JPH0310681A - バチルス・チューリンゲンシス変異株及び殺虫剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ１発明の目的 「産業上の利用分野」 本発明は、鱗翅目昆虫（モンシロチョウ、コナガ等）の
幼虫に対して、きわめて優れた殺虫効果を示すバチルス
・チューリンゲンシス変種クルスタキが保有する、異な
る殺虫性蛋白をコードする遺伝子をそれぞれに含むプラ
スミドを欠落させることにより、菌体内に残存させた、
任意の殺虫性蛋白をコードする遺伝子のみを発現させ、
その発現物である殺虫性蛋白を特異的に生産し、かつ芽
胞を形成しないバチルス・チューリンゲンシス変種クル
スタキ変異株、および該変異株の培養により得られた殺
虫性蛋白を有効成分とすることを特徴とする殺虫剤に関
するもので、農薬業界及び農業分野で広く利用されるも
のである。

「従来の技術」 種々のバチルス・チューリンゲンシスの胞子形成期に形
成される細胞内封入体である殺虫性蛋白は、結晶毒素と
称され、多くの昆虫の幼虫に対して毒性を示すことが知
られており、又、該結晶毒素の殺虫活性は、バチルス・
チューリンゲンシスの亜種により、それぞれ異なってお
り、例えば、亜種のクルスタキ、アイザワイの産生ずる
結晶毒素は、鱗翅目、双翅目昆虫に、イスラエレンシス
の産生ずる結晶毒素は、双翅目昆虫に、またテネブリオ
ニスの産生ずる結晶毒素は、鞘翅目の甲虫類に有効であ
ることが知られている。従って、従来これらの結晶毒素
は殺虫剤として広く用いられ、その際、防除すべき害虫
に対して最も効果があると思われる菌株が選択されてい
る。

「発明が解決しようとする課題」 胞子形成期のバチルス・チューリンゲンシスの培養液を
用いて行われる、結晶毒素を有効成分とする殺虫剤は、
以下に記載する理由により、比較的高い製造コストを必
要としている。

すなわち、結晶毒素は、生産菌の、胞子形成期において
のみ産生されることから、工業的発酵槽での発酵にかな
りの時間を要し、製造効率が劣るという理由。

また通常のバチルス・チューリンゲンシスの培養液をそ
のまま殺虫剤のベースとした場合、この中には、発芽可
能な胞子が多く混在した状態にあるため、自然界に該殺
虫剤が散布された後、この中に含まれる胞子が発芽し、
菌の増殖を促し、蚕に薬害を与える危険がある。従って
、養蚕業保護の立場から、胞子に起因する二次増殖の危
険の無い殺虫剤が強く望まれており、この問題点を解決
するための手段として、バチルス・チューリンゲンシス
の培養液に化学薬剤を添加し、加熱することによって、
胞子を死滅させて製造する方法が提案されている（特開
昭４８−２２６２０号）が、その製造方法の採用は、当
然、工程を複雑化させるという理由。

さらに、バチルス・チューリンゲンシスには、殺虫性蛋
白をコードする遺伝子が複数存在すること（クロンシュ
タッド／Ｋｒｏｎｓｔａｄ、Ｊ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ：Ｊ
。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４，４１９（１９８３）　）
と存在する分子量の異なる多種類のプラスミドのうちの
数種のプラスミドに殺虫性蛋白をコードする遺伝子が存
在すること（アロンソン／Ａｒｏｎｓｏｎ、＾、１．ｅ
ｔ　ａｌ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏ−１ｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖ
ｉｅｉｍ、、５０．１（１９８６））　、さらに同一菌
株が産生ずる各々の殺虫性蛋白については、標的である
鱗翅目幼虫に対して、殺虫効力に差異があること（近藤
／Ｋｏｎｄｏ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ：＾ｇｒｉｃ、Ｂｉｏ１
．ｃｈｅｍ、　、　５１４５５（１９８７）　）等が知
られており、異なる遺伝子によりコードされている殺虫
性蛋白、すなわち結晶毒素の生産比率あるいは、殺虫活
性、殺虫スペクトルには、かなりの差異があるが、工業
的レベルで、バチルス・チューリンゲンシスの培養液中
から、ある比率で存在する特定の結晶毒素のみを分離、
精製し、製剤化することは、無理であるため、現在製造
されている殺虫剤は、それらの混合物で構成されている
ため、標的とする害虫に、本来最も効果のある結晶毒素
を基卓として考えた場合、それらは一定の希釈を受けた
状態にあることになり、一定の効果を挙げるためには濃
度ないし使用量を上げなければならないという理由。

