込んだ植物染色体であり、それに
よって、前記の外因性ＲＮＡが前記プロモーターの制御
下でのみ発現されるようにしてあることを特徴とする植
物染色体。 ７、ＣＡＢ蛋白質遺伝子すなわちクロロフィルａ／ｂ結
合蛋白質遺伝子から単離されたプロモーターを、トウモ
ロコシにとって外因性である ＲＮＡの発現をコードするＤＮＡに作動的に結合させて
成るところの該プロモーターを含有する組換えＤＮＡを
、植物の染色体中に安定的に組込んだ植物であって、そ
れによって、前記ＲＮＡが植物の緑色組織中のみに限っ
て発現されることを特徴とする植物。 ８、添付図面の第２図に記載の塩基配列を有する断片と
、遺伝子コードの縮退によって予言されるような前記配
列の可能な改変体とを含有することを特徴とする、トウ
モロコシのＣＡＢ蛋白質遺伝子すなわちクロロフィルａ
／ｂ結合蛋白質遺伝子のプロモーター。 ９、バシラス・スリンジエンシス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ
￥￥ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ￥）ＨＤ−７３菌株の
δ−エンドトキシン遺伝子に融合されたＣＡＢ蛋白質遺
伝子すなわちクロロフィルａ／ｂ結合蛋白質遺伝子のプ
ロモーターを含有するＤＮＡ組立て体であって、該ＤＮ
Ａ組立て体がプラスミドｐＣＢＴ１（ＮＣＩＭＢ寄託番
号４００３８）中に存在することを特徴とするＤＮＡ組
立て体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB888818706A GB8818706D0 (en) | 1988-08-05 | 1988-08-05 | Dna constructs & plants incorporating them |
| GB8818706.7 | 1988-08-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0286783A true JPH0286783A (ja) | 1990-03-27 |
Family
ID=10641705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1202301A Pending JPH0286783A (ja) | 1988-08-05 | 1989-08-05 | Ｄｎａ組立て体及びそれらを組込んだ植物 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0353908B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0286783A (ja) |
| AT (1) | ATE122717T1 (ja) |
| AU (1) | AU617499B2 (ja) |
| DE (1) | DE68922669T2 (ja) |
| GB (1) | GB8818706D0 (ja) |
| NZ (1) | NZ230206A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016533179A (ja) * | 2013-10-15 | 2016-10-27 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | トウモロコシ調節エレメントおよびその使用 |
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| US6395966B1 (en) | 1990-08-09 | 2002-05-28 | Dekalb Genetics Corp. | Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein |
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| US6118047A (en) | 1993-08-25 | 2000-09-12 | Dekalb Genetic Corporation | Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction |
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| ATE364705T1 (de) | 1997-04-03 | 2007-07-15 | Dekalb Genetics Corp | Verwendung von glyphosat-resistente maislinien |
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| WO2007047016A2 (en) | 2005-10-13 | 2007-04-26 | Monsanto Technology, Llc | Methods for producing hybrid seed |
| CN103635483B (zh) | 2011-07-01 | 2016-11-09 | 孟山都技术公司 | 用于选择性调控蛋白质表达的方法和组合物 |
| TW201531480A (zh) * | 2014-01-23 | 2015-08-16 | Dow Agrosciences Llc | 玉米調控因子及其用途 |
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|---|---|---|---|---|
| BR8600161A (pt) * | 1985-01-18 | 1986-09-23 | Plant Genetic Systems Nv | Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio |
| IL81737A (en) * | 1986-03-28 | 1992-11-15 | Calgene Inc | Regulation of gene expression in plant cells |
| MA20977A1 (fr) * | 1986-05-19 | 1987-12-31 | Ciba Geigy Ag | Plantes tolerant les herbicides contenant le gene de gluthathione S-Transferase |
-
1988
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-
1989
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- 1989-07-19 EP EP89307342A patent/EP0353908B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-19 DE DE68922669T patent/DE68922669T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-08-02 AU AU39183/89A patent/AU617499B2/en not_active Ceased
- 1989-08-04 NZ NZ230206A patent/NZ230206A/en unknown
- 1989-08-05 JP JP1202301A patent/JPH0286783A/ja active Pending
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|---|---|
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| DE68922669T2 (de) | 1995-10-05 |
| GB8818706D0 (en) | 1988-09-07 |
| EP0353908A3 (en) | 1990-08-01 |
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