JPH028743A - 免疫原及び抗体の取得法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はＨｂＡｌｃｍ　’ｈ　Ｈ的抗体を収得する定め
の免疫原並びに該抗体を取得するための方法に関する。

従来の技術 吸入した酸素及びＣ０２の運搬に作用し、赤血球中に局
在するヘモグロビンは４本の鎖からなっておシ、そのう
ちのそれぞれ２本は同じ構造を有する。主に、２本のα
−趨及び２本のβ−ノ・４からなる。このヘモグロビン
は血液中で９０−より多くまでがＨｂＡｏとして示され
る形で存在する。

グリコジル化ヘモグロビンは生体内でヘモグロビンとグ
ルコースとの非＃素的反応により生じる。このグリコジ
ル化はグルコ−スジ）アルデヒｒ基とヘモグロビンのア
ミ７基との間でのシッフの塩基の形成を介して経過する
。生じたアルジミンはアマｒす（Ａｍａｄｏｒｉ　）転
位により転位しＮ−（１−デスオキシ−Ｄ−フルクトー
ス−１−イルクー基となる。この転位形においてグリコ
ジル化ヘモグロビンは安定である。

グリコジル化ヘモグロビンｆ：Ｈｆ１Ａ、と呼び、これ
らの群の最も重要なものをＨＢＡ　Ｉ　Ｃと呼ぶ。

ＨｂＡＩＱはヘモグロビンのβ鎖のアミン末端に存在す
るバリン基の遊離アミノ基のグリコジル化により生じる
。この際、Ｎ−（１−デスオキシ−Ｄ−フルクトース−
１−イル）−Ｌ−バリン基が生じ、以降これを１フルク
トース・バリン１と呼ぶ。

血中でのＨｂＡＩＱの痛度は血液のＩＩ−度に依存する
。全ヘモグロビンに対するＨｂＡ、の鎗は通常成人にお
いて３〜６％の範囲にある。血ｍ値の上昇において、全
グロブリンに対するグリコジル化ヘモグロビンの埼は上
昇し、１５優にまで上昇することがある。従って、Ｈｂ
ＡＩＣ−ｔの測定は糖代謝のコントロールのための確実
なパラメーターである。赤血球及びこれと共に安定なＨ
ｂＡ］は平均して１２０日間生存するので、血中でのグ
リコジル化ヘモグロビン１にの測定は、特に糖尿病患者
に重要である炭水化物代謝會コントロールするための良
好なパラメーターと提供する。このパラメーターは炭水
化物の富んだ食事後の血４Ｍ値の短時間の上昇には依存
せず、こうして長時間パラメーターとして慟らく。

従って、糖尿病の診断のｔめに及び糖尿病患者の監視の
ために、血中のＨｔ）ＡｌｃＯｆを特異的に測定するこ
とはｊＫ要である。

グリコジル化ヘモグロビンの分析に関しては一連の方法
がある。最も多く使用される方法は、β−禎の遊離アミ
ン基をグルコースと反応させる時ヘモグロビン分子中で
のプラスの電荷の喪失に基づく。特に、カラムクロマト
グラフィー法及びｔ毬気泳劾法を使用する。他の方法は
組み込まれたグルコース分子もしくはアマげり転位によ
るフルクトース分子を比色定普法により検出する（チオ
バルビッール酸法）。

従来公知の方法は一部非常に時間金費し、煩雑であり、
□一部グリコシル化ヘモグロビンに関して十分に特異的
ではない。

従って、全ヘモグロビン中のグリコジル化部分賃金著し
く特異的に４Ｆ！！握する簡単な測定法に対する要求が
ある。

そのような簡単な方法は専門家に公知の櫨々のイムノア
ッセイの変法である。均質な拮抗イムノアッセイにおい
ては、例えば標識化ＨｂＡＩＣ誘導体は測定すべき試料
からのＨｂＡＩＣと抗体を争う。標識化ＨｂＡｌｃ−誘
導体としてはＨｂＡｌｃのエピトープである短かい合成
ペプチドを使用し、標識に結合する。正確な結果で再現
性のある測定を（’Ｊ　’ｉｌ＠とするｔめには、標識
化ペプチドと試料からのＨｂＡｌｃとが実際に競合反応
を行なうことができるように、これらがほぼ同じ親和性
で結合する抗体を使用しなければならない。従って、こ
のイムノアッセイの実施のｔめには、非常に特異的にＨ
ｋ）Ａｘｃｔ−認識する抗体、すなわちＨｂＡｌｃ−β
−鎖のグリコジル化Ｎ−末端が特異的Ｖこ請合するが、
相応するＨｂＡＱ−β−鎖の非グリコジル化Ｎ−末端は
結合しない抗体を提供しなければならない。

拮抗イムノアッセイのもう１つの変法は不均一相で実施
される。この際、例えば内相に結合したＨｂＡｌｃ−エ
ピトー７１′を有する合成ペプチドと試料からのＨｂＡ
ｌｃとが特異的抗体を競合する。

同相に結合したペプチドは例えば牛血清アルブミンと、
ＨｂＡｌｃのエピトープの配列を有する合成グリコシル
化ペゾテドとからの複合体であってよい。この変法を実
施するためにも、抗体は該（゛ゾチド及び試料からのＨ
ｂＡ４ｃとほぼ同程度の親和性で結合するべきである。

ＨｂＡ、Ｑの検出のための、感度が良好で、′１１４Ｐ
＋Ａ的な方法を実施するためには、ＨｂＡｏではなく、
特異的にＨｂＡ１ｃＫ結合する抗体を取得することはｆ
ｊ要であった。

すでに、ＨｂＡｌｃの検出法、並びにこの方法に好適な
抗体は、例えばヨーロッパ特許公開第１８５８７０号明
細書から公知である。しかしながら、すべての公知の抗
体は、これらがＨｂＡ４ｃ分子に対して非常に僅かな親
和性を有するという欠点を有している。従って、−役に
ＨｂＡｌの基 抗原決定Ｉが、抗体が十分量で結合されることができる
程度に十分に遊離して存在するように、５１１１定の実
施の前に変性を実施しなければならない。この、Ｌ７ｉ
法は煩雑である。

ヨーロッパ″＃奸公開第１８５８７０号明ｌ洲畜による
方法において使用した免疫原は、僅かに特異的な免疫応
答のみが生じるという欠点を有している。こうして、そ
こに記載された方法によればＨｂＡ４ｃ及びＨｂＡＱの
区別に関して測定可能な特異性を有さない、ポリクロー
ナル羊血清及びマウス血清のみが得られる。

西ドイツ国特許公開第３４５９６１０号公報から、Ｈｂ
Ａｌｃに対する抗体の取得法が公知であり、これにおい
ては免疫原として糖、ヘモグロビンのβ−鎖のへデチド
基及び免疫原担体からなる複合体を使用している。しか
しながら、この方法で得られた抗体は全く十分な選択性
を示さず、その比親和性が小さい。

発明が解決しようとする課題 従って、本発明の課題は公知技術から出発し、晶い親和
性を有し、高い特異性の、ＨｂＡｌｃに対すゐポリクロ
ーナル及びモノクローナル抗体全形成する方法で提供す
ることである。

もう１つの課題は天然のＨｂＡｌｃ−分子及びヘモグロ
ビンのβ−鎖のＮ−末４配列を有するペプチドに対して
、できるだけ小さいファクターで異なる分子比親和性を
有する抗体の喪造である。

課題を解決するための手段 この課題は一般式１ 〔式中、ｍは１〜４０ｔ−衆わし、Ｔは担体蛋白買を表
わし、Ａは一般式１１： （ここで、ＸはＳ又はＮＨｔ−表わし、ｎは１〜４を表
わし、Ｂはサクシンイミド基を含有する有機基を茂わす
）を有する原子数１０〜２０の鎖長のスペーサーを表わ
す〕を有する、ＨｂＡ１０特異的抗体ｔ−製造するため
の免疫原によシ解決する。

本発明による免疫原ｔ−１５１！用する際に高特異的抗
体が得られ、その選択性及び親和性は従来公知のＨｂＡ
４Ｃ抗体のそれらより著しくすぐれているということが
６ｆＡ認されたことは意外であった。

本発明による免疫原は三つの部分（ＨｂＡｌｃ　−蛋白
質のＮ−末端に相応するハプテン部、スペーサー及び免
疫原蛋白質）からなる。本発明による免疫原のハプテン
部はヘモグロビンのβ−顕のＮ−末端部の最初の４つの
アミノ酸及びフルクトース分子を有する。天然のＨｂＡ
ｌ−蛋白質に工？けるように、本発明による免疫原にお
いてはフルクトース分子のＣ１一原子にアミノ酸である
バリン、ヒスチジン、ロイシン及びスレオニンが結合し
ている。

