JPH03108485A - キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 - Google Patents
キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途Info
- Publication number
- JPH03108485A JPH03108485A JP24425789A JP24425789A JPH03108485A JP H03108485 A JPH03108485 A JP H03108485A JP 24425789 A JP24425789 A JP 24425789A JP 24425789 A JP24425789 A JP 24425789A JP H03108485 A JPH03108485 A JP H03108485A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cucumber
- dna
- derived
- polypeptide
- ascorbic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ
活性をもつポリペプチドの遺伝情報を有するＤＮＡおよ
びその用途に関し、詳しくはキュウリ由来のアスコルビ
ン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドをコードする
ＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するＩＪＩＩＡえプラスミド、
該プラスミドにより形質転換された形質転換体および該
形質転換体を用いてキュウリ由来のアスコルビン酸オキ
シダーゼを製造する方法に関する。
活性をもつポリペプチドの遺伝情報を有するＤＮＡおよ
びその用途に関し、詳しくはキュウリ由来のアスコルビ
ン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドをコードする
ＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するＩＪＩＩＡえプラスミド、
該プラスミドにより形質転換された形質転換体および該
形質転換体を用いてキュウリ由来のアスコルビン酸オキ
シダーゼを製造する方法に関する。
従来よりアスコルビン酸オキシダーゼは酸素の存在下に
アスコルビン酸を酸化し、デヒドロアスコルビン酸と水
とを生成する酵素であり、近年、臨床診断薬等として用
いられている。検体中のアスコルビン酸のもつ還元能を
アスコルビン酸オキシダーゼで消去することにより、生
体中の成分、例えばコレステロール、中性脂肪などの精
度の高い測定系を構築することができるため、診断薬等
として広く使用されるようになったのである。
アスコルビン酸を酸化し、デヒドロアスコルビン酸と水
とを生成する酵素であり、近年、臨床診断薬等として用
いられている。検体中のアスコルビン酸のもつ還元能を
アスコルビン酸オキシダーゼで消去することにより、生
体中の成分、例えばコレステロール、中性脂肪などの精
度の高い測定系を構築することができるため、診断薬等
として広く使用されるようになったのである。
ここで言うアスコルビン酸オキシダーゼとは、酵素番号
ＥＣ１，１０，３，３であり、系統名Ｌ−Ａｓｃｏｒｂ
ａｔｅ：Ｏｘｙｇｅｎ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ
のことである。アスコルビン酸オキシダーゼの供給源と
してはキュウリやカポチャなどのウリ科の植物などであ
り、この酵素は一般に青色の銅酵素である。
ＥＣ１，１０，３，３であり、系統名Ｌ−Ａｓｃｏｒｂ
ａｔｅ：Ｏｘｙｇｅｎ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ
のことである。アスコルビン酸オキシダーゼの供給源と
してはキュウリやカポチャなどのウリ科の植物などであ
り、この酵素は一般に青色の銅酵素である。
しかしながら、これらの植物からアスコルビン酸オキシ
ダーゼを採取するには収穫時期、原料コストなどの問題
があり、組換えＤＮＡ技術による微生物での生産が強く
望まれている。
ダーゼを採取するには収穫時期、原料コストなどの問題
があり、組換えＤＮＡ技術による微生物での生産が強く
望まれている。
〔課題を解決するための手段］
本発明者らは組換えＤＮＡ技術によって植物由来のアス
コルビン酸オキシダーゼの遺伝子を微生物などの宿主細
胞内に取り込み、同酵素を多量に生産すべく鋭意検討し
た。
コルビン酸オキシダーゼの遺伝子を微生物などの宿主細
胞内に取り込み、同酵素を多量に生産すべく鋭意検討し
た。
まず、本発明者らはキュウリ由来のアスコルビン酸オキ
シダーゼ遺伝子をクローニングし、該遺伝子のＤＮＡ配
列を決定した。
シダーゼ遺伝子をクローニングし、該遺伝子のＤＮＡ配
列を決定した。
次いで、ｍｌ Ｄ Ｎ Ａ配列を有するプラスミドを構
築し、さらに該プラスミドにより宿主細胞を形質転換し
て、形質転換体を創製した。さらにまた、該形質転換体
を用いるアスコルビン酸オキシダーゼの製造方法を応用
することによって高生産に本酵素活性をもつポリペプチ
ドを製造することが可能になることを見出した。
築し、さらに該プラスミドにより宿主細胞を形質転換し
て、形質転換体を創製した。さらにまた、該形質転換体
を用いるアスコルビン酸オキシダーゼの製造方法を応用
することによって高生産に本酵素活性をもつポリペプチ
ドを製造することが可能になることを見出した。
すなわち、本発明は次の（ａ）〜（ｄ）の要旨を有する
ものである。
ものである。
（ａ）キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活性
をもつポリペプチドをコードする塩基配列であることを
特徴とするＤＮＡ、 （ｂ）該ＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、（ｃｌ 該）
