JPH03103182A - 外来遺伝子の発現を促進するｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、発現効率の高いベクター作製に有用な、外来
遺伝子の発現を促進する作用のあるＤＮＡ断片に関する
ものである。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点］従来
、植物において外来遺伝子を発現させるためのプロモー
ターとしては、ノバリン合成酵素の遺伝子（ＮＯＳ）プ
ロモーターやカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ
）３５３プロモーターなどが用いられて来たが、これら
は植物種によっては必ずしも発現効率が良いとは言えず
、特にイネ科植物では発現効率の良いプロモーターは現
在知られていない。一般に、発現効率を高めるためには
、エンハンサーなどの効果が高い事が知られているが、
イネ科植物では有効なエンハンサーはまだ見つけられて
いない。またトウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝
子（Ａｄｈ）の第１イントロンを組込んだベクターでは
、外来遺伝子（クロラムフエニコールアセチル化酵素遺
伝子）の発現が、約１０倍高まる事も、トウモロコシを
使った実験で確かめられている（Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ，上，１１８３．１９８７）のみである
。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、イネ科植物において、発現効率の良いプ
ロモーターを得るべく鋭意検討した結果、ヒマカタラー
ゼ遺伝子（ＣＡＴ−１）の第１イントロンを組込んだ発
現ベクターが、安定的に発現効率が高い事を見出し、本
発明を完成するに至った。

即ち、本発明の要旨は、 下記塩基配列（Ａ）で表わされるＤＮＡ断片を有し、外
来遺伝子の発現を促進する作用を有することを特徴とす
るＤＮＡ断片に存する。

・・・　（Ａ） 以下本発明を説明する。

本発明の外来遺伝子の発現を促進する作用を有するＤＮ
Ａ断片は、上記塩基配列（Ａ）で表わされる塩基配列を
有する。

なお、上記塩基配列（Ａ）は、相補的な塩基配列の記載
を省略して１本鎖のみ示してある。

上記塩基配列（Ａ）において、上記作用を損なわない範
囲で塩基の一部を置換、追加、削除してもよい。例えば
、上記塩基配列（Ａ）の第１番目の「Ａ」の５′末端側
に「Ａ」を追加し、また、第２番目の「Ｃ」と第３番目
のｒＡＪの間にｒＡ」を追加したものが挙げられる。

本発明の外来遺伝子の発現を促進するｏ　Ｎ　Ａ　ｇ片
は、例えば次の様な方法で得られる。ヒマカタラーゼ遺
伝子（ＣＡＴ−１）（日本植物生理学会１９８８年度大
会講演要旨集，Ｐ．４４，１９８８）断片をＮｃｏｌと
ＢａｍＨＩで切断し、第一イントロンから第二エクソン
に至る領域を切り出す。次いで、大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼクレノー酵素で処理し、Ｍ１３プラスミドベクター
、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＭ１３　（−）プラスミドベク
ター等に組み込んでクローニングする。

次に、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ　　（インビト口の塩基置換）により１塩基の
挿入（上記塩基配列（Ａ）の第２００番目に「Ａ」を挿
入）、２ケ所（上記塩基配列（Ａ）の第２１５番目と第
２１７番目）の塩基置換を引き起こし、イントロン中に
終結コドンｒＴＡＧ．と第二エクソン上流にＳａｌｌサ
イトを導入することによって得られる。もとより、本発
明のＤＮＡ断片は合成法によっても得ることができる。

上記の様にして得られたＤＮＡ断片を植物の発現ベクタ
ーに組み込むことによって、植物細胞内で効率よく発現
する発現ベクターが得られる。

その際、上記ＤＮＡｔ！Ｉｔ片は、５′末端側にはＸｂ
　ａ　Ｉ　，　ＫＬ血１　，　Ｈ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ
、ＸｈｏＩ，Ｐｓｔｒ等の制限酵素部位を、また、３′
未端側にはＳａｉｌ、Ｐｓｔｌ，ＥｃｏＲ（、ＥｃｏＲ
Ｖ等の制限酵素部位を付加して発現・ベクターに組み込
むことができる。もとより、これら制限酵素部位を付加
することなく直接上記ＤＮＡ断片を発現ベクターに組み
込むこともできる。