ハプテン部の製造は自体公知法で行なわれる。

特に好適であるのは同相会戊である（　Ｃ）、　Ｂａｒ
ａｎｙ及びＲ，Ｗ、Ｍｅｒｒｔｆｔｅｌｄ著、Ｇｒｏβ
、ＭｖＬｅＨｈｏｆｅｒ　５Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｔｄｅａ
　、　第２巻、４３〜２８５頁、ニューヨーク、１９７
８年）。この之めにはα−アミ７基はＮα−フルオレニ
ルメトキシカルボニル基で保護される。側鎖の官能基は
ｔｅｒ　ｔ−ブチルエーテル、ｔｅｒｔ−、−ｆチルエ
ステルトシテ、もしくはｔｅｒｔ−ブトキシカルビニル
基トｔ、テ保護される。これらの保護基は完成した構成
ベグナトの担体からの加酸分解による切ｌ析において一
緒に分離する。Ｎ−（１−デスオキシ−Ｄ−フルクトー
ス−１−イル）−基は自体公知法でペプチドとグルコー
スとの反応により挿入される。

引き続く、アマトリ転位により（Ｋ、　Ｈθｙｎθ及び
Ｈ，Ｐａｕｌａｅｎ著、　Ｊ、　Ｌｉｅｂｉｇａ　ａｎ
ｎ、　Ｃｈｅｍ、。

第６２７巻（１９５９年）、第１６０〜１７４頁及びＨ
，Ｒ；ｐｅｒ等著、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ日、第１
１６巻、１９８３年、第１８３〜１９５貞参照）、所望
のＭ−（１−デスオキシ−Ｄ−フルク）　−ノー１−イ
ル）−ペプチドが得られる。

免疫原蛋白質のもう１つの本発明において重要な成分は
スペーサーであシ、これはノ・ブテンを免疫原蛋白質と
留分している。該スペーサーは本発明によ多原子１０〜
２０個の鎖長を示しこの際、該連鎖は炭素、ｒＲ索、窒
素及び／又は鹸黄原子から構成されていてよい。この鎖
長に関しては、連鎖を構成する原子だけを数えていて、
水素原子又は側鎖基原子は数えない。

スペーサーはスレオニンのカルがキシル基に結合してい
る。

スペーサーは次の一般式： 一般式の基Ｂは自体公知のスペーサー分子であり、これ
はサクシンイミジル：４を有する。基Ｂの十Ｈス吉はめ
ま！Ｏｈ＆Ｗではないが、他のスペーサ一部と一緒にな
って原子１０〜２０１１ｉ！ｉｆの鎖長が得られるより
な連鎖分子の長さを示さなければならない。４Ｂとして
サクシンイミジルヘキサメイル基金使用するのが有利で
ある。

スペーサーは全体公知法で挿入される。スペーサーは所
定のペプチドのＣ−末端に結合することができ、かつＮ
Ｈ２−又は８Ｈ−基金有するアミノｔＷ　ｋ含有する。

このアミノ基もしくはメルカプト基を介して、担体蛋白
質との１清合を仲介するナクシンイミジル基は挿入され
る。アミノＯＯＨ を示し、ここでＸはＳ又はＮＨを表わし、ｎは１〜４の
整数ｔ−表わす、Ｘが８１１を表わし、ｎが１である揚
盆、もしくはＸがＮＨ企表わし、ｎが４の場合が有利で
ある。

ペーサ−がアミノ酸としてシスティン又はホモシスティ
ンを含有する場合、はじめに保護されたメルカゾト基金
有するシスティン又はホモシスティンをペプチドの同相
合成用出発アミノ酸として使用することができ、その際
保護基としてｔ−ブチルスルフェニル基を使用するのが
有利である。引き続き、担体蛋白質金すクシ／イミゾル
基金供給する二官能性リンカ−例えばマレイミげヘキサ
メイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドと反応させ、次
いでスペーサー−担体蛋白質−複合体をシスティンもし
くはホモシた スティンの遊離しＦＳＨ−基に結合させる。スペーサー
がアミノ酸としてリジン又はオルニチンを含有するなら
ば、ペプチドの同相合成の九めに出発アミノ酸として保
護され九α−アミ７基を有するアミノｒｆ！をはじめに
使用するのが有利であり、この際保護基として有利にカ
ルざベンゾ牟シ基を使用し、引き続きペプチドの遊離し
たα−アミノ基を二官能性リンカ〜と反応させる。次い
で、ペプチド−アミノ酸−スペーサー複合体を担体蛋白
質に結合するが、この際この結合は担体蛋白質のＳＨ−
基を介して行なう。

担体蛋白質としては自体公知の蛋白質を使用することが
できる。好適であるのは例えばアルブミン、例えば牛血
清アルブミン及びオバルデミン、ヘモシアニン、例えば
キーホール・リンペット舎ヘモシアニア　（ＫＥＩｙｈ
：’Ｏ１ｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏ−ｃｙａｎｉｎす
、ポリアミノ酸、例えばポリ−Ｌ−ＬＹ８及びポリ−Ｌ
　−（Ｌｙｌｉ：　Ｇｌｕ）又は酵素、例えばガラクト
シダーゼである。担体蛋白質としてはエデスチン又はガ
ラクトシダーゼを使用するのが有利である。

担体蛋白質には有利に多くのハプテン・スペーサー基が
結合される。結合する基の紋は担体蛋白質の大きさに依
存する。一般に、担体蛋白質の重数の最高２５％がノ・
ブテン・スペーサー基に結合されていてよい。蛋白質と
してエデスチ／ンを使用する場合、・・ブテンスペーサ
ー基１０〜３０個が有利に結合される。

本発明によ＃）提供された免疫原を用いて、ＨｂＡｌｃ
に対する高活性特異的抗体が得られる。

この抗体はＨｂＡＯとの著しく僅かな交差反応性を示す
。

本発明のもう１つのｆｉ題は、ＨｂＡｌｃに対する抗体
の取得法である。このためには、本発明による免疫原を
好適な生物に多数回注入し、次いで自体公知法で抗体を
取得する。抗体の獲得のためには一役に１１■乳動物を
免役化する。好適であるのは、例えばマウス、羊、家兎
、ラッテ又はモルモットである。免役１ｆＸ　ｔ−１有
利に緩イ鳶液中に暦かし、常用の助剤の添加下に、例え
ばフロイントのアジュバンス（Ｆｒｅｕｎｄｓｃｈｅｎ
　Ａｄｊｕｖａ−ｎｚ）と共に宿主動物中に注入する。

旨い抗体動吻倉得るためにはこの注射を規則的な間隔、
例えば２週間〜４週間ごとに繰り返す。宿主動物の血液
から、ポリクローナル抗体を含有する抗血清を常法で取
得する。

本発明による免疫原を用いて、高特異性モノクローナル
抗体も、例えばＮａｔｕｒｅ％第２６６巻、１９７７年
、第４９５頁及び５ｃｉｅｎｃｅ、第２０８巻、１９８
０年、第６９２頁以降に記載されている、Ｇ、　ＫＭｈ
ｌｅｒ及びＣ，ＭｉｌＢｔｅｌｎの公知ハイブリッド化
法と使用して取得することができる。このためには宿主
生物の免疫化の後、免疫化動物の牌臓からＢ−リンパＲ
ｆｒ単Δにし、骨髄１細＋ｊＷと融合し、生じたハイプ
リドーマ細胞をクローン化する。次いで、生じたクロー
ンから、ＨｂＡｌｃと′４！ｊ％的に反応し、他の分子
と実質的に全く交走反応金行なわない抗Ｉ＊金生産する
細胞系ｋ　＊　ＰＩＩする。この細胞系の単離は、クロ
ーンの著しく高い繍が特異的な抗体を生産するので、簡
単である。この細胞系を更に培凄し、次い“でこれから
所望のモノクロルナル抗体を取得することができる。抗
体活性は自体公知法で、血ｔＲ中又はハイプリドーマ上
澄中で、酵素イムノアッセイｅｌ史用して常法で測定す
る。

本発明により得られた抗体はＨｂＡｌｃに対する高い特
異性及び高い親和性によシ侵れている。

クリコシル化していないヘモグロビンと、及ヒ体液中に
存在する他の蛋白質との交差反応は僅かである。従って
、この抗体は体液中のＨｂＡｌｃの測定法に使用するた
めに優れている。