Ｊｌ換えＤＮＡにより宿主細胞を形質転換して得られた
形質転換体、 （ｄ）該形質転換体を培養し、該形質転換体の産生ずる
キュウリ由来の７スコルビン酸オキシダーゼ活性をもつ
ポリペプチドを採取することを特徴とするアスコルビン
酸オキシダーゼの製造法である。
をもつポリペプチドをコードする塩基配列であることを
特徴とするＤＮＡ、 （ｂ）該ＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、（ｃｌ 該）
Ｊｌ換えＤＮＡにより宿主細胞を形質転換して得られた
形質転換体、 （ｄ）該形質転換体を培養し、該形質転換体の産生ずる
キュウリ由来の７スコルビン酸オキシダーゼ活性をもつ
ポリペプチドを採取することを特徴とするアスコルビン
酸オキシダーゼの製造法である。
本発明に関して、キュウリ由来のアスコルビン酸オキシ
ダーゼは酵素ハンドブック（八尾文治、田宮信雄監修、
１９８２年発行、朝食書店）第１５６頁や臨床酵素ハン
ドブック（馬場茂明、相用博、北村元仕、奥田潤編、１
９８２年発行、講談社）第１１〜１２頁にその理化学的
性質が記載されている。
ダーゼは酵素ハンドブック（八尾文治、田宮信雄監修、
１９８２年発行、朝食書店）第１５６頁や臨床酵素ハン
ドブック（馬場茂明、相用博、北村元仕、奥田潤編、１
９８２年発行、講談社）第１１〜１２頁にその理化学的
性質が記載されている。
本発明に関してキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダ
ーゼ活性をもつポリペプチドはキュウリから得たＤＮＡ
配列から演鐸して、例えば第１図に示すアミノ酸配列を
有する。キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活
性をもつポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば第
１図に示されるアミノ酸配列をコードする。このような
りＮＡとしては、例えば第２図ａ〜第２図すに示される
塩基配列がある。
ーゼ活性をもつポリペプチドはキュウリから得たＤＮＡ
配列から演鐸して、例えば第１図に示すアミノ酸配列を
有する。キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活
性をもつポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば第
１図に示されるアミノ酸配列をコードする。このような
りＮＡとしては、例えば第２図ａ〜第２図すに示される
塩基配列がある。
よく知られているように、多くのポリペプチドにおいて
、それをコードするＤＮＡ配列は複数存在する。その塩
基配列は一義的に決まらず、多種にわたる配列の可能性
があり得る。キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダー
ゼ活性をもつポリペプチドのアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡの場合もその塩基配列は天然界の遺伝子の塩基配
列以外にも多数の可能性があり、本発明のＤＮＡは上記
の第２図ａ−，−１）にて明らかにされた配列を有する
ＤＮＡのみに限定されるもので番よなく、不明ＩＩＩＩ
書により明らかにされたキュウリ由来のアスコルヒ゛ン
酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配
列をコードする他のＤＮＡも当然に包含するものである
。
、それをコードするＤＮＡ配列は複数存在する。その塩
基配列は一義的に決まらず、多種にわたる配列の可能性
があり得る。キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダー
ゼ活性をもつポリペプチドのアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡの場合もその塩基配列は天然界の遺伝子の塩基配
列以外にも多数の可能性があり、本発明のＤＮＡは上記
の第２図ａ−，−１）にて明らかにされた配列を有する
ＤＮＡのみに限定されるもので番よなく、不明ＩＩＩＩ
書により明らかにされたキュウリ由来のアスコルヒ゛ン
酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配
列をコードする他のＤＮＡも当然に包含するものである
。
また、組換えＤＮＡ技術によれば、基本となるＤＮＡの
特定の部位に、該ＤＮＡがコードするものの基本的な特
性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する
ように人為的に変異を起こすことができる。本発明によ
り提供されるキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダー
ゼ活性をもつポリペプチドをコードする天然の塩基配列
を有するＤＮＡあるいは天然のものとは異なるが同じア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡに関しても同様に人為的
にＤＮＡの挿入、欠失、置換を行うことにより、天然の
キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼと類似のポ
リペプチドを得ることも可能である。
特定の部位に、該ＤＮＡがコードするものの基本的な特
性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する
ように人為的に変異を起こすことができる。本発明によ
り提供されるキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダー
ゼ活性をもつポリペプチドをコードする天然の塩基配列
を有するＤＮＡあるいは天然のものとは異なるが同じア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡに関しても同様に人為的