口０発明の構成 ［課題を解決するための手段」 本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を
行い、ＥＭＳなどの変異剤処理により、芽胞形成能力を
失った突然変異株を作成し、さらにその変異株について
、特定の殺虫性蛋白をコードする遺伝子保持プラスミド
を欠落させることにより、上記課題のすべてを解決し得
るバチルス・チューリンゲンシス変種クルスタキ由来の
任意の殺虫性蛋白選択産生変異株の作成に成功し本発明
を完成した。

即ち、本発明は、鱗翅目の昆虫に対して殺虫能を有する
殺虫性蛋白をコードする遺伝子を保持するプラスミドの
一部又は全部と芽胞形成能力を喪失していることを特徴
とするバチルス・チューリンゲンシス変種クルスタキ変
異株及び鱗翅目の昆虫に対して殺虫能を有する殺虫性蛋
白をコードする遺伝子を保持するプラスミドの一部と芽
胞形成能力を喪失しているバチルス・チューリンゲンシ
ス変種クルスタキ変異株の培養により得られた殺虫性蛋
白を有効成分とすることを特徴とする殺虫剤に関するも
のである。

○　　　　　　）　　　　　　　　°　　　　　　の　
　　」芽胞形成能力喪失株は、公知の方法、即ち、バチ
ルス属の細菌に欠失変異を誘発させる変異剤、例えばエ
チルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）を作用させることによ
り、通常の胞子を形成しない、突然変異体を作成するこ
とが出来る。しかしながら、突然変異体の多くのものは
、胞子を形成しないだけでなく、結晶毒素についても全
く産生しないか、あるいは変異処理前に比べて、顕著に
産生量が減少しているものである。しかし、本発明の目
的とする効果を達成するには、胞子を形成しないだけで
なく、結晶毒素生産能力が、変異処理前と同等以上であ
ることが必要条件であり、本発明者等は長期間にわたる
スクリーニングを行い、その結果、胞子形成能力を欠き
、しかも培養後の結晶毒素生産量が、変異処理前と全く
同等な変異株を得ることができた。

○ブースミ゛　　　　せた笛　　　　　のさらに本発明
者らは、変異剤処理により作成した、芽胞形成能力を失
った突然変異株に保持される、染色体上に存在するもの
を含めた、数種の殺虫性蛋白をコードする遺伝子（以下
殺虫性蛋白遺伝子という）のうち、標的となる害虫に対
して、殺虫効果が高い殺虫性蛋白産生に寄与すると判断
された殺虫性蛋白遺伝子について、これを菌体内へ残存
させ、逆に標的とする害虫に対して、その殺虫効力が無
いもしくは低いものあるいは殺虫効力のはっきりしない
ものを産生ずるものについては、その蛋白をコードする
殺虫性蛋白遺伝子を菌体内より一部あるいは全てを排除
することにより、本来、該菌株が、通常産生ずる殺虫性
蛋白のうちの任意の殺虫性蛋白を選択的に産生ずるバチ
ルス・チューリンゲンシス芽胞欠損変異株を作成した。

上記の変異株は、野生型である親株に通常保有されてい
るプラスミドを欠落させる処理、あるいは殺虫性蛋白遺
伝子を保持するプラスミドを喪失した変異株と親株との
接合（Ｍａｔｉｎｇ）によるプラスミドの移入処理を施
すことにより取得することができた。

本発明によるバチルス・チューリンゲンシス変種クルス
タキ変異株は、芽胞を形成することなく、変異処理前の
親株と比較して、標的とする害虫、例えばコナガに対し
て効力の高い殺虫性蛋白を選択的に高生産させることを
意図するものであるので、当事者が、標的として定めた
害虫に応じて、菌体内に残存させるべき殺虫性蛋白遺伝
子保持プラスミドが各々異なることも当然の帰結であり
、その残存させる殺虫性蛋白遺伝子保持プラスミドが、
該変異株の野生型に元々含まれるものであれば良い。