特に好適なモノクローナル抗体はＭＡＫ″θ３．６０９
．３２５１．５．５１．５６及び５，２３０．１４０で
ある。相応するハイプリドーマ細胞系はヨーロピアンキ
コレクション・オデ・アニマル・セル番カルチャーズ（
Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＡｎｉ
ｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ８　）、プロト７−
ダウン（Ｐｒｏｔｏｎ　Ｄｏｗｎ　）、ＧＢに、ＥＣＡ
ＣＣ８７１２０８０１、ＥＣＡＣＣ８８１２２３０２及
びＥＣＡｃｃ　８８１２２３０１という番号で寄託され
ている。

実、廁例 次に本願発明を図面及び実施例につき詳細に説明する。

例　　１ ペグチドフルクトースＶａｌ−）（１ａ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
ｒ−Ｃｙｓ−ＯＨを合成した。固相合成をラボルテック
社（Ｆ　Ｌ　ｒｍａ　Ｌａｂｏｒ　ｔｅｃ　＃　Ｂｕｄ
ｅｎｄｏｒ　ｆ　％Ｓｃｈｗｅ　ｉ　Ｚ在）の半自動ペ
プチド合成機（Ｂｅｎｔ−ａｕｔｏｍａｔＬｆｌｈｅｎ
ｐｅｐｔｉｄ日ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　）中で実施した
。

Ｎα−アミノ保護基としてはＦｍｏｃ−基（Ｆｌｕｏｒ
ｓｎｙｌ−ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ　ｇｒｕｐ
ｐｅ　）を使用しｆｌ：、、このベノチ「合成法の記載
はマイエンホーファー（Ｊ、　Ｍｅｙｅｎｈｏｆｅｒ　
）等著、Ｉｎｔ、　Ｊ。

Ｐｅｐｔｉｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅａ、、第１３巻、
第６５〜４２貞（１９７９年）にある。

マイエンホーファーにより記載されているように、Ｃ−
末端Ｆｍ　（Ｉｃ−アミノ酸をｐ−アル午ルオキシベン
ゾルアルコール樹脂（Ｆｉｒｍａ　Ｂａｃｈｅｍ。

Ｂｕｄｅｕｄｏｒｆ　％Ｓｃｈｗｅｉｚ　）に結合し次
。

合成サイクルに関する合成力法： １２ｘ１分 ２１ｘ３分 ３１ｘ７分 ４　４Ｘ１／２分 ５２ｘ１／２分 ６　中止 ７２×１分 ９２分 ＤＭＦ　（ジメチルホルムアミド） ピペリシン／ＤＭＦ　　１　　：　　４ピペリジン／肌
０１：４ ＤＭＦ イングロパノール ニンヒＶリンテスト ＤＭＦ アゾール）の添加 撮　盪 の添加 １１９０分　　栢合 １２６×１分　　　ＤＭＦ’ １３　　２Ｘ１分　　　イソグロパノール１４　中止　
　　　二ンヒドリンテスト工椎８〜１１による結合のた
めに、Ｆｍ０Ｃ−アミノ酸及びＤＣＣは出発樹脂の負荷
に対してそれぞれ６倍モル揄で使用する。ＨｏＢｔは４
．５倍モル喰で使用する。

最後のＸ−末端Ｆｍｏ　ｃ−アミノ酸の結合の後、Ｆｍ
ｏＣ−保護基の脱離の几めに、合成サイクルの工程１〜
５を実施する。その後、この樹脂を１５倍容積のジクロ
ルメタン（ＤｃＭ）　／　）　！ＪフルＩ オル酢漬（ＴＦＡ）〆１中で２時間室温で振盪する。

（１過し、ＤＣＭ／ＴＦＡ４　：　１　テ更に２回この
樹脂ｔ−洗浄し、すべての濾液を合し、真空中２５°Ｃ
でトルエン添加下に濃縮する。残分にジエチルエーテル
′ｔ−加えるっ固体を濾別し、乾燥する。

＋ｉ’ｉｌ　ｎ己の概要法によりペゾチＹであるフルク
トース−Ｖａｌ−Ｈｌａ−Ｌｅｕ−’ｒｈｒ−Ｃｙ１３
（ＳｔＢｕ〕ＯＨが合成された。出発樹脂としてはＱ、
６ｍ　Ｍｏｌ　／　ｊｉで負荷されたＦｒｎｏｃ　Ｃｙ
ｅ（ＳｔＢすｐ−アルコキシペンシルアルコール樹脂１
０ｙを使用した。合成サイクルにひいて次のＦｒｎｏｃ
−アミノを翼をノー次使用し之　： １、　　Ｆｍｏｃ　Ｔｈｒ（ｔＢｕ）　６．２　ｇ２、
　　ＦｍｏＣＬｅｕ　　　　６．４　ｆｌ３、’　　Ｆ
ｍｏｃＨｌｓ（Ｔｒｔ）１１　、！ｉ’４、　　Ｆｍｏ
ＣＶａｌ　　　　６．１　、！／次、／）短縮彫金使用
した： ｔＢｕ　：　トリエチルブチルエーテルＴｒｔ　　：　
　　ト　リ　テ　ル ５ｔＢｕ：　ｔ−ブチルチオエーテル ０ｔＢｕ：　ｔ−ブチルエステル ｚ　：ペンジルオ十シ力ルボニル ーピｙθ（ＳｔＢｕ）：　ｔ　−７”チルスルフェニル
システィン樹脂の脱離後の徂収率はＨｖａｌ−Ｈｌｓ−
Ｌｓｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｅ　（！：２ｔＢｕ）ＯＨ６−２
９１である。ＤＣ：（シリカケ９ルＨｐＴＬｃ　Ｍｅｒ
ｃｋ　％　ｒｍＨｍ剤：エタノール／氷師／水６：　２
：　２）Ｒｆ＝０．６２゜ニンヒドリンスプＬ’　　０
．１　％　（Ｍｅｒｃｋ）での噴霧及び１２０℃で５分
間での顕色により赤紫色となる。０．４％レゾルシンメ
タノールＭｅ　２００　ｃｔｌ及Ｕ　５　ＭＷｔ酸４Ｑ
ｍｌからなる混合物（レゾルシン硫１１！りでの噴霧及
び５〜１０分間の１２０℃での顕色によシ発色しない。

祖ペプチド１ｇをグルコース５４０１１１１ｉ＋及びピ
リジン／氷酢５０ｍ１を添加し、５日間室温で攪拌した
。次いで室温で真空中濃縮し、引き続き残分を６回水５
Ｑｒｎｌで取９込み、再び蒸発乾固する。残分を水５Ｑ
ｍｊ中に１１り込み、デュウエックス（ＤｏｌＦｅＸ）
　５０　Ｗ　Ｘ　８　（Ｈ”−９，５０ｘ５．５ｃｍ）
を有するカラム上にのせ、全グルコースがｔ４離される
まで水で洗浄した。その後、生成′ｆＩＩＪｅｌＮアン
モニアで溶離し、凍結乾燥した（８１０Ｉｎ９が得られ
る）。凍結乾燥物を０．１Ｍトリエチルアンモニウムア
セテート緩４ｍＷ、Ａ８．５中にｌ１ｌ）込み、アフィ
ゲル（Ａｆｆｔｆｅｌ）６０１（Ｂｉｏｒａｄ　、　　
５　Ｘ　２６ＣＩ１１　）を有するカラム上で０．１　
Ｍ　トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液、Ｐｌ″
１８．５２−ｅで、及びその汲水２１で洗浄する。次い
で、該生成換金０．１％ｍ酸で溶離し、凍結乾燥する。

このように得られた凍結乾燥物をボリイシル（Ｐｏｌｙ
ｇｏｓｔｌ）　Ｃ１８，５／Ｊ　（Ｍａｃｈｅ−ｒθｙ
　ａｎｄ　Ｎａｇａｌ）でクロマトグラフィーを行なう
（水中の０．１％ＴＦＡ〜６５％イソグロパノール水ｄ
液中のＱ、１％　ＴＦＡの傾斜％？夜〕。フルクト−°
ス−Ｖａｌ−Ｈｌｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ　（Ｓｔ
Ｂｕ）　ＯＨ２８３ダが得られる。ＤＣ（シリカゲル、
Ｆｆｇ離剤、同上）；Ｒｆ＝０．５８゜ニンヒげリンで
の着色：茶褐色、レゾルシン硫酸での着色：赤横色。