にＤＮＡの挿入、欠失、置換を行うことにより、天然の
キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼと類似のポ
リペプチドを得ることも可能である。
従って、本発明におけるＤＮＡはキュウリ由来のアスコ
ルビン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドをコード
するすべての塩基配列を包含するものである。
ルビン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドをコード
するすべての塩基配列を包含するものである。
本発明における組換えＤＮＡは上記ＤＮＡ配列を含有す
る組換えプラスミド、組換えファージなどを含む。
る組換えプラスミド、組換えファージなどを含む。
本発明の形質転換体を得る方法としては、たとえば次の
如き方法が例示される。
如き方法が例示される。
すなわち、例えば生育したキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓｓ
ａｔｉｖｕｓ）などの果実を破砕し、塩化セシウム平衡
密度勾配遠心法などでＲＮＡを分取する。さらに、ポリ
（Ａ）”ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースなどで精製
する。
ａｔｉｖｕｓ）などの果実を破砕し、塩化セシウム平衡
密度勾配遠心法などでＲＮＡを分取する。さらに、ポリ
（Ａ）”ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースなどで精製
する。
次にオリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を用いてｃ
ＤＮＡを作成する。二本鎖のｃＤＮＡをベクターである
例えばプラスミドｐＵｃ１９に取り込ませ、宿主細胞、
例えば大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ＨＢＩＯＩを形質転
換し、培養して遺伝子ライブラリーを作成する。Ｎ−末
端のアミノ酸配列より推定したオリゴヌクレオチド（プ
ローブ）と相補性のある遺伝子ライブラリーを見出し、
採取する。
ＤＮＡを作成する。二本鎖のｃＤＮＡをベクターである
例えばプラスミドｐＵｃ１９に取り込ませ、宿主細胞、
例えば大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ＨＢＩＯＩを形質転
換し、培養して遺伝子ライブラリーを作成する。Ｎ−末
端のアミノ酸配列より推定したオリゴヌクレオチド（プ
ローブ）と相補性のある遺伝子ライブラリーを見出し、
採取する。
こうして得られたキュウリ由来のアスコルビン酸オキシ
ダーゼのＤＮＡを含有する組換えプラスミドは、さらに
発現ベクター、たとえばＩｌ±プロモーターを保持する
発現ベクターｐＵｃ１８（東洋紡）、大腸菌の強力なプ
ロモーターであるＬａ互プロモーターとｒｒｎＢリポソ
ームＲＮＡのターミネータ−を保持する発現ベクターｐ
ＫＫ２２３−３、ｔ工上プロモーターを保持する発現ベ
クターｐＤＲ７２０、誘導可能な発現ベクターｐｐＬ
−Ｌａｍｂｄａ （ファルマシア社）等に上記ＤＮＡを
連結することにより、大腸菌等の微生物菌体で本発明の
キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつ
ポリペプチドを生産させる組換えプラスミドを横築する
ことができる。さらに例えば、枯草菌と大腸菌とのシャ
トル・ベク９−ｐＨＹ３００ＰＬＫ（東洋紡）やプラス
ミドベクターｐＵＢ ｌ ｌ Ｏ（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、、 、ｌ１４．３１８〜３２９ｔ １９７８
）などに上記ＤＮＡを連結することにより、枯草菌の微
生物菌体内および培養液中でキュウリ由来のアスコルビ
ン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドを生産させる
組換えプラスミドを構築することができる。
ダーゼのＤＮＡを含有する組換えプラスミドは、さらに
発現ベクター、たとえばＩｌ±プロモーターを保持する
発現ベクターｐＵｃ１８（東洋紡）、大腸菌の強力なプ
ロモーターであるＬａ互プロモーターとｒｒｎＢリポソ
ームＲＮＡのターミネータ−を保持する発現ベクターｐ
ＫＫ２２３−３、ｔ工上プロモーターを保持する発現ベ
クターｐＤＲ７２０、誘導可能な発現ベクターｐｐＬ
−Ｌａｍｂｄａ （ファルマシア社）等に上記ＤＮＡを
連結することにより、大腸菌等の微生物菌体で本発明の
キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつ
ポリペプチドを生産させる組換えプラスミドを横築する
ことができる。さらに例えば、枯草菌と大腸菌とのシャ
トル・ベク９−ｐＨＹ３００ＰＬＫ（東洋紡）やプラス
ミドベクターｐＵＢ ｌ ｌ Ｏ（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、、 、ｌ１４．３１８〜３２９ｔ １９７８
）などに上記ＤＮＡを連結することにより、枯草菌の微
生物菌体内および培養液中でキュウリ由来のアスコルビ
ン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドを生産させる
組換えプラスミドを構築することができる。
また、大腸菌や枯草菌の宿主−ベクター系のみならず、
酵母、シュードモナス属菌あるいは放線菌などの宿主−
ベクター系も利用可能であり、各々の宿主−ベクター系
の特徴を活かしたキュウリ由来のアスコルビン酸オキシ
ダーゼ活性をもつポリペプチドの大量生産が行える。
酵母、シュードモナス属菌あるいは放線菌などの宿主−
ベクター系も利用可能であり、各々の宿主−ベクター系
の特徴を活かしたキュウリ由来のアスコルビン酸オキシ
