JPH029400A - 非放射性標識によって検出される核酸を発色させる方法及び該方法を実施するための反応物 - Google Patents

非放射性標識によって検出される核酸を発色させる方法及び該方法を実施するための反応物

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JPH029400A
JPH029400A JP1072017A JP7201789A JPH029400A JP H029400 A JPH029400 A JP H029400A JP 1072017 A JP1072017 A JP 1072017A JP 7201789 A JP7201789 A JP 7201789A JP H029400 A JPH029400 A JP H029400A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、固体支持体（ｓｏｌｉｄ　　ｓｕρｐｏｒシ
）に固定された後、非放射性標識法（ｎｏｎ−ｒａｄｉ
ｏａｃＬｉｖｅｌａｂｃｌｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）によ
り検出される核酸を発色させる（ｓｔ、ａｊｎｉｎｇ）
方法に関する。
従来技術及びその課題 生化学の分野では、特定の核酸配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ
）を検出することが、年々重要な課題となってきている
。このことは、遺伝病を検出するのに特に重要である。
固体支持体を使用した方法、すなわち、試料から核酸が
転移固定されるポリアミドの膜やニトロセルロースの膜
を使用する方法が筬に知られている。このようにすれば
、所望の配列を固体支持体上で検出することができる。
試料中の核酸は、天然或いは合成の、変更（ｍｏｄ−ｉ
ｆｉｃｄ）或いは不変更のＤ　Ｎ　Ａ又はＲＮＡである
。
通常、核酸は制限酵素を使用して明所される。明所され
た阿片は、ついで、公知の手段で固体支持体上に移され
固定される。
特定の配列は、それから、ｎプローブ（ｐｒｏｂｅ）の
ような検出システムを使用して判定される。
プローブとは、それ自身を配列上に固着し１本来の位置
で、すなわち固体支持体上に自身が同者する位置で、配
列を明らかにするものである。
一般に、使用される検出システムは９判定される配列と
相補的な配列を具え、検出システムの配列は判定さ才り
る配列と交！　（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）できる配列であ
る。このような交１１　（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
）は。
検出システムがＩＭ体支持体上に保持された相補性配列
を認めた場合にのみ生じる。
核酸の直接検出は、固体支持体上に保持された″標的（
ｔａｒｇｅｔ）　”配列と、検出手段の一部分（ｐａ−
ｒｔ）を構成する″プローブ″配列との間の交雑を必要
としない他の方法でも行うことができる。
このような核酸検出は、直接的なものや、２つの８１補
的な核酸配列の交雑を伴うものであっても、放射性同位
元素を使用する工程を欠くことができない、このような
方法では、’　Ｈ或いは！！ｐで放射能１１ＲＩ、た（
ｒａｄｉｏ−１ａｂｅｌｌｅｄ）　１以上のヌクレオシ
ドが、核酸を標識する（ｌａｂｅｌ）ために使用される
。それは、コンピュータやオートラジオグラフィーで検
出される。このような公知の方法は信頼ｆ性が高く感度
が鋭敏ではあるが、その反面、放射能の使用が可能な特
別な装、？Ｌ設備が備おった実！ｉ室を必要とする。さ
らに、このような実験室は。
放ｉ１４能の取り扱い、使用、隔離をするための必要な
免許の取得を欠くことができない。
この問題を解決するために、放射性同位元素を使用しな
い検出方法が最近になって開発されてきた。
このような一つの方法は、艮のような固体支持体に予め
核酸を固定し、そして酵素系が非放射性で配列を標識す
るように使用される方法であって、この酵素系は、その
後、本来の場所で凝結して（Ｐ−ｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ
）　、発色物質を形成するように色素基質と反応させら
れ、かくして、その反応部位において、配列を明らかに
する（ｒｅｖｅａｌ）。
この方法は、特定の核酸を特徴付けるのに必要な物質を
含む反応物の１セツト、すなおちキラ１−（ｋｉｔ　）
を使用して行われる。
商業的に最も利用が盛んな核酸検出キットは。
最終の可視検ｆｆｉ酵素としてアルカリ性ホスファター
ゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を使用している。この酵
素の特徴は、この酵素を使用した非放射性検出が放射性
同位元素を使用した方法と同程度の感度を有することで
ある。
アルカリ性ホスファターゼは、このタイプの検出が使用
される他の酵素、例えば、ペルオキシダーゼやゲルコシ
ダーゼと比べて特に耐性があり、極めて感度が高い。
非放射性のシステム及び方法の主な長所は、それらが放
射性物質をＪｉｆｆ　Ｉｎに使用できない状況でもミ所
に使用できるということである。このような新しい詮所
テスト、特にエライザ（ＥＬＩＳＡ）テストは、全ての
分野、特に、瑚菌学、ビールス学、寄生物学の分野の公
知のテストに置き換わることができるであろう、こわら
のシステム及び方法は。
検出可能な核酸が見出される如何なる場所でも。
すなわち、生体内でも使用することができる。
非放射性（′″コールドｃｏｌｄ）　”　）プローブの
使用は、検出感度が放射性同位元素を使用したものと少
なくとも同程度であるとの理由で、）ＡＤ研究及び臨床
実験において重要な利点を有する。
Ｊｒ＝放射性プローブは、これらが特別な装置を必要と
せずに直ちに使用することができろとうぃう理由で、特
に有用である。放射性元素を使用する技術者に強いられ
る危険性がなく、さらに、有毒性、又は発癌性物質の使
用も必要としない。
しかし、このようなシステムや方法は放射性元素のプロ
ーブに優る種々の長所があるが、コールドプローブはま
だ多くの問題点を抱えている。
この問題点のいくつかは９例えば、現在可能となった独
自（ｕｎｊｑｕｅ）配列の検出においては解決された。
コールドプローブの主な欠点の一つは、膜のような固体
支持体が交雑後や比色検出後において再度使用できない
ということである。これは、臨床及びノ５礎研究におい
て大きな問題となる。
研究者は、実１ｍ　＃ｉｌ　ｍとして、標的（ｔａｒｇ
ｅｔ）核酸が１１寸走込れた固体支持体を、何回も、場
合によっては２０回も再使用しなければならない。
これは、固定された核酸が極めて高価であるからである
。また、抽出作業が長く、高価で困難であるためや、胎
児のＤＮＡのようにその核酸が希少であるからでもある
。そのため、核ａ標的上に何回もプローブを固定できろ
ようにすること、例えば＋１＃交雑することができるよ
うにすることが重要である。
このような再交雑は、放射性元素のプローブでは周知で
あるが、コールドプローブでは１本来の場所で（ｉｎ　
　５ｉｔｕ）凝結した発色物によって構成される色の消
せない付着物のために不可能であった。
発色生成物を除去する多くの試みがなされたが、成功す
るに至らなかった。この点に関して、ある製造又者は付
着性発色を除去するために、１以上の放射性同位体を有
するジメチル・ホルムアミドの使用を提唱した。しかし
ながら、ジメチル・ホルムアミドは、放射性同位体を有
するときには特に、揮発性の奇形形成因子である。従っ
て、何回も洗浄する場合の使用は制限される。
従って、１２在のところ１分析すべき核酸が転移し固定
した固体支持体が繰り返し使用できるように５可視化後
に直ちに除去できるような、発色性で不溶解性の物質を
生成する基質を使用した比色検出（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔ
ｒｉｃ　ｄｅＬｃｃｔｉｏｎ）方法はない。
本発明の１つの目的は、適当な固体支持体上に固定され
る核酸を発色させる方法を提供することであり、この方
法は非放射性標識検出方法であって、反応によって生成
した発色物の除去ができるようになっているものである
。
本発明のもう１つの目的は、使用者に危険を与えない物
質を使用して発色物の除去が行えるような方法を提供す
ることである。
本発明の他の［１的は、良好な発色、そのため。
核酸の良好な検出、特に、独自のゲノム配列の発色物を