Ｆａｂ−ＭＳ　（Ｆａｓｔ　Ａｔｏｍ　Ｂｏｍｂａｒｄ
ｉｍｅｎｔ　ＭＳ　）　（ポジティブ）：ＭＨ”＝８２
２゜ システィン保護基の説、僅のためには、前記の得られた
ベプチ１″を０．１Ｍ燐酸カリウム＃ｌｌ鋳液、−８，
５，１３０ｉｊ中に溶刀為し、多紋回脱ガスし、再び窒
素を吹きつける。次いで、このｍ液にジ？、１トライト
ール（ＤｉｔｈＬｏｔｒｅｉｔｏｌ　）　７７８　Ｉｎ
９を加え、９素雰囲気下に２４時間放置する。引き続き
、ＨＣＩでｐ）１５にし、ボリコ９シルＣ１８でクロマ
トグラフィーにより精製した（前記のような傾斜浴液）
。

フルクトース−Ｖａｌ−Ｈｌｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙ
８０Ｈ１７８叩が得られる、ＦａｂＭＳ　：ボジテイデ
：　Ｉａ”＝７３４゜例　　２ 例１に記載した合成工程により、ペグチドであるフルク
トース−ＶａｌＨＬａＬｅｕＴｈｒＬｙ８０Ｈが合成さ
れた。出発樹脂としては０．４８　ｍ　ｍｏｌ　／　ｇ
で負荷されたＦｍｏｃ　Ｌｙｅ（Ｚ）　ｐ−アルコキシ
ベンジルアルコール樹脂１０Ｉｎ９を使用した。合成サ
イクル中で次のＦｍｏｃ−アミノ酸を順次使用する：１
、　　Ｆｍｏｃ　Ｔｈｒ　（ｔＢｕ）　　５１１２、　
　Ｆｍｏｃ　Ｌｅｕ　　　　５．１　ｇ３、　　Ｆｍｏ
ｃ　Ｈｌｓ（Ｔｒｔ）　８．９　ｇ４、　　Ｆｍｏｃ　
Ｖａｌ　　　　４−９　、！ｉ’樹脂の脱離後の粗収鷺
：５．２ＦＩ Ｄ　Ｃ：　（シ＋）　力ｒ／Ｉ／ＨＰ’ｒｉ、Ｃ，溶離
剤例１，３参照）　：　Ｒｒ＝　０．５８ 徂ペプチドを室温でグルコース１．６ｇと共にピリジン
／氷酢１：１　１５０ｉｊ中で攪拌した。

反応尋液を蒸発し、列１．６に記載したように、デュウ
エックス５０ＷＸ８Ｈ＋及びアフィゲル６０１で４＃製
した。

フルクト−ｘ　−ＶａｌＨＬａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙ
ａ　（Ｚ）　ＯＨ１，７ｇが得られた。

ＤＣ：（シリカケ９ルＨＰＴＬＣ、溶離剤例１参照）：
Ｒｆ＝０−５８、＋流酸スプレー試薬での麿色：赤喝色
°、 ＩＨ−ＮＭＲ（３００Ｍｈｚ、　Ｄ２０　）　：δ＝０
．８５　（ｄ。

Ｊ＝５．１　Ｈｚ、　３Ｈ）　；　０．８９　（ｄ、　
Ｊ＝４．９Ｈｚ。

６Ｈ）　ｓ　Ｏ−９６（ｄ、　　Ｊ＝７．１　Ｈｚ、３
Ｈ）　；１．０４（ｄ、　Ｊ＝６．８Ｈ２，３Ｈ）　；
　１．２０　（ｄ。

Ｊ＝１．２０−　３Ｈ）　ｓ　１．３〜１．９　（ｍ、
９Ｈ）；２．３（ｍ、　　２　Ｈ）　ｓ　５−０〜６．
３（ｍ、６　Ｈ）　ｚ３．６３／４．１　（ｍ、５Ｈ）
；　４．１〜４．２９Ｃｍ。

４Ｈ）　ｓ　４−３２（ｄ、　Ｊ＝５．４Ｈｚ−Ｉ　Ｈ
）　；４．４５（ｍ、ＩＨ）：４．４８（ｍ、２Ｈ）：
５．０９（ｓｅ　　２Ｈ）；７．３２（ｓ、ＩＨ）；７
．４　（曹　８　Ｃ、５Ｈ）　；　８．６３　ｐｐｍ　
（Ｓ　、　１　Ｈ）。

前記の得られた生成物４００号をメタノール／水５：１
５０ｍ１中でパラジウム／活性炭で水素添加した。触媒
を濾過し、濃縮し、ボリゴシルＣ１８でクロマトグラフ
ィーを行なう。

収量：３００η Ｄ　Ｃ（シＩ７　力１’ルＨＰＴＬＣ，＄ｄ剤ｉｊｌ　
ｌ　参照）二Ｒｆ＝　ｏ、ｏ　９　ｍ酸スプレー試薬で
の着色：赤褐色。

例　６ 例２からの７Ａ／クトースＶａｌＨ１ａＬｅｕＴｈｒＬ
ｙｓＯＨ１０Ｉｎ９を０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐ
ｉ−１７，１ｍｌ中に取り込んだ。エタノール２ｍｌ　
中のマレイミドヘギサン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシンイ
ミドエステル６．２ｍ９を添加した。反応溶液を室温で
１４時間攪拌し、ポリイシルＣ１８で精製した。純粋な
フラクションの」結乾燥の後、フルクトースＶａｌＨ１
ｓＬｅｕＴｈｒＬｙａ　（ｆｆ　Ｖイミドヘキサノイル
）ｏＨ４，３ｍ９が得られた。

ＦＡＢ−ＭＳ　、ポジティブ；　ＭＨ”　：　９５２Ｌ
Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、　ＤＭＳＯ（Ｄ６）／ｃＤ
３０Ｄ）：　＝０．８３〜１．０６　（ｍ　＋　１２Ｈ
；　Ｌｅｕ−ＣＨ３，Ｖａｌ−ＣＨ３）ｓ　　１．０４
　（ｄ＋　　Ｊ＝６．５　Ｈｚ、３Ｈ；　　Ｔｈｒ−Ｃ
Ｈ！りｌ　　２−０１　　（ｔ　、Ｊ　＝（５，５Ｈｚ
１’ｌ　Ｈｔ　ｂｌｌｉ−Ｃ−０−Ｃｆ（２，）及び６
．９２　ｐｍ）ｍ　（５１、２Ｈ；　ＭＨ−ＣＨ−ｔ、
’ｆ（）。

列　　４ 麻のｄ子からのエデスチン（Ｒｏｉｈ）　５　ｇを０．
１Ｍ燐酸カリウムｐｉ−１７．０　５００１中で攪拌し
、エタノール１００ｍ１中のマレイミドヘキサン酸−Ｎ
’−ヒｒロ中シサクシンイミドエステル５００１１１９
の溶液と混合する。＃、浴溶液室温で９０分間攪拌し、
固体を吸引濾過し、水苔１０（１４で２回、エタノール
各１ｏｏｍｔで４回及びもう１度水苔１００Ｔｎ／で２
回洗浄する。固体を水１５０酩中にｉ濁させ、凍結乾燥
する。

収量：４．３４ｇ エデステン１モルあ之りのマレインイミド基：１７個。

マレインイミド基の数は次のように決定する； 醇液Ａ：水中１ｍＭソステイン、Ｑ、５　ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ溶液Ｂ　：　０．Ｉ　Ｍ燐酸カリウム緩衝液、−８
，０中の１０ｍＭ５．５’−ジチオビス（２−二トロペ
ンゾエー）　）　（Ｅｌ１ｍａｎｎ’θ試薬）ｆど１Ｒ
更　Ｃ：　１　Ｍ　ト　リ　ス　・　ＨＣｌ、　　Ｐｌ
″１８．２マレイミドへキサノイルーエデスチン８１１
９を０．０５　Ｍカリウム燐酸緩衝液３９　ｍｌ中に取
り込み、超音波府中で１５分間処理する。

その後、溶液Ａ　ｌ　ｔｎｌを添加し、２５℃で１０分
間恒温保持する。

ｌａ液Ｃ６，２ｍｌと共に２５℃で２分間攪拌し、次い
で溶液８２００μｅ金加え、３７℃で１０分間恒温保持
する。試料を２５℃で１５分間遠心分離する。

上澄に関して４０５１ｍにおける吸光度を測定する。盲
検値はマレイミドヘキサノイルーエデステンー試料の添
加なしに同様な方法を実施することにより得られる。ｎ
　ｍｏｌにおけるマレイミド基の数は　ΔＥ（ｍＥｌ・
４６．４　であり、こ１３．３ の際ΔＥは盲検値と試料値との間の吸光度差である。エ
デステンのｉ（ｍｏｌ）は正確な秤せと、５ｉｏｏｏｏ
のエデスチンの比モルー質盾で得０．６１ このようにして得られ次マレイミドへキサノイルーエデ
スチン２５０ＩＶ金アルゴン雰囲気下にＯＡ　ｖｐａ力
＋）　ラムｍ＊Ｋ、ｐ）１６．５　２０１ｄト混合した
。例１によシ得られたフルクトースＶａｌＨ１８Ｌｅｕ
ＴｈｒＣｙｓＯＨ３４ｎＫｌを酸素遮断下に添加し、室
温で２９時間攪拌した。該溶液を遠心分離し、沈殿を水
で３回洗浄し、そのつど遠心分離を繰り返す。固体残分
を水１０ｍｚ中に懸濁させ、凍結乾燥した。フルクトー
スＶａｌＨＬｌＩＬｅｕ−ＴｈｒＣｙａ　ＣＨ及ぎマレ
イミドヘキサノイルーエデステンからの複合体１７５ｒ
ｎ９が得られ、これを免疫原１とする。