ダーゼ活性をもつポリペプチドの大量生産が行える。
本発明のキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活
性をもつポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組
換えプラスミドを宿主細胞へ導入することにより、菌体
内および菌体外でキュウリ由来のアスコルビン酸オキシ
ダーゼ活性をもつポリペプチドを生産する形質転換体を
得ることができる。該細胞としては、大腸菌や枯草菌な
どの細菌、酵母、植物細胞、動物細胞などが使用できる
。
性をもつポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組
換えプラスミドを宿主細胞へ導入することにより、菌体
内および菌体外でキュウリ由来のアスコルビン酸オキシ
ダーゼ活性をもつポリペプチドを生産する形質転換体を
得ることができる。該細胞としては、大腸菌や枯草菌な
どの細菌、酵母、植物細胞、動物細胞などが使用できる
。
このようにして製造された形質転換体を適当な培地条件
で培養することによりキュウリ由来。アスコルビン酸オ
キシダーゼ活性を有するポリペプチドを大量に生産する
ことが可能である。この場合、たとえば大腸菌で該構造
遺伝子がｌａｃプロモーターの支配下にある時は培養初
期に誘導剤、イソプロピルチオガラクトシド等を添加す
ることによりキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダー
ゼ活性を有するポリペプチドの単離は、たとえば、菌体
をリゾチームで処理するか、あるいは超音波等の手段を
用いて破砕したり、または培養液より抽出・分離・精製
することなどにより行うことができる。
で培養することによりキュウリ由来。アスコルビン酸オ
キシダーゼ活性を有するポリペプチドを大量に生産する
ことが可能である。この場合、たとえば大腸菌で該構造
遺伝子がｌａｃプロモーターの支配下にある時は培養初
期に誘導剤、イソプロピルチオガラクトシド等を添加す
ることによりキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダー
ゼ活性を有するポリペプチドの単離は、たとえば、菌体
をリゾチームで処理するか、あるいは超音波等の手段を
用いて破砕したり、または培養液より抽出・分離・精製
することなどにより行うことができる。
以下に実施例を挙げ、さらに本発明の詳細な説明する。
本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
実施例
１、材料
キュウリ（ｃｕｃｕｗｉｓ ５ａｔｉｖｕｓ）は開花後
７日たったものを１００ｇ使用し、使用するまで液体窒
素中で凍結保存した。
７日たったものを１００ｇ使用し、使用するまで液体窒
素中で凍結保存した。
２、ｃＤＮＡライブラリーの構築とスクリーニング
キュウリ果実の新鮮型Ｎ １００ ｇを液体窒素中で粉
砕後、６Ｍグアニジンチオシアネート中でホモゲナイズ
した後、５．７Ｍ塩化セシウムの平衡密度勾配遠心分画
を行い、ＲＮＡを約２０ｍｇ調製した（ Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ、 Ｔ、、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ、 Ｅ、Ｆ、 ＆Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、（１９８２）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ。
砕後、６Ｍグアニジンチオシアネート中でホモゲナイズ
した後、５．７Ｍ塩化セシウムの平衡密度勾配遠心分画
を行い、ＲＮＡを約２０ｍｇ調製した（ Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ、 Ｔ、、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ、 Ｅ、Ｆ、 ＆Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、（１９８２）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ。
Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 ＮＹ）、 ｐ
ｐ、 １９６−１９８ ） −オリゴ（ｄＴ）−セルロ
ースを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより
、Ｐｏ１ｙ（Ａ） ’ ＲＮ Ａを１．６■分離精製し
た。さらに精製したＰｏ１ｙ（Ａ） ” ＲＮＡ５μｇ
を鋳型として、オリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素
を用いてｃＤＮＡを４μｇ合成した（Ｇｕｂｌｅｒ、
’Ｕ、 ＆ Ｈｏｆｆ５ａｎ、 Ｂ、Ｊ、 （１９８３
）Ｇｅｎｅ ２５．２６３−２６９３ 、４種類のｄＮ
ＴＰとＤＮＡポリメラーゼ■を用いて２本鎖ｃＤＮＡと
した後、ＣＬ−４Ｂカラムにより５００ｂｐ以上の長さ
のＤＮＡを選択し、ＥｃｏＲ［アダプター（ファルマシ
ア社）を介し、プラスミドｐＵｃ１９に組み込み、大腸
菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ＨＢ １０１を形質転換した［
１（ｕｙｎｈ、 Ｔ、、 Ｙｏｕｎｇ、 Ｒ，Ａ、 ＆
Ｄａｖｉｓ、 Ｒ，Ｗ。
ｐ、 １９６−１９８ ） −オリゴ（ｄＴ）−セルロ
ースを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより
、Ｐｏ１ｙ（Ａ） ’ ＲＮ Ａを１．６■分離精製し
た。さらに精製したＰｏ１ｙ（Ａ） ” ＲＮＡ５μｇ
を鋳型として、オリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素