「作用」 本発明によれば、同−菌株中の異なる遺伝子にコードさ
れた殺虫性蛋白のうち、標的とする害虫に対して最も効
果のある蛋白の結晶毒素単位量当りの存在比を高めるこ
とができ、より活性の高い殺虫剤を生産することができ
るため、例えばしばしば起こり得ることであるが、特定
の害虫の大発生による農作物の被害などの状況下におい
て、その害虫に対して卓効性の結晶毒素を高濃度に含ま
せた、その害虫例えばコナガに対して、従来の製剤より
も高い比活性を有する製剤を生産コストを上げることな
く供給できることが可能となり、さらに該変異株は、発
芽可能な胞子を含まないことから、微生物の拡散、増殖
の危険も生じないという優れた作用が奏せられるのであ
る。

「実施例」 以下に詳細な実施例を示すが、本発明による方法をこの
実施例だけに限定するものではない。

実施例１ ０変異抹免製造 ステップ１ ｐＨ６，５のリン酸緩衝液にバチルス・チューリンゲン
シス変種クルスタキＨＤ−１の胞子を懸）・蜀したちの
５ｍ１（約１０　”／ｍＩ）を７０°Ｃで２０分間熱処
理する。冷却後、ＥＭＳを０．７５　ｍｌ（０，６Ｍ相
当）加え、３０°Ｃで２時間振盪（５０ｃｙｃｌｅ／ｗ
ｉｎ）後、無菌的に遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０
分）する。

沈澱部を無菌生理食塩水で数回洗浄後、５ｍｌのｐＨ６
，５のリン酸緩衝液に懸濁する。同懸濁液をシャーレに
塗布し、３０°Ｃで１日培養後、比較的小さくて、しか
も、色が薄白色のコロニーを選択し、２日後にコロニー
の半分を新鮮斜面培地（ＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ−
寒天培地）に植え、３０°Ｃで１日培養後、斜面上に生
育が認められたもののみ５°Ｃで保存し、その他は廃棄
する。一方、プレート上のコロニの残り半分をさらに３
０°Ｃで、１日培養し、それを１ｍｌの無菌生理食塩水
に懸濁し、そのうち０．５１１１１を７０’Ｃで２０分
間加熱処理した後、予め５０°Ｃに保持しておいたＮｕ
ｔｒｉｅｎｔ−Ｂｒｏｔｈ培地にｉ！Ｍｉ、固化後、３
０″Ｃで２日培養後、菌数０個すなわち胞子形成能の認
められないコロニーを選抜する。

次に、同コロニーの懸濁液を加熱処理した残液を検鏡し
、結晶毒素の生成の有無を調べる。

上記試験により、結晶毒素を変異処理前と同程度に産生
ずる胞子欠損株を得たのでこれを以下に示す実験に供試
する。

ステップ２ 上記で得た胞子欠損変異株をベーンハード（Ｂｅｒｎｈ
ａｒｄら（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　１３３．８
９７（１９７８）　）の方法を参考にプラスミドの欠落
（Ｐｌａｓｍｉｄ　ｃｕｒｉｎｇ）処理を行う。すなわ
ち０．００２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を
含むしブロス（Ｌｏｇ）リブトン、５ｇ塩化ナトリウム
、５ｇイーストエキストラクト、１ｇグルコースを１２
の蒸留水に溶解したもの）培地で４２°Ｃ１２日間の振
盪培養を行う。その後、培養液を適宜希釈し、プレート
（Ｌフロス寒天培地）に塗布し、３０°Ｃで１日培養、
生じたコロニーより無作為に抽出したものについて、各
々５ｍｌのしブロス培地を含む試験管で３０°Ｃ１６時
間の振盪培養を行い、バチスチ（Ｂａｔｔｉｓｔｉ。

Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　１６２．５４３（１９
８５）　）の方法に準じて、プラスミド抽出を行う。