前記のように、なお遊離のマレイミド基を測定した。最
初の負荷に対する差から、該免疫原がエデステン１モル
あたりペプチド１４．６モルを含有していることが明ら
かになる。

例　５ β−ガラクトシダーゼ（ｇＩＡ−品質、ベーリンガー・
マン・・イム社）４８１ｎ９をアルゴン雰囲気下にアル
ゴンを通気した０、１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、−７，０
に溶かした。酸素遮断下に、例６により得られたフルク
トースＶａｌＨ１ａＬｅｕＴｈｒＬｙｓ（ＭＨ）　ＯＨ
５ＩＱをこれに添加し、室温で１時間攪拌した。

ＡＣＡ　２０２−カラム（２Ｘ２４ｃ１１１）をアルイ
ン飽和０．９％ＮａＣｊで平衡にした。全反応溶液を力
、ラム上に担持した。アルイン飽和０．９％ＮａＣＪで
溶離し、蛋白質７ラクシヨンを集めた。

免疫原溶液、ｃ＝３．１■／ｍｊ、１５−が得られる。

免疫原での負荷は試料とエルマン（Ｅｌ　１ｍａｎ　）
の試薬との反応によシ測定することができる＝ＳＨ−基
１モルあたりカルざキシニトロチオピリドン１モルが遊
離される（λｍａ工＝４１２ｒ１ｍ％！＝１５６００、
Ｐ）ｊ　３．０１Ｃおいて）β−ガラクトシダーゼ、ｇ
ＩＡ−品質は分子あたり５Ｉ（−基１４個を有する。ペ
プチドとの反応の後、遊離８Ｈ基２個が見い出され九、
すなわち負荷はβ−ガラクトシダーゼ１モルあ九りペプ
チド１２モルでろる。

フルクトースＶａｌＨ１ａＬｅｕＴｈｒＬｙＢ（Ｉａ）
ＯＨとβ−ガラクトシダーゼとから得られた複合体を免
疫原２とする。

例　６ 比較のためによプ長いペゾテド＠會有する免疫原・ｔ−
製造した。このためには、まず例１に記載された合成法
によシペゾチドであるＶａｌＨ１８−Ｌｓｕ’ｌ’ｈｒ
Ｐｒｏ（）１ｕＧｌｕＣｙｓＯＨを合成した。

例１の合成法により、ペプチドＨＶａｌＨ１ａＬｅｕ−
ＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧ１ｕＣｙａ（ＳｔＢｕ）ＯＨＪｋ
’Ｍ造する。出発樹脂としては０．５　ミ’）モル／ｇ
の負荷を有するＦｍｏｃ　Ｃｙａ（８ｔＢｕ）　ｐ−ア
ルコキシベンジルアルコール樹脂１０ｇを使用する。合
成サイクルにおハでは次のアミノ酸を使用する。

１、　Ｆｍｏｃ　Ｇｌｕ　（ＯｔＢｕ）　　６．４９２
、　　Ｆｍｏｃ　Ｇｌｕ　（ＯｔＢｕ）　　６．４　、
！ｉ’３、Ｆｍｏｃ　Ｐｒｏ　　　　　５．１　ｇ４、
　　ＦｍｏＣ’Ｐｈｒ　（ｔＢｕ）　　　６　ｇ５、　
　Ｆｍｏｃ　Ｌｅｕ　　　　　　　５．３　、！ｉ’６
、　　Ｆｍｏｃ　Ｈｌｓ　（Ｔｒｔ）　　９．５１１７
、　　Ｆｍｏｃ　Ｖａｌ　　５−１１１　ｓこの結合を
１回繰り返す。

樹脂の脱離後の祖収ｔ：４．２ｇ、組成物を例１に記載
したようにボリゴシル０１８でクロマトグラフィーを行
なった。牧童はＨＶａｌＨＬｇＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌ
ｕＧｌｕＣｙａ（ＳｔＢｕ）ＯＨ８８０ｒｎ９であった
。

ＤＣ（シリカゾル、列１におけると同じ溶離剤）：Ｒｆ
＝　０．５３゜次いで、このペプチド８００号を例１に
記ｌ或されているようにグルコースと反応させ、デュウ
エックス５　Ｑ　Ｗ　ｘ　８　Ｈ”−型、その後アフィ
ゲル６０１で種実した。ボリイシルｅ１８でクロマトグ
ラフィーを行なった後、生成物１５０ｍ９が得られた。

ｔａｂ　Ｍｅ、ポジティブ：ＭＨ”＝１１７７゜次いで
例１と同様にしてシスティン保護基をジチオトライトー
ルの添加により切断し丸。フルクトースＶａｌＨ１ｊＬ
ｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙａＯＨ７８ｒｎ９が
得られた。ＦａｂＭ８ボゾテイデ：ＭＨ”＝１０８７゜ このように得られたペプチドをマレイドヘキサノイルエ
デスチン３２２■と、例４に記載したように反応させる
。免疫原２００１％’が得られ、これを比較免疫原ｖ１
として使用し之。

例　７ もう１つの比較免疫原としてはフルクトースＶａｌＨ１
日ＬｅｕＴｈｒＣｙａとピリジルジテオグロピオニルエ
デスチンとから複合体を製造した。ペプチドを例２に記
載したように製造した。

ビリゾルジチオゾロぎオニルエデスチンの製造のために
は大麻の１子からのエデスチン１ｇを０．１Ｍｇ４酸カ
リウム緩衝液、−７，５，１５０ｍ１　中ｉｃ　１Ｉｉ
ｊ　’）込む。このＩＷ液に、エタノール１２．５ｍＪ
中に溶かしたサクシンイミジルー３（２−ピリジルジチ
オ）−ゾロビオネート１０■ｔ−攪拌下に添加した。２
時間攪拌し、次いで固体ご吸引濾過し、それぞれ６回水
ＩＱＱｍ／。

エタノール１００＋ＩＩｔ及びもう１回水１００ｍ／で
洗浄し友。固体を水１０Ｑｍｔ中に取シ込み、凍結乾燥
した。

このようにして得られたピリジルジチオゾロビオニルエ
デスチン３５２　ＩＱにアルゴン雰囲気下に０．０５　
Ｍ燐酸カリウム緩ｍ液、−６，０，１ｏｏｍｔを混合す
る。同様に、酸素速断下にペプチドであるフルクトース
ＶａｌＨ１ａＬｅｕＴｈｒＣｙ８４９．５ｍ９を添加し
、室温で２３時間攪拌する。

引き続き、遠心分離し、沈殿を３同各５０−の水で、２
同各５Ｑｍｌのエタノールで、更に１回水で洗浄し、そ
のつど遠心分１Ｉｌｌｔ−繰シ返す。固体の残分を水５
０＋＋１１中に敗シ込み、凍結乾燥させる。負荷の測定
のためには、第１の遠心分離の上澄液中で遊離したチオ
ピリげンを測定した。

フルクトースＶａｌＨ１ｌ？ＬｅｕＴｈｒＣｙａとビリ
ジルジチオグロビオニルエデスチンから、比較免疫原ｖ
２と呼ばれる複合体６００叩が得られた。負荷はエデス
テン１モルあ九シペデチ）Ｆ３９モルであった。

例　８ 抗−ＨｂＡ４ｃ−抗体に関するスクリーニングテストの
実施のためにポリハプテンを製造する。

ポリハプテン１　ｔ　ＨＶａｌＨｌｓＬｅｕＴｈｒＰｒ
ｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓＯＨとピリジルジチオプロビオニ
ル−牛血清アルブミンとから製造する。