を用いてｃＤＮＡを４μｇ合成した（Ｇｕｂｌｅｒ、
’Ｕ、 ＆ Ｈｏｆｆ５ａｎ、 Ｂ、Ｊ、 （１９８３
）Ｇｅｎｅ ２５．２６３−２６９３ 、４種類のｄＮ
ＴＰとＤＮＡポリメラーゼ■を用いて２本鎖ｃＤＮＡと
した後、ＣＬ−４Ｂカラムにより５００ｂｐ以上の長さ
のＤＮＡを選択し、ＥｃｏＲ［アダプター（ファルマシ
ア社）を介し、プラスミドｐＵｃ１９に組み込み、大腸
菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ＨＢ １０１を形質転換した［
１（ｕｙｎｈ、 Ｔ、、 Ｙｏｕｎｇ、 Ｒ，Ａ、 ＆
Ｄａｖｉｓ、 Ｒ，Ｗ。
（＋９８５） ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ
： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ 八ｐｐｒｏａｃ
ｈｅｄ、 Ｇｌｏｖｅｒ、 Ｄ、Ｍ （ＩＲＬ、 ０ｘ
ｆｏｒｄ）、ｐＰ ４９−７８ｔｌａｎａｈａｎ、 Ｄ
、 （１９８５） ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、 ｅｄ
、 Ｇｌｏｖｅｒ＋ Ｄ、Ｍ、 （ＩＲＬ、 ０ｘｆｏ
ｒｄ）ｐｐ、 １０９−１３５ ）。
： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ 八ｐｐｒｏａｃ
ｈｅｄ、 Ｇｌｏｖｅｒ、 Ｄ、Ｍ （ＩＲＬ、 ０ｘ
ｆｏｒｄ）、ｐＰ ４９−７８ｔｌａｎａｈａｎ、 Ｄ
、 （１９８５） ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、 ｅｄ
、 Ｇｌｏｖｅｒ＋ Ｄ、Ｍ、 （ＩＲＬ、 ０ｘｆｏ
ｒｄ）ｐｐ、 １０９−１３５ ）。
一方、ｃＤＮＡのスクリーニングには蛋白質の一次構造
よりＮ−末端のアミノ酸配列（２５アミノ酸残基）に基
づく、オリゴヌクレオチドの混合液を用いる方法（プロ
ーブ法）を採用した。５′ＴＣＣＣＡＹＴＴＲＴＡＲＴ
Ｇ−３’からなる８個のオリゴヌクレオチド（プローブ
１）と５′ＡＡＣＡＴＲＴＡＹＴＣＮＡＣＲＴＣＣＣＡ
３’ （Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ；Ｒ＝Ｇ、Ａ；Ｙ＝ＣＴ
）からなる３２個のオリゴヌクレオチド（プローブ２）
を合成した（Ａｄａｍｓ、 Ｓ、Ｐ、、 Ｋａｖｋａ、
Ｋ、Ｓ。
よりＮ−末端のアミノ酸配列（２５アミノ酸残基）に基
づく、オリゴヌクレオチドの混合液を用いる方法（プロ
ーブ法）を採用した。５′ＴＣＣＣＡＹＴＴＲＴＡＲＴ
Ｇ−３’からなる８個のオリゴヌクレオチド（プローブ
１）と５′ＡＡＣＡＴＲＴＡＹＴＣＮＡＣＲＴＣＣＣＡ
３’ （Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ；Ｒ＝Ｇ、Ａ；Ｙ＝ＣＴ
）からなる３２個のオリゴヌクレオチド（プローブ２）
を合成した（Ａｄａｍｓ、 Ｓ、Ｐ、、 Ｋａｖｋａ、
Ｋ、Ｓ。
Ｗｙｋｅｓ、 Ｅ、Ｊ、、Ｈｏ１ｄｅｒ、 Ｓ、Ｂ
、 ＆ Ｇ１１ｕｐｉ、 Ｇ、Ｐ、（１９８３）Ｊ
、 Ａｍ、 Ｃｈｅ＋＊、 Ｓｏｃ、 １０５．６６１
−６６３ ） −プローブ１および２はアスコルビン酸
オキシダーゼの２箇所のアミノ酸配列域、つまり、旧ｓ
’−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ”−ＡｓｐとＴｒｐ”−Ａ
ｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅをコー
ドするオリゴヌクレオチドとなる。ニトロセルロース上
にレプリカしたコロニーをプローブｌは３３°Ｃで、プ
ローブ２は４６°Ｃでハイブリダイズさせた（Ｎａｗａ
、 Ｈ，、Ｈｉｒｏｓｅ、 Ｔ、＋ Ｔａｋａｓｈｉ＊
ａ＋ Ｈ。
、 ＆ Ｇ１１ｕｐｉ、 Ｇ、Ｐ、（１９８３）Ｊ
、 Ａｍ、 Ｃｈｅ＋＊、 Ｓｏｃ、 １０５．６６１
−６６３ ） −プローブ１および２はアスコルビン酸
オキシダーゼの２箇所のアミノ酸配列域、つまり、旧ｓ
’−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ”−ＡｓｐとＴｒｐ”−Ａ
ｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅをコー
ドするオリゴヌクレオチドとなる。ニトロセルロース上
にレプリカしたコロニーをプローブｌは３３°Ｃで、プ
ローブ２は４６°Ｃでハイブリダイズさせた（Ｎａｗａ
、 Ｈ，、Ｈｉｒｏｓｅ、 Ｔ、＋ Ｔａｋａｓｈｉ＊
ａ＋ Ｈ。
ｆｎａｙａｍａ＋ Ｓ、 ＆ Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、
Ｓ、 （１９８３）＋ Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）
３０６．３２−３６３ 、約８５．０００コロニーから
６個のコロニーを選び出した。
Ｓ、 （１９８３）＋ Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）
３０６．３２−３６３ 、約８５．０００コロニーから
６個のコロニーを選び出した。
３、ヌクレオチドの配列
ｃＤＮＡ挿入ｐＡｓＯ１１（第３図参照）を制限酵素で
切断し、Ｍｌ ３ｍｐ １８やＭｌ ３ｍｐ １９中に
サブクローニングした。ヌクレオチド配列の分析はチェ
ーンターミネーシヲン法を用いた［Ｓａｎｇｅｒ＋ Ｐ
、＋ Ｎ１ｃｋｌｅｎ、 Ｓ、 ＆ Ｃｏｕｌｓｏｎ、
Ａ、Ｒ。
切断し、Ｍｌ ３ｍｐ １８やＭｌ ３ｍｐ １９中に
サブクローニングした。ヌクレオチド配列の分析はチェ
ーンターミネーシヲン法を用いた［Ｓａｎｇｅｒ＋ Ｐ
、＋ Ｎ１ｃｋｌｅｎ、 Ｓ、 ＆ Ｃｏｕｌｓｏｎ、
Ａ、Ｒ。
（１９７７） Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ １１．５４６３５４６７ ） 、第