生成する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、分析すべき標的核酸が不可逆的（
ｉｒｒａｖａｒｓｉｂｌｙ）に固定されるポリアミドや
ニトロセルロースの膜によって構成される固体支持体に
特に適用されるような方法を提供することである。
本発明の他の目的は、特に膜のような固体支持体が、発
色の痕跡を残すことなく完全に白色の固体支持体を生成
するように直ちに脱色され、別個の検出操作、例えば交
雑にすぐに再使用されるような方法を提供することであ
る。
そして１本発明のもう１つの目的は、前述の検出方法を
実施するための反応物のセット、すなわちキットを提供
することである。
課題を解決するための手段 本発明は、第１に、酵素系を使用して固体支持体Ｅに固
定される核酸配列を発色させる方法であって、前記Ｉｇ
素系が前記配列を非放射性標識によって検出できるよう
に前記配列に固着するようになっており、前記酵素系が
反応部位で検出される配列を直接明らかにするように本
来の場所（ｉｎｓｉｊｕ）で凝結（ｐｒｅｃｉｐｉｔａ
ｔｅ）する発色物（ｃｏｌｏｒｅｄ眞記酵素系のための
基質を形成し有機チオールを形成するように前記酵素系
により加水分解されるような硫黄原子との結合を有する
硫黄を含む有機化合物と。
水溶液に溶解しかつ安定であり１本来の場所で凝結して
特徴ある色を呈する金属・硫黄化合物複合体を形成する
ように前記有機チオールと反応可能であり、その後脱色
されうる金属化合物とを有する方法を要旨とする。
好ましくは、金属化合物中の金属は、金、水銀。
銀、白金又は鉛である。
好ましくは、使用される金化合物は、黄色の金・硫黄化
合物複合体を形成するように有機チオールと反応するこ
とができるものである。
本発明の好ましい実施例では、金属・硫黄化合物複合体
は、ついで前記複合体の色を強調する強調側化合物（ｉ
ｎｓｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ）と反応
するようになっている。得られた複合体の色は、たとえ
視覚的にはっきりしていても、写真として必ずしも明瞭
になるわけではない。金・硫黄化合物複合体の特徴であ
る黄色では、特にそうである。
本発明の他の特徴によると、得られた金属・硫黄化合物
複合体は、必要に応じて色が強調されたものであっても
、ついで、脱色溶液で処理される。
脱色溶液は５分析すべき核酸が不可逆的に固定された固
体支持体の再使用を可能にする。
上述したように１本発明の方法は、適当な固体支持体上
に不可逆的に固定された天然或いは合成の、変更或いは
不変更のＤＮＡ又はＲＮＡの検出にも使用できる。
これらの固体支持体は、当業界で知られており。
例えばポリスチレンやラテックス等からｔＰｉ　Ｊ＆す
ることができる。
しかし１本発明の好ましい実施例では、この方法はポリ
アミド（ナイロン）やニトロセルロースの膜を使用して
行おれる。
分析すべき試料中のＭｆｌｌは、適当な公知の技術を使
用して、それらを切断するように利限酵索により処理さ
れ、次に、固体支持体上に移される。
切断された核酸は１例えば、アガロース・ゲルが封入さ
れた容器に入れられてもよい、この時、アガロース・ゲ
ルは固体支持体に毛細管現象によって翫移する。或いは
、核酸は、支持体をフィルターとじて使用して、支持体
に直接付着させてもよい。
各々の場合、支持体、特に膜に移された核酸は、当業界
で知られた乾燥、′Ｍ外外線処理−は熱処理によって、
支持体上に固定される。
本発明の方法の次の工程では、核酸を固定した固体支持
体は、固体支持体上に保持された標的核酸配列と相補的
なプローブ核酸配列を含む適当な酵素系で処理される。
そのため、この酵素は、プローブ或いは標的核酸と直接
的に反応するか、或いは、共役抗体、蛋白質、他の化合
物によって間接的に反応するものでなければならない。
本発明の好ましい実施例では、使用される酵素系は１例
えば、アルカリ性ホスファターゼのようなリンａ酵素性
活性（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｉｃ　ａｃｔｊｖｊｔｙ）
を有する酵素である。
この場合、使用される顕色溶液は、適当な基質。
例えば、Ｓリン酸シスタミン（ｃｙｓｔａｍｉｎｅ−５