抽出液をアガロース電気泳動により各コロニが内含する
プラスミドを分析する。

その結果、分子量が約４４Ｍｄのプラスミドを喪失した
ＭＡ３１−１株、また４４Ｍｄと同時に分子量が約ｌ１
０Ｍｄのプラスミドも喪失したＭＡ３１−０株を得た（
図１参照）。

これらのプラスミドには、それぞれ異なる殺虫活性を持
つ殺虫性蛋白遺伝子（Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｔ、　ｅｔ　
ａｌ。

Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、、１７．
５（１９８８））が保持されている。

ステップ３ ＭＡ３１−０株と変異処理前の元株（バチルス・チュー
リンゲンシス変種クルスタキＨＤ−１）とをそれぞれ３
ｍｌのしブロス培地を含む試験管で８時間、３０°Ｃで
振盪培養後、１ｍｌずつを１０ｍ１の新鮮なしブロス培
地を含む試験管へ移す。３０°Ｃで、４時間、静置した
後、適宜希釈した培養液をしブロス寒天培地プレート上
へ、塗布する。３０゛Ｃで３日培養後、胞子形成のみら
れないコロニーより菌をかきとり、ステップ２と同様の
方法でプラスミドを分析した。

その結果、ｌ１０Ｍｄのプラスミドを菌体内に含まない
ＭＡ３１２株を得た。

上記の実施例で得た、本発明であるバチルス・チューリ
ンゲンシス変種クルスタキ変異株Ｍ　Ａ　３１−〇、Ｍ
Ａ３１−１、ＭＡ３１−２は、それぞれＢＴＫＭＡ３１
−０、ＢＴＫＭＡ３１　１、ＢＴＫＭＡ３１−２と命名
し、茨城系つくば市東１１−３に所在する工業技術院微
生物工業技術研究所に平成元年５月２４日にそれぞれ微
工研菌寄第１０７３７号、第１０７３８号、第１０７３
９号として寄託した。

上記３株は、胞子形成能を欠き、かつ菌体内に存在する
殺虫性蛋白遺伝子保持プラスミドの種類の差異に起因し
て産生される結晶毒素の質的相違以外は、分類学上、親
株であるバチルス・チューリンゲンシス変種クルスタキ
ＨＤ−１と同一である。

○双濾ｍ賢汰 本発明により、得られたバチルス・チューリンゲンシス
変異株ＭＡ３ｍ−１，２由来の殺虫剤の製造方法として
は、本発明株の変異処理前の元株を用いた殺虫剤の製造
法に準ずればよく、例えば、ダルメイジ（Ｄｕｌｍａｇ
ｅ、　Ｉｌ、Ｔ、　：Ｊ、　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ、Ｐａ
ｔｈｏｌ、　。

２２、２７３　（１９７１）　）開示の方法により、製
造できる。

さらに具体的に説明すると、窒素源、炭素源、ミネラル
及びビタミンに富む天然培地で当該変異株を培養する。

結晶毒素ならびに菌体の産生量は、通気撹拌条件に大き
く左右されることより、十分な好気的条件で培養すべき
である。培養温度は、約２５〜３０°Ｃ１培養日数は、
２〜４日間がよい。

炭素源としては、例えば、蔗糖、麦芽糖、グルコース、
フラクトース、糖蜜が利用され、窒素源としては、例え
ば、コーンスチーブリカー、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、綿実粉、酵母エキス、大豆粉、カゼイン氷
解物等が挙げられる。

また、ミネラル、ビタ、ミンは、糖蜜、コーンスチーブ
リカー、酵母エキスで代用することができ、必要に応じ
ては、無機塩類、ビタミン類をさらに添加してもよい。

特に大量生産を行う場合、深部通気撹拌培養が望ましい
。

培養終了後、培養液から結晶毒素含有部分を分離採集す
る場合、通常の遠心分離法、濾過法などを利用すること
ができる。また、培養液を濃縮、乾燥させて粉末にする
場合も、通常の濃縮法や乾燥法（例えば噴霧乾燥法）を
用いればよい。