２図に全ＤＮＡ配列を示す、サブクローニングによる遺
伝子地図および命名は第３図に示す。
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ １１．５４６３５４６７ ） 、第
２図に全ＤＮＡ配列を示す、サブクローニングによる遺
伝子地図および命名は第３図に示す。
４、アスコルビン酸オキシダーゼ蛋白の発現プラスミド
構築 アスコルビン酸オキシダーゼｃＤＮＡを大腸菌細胞内で
発現させるため、以下のプラスミド構築を行った。
構築 アスコルビン酸オキシダーゼｃＤＮＡを大腸菌細胞内で
発現させるため、以下のプラスミド構築を行った。
キュウリ細胞由来の該酵素の構造遺伝子は５′末端に分
泌のシグナル様配列をコードする領域（９９ｂρ）を有
する。大腸菌細胞内でキュウリで生成する成熟型酵素の
アミノ末端を有するタンパク質を合成させるため、第３
図に示すＥｃｏＲＩ−Ｎｓｐ１合成リンカ−５３ｂｐを
作成した。これは５′側のＥｃｏＲＩ粘着末端のすぐ下
流に翻訳開始コドンＡＴＧを有し、次いで成熟型酵素の
Ｎ末端グリシンからのアミノ酸配列をコードする。
泌のシグナル様配列をコードする領域（９９ｂρ）を有
する。大腸菌細胞内でキュウリで生成する成熟型酵素の
アミノ末端を有するタンパク質を合成させるため、第３
図に示すＥｃｏＲＩ−Ｎｓｐ１合成リンカ−５３ｂｐを
作成した。これは５′側のＥｃｏＲＩ粘着末端のすぐ下
流に翻訳開始コドンＡＴＧを有し、次いで成熟型酵素の
Ｎ末端グリシンからのアミノ酸配列をコードする。
３′末端のＮ５ｐ１部位を介し、読み枠を変えることな
（アスコルビン酸オキシダーゼを生成するようにｃＤＮ
Ａに直結可能である。なお、キュウリ由来のこの領域の
ＤＮＡ配列は大腸菌ベクター向配列と一部相同性がある
ため、該合成リンカ−はコードするアミノ酸配列を変え
ることなく一部核酸塩基配列を変更しである。
（アスコルビン酸オキシダーゼを生成するようにｃＤＮ
Ａに直結可能である。なお、キュウリ由来のこの領域の
ＤＮＡ配列は大腸菌ベクター向配列と一部相同性がある
ため、該合成リンカ−はコードするアミノ酸配列を変え
ることなく一部核酸塩基配列を変更しである。
アスコルビン酸オキシダーゼｃＤＮＡをコードするｐＡ
ｓＯｌｌより第３図に示すようにＮａｐｌ−ＢａｍＨＩ
断片を切り出し、合成リンカ−に連結し、Ｐ Ｋ Ｐ
ｌ ５００ （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇＶｏｌ、１ ｎｏ、４ ｐ３２７−３３２．１９８７
）内のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を置き換えた。更に
ＰＡＳＯＩＩより３′側領領域ＢａＨｌ−３ｓ ｐ Ｉ
断片（Ｓｓｐ１部位はＰｓＬ１部位に変換）を調製し、
前記構築物のＢａｍＨＩ−Ｐｓ ｔ Ｉ領域を置き換え
、ｐＥＡＳＯ３を構築した。これによりアスコルビン酸
オキシダーゼ遺伝子はｔａｃプロモーターの支配下にあ
る。
ｓＯｌｌより第３図に示すようにＮａｐｌ−ＢａｍＨＩ
断片を切り出し、合成リンカ−に連結し、Ｐ Ｋ Ｐ
ｌ ５００ （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇＶｏｌ、１ ｎｏ、４ ｐ３２７−３３２．１９８７
）内のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を置き換えた。更に
ＰＡＳＯＩＩより３′側領領域ＢａＨｌ−３ｓ ｐ Ｉ
断片（Ｓｓｐ１部位はＰｓＬ１部位に変換）を調製し、
前記構築物のＢａｍＨＩ−Ｐｓ ｔ Ｉ領域を置き換え
、ｐＥＡＳＯ３を構築した。これによりアスコルビン酸
オキシダーゼ遺伝子はｔａｃプロモーターの支配下にあ
る。
第３図に示すようにｐＥＡｓＯ３を含む宿主大腸菌Ｅ、
ｃｏｌｉ ＨＢ Ｉ Ｏ１をＬＢ培地で３時間培養後、
ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を１ｍＭ添
加し、更に１６時間培養し、酵素を誘導生成させた。培
養菌体破砕物を５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（
そのパターンは第４図に示した通りである）を行った結
果、６３に付近にアスコルビン酸オキシダーゼと思われ
る蛋白（塩基配列から推定されるタンパクの分子ｍ ：
６２．３８８）を産生じていることが判った。さらに
イムノブロッティング法によりそれがウサギ抗−アスコ
ルビン酸オキシダーゼ抗体と反応した（第５図）。この
タンパク質のＮ末端アミノ酸配列１６残基を確認した結
果、Ｎ末端のメチオニンは除去され、キュウリの成熟型
酵素のＮ末端配列と一致することが解った。
ｃｏｌｉ ＨＢ Ｉ Ｏ１をＬＢ培地で３時間培養後、
ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を１ｍＭ添
加し、更に１６時間培養し、酵素を誘導生成させた。培
養菌体破砕物を５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（
そのパターンは第４図に示した通りである）を行った結
果、６３に付近にアスコルビン酸オキシダーゼと思われ
る蛋白（塩基配列から推定されるタンパクの分子ｍ ：
６２．３８８）を産生じていることが判った。さらに
イムノブロッティング法によりそれがウサギ抗−アスコ
ルビン酸オキシダーゼ抗体と反応した（第５図）。この
タンパク質のＮ末端アミノ酸配列１６残基を確認した結
果、Ｎ末端のメチオニンは除去され、キュウリの成熟型
酵素のＮ末端配列と一致することが解った。
上述したことにより明らかなように、本発明のキュウリ
由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含有する組換えプラスミドを
用いた形質転換体を栄養培地にて培養することにより、
キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼを効率よく