−ｐｈ−ｏｓｐｈａｔｅ）、アデニン・モノヌクレオチ
ド・ネ入フエ４ト（ａｄｅｎｉｎｅ　　ｍｏｎｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）＋或いはアデノ
シン５′モノホスフエイト（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’
　−鵬ｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含んでいなければ
ならない。
上述のように、酵素系のために基質を形成する硫黄有機
化合物は、有機チオールを生成するように［１によって
加水分解されるようになっている。
特にアルカリ性ホスファオターゼの酵素系が使ｔＵされ
た場合、酵素基質は酵素によって認められるリン酸グル
ープのチオエステル（ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ）結合を含む
化合物である。酵素によってこの結合の加水分解が、リ
ン酸イオンと例えばＲ−８ＨＪＪ　（Ｒは炭化水素）の
化合物のようなチオール・グループを持つ有機化合物を
遊離する。Ｒ−５Ｈ基は。
１、？徴ある色を呈する金属・硫黄化合物複合体を形成
するような水溶液中で溶解し安定であるいくつかの金属
化合物と反応することができる。
ホスファターゼ＃素を持つｆｇ素系の替わりに。
グルタチオン・レダクターゼ酵素を持つ系を使用し、そ
の後、この特定の酵素の基質を使用してもよい。
この例の方法に使用される金属化合物は、水溶液中で溶
解して安定であり、上述したように、特徴ある色を呈し
て本来の場所で凝結する金属・硫黄化合物複合体を形成
するように有機チオールと反応できなければならない。
金属化合物が金化合物である好ましい実施例では、有機
金化合物や金塩を使用することができる。
そのため、Ａｕ　（Ｉ）を含む金化合物を、すなわち、
金が最も一般的に酸化しやすい状態にある場合において
使用できる。この場合、金は水中で。
Ｌ−シスチンと非溶解性の複合体を生成する０反応はモ
ル単位で２重合タイプの複合体を生成し、金の固定がシ
スチン硫黄原子で生じる。
水溶液中でＡｕ　（１）として金を安定させることので
きる化合物は僅かしかない。このような化合物の中には
、ソジウム・アウロチオマレート（ｓｏｄｉｕｍ　ａｕ
ｒｏｔｈｉｏｍａｌａｔｅ）　（Ｍｙｏｃｒｉｓｉｎｃ
）と７ウロチオグルコース（ａｕｒｏＬｈｉｏｇｌｕｃ
ｏｓａ）　（Ｓｏｌｇａｎｏｌ）がある。
本発明の好ましい実施例では、アウロチオグルコースが
、水溶液中で極めて安定であるという理山で使用される
。アウロチオグルコースは、反応と 部位のＡの場所で凝結してレモン−金色の黄色複合体を
形成するように、酵素反応からの加水分解物質のチオー
ル・グループと反応する。
また１本発明の顕色溶液中に使用される金化合物は、水
溶液中で溶解して安定な金塩１例えば、１１Ａｕｃ１．
によって作られてもよい。
本例の方法に使用される顕色溶液は、好ましくは、！１
３々中性或いは僅かに低基性の緩衝液（ｂｕｆＴｅｒ　
５ｏｌｕｔｉｏｎ）　、例えば、トリス・アセテート（
Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ）と酢酸マグネシウム（ｍａ
ｇｎｅｓｉｕ１５ａｃｅｔａｔｅ）の緩衝液と混合され
てもよい。
顕色溶液は、　！ｉｆましくは、緩衝液と硫黄・有機基
質化合物と１例えば金化合物のような金属化合物とを混
合することによって、使用前、即座に作製される。
このようにして得られた水溶液は、探索される核酸を明
らかにするために直ちに使用される。
金属・硫黄化合物複合体の特徴ある色を、強調剤化合物
で処理することによって強調することができる。この化
合物は、夕Ｆましくは、茶−黒複合体を生成するような
複合体と反応できる銀塩１例えば硝酸銀や過塩素酸銀で
ある。この色は、非常に良く見え、写真としても特に写
りがよい。
本例の方法では、得られた凝結発色物を１１２１１Ｍ　
（ｊｎｔｅｎｓｉｆｉｃｒ）によって、或いはこれによ
らずに、脱色溶液で処理することにより除去することが
できる。
本発明によると、この溶液は、好ましくは、Ｗｌ性媒体
中の高濃度のチオ硫酸ナトリウムとチオ硫酸アンモニウ
ムの混合物である。