牛血清アルブミン１ｇを０．１Ｍ燐酸カリウム緩−ｔｈ
液、ｐ）１７．５．．５０ゴ中に溶かした。この溶液に
エタノール１５ｍ１中に尋かしたサクシンイミジルビリ
ジルゾチオグロビオネート２２６ｍ９を加えた。室温で
４０分間攪拌し、全反応溶液をＡｃＡ２０２（３１ｘ３
ｄ）を介してりｏマドグラフィーにかけた；＃１離剤、
０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐ）Ｉ　６．０．蛋白質
溶液、Ｃ＝６．６ｍ９７ｍ１，１５２１ｄｌが得られた
。核辞液をジチオドライド−＃２８０．５Ｉｎ９と混合
し、０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐｉ−１７，５で１
０扉ｌとした。ファクター約６に希釈した。遊離するチ
オピリドンの濃度は使用したジチオぎリジル基の濃度に
相応した。３４０　ｎｍにおけるチオピリドンに関する
吸光係数８０８０及びエデスチンの比分子量３１０００
０から負荷を決定することができる。

負荷は蛋白質１モルあたり３６モルである。

ピリゾルゾチオグロピオニル牛血清アルデミン及び列６
により得られたＨＶａｌＨ１！ＩＬｅｕＴｈｒＰｒ。

ＧｌｕＧｌｕＣｙａＯＨ４７ｍ９から得られた尋Ｕ１０
．５ｆｆｌｊをアルゴン雰囲気′Ｆ（＃Ｒ素遍祈下）に
１日攪拌した。′）Ｘ荷は遊４チオビリｒンの測定によ
プペグテド６６モル／１モル蛋白質で計算された。

残りの反応性基をシスティン１．７１ｎ９の添加により
廟和する。全反応溶液をＡｃＡ　２０２−カラム（３１
Ｘ３ｃｒｎ）を介してクロマトグラフィーにかけ、蛋白
質フラクションを１夜かけてＨ，Ｏに対して透析し、凍
結乾燥する。得られた生成物をポリハプテン１とする。

収せ：８５ｒｎ９ 例　９ ポリハシテン２の製造のために（列８参照）、例６に記
載されているようにして得られたビリジルジチオグロビ
オニル牛血清アルデミンＪ液７ｒｎｌｆ使用した。ペプ
チド成分としては、アミノ酸Ｖａｌにフルクトースを担
持する、例６によシ製造されたペプチド７．８■を使用
する。このためには列６によシ得られたベゾチｒ ＨＶａｌＨ１ａＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧ１ｕＧｌｕＣｙａ
ＯＨ４３Ｑ　Ｑ　ｍ９を例１に記載されたようにグルコ
ースと反応させ、デュウエックス５０　ＷＸ　Ｈ−型、
その後アフィゲル６００で精製する。ボリコ９シルＣ１
８でクロマトグラフィーと行なった後、グリコジル化ペ
プｔド１５０ｍ９が得られた。Ｆａｂ　ＭＳポジティブ
、ＭＨ”＝１１７７３システィン保護基をジチオトライ
トールで脱離した後、グリコシル化ペゾチド１００〜か
ら所望の生成物７８ηが得られ友。

Ｆａｂ　ＭＳポジティブＭＨ”＝１０８９０このように
得られた生成物をポリハプテン２とする。

例１０ 免疫化されたマウス又はハイブリッド細胞の培養上澄液
又は１攬水中のＨｂＡｌｃに対する抗体の存在及び特異
性を知るために、エリザ（Ｅｌｉｓａ）法をテスト原理
として使用した： 微址滴定プレートをポリバッテン２１０μｇ又はポリハ
プテン１１０μｇ／嵯積層緩１所液（０，２Ｍ炭酸ナト
リウム／炭酸水素ナトリウム、ｐ）ｌ　９．３〜９．５
）で、室温で１時間振盪下に積ｊ−した。次いで、０．
９％塩化ナトリウム溶液及び１チアルデミン溶液で後処
理した。引き続き、０．９チ塩化ナトリウム俗液で洗浄
し九。その後室温で、約１時間試料１００μｅで恒温保
持し、新たに０．９％塩化ナトリウム溶液で洗浄し友。

引キ続き、羊−Ｆａｂ−抗マウスＦＱｒ−ペルオキシダ
ーゼ複合体２００Ｕ／ｍｊと共に１時間恒温保持した。

０．９％塩化ナトリウム溶液を用いる祈たな洗浄工程の
後、ペルオキシダーゼ活性を室温で１５分間ＡＢ’ｌ’
Ｓと反応させることにより常法で測定する。

その後、吸光度差、４０５　ｎ！！ｌにおける４ｍＢｘ
を測定する。

本発明により、９１４により得られた免疫原１での免疫
化によシ得られた抗血清は、免疫化マウス１００匹全部
においてポリ／１ブテン２との結合を示し、かつポリ／
１ブテン１との結合を示さなハか、もしくは非常に僅か
にのみ示すＫすぎない。すなわち、ポリ／１ブテン２と
結合性の抗体が選択的に得らｎた。

本ンら明ｒＣよシ、例６によりａ造された免疫原２によ
り得られた抗血清において、免疫化マウスから得られた
血清１８個のうちの６個がポリハプテン２と反応し、ポ
リハプテン１とは反応しなかつ之。この際ボリノ・ブテ
ン２への結合は免疫原１にｐいてと同様に良好であった
。ここでも゛選択的な抗体が得られた。

比較のために実施した、比較免疫原ｖ１での免疫化にお
いては１００匹のマウスから、ポリハプテン２と優先的
に反応する抗血清１つが得られ、この際他の９９すべて
の抗血清は両方のポリハプテンと同じように良好に反応
する。ここでは、ポリハプテン２と選択的に結合性の抗
体を得ることができなかった。

比較免疫原ｖ２での免役化においては全く差異をつける
マウス抗血７？１を得ることはできなかった。マウス１
００匹から得られたすべての抗血清は両方のポリハプテ
ンと同じように良好に反応する。この際、ボリノ・ブテ
ンへの結合は、本発明による免疫原１及び２で得られた
血清にかいてよシフアクタ−１０だけ弱い。

例１１ 生後８〜１２週のＢａ１ｂ／ｃ−及びＢＩＤ、Ｄ２−−
ｖウスを完全フロイントのアジユバンス（ｃＦＡ）　中
のＨｌ）Ａｌｃ（β１〜４　Ｃｙａ、ＭＨ８）−エデス
チン（免疫原１　）　１００　ｐｇ　テａａＡ内（Ｌｐ
、＋　ｖｃｍ　１回免役化を行なった。６週間及び１０
週間後に、更に２回の免疫化を実施した。この際、不完
全７０インドのアジュバンス（ＩＦＡ）中の免疫原１０
０１１ｇを投与し友。最後の免疫化の１０日後圧、血τ
Ｍから抗体滴定清を測定するために血液を採収した。融
合前４日及び６８目にマウスをもう１度緩＊ｔｉｊ　ｙ
＆中の免疫原１００μｇで静脈内免疫化を行なつ之。

融合のためにはヤヤル７しく　Ｇａｌ　ｆｒ’ｅ　；　
Ｍｅｔｈｏｄ８ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　＆　第７
６巻、１９８１年、第６頁）による方法と同様にして、
免疫化マウスの肺臓細胞１０８と骨１禮帳細胞２ｘ１０
フ（Ｐ３×６５　ｋｇ　８−６５５、ＡＴｅＣ−ｃｍ、
　８５７５　）とを１回で（昆脅し、引き続き１０分間
遠心分離を行なう（３００ｇ、４°Ｃ）。細胞をもう１
回Ｂ５５（平衡塩＠浴液）で洗浄し、尖端を有する管５
Ｏｒｕｌ中４００ｇで遠心分離する。上げを呟去した０
梱１把沈殿物をほぐし、６０慢ＰＥＧ−浴液（分子ｆ４
０００、メルク社）　１ｉｒｌと混合した。

水浴中で１分後、室温で胎児性子牛血清（ＦＫＳ　）を
含有しないＲＰＭＩ　１６４０培地（ａｐｕ＝Ｒｏａｅ
ｗｅｌｌ　Ｐａｒｋｅｒ　Ｍｅｍｏｒｙ　Ｉｎａｔｉｔ
ｕｔ　）　５　ｒｎｌを４〜５分１…かけ°Ｃ滴加し、
十分に混合し、培地で５Ｑｍｌとし、かつ引き続き１０
分間４００ｇ、４℃で遠心分離した。分離した細胞を１
０％ＦＫＳ　ｆ含有するＲＰＭＩ　１６４０−培地に散
り込んだ。２４孔−細胞培地プレート（Ｎｕｎｃ社）上
に牌１臓細胞各１０５を層、、１する。各培地に複勝浸
出液−細胞５×１０４をＭ科用細胞として７森加した。