多量に得ることが可能となる。
由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含有する組換えプラスミドを
用いた形質転換体を栄養培地にて培養することにより、
キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼを効率よく
多量に得ることが可能となる。
第１図はキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活
性をもつポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対応す
るアミノ酸配列の一例を示す。 第２図（ａ）、（１））はキュウリ由来のアスコルビン
酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドをコードするＤ
ＮＡの一例を示す。 第３図はキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼの
ＤＮＡ断片の遺伝子地図およびプラスミドｐＡｓＯ１１
より（７）ＰＥＡＳＯ３（７）構築を示す。 第４図は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のパ
ターンである。 第４図中、（１）は分子量マーカーを、（２）はキュウ
リ由来のアスコルビン酸オキシダーゼを、（３）は大腸
菌Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢ Ｉ Ｏｌの菌体蛋白を、（４）
はキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ遺伝子を
含むプラスミド（ｐＥＡｓＯ３）を組み込んだ形質転換
体大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢ １０１の菌体蛋白を示す
。 第５図は第４図のキュウリ由来のウサギ抗−アスコルビ
ン酸オキシダーゼ抗体を用いたイムノブロッティングを
示す。
性をもつポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対応す
るアミノ酸配列の一例を示す。 第２図（ａ）、（１））はキュウリ由来のアスコルビン
酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドをコードするＤ
ＮＡの一例を示す。 第３図はキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼの
ＤＮＡ断片の遺伝子地図およびプラスミドｐＡｓＯ１１
より（７）ＰＥＡＳＯ３（７）構築を示す。 第４図は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のパ
ターンである。 第４図中、（１）は分子量マーカーを、（２）はキュウ
リ由来のアスコルビン酸オキシダーゼを、（３）は大腸
菌Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢ Ｉ Ｏｌの菌体蛋白を、（４）
はキュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ遺伝子を
含むプラスミド（ｐＥＡｓＯ３）を組み込んだ形質転換
体大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢ １０１の菌体蛋白を示す
。 第５図は第４図のキュウリ由来のウサギ抗−アスコルビ
ン酸オキシダーゼ抗体を用いたイムノブロッティングを
示す。
Claims (4)
- （１）キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活性
をもつポリペプチドをコードする塩基配列であることを
特徴とするＤＮＡ。 - （２）請求項（１）記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮ
Ａ。 - （３）請求項（２）記載の組換えＤＮＡにより宿主細胞
を形質転換して得られた形質転換体。 - （４）キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活性
をもつポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換
えＤＮＡにより宿主細胞を形質転換して得られた形質転
換体を培養し、該形質転換体の産生するキュウリ由来の
アスコルビン酸オキシダーゼを含むポリペプチドを採取
することを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24425789A JPH03108485A (ja) | 1989-09-19 | 1989-09-19 | キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24425789A JPH03108485A (ja) | 1989-09-19 | 1989-09-19 | キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03108485A true JPH03108485A (ja) | 1991-05-08 |
Family
ID=17116064
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24425789A Pending JPH03108485A (ja) | 1989-09-19 | 1989-09-19 | キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03108485A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5180672A (en) * | 1990-02-13 | 1993-01-19 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Ascorbate oxidase isolated from acremonium sp. hi-25 ferm bp-3124 |