脱色溶液での処理後、固体支持体上に固定されて残って
いる核酸の配列から蛋白質や核酸の全ての痕跡を除去す
るように、支持体は尿素とＳＤＳ（（ｓｏｄｉｕｇ＋　
ｄｏｄｅｃｙｌ　５ｕｌｆａｔｅ　）　ドデシル硫酸ナ
トリウム）の熱い混合物で処理することができる。
必須反応物の１キツトが、本発明の方法を行う上ために
提供される。
他の観点によると１本発明は、酵素系が非放射性標識に
よって核酸配列を検出するために使用されて固体支持体
上に固定された前記配列を発色させるための反応物のセ
ットであって、前記反応物のセントは、硫黄原子との結
合を持ち前記酵素系のための基質を形成する硫黄有機化
合物であって前記硫黄有機化合物は前記酵素系によって
有機チオールを生成するように加水分解するようになっ
ているものを（容器に）入れたものと、水溶液中で溶解
して安定であり本来の場所で凝結して特徴ある色を泉す
る金属・硫黄物産合体を生成するような前記有機チオー
ルと反応できる金属化合物を入れたものと、顕色溶液を
形成するように眞記基灯と金属化合物が混合された緩償
液（ｂｕｆｆｅｒ　５ｏｌｕ　−ｔｉｏｎ）を入れたも
のと、脱色溶液を入れたものとからなる。
好ましくは、この反応物のセットは、さらに。
強調剤溶液（ｉｎｓｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇ　　５ｏｌｕ
ｔｉｏｎ）を入れたものと、尿素とＳＤＳの混合物溶液
を入れたものを含む。
実　　　施　　　　例 以下、実施例によって１本発明をさらに説明する。
［実施例１］ 本実施例では、アルカリ性ホスファターゼを有する酵素
系が使用された。
顕色溶液が１次の反応物から、即座に作製された。
トリス（Ｔｒｉｓ）−アセテート５０ｍＭ　　ｐＨ：　
９．５＃酸マグネシウム　　　　１０ｍＭ リン酸シスタミン　　　　　５躇に アウロチオグルコース　　　３−Ｎ この顕色溶液は１分析すべき核酸が固定された間の間で
色が現すれてきた。
リン酸シスタミンは、化学式 ％式％ で表わされるスタミンを遊離する、化学式ＮＨｚ　−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ２＝Ｓ−［’０３　Ｈ２を有する化合物であ
る。シスタミンは、ついで。
アルカリ性ホスファターゼと加水分解する。アウ成する
ように、リン酸シスタミンの酵素加水分解によって形成
されたシスタミンのチオール・グループと反応する。
変更された核酸又は核酸ハイブリッドの可視度は５過塩
素酸銀や硝酸銀とアウロチオグルコースーシスタミン化
合物の反応によって、ｉ＜可視化された赤茶〜黒の着色
を生成して強調（ａｃｃｅｎ−ｔｕａＬｅ）される。
実施例では、過塩素酸銀や硝酸銀が１ＯＯｄ使／１７さ
れた。アウロチオグルコースーシスタミン化合物が充分
に形成したと認められると、すぐに。
膜が蒸留水で軽く洗浄され、銀塩溶液が加えられた。
銀とアウロチオグルコースーシスタミン化合物の反応は
瞬時に或いは殆ど１ｌ１１１ｆｆに生じた。茶色の発色
物が成長した後、膜が蒸留水で洗浄され、その結果を写
真に撮った。
発色物の成長は、アルカリ性ホスファターゼがプローブ
核ｍ　（ＤＮＡ或いはＲＮＡ）若しくは標的核酸（ＤＮ
Ａ或いはＲＮ　Ａ　）によって直接保持されているか、
又は共役抗体、他の蛋白質或いは他の化合物によって間
接的に保持されているかに拘らず、アルカリ性ホスファ
ターゼが固定された位δにｆ、？右のもの（５ｐ６ｃｉ
　ｆ　ｊｃ）である。
この方法の感度は、既に述べた非放射性核酸ハイブリッ
ドが使用された。従来の発色物を使用して得られた感度
に等しい、このような発色の例は、５−ブロモ−４クロ
ロ−３−インドリル・リン酸（５−ｂｒｏａｏ−４−ｃ
ｈ　Ｉｏｒｏ−３−ｉ　ｎｄｏ　１　ｙ　１−ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ）　（ＢＣＩＰＯ）とニトロブルーテトラゾ
リウム（ｔｅｔｒａｚ、ｏｌｉｕｓ１’１ｔｒｏｂｌｕ
ｅ）　（ＴＮ口）である。
得られた結果は、バックグラウンドの干渉（ｂａｃｋｇ
ｒｏｕｎｄ　１ｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）が顕著に減少