翌日にヒポキサンチン−アゾセリン−選択培地（１００
ｍＭヒボキサンチン、１μｇ／　ｍｌアゾセリン）を晧
加した。

約７〜１０日後、すでに多くのクローンが町視となった
。第１次培地の上澄を列１０に記載したエリザ法により
試験した。ＨｂＡＯとほとんど交差反応を示さないか、
又は全く示さない第１次培地を螢光活性化細胞ｆｊｌｉ
　（ＦＡＣ９）を用いて９６孔−細胞培地プレー）　（
Ｎｕｎｃ社）上で更にクローン化した。飼料用細胞とし
ては孔あたり腹腔−浸出液細胞Ｉ　Ｘ　１０’を使用し
た。

このようにして、例えばノ・イブリドーマ＃Ｉ胞系を単
離することができ、これはヨーロピアン・コレクション
・オデ・アニマル番セル・カルチャーズ（１ｌｉｕｒｏ
ｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｔｏｎｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　
Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅ８ンにおいて寄託番号（１，）
　ｙＡｃｃ８７１２０８０１、（２，）　ＥＣＡＣＵ　
８８１２２３０２及び（３，）　ＥＣＡＣＣ８８１２２
３０１で寄託されている。この細胞系からモノクローナ
ル抗体（１，）３．６０９３．２５　（２，）　３．５
１．５６及び（３，）５．２３０．１４０を得ることが
できる。

腹水の生産の比めには、あらかじめシリスタ７　（Ｐｒ
ｉｓｔａｎ）　Ｑ、５　ｍｌで１〜２回前処理した、ノ
・イゾリノｒ細胞５　Ｘ　１０’でマウスを腹腔内圧射
した。その後１〜３週間で、このマウスから５〜２０１
ダ／　ｔｎｌのＩｇＧ−ｇ＋式ケ有する腹水液がマウス
〃・ら得られた。ここから常法で抗体を単離することが
でき友、このモノクローナル抗体はＨｂＡｌｃに対して
特異的に反応し、ＨｂＡＯとは全く交差反応を示さない
か、又は僅かに示すだけである。

輿ｊ１°２ 材料 微ｆ滴定プレート； Ａ　：　ＮＵＮＣ４−４２４０４１１ Ｂ：ＮＵＮｅ　　２−６９６２０ ダイナチク（ＤｙｎａｔｅＣｈ）、　カタログ番号、７
７−８８７−００ フロー・ラボラトリーズ（Ｆｉ　ｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ティターチク（ＴＬｔｅ
ｒｔｅｋ）、カタログ番号７７−ダイナチク・プレート
・シーラー （Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｐｌａｔｅ　５ｅａｌｅｒｓ）、
カタログ番号Ｍ３０ １２′ｕ−ピペット： プレート振盪機　： カンマ−シート： エリザＪみ収シ機：　　ダイナチクＭＲ７００横４４　
、ｄ　漬液：　　　　５　Ｑ　ｍＭ炭酸ナトリウム、Ｐ
）１９．６試料緩ｉＩ液：　　　　ｉＱｍＭ燐酸ナトリ
ウム、ｐ）１７．４゜０．９％ＮａＣｊ、０．１％ツウ
イーン２０．１％クロティンＣ 洗浄緩衝液：　　　　０．９％ＮａＣｚ　、０．１　％
ツウイーン２０抗体／酵素複合体：マウス−Ｉｇ（）の
Ｆｃγ一部に反応する、羊からのポリクローナル抗体の
Ｆａｂ−フラグメントとペルオキシダーゼとか らの複合体、試料緩衝液中２５　ｍＵ／＋ｎｌ基　　質
　：　　　　　　１００ｍ　ｍｏｌ／−ｅ燐酸塩−クエ
ン酸塩−緩尚ｔｃｐ）３４．４ ３．２　ｍ　ｍｏｌ／ぶ過硼素酸ナトリウム１、９　ｍ
　ｍｏｌ　／−ｅ　ＡＢＴＳ　（２ｒ　２’−アジノー
ジ−〔３エチル−ベンズチ アゾリン−スルホン酸−（６）〕 ジアンモニウム塩） 抗　　体　：　　　　　　ＭＡＫ　５．６０９．５２５
（ＥＣＡＣＣ８７ｔ２０８０１）ポリハブテン二　　　
例８によるポリハプテン１例９によるポリハプテン２ すＬ　原　：　　　ＨｂＡ４Ｃ天然 ＨｂＡｏ　　天然 予備実験において、本来の特異性実験に使用すべき抗体
ｆを決めた。

このためには、鍼を滴定プレート金ポリ・・ブテン１も
しくはポリハプテン２で積層した。各窪み１００！＊＃
（＋−槓ツノ−緩衝液１−たりポリノ・ブテン１μｇ（
１１−１時間室諷で恒温保持する。その後、該ｄ液を吸
引濾過し、洗浄緩衝液で３回洗浄する。

引き続き、同相に結合したポリ・・ブテンに抗体６．６
０９．５２５　（ＦＩＬ水）の希釈列を添加するが、こ
の際試料緩衝液での希釈は１：１００から４段階で行な
った。それぞれ１００μｅ／窪で、１時間室温で恒温保
持し、最後に洗浄した。

ポリハシテンに結合し友抗体はマウス−ＩＫＧのＦＣ７
’一部に反応する、羊からのポリクローナル抗体のＦａ
ｂ−７ラグメントとペルオキシＪ”　−ゼとからの複合
体の添加によシ、ペルオキシダーゼと添加した基質との
反応を介して測定された。複合体１００μｅ／窪を添加
し、室温で１時間恒温保持した。検出反応をすべての１
中に２１！！−質１００μｔ／窪の添加によシ開始した
。このｊｌｌｊ定をエリデ読み収り機中４０５　ｎｍで
行なう（参照波長４９０ｎｍ） 半最大結せが行なわれる抗体希釈が滴定液として定義さ
れ友。この抗体量を次の実験に使用した。

モノクローナル抗体の特異性を実験した。このためには
、個々の抗体の反応性を溶液中に存在する撞々の成分と
比較した。

１％クロティン（ＵｒｏｔｓｉΩ）Ｃで予Ｍ／ｉＪした
砿蓋メ商定プレート中に、滴定液の２焙潰縮液中のモノ
クローナル抗体のｍ液５０μを及び抗原溶液（希釈列、
下を参照）５０μｔをぞ１１ぞれピペットで入れ％混合
し、室温で３０分間恒温保持した。その後、ポリハシテ
ンで積層し九微債滴定プレート中の該混合物の分割＆１
００μｔを移転する。

希釈列： 測定すべき物質の半最高結曾に属する１度（ｍｏｌ　／
−ｅ　）をモル比親和性と定義する。

モノクローナル抗体と攬々の成分との反応性の比較のた
めには成分フルクトース ＶａｌＨＬθＬｓｕＴｈｒＰｒｏＧ１ｕＧｌｕＣｙθ（
Ｓｔｂｕ）ＯＨのためのモノクローナル抗体の比親和性
を１００％とする。父差反応とも呼ばれる、他の成分と
の反応性は次のように比肩和性の商から次のように得ら
れる： ０比親和注、フルクトース ｆｉｌ々の成分に関して得られ念＋ｔｉを次のｇ１表に
記載し念。

この際、種々の同様にして得られた抗体で得られた結果
も評価した。

この表は、特異的にＨｂＡｌｃと結合するが、ＨｂＡＱ
とは結合しない多数のモノクローナル抗体を本発明によ
る免疫原で製造することができることを示す。比較免疫
原ｖ１の使用下に得られた抗体又はヨーロッパ特許公開
用１８５８７０号公岨から公知の抗体と比較すると、本
発明によシ得られた抗体は特別な変性なしに著しく高い
親イ１性でＨｂＡｌｃを認識する。従って、本発明によ
シ得られた抗体は競合イムノアッセイに非常に好適であ
る。

例１３ 例１２に記載したように、１％クロティンＣで予め積ノ
ーシた微破滴足プレート中に２倍禰縮滴定孜中Ｊ）　Ｖ
ＬＡＫ　５．６０９．６２５　ノ溶液５０μｅ及びＨｂ
Ａ、ｃ−混液５０μｅをそれぞれピペットで入れ、混付
し、室温で６０分間恒温保持する。

、１−［１々の濃度のＨｂＡ、ｃｉ使用する。

その後ポリハプテン２で！Ｒ層したａ量滴定プレート中
にこの混合物１００μ−一分割檜を導入する。ポリハプ
テン２　Ｖ（、結合した抗体ｔ−ｆ１１１２に記載した
ように、マウス−１ｇｏのＦｃｒ一部に反応する羊から
のポリクローナル抗体のＦａｂ−フラグメントとペルオ
キシダーゼとからの複合体を用いて検出する。