本発明の発現ベクターのプロモーターとしては、植物細
胞内で機能するものであればいずれも使用し得るが、例
えば、カリフラワーモザイクウィルスの３５３プロモー
ター［ｐＢ！２２１．　　（ＥＭＢＯ　　Ｊ．，６，３
９０１．　　１９８７））、トウモロコシのＡｄｈｌプ
ロモーター（Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．，土，１１８３．１
９８７）、ＮＯＳ（　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉｄ　
　Ｒｅｓ．，上土，３６９．１９８３）等が挙げられる
。

また、ターミネーターとしては、例えば、Ｊ）ＢＩ２２
１に由来するノパリン合成酵素のターミネーター、Ｃａ
ＭＶのターミネーター（ＥＭＢ○Ｊ，，３，２７１７．
１９８４）等が挙げられる。

本発明においては、レポーター遺伝子として、大腸菌グ
ルキュロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子ＣＰ．Ｎ．Ａ．Ｓ，
，８エ，８４４７．１９８６）、ＣＡＴ（クロラムフエ
ニコール　アセチルトランスフエラーゼ）（Ｎａｔｕｒ
ｅ，２８２，８６４．１９７９）等のＡＴＧ開始コドン
を除去した断片を組み込むと、クローンのスクリーニン
グが容易になるので好ましい。

上記各構ｒｆｉ戒分を、ｐＵＣ，ｐＢＲ３２２等のプラ
スミドベクターに組み込むことによって発現ベクターが
構築されるが、その際、各構威戒分は、通常、プロモー
ター／本発明のＤＮＡ断片／レポーター遺伝子／外来遺
伝子／ターミネーターの順ちこ連結される。

本発明の発現ベクターで発現される外来遺伝子は特に制
限されないが、例えば、グルタミン合或酵素、ＢＴ毒素
蛋白、β−１，３−グルカナーゼ等の種々の遺伝子が挙
げられる。

上述の様にして構築される発現ベクターは、植物プロト
ブラスト、例えば、タバコ、トマト、ペチュニア等の双
子葉植物やイネ、トウモロコシ、コムギ等の単子葉植物
のプロトプラストにエレクトロポレーション法等公知の
方法により導入することができる。

次いで、常法に従い培養することによって上記発現ベク
ターを含む植物体を再生することができる。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて更に本発明を具体的に説明する。

実施例１（第１図参照） （１）　　イントロンを含むＤＮＡ断片の調製ヒマカタ
ラーゼ遺伝子（ＣＡＴ−１）断片１μｇをＮｃｏ’Ｉ　
　’ｌｕにより１０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）
，１００ｍＭ塩化ナトリウム及び６ｍＭ塩化マグネシウ
ムを含む緩衝液１０μｌ中で３７゜Ｃ，２時間反応させ
消化した。次にＢａｍＨｌ　　ｌｕを反応液に加え、さ
らに３７゜Ｃ、２時間反応させた。エタノール沈澱後、
１５μ１１０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸−１ｍＭＥＤＴＡ　（
ｐＨ８．０）緩衝液（ＴＥ液）に溶かし、２．０％アガ
ロースゲルで７０ｖ５時間電気泳動した。イントロンを
含むゲルをナイフで切り出し、透析チューブに入れ１０
０ｕｊ２の８９ｍＭＴｒｉｓ−塩酸、２ｍＭＥＤＴＡ、
８９ｍＭホウ酸を加え、同液中でｌ３５ｍＡ、３０分間
電気泳動した後、緩衝液中のＤＮＡをエタノール沈澱で
蒸発乾燥後、ＴＥ液を加えた。このＮｃｏｌ−ＢａｍＨ
Ｉ断片０．　５　ｕ　ｇをＤＮＡポリメラーゼクレノー
酵素５ｕを含む７０ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ一塩酸（ｐＨ７．
４）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭＤＴＴ及び各
５０ｔｌＭのｄＡＴＰ，ｄＣ；ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴ
Ｐの緩衝液３０μｌ中で室温、２０分間反応後さらに、
７５゜Ｃ、１０分間反応させた。

次にＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　　Ｍ１３（　　）プラスミ
ドベクター１００ｎｇをＳｍａＴ　　１μｌｏｍＭＴｒ
ｉｓ一塩酸（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ塩化カリウム、１
０ｍＭ塩化マグネシウム及び１ｍＭＤＴＴを含む緩衝液
１０μｌ中で３７゜Ｃ、２時間反応させエタノールで沈
澱させた。その後イントロンを含む断片１００ｎｇとＳ
ｍａ　Ｉで切断したＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　　Ｍ１３　
　（　　）１００ｎｇにＴ４リガーゼ１ｕを用い、１０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化
マグネシウム、１０ｍＭ　　ＡＴＰ及び１ｍＭ　　ＤＴ
Ｔを含む緩衝液ｌＯｐｌ中で４゜Ｃ５　１６時間反応さ
せてプラスξドｐＡＯＩＮＢを得た。

次にこのイントロンを含む断片にｌ塩基の挿入、２ケ所
の塩基置換を引き起こすため第１図に示す３３ｍｅｒの
オリゴヌクレオチドを合成した。上述のｐＡＯＩＮＢを
ＪＭ１０９菌に感染させ一本鎖ＤＮＡを得た。０．２ｐ
ｍｏｌの一本鎖ＤＮＡと０．　２　ｕ　ｇの二本鎖ＤＮ
Ａとをアニーリングさせ、Ｍｕｔａｎ−Ｇ（宝酒造社製
）のキットを用いて変異の導入されたプラスミドｐＡＯ
ＩＮＢｍｕｔを得た．この結果、イントロン中の第二エ
クソンより塩基上流に終止コドンＴＡＧが導入され、ま
たイントロン３′側下流５塩基のところにＳａｔ■サイ
トが導入された（第２図参照）。

ｐＡｏ　ＩＮＢｍｕ　ｔプラスミドＤＮＡをＮｃｏ１　
　１ｕを含む１０ｍＭＴｒｉｓ一塩酸（ｐＨ７．５）、
１００ｍＭ塩化ナトリウム及び６ｍＭ塩化マグネシウム
緩衝液で処理した後、そのＤＮＡ０．５μｇをＤＮＡポ
リメラーゼクレノー酵素５ｕを含む７０ｍＭＴｒｉｓ−
塩酸（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍ
ＭＤＴＴ及び５０μＭのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ
，ｄＴＴＰの緩衝液３０μｌ中で室温２０分間反応させ
、さらに、７５゜Ｃ，１０分間反応させた。さらにこの
ＤＮＡをΣｕＩ　　ｌｕで切断し、次いでＳ，ヌクレア
ーゼで処理した後、０．１μｇを用い、Ｔ４ＤＮＡＥリ
ガーゼ１ｕを用い、１　０ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ一塩酸ｐ　
Ｈ　７．　５、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ　
　ＡＴＰ及び１ｍＭ　　ＤＴＴを含む緩衝液１０μｌ中
で４゜Ｃ及びｌ６゜Ｃで反応させプラスミドｐＡｏ　Ｉ
ＮＢＡＴＧを得た。この処理によりＡＴＧ開始コドン前
の配列が植物で発現しやすい配列となり、またイントロ
ンを含む断片をＸｂａ■とＳａｌｌで切り出すことがで
きるようになった（第２図参照）。

（２）発現ベクターの構築 レポーター遺伝子として大腸菌β−グルキュロニダーゼ
（ＧＵＳ）遺伝子を用いた。ＧＵＳ遺伝子をイントロン
カセットの上流にあるＡＴＧ開始コドンと翻訳のための
フレームとなるよう改変するため、プラス某ドｐＲＡＪ
２７５　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　　ｒａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ　　Ｉｎｃ．製）をＮｃｏＩとＳａｌｌで切断し、
その後ｓ１ヌクレアーゼ処理により両末端を平滑化した
。その後Ｓａｌｌ　　リンカー（宝酒造社製）を付けて
再環状化してｐＲＡＪ２７５△ＡＴＧを得た。

一方、プロモーターとターξネーターにはｐＢＩ２２１
（ＥＭＢＯ　　Ｊ．，６，３９０１．１９８７）に含ま
れるカリフラワーモザイクウィルス３５３プロモーター
と、ノパリン合成酵素遺伝子ターξネーターを利用する
ため、このプラスξドをｘｂａｌとＳｎａＢＩで切断し
た断片を用いた。この断片とイントロンを含むＸｂａｌ
−ＳａｌＩ断片、改変したＧＵＳ遺伝子であるｐＲＡＪ
２７５△ＡＴＧのＳａ　ＩＩ−ＳｎａＢＩ断片とをＴ４
リガーゼの反応によりつなぎ、Ｎ末端部にイントロンを
含むＧＵＳ遺伝子がカリフラワーモザイクウィルス３５
Ｓプロモーターとノバリン合威酵素遺伝子のターミネー
ターの間にはさまれた発現ベクターｐｌＧ２２１を得た
（第１図参照）。