し、バンドの鮮明度（ｂａｎｄ　ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ
）が改善されたことを示した。
ｉｐｌ述の方法で、Ｉ　Ｐｇｌ）　Ｎ　Ａに至るまでの
ドツト・プロット（ｄｏｔ：　ｂｌｏｔ）検出と、膜に
”５ｏｕｔｈｅｒｎ’″タイプの転移を伴うシングルゲ
ノム配列の交雑の検出ができた。この方法は、アガロー
ス・ゲル中で駒間酵素を使用してニトロセルロース膜や
ポリアミド膜上に電気泳動を受けた加水分解された核酸
の付着作用（ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）からなるものであ
る。
る。
膜の脱色が、　ＰＩ−１４，８であり、ＬＭのチオｇｌ
ｌｌｌ！アンモニウムとＩＭのチオ硫酸ナトリウムと０
．　ＩＮの＃酸ナトリウムを含む脱色溶液を使用して行
われた。又は、脱色を、２Ｍのチオ硫酸ナトリウムの溶
液で１１＠に希釈された写真用フィルムのための定着剤
を使用して行うこともできる６例えば、ギレミノー（Ｇ
Ｕ　ＩＬＬＥＭ　ｌＮ０Ｔ）によって製造された定着剤
が使用できる。
脱色は、室温で約１５分間、脱色溶液中に膜を浸漬する
ことによって行おれた。
ついで、膜はプラスチック製の容器中に入れられ、７Ｍ
の尿素と１％（７）　Ｓ　Ｄ　Ｓ　（＋００　ｐ　Ｉ／
ｃｍ”　）の溶液が加えられた。容器は密封され、つい
で。
７０″の温浴に１５分から３０分浸漬された。膜は、室
温で蒸留水によって洗浄・乾燥され、ついで、その後の
配列検、“’Ｂ　１作に使用するための膜を生成するよ
うに、２枚のワットマン紙の間で保存された。保存は室
温でよい。
［実ｍＮ２コ この実施例では、酵素グルタチオン・レダクターゼを有
するＩｇ素系を使用した。
分析すべき酸が転移して固定された膜を処理するために
、この酵素系が使用された。
顕色溶液が７次の反応物から、即座に作製された。
トリス−塩化水素　　　　５０ａ＋Ｎ　　ρ１１ニアＮ
ＡＤＰＨ”　　　　　　　　　　　　　　５ｓＭ酸化グ
ルタチオン　　　　　５１１Ｎ （ナトリウム塩） １１Ａｕｃｌ、　　又は１ウロチｔり゛ルコース　　　
３ｓＭＮＡＤＩ）Ｈ’＝ニコチンアミド・アデニン・ジ
ヌクレオチド・ホスフェイト（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｊｄ
ｅａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔ、ｉｄｃ　ｐｈ
ｏｓｐｈａＬｅ）　Ｍ元体本実施例の後半は、第１実施
例と同様である。
本発明の方法は、多くの分野、特に、１ａ菌学。
ビールス学、寄生停学の分野に適用可能であり。
公知のコールドプローブの機相を著しく改善するもので
ある。
これらの適用範囲は、特に、胎児細胞試料を使用した胎
児の遺伝病の検出、ハンチイントン（Ｉｌｕｎｔｉｎｇ
ｔｏｎ）病のような遺伝病の診所、父親の判定、殺人や
強盗事件における犯人の特定、１１値瘍中の癌細胞集団
の研究、遺伝交差（ｃｒｏｓｓｉｎｇｓ）中の　ＲＦ　
　Ｌ　　Ｐ　　（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　　　Ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ　　Ｌｅｎｇｔｈ　　Ｐｏ１ｙ−ａｏｒｐｈ
ｉｓ■）研究を含むものである。

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）酵素系を使用して固体支持体上に固定される核酸
    配列を発色させる方法であって、前記酵素系が前記配列
    を非放射性標識によって検出できるように前記配列に固
    着するようになっており、前記酵素系が反応部位で検出
    される配列を直接明らかにするように本来の場所で凝結
    する発色物を形成するように色素基質と反応させられ、
    顕色溶液が、前記酵素系のための基質を形成し有機チオ
    ールを形成するように前記酵素系により加水分解される
    ような硫黄原子との結合を有する硫黄を含む有機化合物
    と、 水溶液に溶解しかつ安定であり、本来の場所で凝結して
    特徴ある色を呈する金属・硫黄化合物複合体を形成する
    ように前記有機チオールと反応可能であり、その後脱色