上記方法で得た結晶毒素が生菌を含有する場合、必要に
応じて通常用いることのできる殺菌手法を利用して殺菌
する。例えば、熱処理、超音波処理、放射線処理などの
物理的殺菌法、あるいはまた、ホルマリン、過酸化水素
、亜硫酸塩類、塩素化合物、β−プロピオラクトン、界
面活性剤、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド
等の化学的殺菌法、自己融解、ファージ処理、リヅチー
ム処理などの生物学的殺菌法が挙げられるが、工業的に
は熱処理法と化学的殺菌法が利用しやすい。

得られた結晶毒素は、その使用目的や散布方法に応じて
、製剤化することができ、増量剤、展着剤、界面活性剤
、安定剤等を必要に応じて添加できる。また、用途に応
じて、他の農薬とも混合できる。

○殺」１図ど目１代験 上記の培養方法で得たＭＡ３１−１あるいはＭＡ３１−
２培養液の殺虫活性を調べるため、生物検定を行った。

すなわち、これらの培養液を蒸留水で適宜希釈したもの
を協同飼料社製の人工飼料に混合後、３令の蚕あるいは
コナガ幼虫１０頭に摂食させ、３日後の死出率より粗蛋
白濃度換算でＬＣ，。を求め、殺虫活性の指標とした。

−（以下余白）− 表１：カイコに対する殺虫活性 対象昆虫がカイコの場合、表１に示されるように、本発
明で得た変異株ＭＡ３１−１を用いた培養液での粗蛋白
あたりの殺虫活性は、親株であるＨＤ−１株を用いた培
養液での粗蛋白当りの殺虫活性を上回った結果となった
。

表２：コナガに対する殺虫活性 また対象昆虫をコナガとした場合、表２に示されるよう
に、本発明で得た変異株ＭＡ３１−２を用いた培養液で
の殺虫活性が、親株のＨＤ−１を用いた培養液での粗蛋
白あたりの殺虫活性を上回った。　従って、これらの結
果にみられるように、これら変異株を殺虫剤の製造に利
用することにより、標的とする害虫に応じて、特に高い
殺虫効果を示す殺虫性蛋白を選択的に高生産することが
可能となった。

ハ３発明の効果 本発明によれば、卓効性の結晶毒素を高濃度に含ませ、
従来の製剤よりも高い比活性を有する殺虫剤をしかも発
芽可能な胞子を含まない状態、すなわち微生物の拡散、
増殖の危険も生じないという殺虫剤を生産コストを上げ
ることなく供給できることが可能で、農薬業界及び農業
に与える効果は非常に大きなものである。

【図面の簡単な説明】

図１は、各菌株よりの、プラスミド抽出物をゲル電気泳
動に供試し、その０．７％アガロースゲルをアルカリ変
性後、サザーンブロンティングによりプラスミドをゲル
からニトロセルロース膜へｔ多動させたのちに、近勝ら
（Ｋｏｎｄｏ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ：Ａｇｒｉｃ。 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、５１，４５５（１９８７）　）
が示したＨＤ−１株の殺虫毒素の構造遺伝子ＤＮＡの一
部を酵素的にラヘルしたものをプローブにして、核酸ハ
イブリダイゼーション操作を行うことによりニトロセル
ロース膜上で、殺虫性蛋白遺伝子をコードするプラスミ
ドを検出したものである。図中の番号ｌはバチルス・チ
ューリンゲンシス・クルスタキＨＤ１株、２はＭＡ３１
０．３はＭＡ３１−２株よりの抽出物である。図の右端
に記した矢印は、殺虫性蛋白遺伝子をコードするプラス
ミドのおおよその分子量を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、鱗翅目の昆虫に対して殺虫能を有する殺虫性蛋白を
   コードする遺伝子を保持するプラスミドの一部又は全部
   と芽胞形成能力を喪失していることを特徴とするバチル
   ス・チューリンゲンシス変種クルスタキ変異株。 ２、鱗翅目の昆虫に対して殺虫能を有する殺虫性蛋白を
   コードする遺伝子を保持するプラスミドの一部と芽胞形
   成能力を喪失しているバチルス・チューリンゲンシス変
   種クルスタキ変異株の培養により得られた殺虫性蛋白を
   有効成分とすることを特徴とする殺虫剤。