（３）ｐｌＧ２２１の植物細胞への導入と発現の　タバ
コプロトプラストにおける発現タバコプロトプラストは
Ｂ　Ｙ　２　！ｇ濁培養液より常法によって酵素処理で
単離し、１×ｌＯ６ブロトプラスト／　ｍ　１の密度で
、エレクトロボレーション用緩衝液（７０ｍＭ塩化カリ
ウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％ＭＥＳ（ｐＨ
５．８）及び０．４Ｍマニトール）に９濁した。０．　
５ｍｌのフ゜ロトフ゜ラスト懸濁冫夜をフ゜ラスチンク
セルに移し、環状のｐｌＧ２２１又はｐＢＩ２２１を２
５μｇ、キャリアーＤＮＡとして子牛胸腺ＤＮＡを２５
μｇ加え１００μＦ、７００Ｖ、１０ｍＳの電荷をかけ
た。４゜Ｃ、１０分間冷却後、４．　５　ｍ　ｌのＫ３
プロトプラスト培地を加え、２５゜Ｃで４８時間培養し
た。培養後のプロトプラストを遠心分離により集めた後
、リニケーションにより細胞を摩砕し遠心分離後上清を
用い、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎの方法（Ｐｌａｎｔ　　Ｍｏ
１．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，５，３８７．１９８７）でＧ
ＵＳ活性を測定した。表１に結果が示されている。この
結果よりタバコプロトプラストにおいてヒマカタラーゼ
遺伝子１　　（ＣＡＴ−■）の第ｌイントロンにＧＵＳ
遺伝子の発現を促進できることが明らかになった。

表１　タバコプロトプラストにおけるｐＢＩ２２１とｐ
ｌＧ２２１の発現 ｐＢＩ２２１　　（３５Ｓ　ｐｒｏ．　　Ｇ［ＩＳ）　
　　　　　　　　　２Ｂ，７ｐｌＧ２２１　　（３５Ｓ
　ｐｒｏ．　　Ｉｎｔｒｏｎ−ＧＵＳ）　　　　　４６
．９■　イネプロトプラストにおける発現 イネ懸濁培養液より常法によってプロトプラストを単離
し、８Ｘ１０’　プロトプラスト／ｍｊ２の密度でエレ
クトロボレーション用緩衝液（７０ｍＭ塩化カリウム、
５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％ＭＥＳ　（・ｐＨ５
．８）、０．４Ｍマニトール）に懸濁した。０．　５　
ｍ　ｌのプロトプラスト懸濁液をプラスチックセルに移
し、２５μｇのｐＢＩ２２１またはｐＩＧ２２１とキャ
リアーとして２５μｇ子牛胸腺ＤＮＡを加え１０００μ
Ｆ、６００Ｖ、３０ｍＳの電荷をかけた。４゜Ｃ、１０
分間冷却後、直径６　ｃｍプラスチックシャーレの中央
に置いたミリボアセル（直径３５ｍｍ）内に移し、シャ
ーレにＲ２プロトプラスト培地（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．２０６，４０８、１９８７）を５ｍｌ加え、さ
らにイネ懸濁細胞Ｏｃを入れ２５゜Ｃで４８時間培養し
た。培養後のプロトプラストを遠心分離により集めた後
、ソニケーションにより細胞を摩砕し、遠心分離後上清
を用い、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎの方法（Ｐｌａｎｔ　　Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，工．３８７、１９８７）に
よりＧＵＳ活性を測定した。表２に示した結果より、ヒ
マカタラーゼ遺伝子１　（ＣＡＴ−１）の第１イントロ
ンは、単子葉植物であるイネプロトプラストにおいて、
イントロンを持たないｐＢＩ２２１と比べ７〜１７倍の
発現量があることが明らかになった。