    されうる金属化合物とを有する、方法。
  2. （２）前記金属化合物中の金属は、金、水銀、銀、白金
    又は鉛である、請求項１記載の方法。
  3. （３）前記金属化合物は黄色の金・硫黄化合物複合体を
    形成するように前記有機チオールと反応することができ
    る金化合物である、請求項２記載の方法。
  4. （４）前記金属・硫黄化合物複合体は、ついで前記複合
    体の発色を強調するように強調剤化合物と反応するよう
    になっている、請求項１記載の方法。
  5. （５）前記金属・硫黄化合物複合体は脱色溶液で処理さ
    れるようになっている、請求項１記載の方法。
  6. （６）前記酵素系がアルカリ性ホスファターゼのような
    リン酸酵素であり、前記顕色溶液がＳリン酸シスタミン
    のようなホスファターゼ基質若しくはアデニン・モノヌ
    クレオチド若しくはアデノシン５′モノホスフェートと
    金属有機化合物若しくは適当な金属塩を有してなる、請
    求項１記載の方法。
  7. （７）前記金属化合物が金化合物であり、前記酵素系が
    アルカリ性ホスファターゼであり、前記顕色溶液が前記
    ホスファターゼ基質を含むＳリン酸シスタミンと前記金
    属有機化合物を含むアウロチオグルコースとを有する、
    請求項６記載の方法。
  8. （８）前記顕色溶液は、 トリス−アセテート５０ｍＭ　ｐＨ：９．５酢酸マグネ
    シウム１０ｍＭ Ｓリン酸シスタミン５ｍＭ アウロチオグルコース３ｍＭ からなる、請求項７記載の方法。
  9. （９）前記酵素系がグルタチオン・レダクターゼ酵素で
    あり、前記顕色溶液がグルタチオン・レダクターゼ基質
    と金属有機化合物若しくは適当な金属塩とを有してなる
    、請求項１記載の方法。
  10. （１０）前記金属化合物は金化合物であり、前記顕色溶
    液は、 トリス−塩化水素５０ｍＭ　ｐＨ：７ ニコチンアミドアデニン ジヌクレオチド ホスフェイト（還元体）５ｍＭ 酸化グルタチオン５ｍＭ （ナトリウム塩） ＨＡｕＣｌ＿４又はアウロチオグルコース３ｍＭからな
    る、請求項９記載の方法。
  11. （１１）前記強調剤化合物が茶−黒染色を生成するよう
    に前記金属・硫黄化合物複合体と反応できる硝酸銀のよ
    うな銀塩である、請求項４記載の方法。
  12. （１２）前記脱色溶液が酸性媒体中の高濃度のチオ硫酸
    ナトリウムとチオ硫酸アンモニウムの混合物からなる、
    請求項５記載の方法。
  13. （１３）前記脱色溶液での処理後、前記支持体が前記固
    体支持体上の核酸配列を除いて全ての核酸及び蛋白質の
    痕跡を除去するように、尿素とドデシル硫酸ナトリウム
    の熱い混合物で処理されるようになっている、請求項１
    ２記載の方法。
  14. （１４）酵素系が非放射性標識によって核酸配列を検出
    するために使用されて固体支持体上に固定された核酸配
    列を発色させるための反応物のセットであって、 硫黄原子との結合を持ち前記酵素系のための基質を形成
    する硫黄含有有機化合物であって、前記硫黄有機化合物
    は前記酵素系によって有機チオールを生成するように加
    水分解するようになっているものを入れたものと、 水溶液中で溶解して安定であり本来の場所で凝結して特
    徴ある色を呈する金属・硫黄化合物複合体を生成するよ
    うな前記有機チオールと反応できる金属化合物を入れた
    ものと、 顕色溶液を形成するように前記基質及び金属化合物と混
    合される緩衝液を入れたもの、及び脱色溶液を入れたも
    のからなる、 反応物のセット。
  15. （１５）発色強調剤化合物の溶液を入れたものと、尿素
    とドデシル硫酸ナトリウムの溶液を入れたものをさらに
    有する、請求項１４記載の反応物のセット。
JP1072017A 1988-03-25 1989-03-27 非放射性標識によって検出される核酸を発色させる方法及び該方法を実施するための反応物 Pending JPH029400A (ja)

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