試料溶液中にＨｂＡｌｃが多項に存在すればする程、少
址の抗体がポリハプテンに結合する、すなわち、測定し
た吸光度は小さくなる。図１中にはＨｂＡ４Ｃの測定く
おいて得られた曲線が示されている。

完全７０インドのアジュバンス中の本Ｑ明による免疫原
１もしくは２で各１０匹の羊を免疫化した。投与ｔは第
１回目の及びそれに続く免疫化において動物１匹めたシ
免疫原各２００μｇであった。免役化は１ケ月の間隔で
行なわれた。

得られた血清を、列１２に記載され′ＣいるようにＨｂ
Ａｌｃに対する抗体の存在及びｖｊｎ性に関して実１倹
した。このためには、微着滴定プレートをポリハプテン
２０．０４μｇ　／　ａｔで種層した。抗体−酵素−複
合体としてはペルオキシダーゼと家兎−抗羊一免疫グロ
ブリンからの積台ｆ＄を使用した。この複合体の使用濃
度は１５０ｍＵ　／　ｍｌであった。抗原としてはＨｂ
Ａｌｃ及びＨｂＡＱ天然を使用し、ペプチドとしてはＨ
ＶａｌＨｌ　Ｉ！ＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌ　ｕＧｌ　ｕ
ｃｙｉｉＯＨ及びフルクトースＶａｌＨ１８ＬｅｕＴｈ
ｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙａＯＨを使用する。

この方法は、例１２に記載したように実施した。

次の試料全実験した： 例１４ プール１：　本発明による例４からの免疫原で処理した
１０匹の動物すべての血清試料の部分量からなる混合物
（ｉ＆初の免疫化後４５日で採血） ゾール２：　本発明による例５からの免疫原で処理しｆ
ｃｉｏ匹り動物すべての血清試料の部分１ｔからなる混
合物１ｔ？７Ｊの免疫化後４５日で採＠） 試料ａ二　本発明による例４からの免疫原１で処理した
羊６２２７の血清試料（梼初の免疫化後１６５日で採血
） 試料ｂ：　本発、３Ａンこよる例４からの免疫原１で処
理した羊３２６３の血清試料（最初の免疫化後１６５日
で採血） 試料Ｃ：　本発明による例５からの免疫原２で処理した
羊６２７２の血清試料（最初の免疫化後７５日で採血） 滴定測定は次の結果を示す： ゾール１：　　１４５４００ プール２：　　１：８４００ 試料ａ　　：　　１：り７００ 試料ｂ　　：　　１：３６００ 試料Ｃ：　　’Ｉ：２６００ Ｍ２図は抗血清濃度に依存する吸光度に関する例を示す
。

ｆｌＪ１５ 列１４中に記載されているように、グリコジル化及び非
グリコジル化抗原に対する抗体の親和性及び特異性を測
定した。結果金弟２表及び第３表並びに第６図に示した
。

第６図中では次のことを示す： 曲線　　　　抗　原　　最大使用−度（ｎｍｏｌ／ｌ）
１　　ペプチドＡ　　　　　　５３４０２　　ペプチド
Ｂ　　　　　１６０００５　　　ＨｂＡｌｃ　　　　　
　　　２６７０４　　　ＨｂＡｏ２６７０ 核貞は本発明による免疫原で、非常に特異的にＨｂＡｌ
ｃと結合するが、ＨｂＡｏとは結合しない、著しく特異
的なポリクローナル抗体を製造することができることを
示す。このポリクローナル抗体ＨｂＡ１ｃが変性なしで
、高い親和性で認識されるということが示される。更に
、本発明により得られた免疫原での処理によりそれぞれ
羊１０匹から得られたポリクローナル抗体の混合物から
なる。！ｊ［々のプールの結果から、本発明による兎疫
原金使用する際に非常に高い率の兇疫１ヒ動物が好Ｊ！
′４な抗体全生産するということが明らかである。

第　２　表 グリコジル化及び非グリコジル化抗原への抗体の滉和性 比硯和性　（ｎｍｏｌ／１）　　　　交差反応ゾール１
　　　２１　　　　＞＞１６０００　　　　３０　　＞
＞２６７０試料ａ　　　　３３　　　＞＞１６０００　
　１１５　　＞＞２（５７０グール２　　１５　　　＞
＞１６０００　　　１８　　＞＞２６７０試料Ｃ２１＞
＞１６０００　　１３４　　＞＞２６７０（１，１％ （４，６％ （ｎ、７チ （５，０％ 脣ペプチドＡ二フルクトース ＶａｌＨ１８Ｌｅｕ’ｒｈｒＰｒｏＣ）ｌｕＧｌｕｃｙ
ｏ（ＳｔＢｕ）ＯＨ１１ペプチドＢ　：　ＨＶａｌＨＬ
ｓＬｅｕＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＣｙｓ（ＳｔＢｕ）
ＯＨ第　　６　　表 Ｍｌ）Ａｌｃに対するポリクローナル抗体の＃異性実験
結果ニ ー　　　　÷ 又応性　　　プール１　　試料ａ　　　プール２　　試
料Ｃポリハプテン２＋　　　　　＋　　　　　　＋　　
　　　　＋ペプチドＡ　　　　１００　　１００　　　
１００　　　１００ＨｂＡ１ｃ天然、　　　　７０　　
　２８．６　　　Ｂ５．５　　１５．７ポリハデテン１ ペプチドＢ　　　　＜、、０．１３　　＜＜０．２　　
　＜＜０．０９　　＜＜０．１３ＨｂＡＱ天然　（肌８
　　＜＜１．２　　（０，５＜＜０．８＋ゾール１．試
料ａ：　例４の免疫原１から製造プール２．試料Ｃ：　
例５の免疫原２から製造

【図面の簡単な説明】

第１図はモノクローナル抗−Ｈｔ）Ａｌｃ−抗体（ＭＡ
Ｋｌ、６０９．３２５　）のＨｂＡ４ｃに対する反応性
の標準曲線を示すグラフ図であり、第２図は列１４によ
り得られた抗血清に関する滴定測定値（二回測定）を示
すグラフ図であシ、第６図はペノチド及びへ七グロビン
に対する抗体の比親昶性を示す図で、ｉＤシ、第１、第
２、第３及び第４自蔵はそれぞれ抗原としてペプチドＡ
１ペプチドＢ％Ｈ１）ＡＩＱ及びＨｂＡ、　ｋ用いた結
果を示す。 血、青濃度 （抗血清μｌ／ｌ溶液 Ｆｉｇ、１ Ｈｂａｌｃ　（、ｕｇ／ｍｌ　） 曲線 曲線 曲線 曲線

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｍは１〜４０を表わし、Ｔは担体蛋白質を表わ
   し、Ａは一般式II： ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、ＸはＳ又はＮＨを表わし、ｎは１〜４を表わ
   し、Ｂはサクシンイミド基を含有する有機基を表わす）
   を有する原子数１０〜２０の鎖長のスペーサーを表わす
   〕を有する、ＨｂＡ＿１＿ｃ−特異的抗体を取得するた
   めの免疫原。 ２、基Ａが原子数１２〜１８の鎖長を有する請求項１に
   よる免疫原。 ３、ｍが３〜２０を表わす請求項１又は２記載の免疫原
   。 ４、Ｂがサクシンイミジル−ヘキサノイル基を表わす請
   求項１から３までのいずれか１項記載の免疫原。 ５、特異的にグリコシル化ヘモグロビンを結合する抗体
   を取得するために、一般式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｍは１〜４０を表わし、Ｔは担体蛋白質を表わ
   し、Ａは一般式II： ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、ＸはＳ又はＮＨを表わし、ｎは１〜４を表わ
   し、Ｂはサクシンイミド基を含有する有機基を表わす）
   を有する原子数１０〜２０の鎖長のスペーサーを表わす
   〕の免疫原を、抗体を形成する能力のある生物に注射し
   、次いで自体公知法で抗体を取得することを特徴とする
   抗体の取得法。 ６、免疫原として請求項２から４までのいずれか１項記
   載の免疫原を使用する請求項５による取得法。 ７、請求項５又は６に記載の方法により得られた抗体を
   使用することを特徴とする体液中のＲｂＡ＿１＿ｃの測
   定法。 ８、細胞系ＥＣＡＣＣ８７１２０８０１。 ９、細胞系ＥＣＡＣＣ８８１２２３０２。 １０、細胞系ＥＣＡＣＣ８８１２２３０１。