表２　イネプロトプラストにおけるｐＢＩ２２１とｐ　
ＩＧ２２　１（７）発現 Ｏｃ　　　　　　　ＴＲ　１ ｐＢＩ２２１（３５Ｓ　ｐｒｏ．ＧＵＳ）　　　　　　
１０６　　　　　１５９ｐｌＧ２２１（３５Ｓ　ｐｒｏ
．Ｉｎｒｏｎ−ＧＵＳ）　１７７５　　　　１０７１（
ＧＵＳ活性：　ｐｍｏｌｅ　ＭＵ／ｍｉｎ／ｍｇ　ｐｒ
ｏｔｅｉｎ）■　イネカルスにおける発現 イネ品種日本晴の完熟種子に由来する懸濁培養よりＫｙ
ｏｚｕｋａらの方法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，
２０６、４０８、１９８７）でプロトプラストを単離し
４×１０ｔｈプロトプラスト／ｍｌの密度でエレクトロ
ボレーション用緩衝液（前述）に懸濁した。０．　５　
ｍ　ｌのプロトプラスト懸濁液に２５μｇの環状ｐｌＧ
２２１あるいはｐＢＩ２２１と選抜マーカーとしてハイ
グロマイシン耐性を与える、３５ｓプロモーターにハイ
グロマイシン耐性遺伝子を連結したプラスミド、ｐＧＬ
２　（Ｎａｔｕｒｅ，３３８、２７４、１９８９）を２
５μｇ加え、１０００μＦ、４００Ｖ、３０ｍＳの電荷
を与えた．４゜Ｃ、１０分間冷却した後、Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．．２０６、４０８、１９８７に報告さ
れているナース法によって培養した。培養２週間後にナ
ース細胞を洗い出すと同時にハイクロマイシン耐性細胞
の選抜のため２０μｇ／ｍｅハイグロマイシンＢを培地
中に加えた。２５゜Ｃで３週間培養した後、ハイグロマ
イシン耐性コロニーを２５μｇ　／　ｍ　ｌハイグロマ
イシンＢを含むＲ２アガロース培地に移し２５゜Ｃで培
養した。ＧＵＳ活性の測定はカルスの一部（約１００ｍ
ｇ）を用いＪｅｆｆｅｒｓｏｎの方法（Ｐｌａｎｔ　　
Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ，，ｉ、３８７、１９８７）
で行なった。結果を表３に示した。この結果、イネカル
スにおいてはｐｌＧ２２１はｐＢＩ２２１と比べｌＯ〜
１００倍の発現量であることが明らかになった。

表３　イネカルスにおけるｐＩＣ；２２１とｐＢ■２２
１の発現 （ＧＵＳ活性：　ｐｍｏｌｅ　ＭＵ／ｗｉｎ／ｍｇ　ｐ
ｒｏｔｅｉｎ）〔発明の効果〕 本発明のＤＮＡ断片は、外来遺伝子の発現を促進させる
作用を有し、該ＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターは
、植物細胞内で外来遺伝子を従来より高い割合で発現さ
せることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例ｌに示した本発明の外来遺伝子の発現を
促進するＤＮＡ断片を含む発現ベクターｐｌＧ２２１の
構築を示す概略図である。 第２図は、実施例１で得られた本発明の外来遺伝子の発
現を促進するＤＮＡ断片及びその近傍の塩基配列を表わ
す。 昂 ２ 凪 Ｘｂａ　Ｉ ＴＣＴＡＧＡＡＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴ
ＡＡＡＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＴ
ＴＴＣＴＴＧＧＴＴＡＧＧＡＣＣＣＴＴＴＴＣＴＣ丁Ｔ
ＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴ
ＣＴＴＴＡＡＡＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴ
ＧＡＴＴＧＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡ
ＴＡＧＣＴＴＴＡＡＣＴＧＡＴＡＡＴＣＴＧＡＴＴＡＣ
ＴＴＴＡＴＳａＬ　Ｉ 丁ＴＣＧＴＧＴＧＴＣＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴ
ＡＧＴＴＡＣＡＧＡＡＣＣＧＴＣＧＡＣＴＣＧＴＣＣＧ
ＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡｔｅｒｍ． ＧＵＳ 造イ云子

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記塩基配列で表わされるＤＮＡ断片を有し、外
   来遺伝子の発現を促進する作用を有することを特徴とす
   るＤＮＡ断片。 【遺伝子配列があります】