-
1989
- 1989-09-19 JP JP24425789A patent/JPH03108485A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5180672A (en) * | 1990-02-13 | 1993-01-19 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Ascorbate oxidase isolated from acremonium sp. hi-25 ferm bp-3124 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fliegel et al. | Molecular cloning of the high affinity calcium-binding protein (calreticulin) of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum | |
| Quevillon et al. | Macromolecular assemblage of aminoacyl-tRNA synthetases: identification of protein-protein interactions and characterization of a core protein | |
| Oberbäumer et al. | Amino acid sequence of the non‐collagenous globular domain (NC1) of the α1 (IV) chain of basement membrane collagen as derived from complementary DNA | |
| KR100316347B1 (ko) | 대장균엔테로톡신ⅱ신호펩티드의변형체와인체성장호르몬의융합단백질을발현하는재조합미생물및그를이용한인체성장호르몬의제조방법 | |
| JPS62502544A (ja) | アンギオゲニン活性を有する精製蛋白及びその製造方法 | |
| KR940000542B1 (ko) | 재조합 dna 기술에 의해 제조된 생리적 활성물질의 정제방법 | |
| CN118955688A (zh) | 一种重组片段化人源ⅲ型胶原蛋白及其制备方法、应用 | |
| US5556943A (en) | Cell adhesion protein, gene coding for the same, process for preparing the same and carrier onto which the same is immobilized | |
| US5659016A (en) | RPDL protein and DNA encoding the same | |
| JPWO1995001432A1 (ja) | 新規ポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ | |
| JPH03108485A (ja) | キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼ活性をもつポリペプチドの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 | |
| JPH03151877A (ja) | 骨カルシウム沈着因子 | |
| US5702921A (en) | Expression of biologically active human C-reactive protein in escherichia coli | |
| KR0161656B1 (ko) | 글루카곤의 생산방법 | |
| JPH025866A (ja) | ヒトアルファフェトプロテインドメインｉ遺伝子、対応プラスミド組換体、対応形質転換体、該ドメインｉの製造法及び製造された該ドメインｉ | |
| JPH0853500A (ja) | 融合タンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子 | |
| West et al. | SP75 is encoded by the DP87 gene and belongs to a family of modular Dictyostelium discoideum outer layer spore coat proteins | |
| JP3014159B2 (ja) | ヒト表皮トランスグルタミナーゼをコードするｄｎａ配列 | |
| US6252046B1 (en) | Polypeptide having water channel activity and DNA sequence | |
| US5612190A (en) | DNA molecule encoding bovine group I phospholipase A2 receptor | |
| JP3657751B2 (ja) | アクチン結合蛋白質ｌ−アファディン | |
| JP2829397B2 (ja) | フィブリン結合活性ポリペプチド | |
| JP2623807B2 (ja) | セリンプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ遺伝子 | |
| JPS61192288A (ja) | ヒトエラスタ−ゼ２の生物工学的製造 | |
| JPS617296A (ja) | インタ−ロイキン１の遺伝子の精製、クロ−ニング及び特性づけ |